Nghiên cứu tính đa hình di truyền và vai trò truyền bệnh của các thành viên trong nhóm loài Anopheles maculatus ở Việt Nam tt

1

Đại học quốc gia Hà Nội
Tr-ờng Đại học khoa học tự nhiên



Nguyễn Thị H-ơng Bình







Nghiên cứu tính đa hình di truyền
và vai trò truyền bệnh
của các thành viên trong nhóm loài
Anopheles maculatus ở việt Nam



Luận án tiến sỹ sinh học






Hà Nội 2009

Đại học quốc gia Hà Nội
Tr-ờng Đại học khoa học tự nhiên


Nguyễn Thị H-ơng Bình


Nghiên cứu tính đa hình di truyền
và vai trò truyền bệnh
của các thành viên trong nhóm loài
Anopheles maculatus ở việt Nam

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 62.42.70.01


Luận án tiến sỹ sinh học


Ng-ời h-ớng dẫn khoa học:
1. PGS. TS. Trịnh Đình Đạt
Tr-ờng Đại học Khoa học Tự nhiên
2. TS. Trần Đức Hinh
Viện sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng Trung -ơng



Hà Nội 2009

Mục lục

Trang
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Mục lục
Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ, đồ thị

Mở đầu 1
Ch-ơng 1 : Tổng quan tài liệu 4
1.1. Đại c-ơng về vấn đề nghiên cứu các loài đồng hình 4
1.2. Đa hình di truyền và nghiên cứu đa hình di truyền ở muỗi 8
1.2.1. Đa hình enzym và ứng dụng để nghiên cứu đa hình di truyền ở muỗi 8
1.2.2. Di truyền tế bào và ứng dụng trong nghiên cứu đa hình di truyền 13
1.2.3. Đại c-ơng về PCR và ứng dụng trong nghiên cứu đa hình di truyền
ở muỗi. 19
1.3. Những nghiên cứu về vai trò truyền bệnh và tính -a vật chủ của các vectơ 35
1.3.1. Những nghiên cứu về vai trò truyền bệnh sốt rét của muỗi 35
1.3.2. Xác định tính -a vật chủ của vectơ 35
1.4. Những nghiên cứu về nhóm loài An. maculatus 36
1.4.1. Những nghiên cứu ở n-ớc ngoài 37
1.4.2. Nghiên cứu trong n-ớc 41
Ch-ơng 2 : Đối t-ợng và ph-ơng pháp nghiên cứu 43
2.1. Đối t-ợng nghiên cứu 43
2.2. Thời gian nghiên cứu, địa điểm nghiên cứu 43
2.3. Ph-ơng pháp nghiên cứu 43
2.3.1. Ph-ơng pháp thu thập và xử lý mẫu vật tại thực địa 45
2.3.2. Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm 45
Ch-ơng 3 : Kết quả nghiên cứu 60
3. 1. Đa hình dấu hiệu kiểu hình của các thành viên trong nhóm loài An.

maculatus 60
3.1.1. Đa hình các dấu hiệu hình thái của các thành viên trong nhóm loài
An. maculatus 60
3.1.2. Đa hình di truyền các dấu hiệu sinh học, sinh thái học của các thành
viên trong nhóm loài An. maculatus. 80
3.2. Đa hình di truyền tế bào và các dấu hiệu kiểu gen của các thành viên trong
nhóm loài An. maculatus 89
3.2.1. Đa hình các dấu hiệu di truyền tế bào của các thành viên trong nhóm
loài An. maculatus 89
3.2.2. Đa hình di truyền các đặc điểm điện di enzym của các thành viên
trong nhóm loài An. maculatus. 92

3.2.3. Kết quả phân tích sự đa hình dựa vào chỉ thị PCR-RFLP ở nhóm loài
An. maculatus 112
3.2.4. Kết quả đánh giá sự đa hình di truyền của các thành viên trong
nhóm loài An. maculatus dựa vào chỉ thị RAPD. 116
3.2.5. Định loại các thành viên của nhóm loài An. maculatus bằng PCR đa
mồi 126
3.2.6. Kết quả đánh giá sự đa hình di truyền của các thành viên trong
nhóm loài An. maculatus dựa vào kết quả giải trình tự đoạn ITS2 128
3.3. Thành phần loài và phân bố của các thành viên trong nhóm loài An.
maculatus 135
3.3.1. Bảng định loại các thành viên đã xác định tên trong nhóm loài 135
An. maculatus 135
3.3.2. Phân bố của các thành viên trong nhóm loài An. maculatus 137
3.4. Vai trò truyền bệnh của các thành viên trong nhóm loài An. maculatus 141
Ch-ơng 4: Bàn luận 144
4.1. Đa hình di truyền và mối quan hệ di truyền của các thành viên trong nhóm
loài An. maculatus 144
4.1.1.Đa hình các dấu hiệu kiểu hình của các thành viên trong nhóm loài

An. maculatus 144
4.1.2. Đa hình di truyền các dấu hiệu kiểu gen của các thành viên trong
nhóm loài An. maculatus ở Việt Nam 155
4.2. Thành phần loài và phân bố của các thành viên trong nhóm loài An.
maculatus 161
4.2.1. Xây dựng bảng định loại các thành viên đã đ-ợc định tên trong
nhóm loài An. maculatus ở Việt Nam 161
4.2.2. Phân bố của các thành viên trong nhóm loài An. maculatus 162
4.3. Vai trò truyền bệnh của các thành viên trong nhóm loài An. maculatus 163
Kết luận 164
Các công trình của tác giả liên quan đến luận án đã công bố 167
NHững đóng góp mới của luận án 168
tài liệu tham khảo 169
Phụ lục 189















- 1 -

Đặt vấn đề
Những nghiên cứu về các côn trùng truyền bệnh, trong đó có muỗi Anopheles, trung gian truyền bệnh sốt rét
ngày càng đ-ợc đẩy mạnh trên mọi ph-ơng diện: phân loại, phân bố, vai trò truyền bệnh, sinh học, tập tính và biện
pháp phòng chống. Nhiều ph-ơng pháp kỹ thuật, nghiên cứu mới nhằm phân loại và xác định nguồn gốc phát sinh
đ-ợc ứng dụng rất mạnh. Việc kết hợp giữa các ph-ơng pháp nghiên cứu truyền thống với những ph-ơng pháp sinh
học phân tử là rất cần thiết để nghiên cứu các quần thể muỗi truyền bệnh. Nhiều loài muỗi lúc đầu đ-ợc xác định
nh- một loài đơn, nh-ng trong quá trình nghiên cứu sâu về vai trò dịch tễ, đặc tính sinh học và bằng việc sử dụng
các kỹ thuật mới, áp dụng các dấu hiệu nhận biết về di truyền, hoá sinh đã xác định chúng là những nhóm loài
đồng hình (sibling species complex, cryptic species complex), v chúng có thể có vai trò truyền bệnh khác nhau.
Loài muỗi Anopheles (Cellia) maculatus đ-ợc Theobald phát hiện ở Hồng Kông, Trung Quốc vào năm 1901. Đây
là loài muỗi phân bố rộng rãi ở vùng Đông ph-ơng. Cho đến nay, phức hợp An. maculatus gồm ít nhất 12 loài thành
viên. Nhiều thành viên trong nhóm này đã đ-ợc xác định có vai trò truyền bệnh ở Malaysia, Thái Lan, Nepal,
Trung Quốc, Singapore. ở Việt Nam, tr-ớc đây, muỗi Anopheles maculatus đ-ợc xác định là một loài đơn, phân bố
rộng rãi ở vùng rừng núi toàn quốc. Những nghiên cứu gần đây về hình thái, tế bào cho thấy phức hợp loài này gồm
ít nhất 6 loài đã đ-ợc định tên và một số dạng ch-a xác định rõ vị trí phân loại. Đến nay loài An. maculatus vẫn
đ-ợc coi là vectơ truyền bệnh thứ yếu ở n-ớc ta. Nhiều vấn đề mang tính hệ thống liên quan đến phân loại, vai trò
truyền bệnh của loài muỗi này ở Việt Nam cần đ-ợc giải quyết.
Với những lý do nêu trên chúng tôi tiến hành đề tài :Nghiên cứu tính đa hình di truyền và vai trò truyền
bệnh của các thành viên trong nhóm loài Anopheles maculatus ở Việt Nam nhằm mục đích :
1. Xác định thành phần loài và phân bố của các thành viên trong phức hợp loài An. maculatus ở Việt Nam.
2. Xác định tính đa hình di truyền và mối quan hệ di truyền của các thành viên trong phức hợp loài.
3. Xác định vai trò truyền bệnh của chúng nhằm góp phần vào việc phòng chống vectơ sốt rét ở n-ớc ta.
Những đóng góp mới về mặt khoa học
và ý nghĩa thực tiễn của luận án
1- Lần đầu tiên đã phối hợp nhiều kiểu dấu hiệu từ dấu hiệu hình thái kiểu hình đến dấu hiệu di truyền tế bào, điện
di enzym và phân tích phân tử ADN để nghiên cứu một nhóm loài đồng hình có vai trò truyền sốt rét ở Việt Nam và
xác định mối quan hệ di truyền của các thành viên trong nhóm loài An. maculatus.
2- Lần đầu tiên đã xây dựng đ-ợc bảng định loại hình thái đầy đủ các pha phát triển của các thành viên, đã định tên
trong nhóm loài An. maculatus và lập bản đồ phân bố của chúng ở Việt Nam.
3- Đã bổ sung thêm về những đặc điểm đa hình sinh học, sinh thái học của muỗi và bọ gậy các thành viên trong

nhóm loài An. maculatus ở Việt Nam
4- Đã xác định đ-ợc khả năng truyền cả hai loài KST P.falciparum và P.vivax của muỗi An. maculatus.
Cấu trúc của luận án
Luận án có 188 trang (không kể phụ lục) bao gồm các phần: Đặt vấn đề (3 trang); ch-ơng 1: Tổng quan tài
liệu (40 trang); ch-ơng 2: Đối t-ợng và ph-ơng pháp nghiên cứu (17 trang); ch-ơng 3: Kết quả nghiên cứu (83
trang); ch-ơng 4: Bàn luận (20 trang); Kết luận và đề nghị (3 trang); các công trình đã công bố của tác giả có liên
quan đến nội dung luận án (1 trang); những đóng góp mới của luận án (1 trang); tài liệu tham khảo (20 trang, gồm
27 tài liệu tiếng việt, 192 tài liệu tiếng Anh, 2 tài liệu tiếng Pháp) và phụ lục (32 trang). Luận án đ-ợc trình bày với
33 bảng, 72 hình. Ch-ơng 1 (3 hình), ch-ơng 2 (8 bảng, 6 hình), ch-ơng 3 (25 bảng, 63 hình). Phụ lục (10 bảng).
Ch-ơng 1: tổng quan tài liệu
1.1. Đại c-ơng về vấn đề nghiên cứu các loài đồng hình
Nhiều loài muỗi là vectơ truyền bệnh sốt rét tồn tại nh- thành viên của các phức hợp loài, trong đó có những loài
truyền bệnh và những loài không có vai trò này (Torres và cs, 2000; Van Bostel và cs, 2001). Để nghiên cứu các
phức hợp loài đồng hình đòi hỏi phải áp dụng nhiều ph-ơng pháp khác nhau từ đơn giản đến phức tạp để kết hợp
đ-ợc -u điểm của từng ph-ơng pháp (Cockburn, 1997).
1.2. Đa hình di truyền và nghiên cứu đa hình di truyền ở muỗi
Tính đa hình di truyền có thể đ-ợc xác định tại mọi cấp độ tổ chức bao gồm từ số l-ợng nucleotit đến cấu trúc
của ADN trong mỗi tế bào cũng nh- số l-ợng, cấu trúc của nhiễm sắc thể, protein, hay hình thái cơ thể của mỗi loài
trong các điều kiện tự nhiên khác nhau
1.2.1. Đa hình enzym và ứng dụng để nghiên cứu đa hình di truyền ở muỗi: Hiện t-ợng đa hình izozym trong tự
nhiên là kết quả của đột biến gen cấu trúc của các locut kiểm soát việc tổng hợp các sản phẩm của gen, có tính ứng
dụng cao, cung cấp những số liệu có giá trị cho những nghiên cứu về Anopheles. Những dấu hiệu về sự đa hình di
truyền đã đ-ợc phát hiện ở hầu hết các loài Anopheles nhất là ở các loài đồng hình. Có nhiều nhóm loài, phức hợp
loài đã đ-ợc nghiên cứu bằng ph-ơng pháp này nh-: An. minimus, An. dirus ở Châu á, An. quandrimaculatus ở

- 2 -
Nam Mỹ, An. gambiae, An. funestus ở châu Phi( Coluzzi và cs, 1977; Narang và cs, 1989; Sylvie Marguin và cs,
1998)
1.2.2. Di truyền tế bào và ứng dụng trong nghiên cứu đa hình di truyền: Ph-ơng pháp di truyền tế bào tập trung
vào nghiên cứu nhiễm sắc thể của tế bào: nhiễm sắc thể khổng lồ (polytene chromosome) và bộ nhiễm sắc thể ở kỳ

giữa nguyên phân (karyotype). Di truyền tế bào rất hữu ích trong việc phân biệt các loài đồng hình trong phức hợp
loài An. gambiae (Coluzzi 1968, Green 1972), An. culicifacies (Green & Miles 1980; Subbarao và cs 1983) và An.
maculatus (Green và cs 1985). Tần số của những đảo đoạn nhiễm sắc thể đ-ợc sử dụng để nghiên cứu cấu trúc quần
thể (Taylor và cs., 1993; Petrarca và cs, 2000; Kamau và cs, 2002).
1.2.3. Đại c-ơng về PCR và ứng dụng trong nghiên cứu đa hình di truyền ở muỗi.
- Phản ứng PCR: Phản ứng PCR có ứng dụng rất hiệu quả để nghiên cứu sự khác nhau ở mức độ phân tử, xác định
chính xác quan hệ tiến hoá của các loài. Các nhóm loài muỗi truyền bệnh quan trọng đều đã đ-ợc sử dụng phản ứng
PCR để định loại nh-: An. gambiae (Scott, 1993); An. quandrimaculatus (Collins và cs 1996), An. dirus (Jian và
Feng, 1997); An. sinensis (Ma Yajunvà cs, 1998), An. funestus (Kaumau, 2002; Anna Cohuet và cs, 2003).
- Kỹ thuật RAPD-PCR và ứng dụng RAPD- PCR trong nghiên cứu đa hình ở muỗi : Kỹ thuật RAPD sử dụng
mồi ngẫu nhiên tạo ra các đoạn nhân bản đa hình. Chỉ thị RAPD đ-ợc dùng để phân tích và xác định mối quan hệ
giữa các quần thể, loài sinh vật.
Wilkerson và cs (1993) đã sử dụng RAPD-PCR để phân biệt 2 loài muỗi trong phức hợp Anopheles gambiae là
An. gambiae và An. arabiensis. Phức hợp loài An. dirus cũng đ-ợc Sylvie Manguin và cs (2002) phân biệt nhờ sử
dụng kỹ thuật RAPD.
- Đại c-ơng về PCR- RFLP và ứng dụng PCR- RFLP trong nghiên cứu đa hình muỗi: Phân tích PCR- RFLP
dựa trên nguyên tắc là sự khác nhau về kích th-ớc của các phân đoạn đ-ợc tạo ra do xử lý enzym giới hạn đối với
các đoạn ADN đích đã đ-ợc nhân bản.
RFLP-PCR đ-ợc sử dụng để phân biệt 2 loài trong phức hợp An.maculipennis ở Anh. An. maculatus có thể
nhận biết đ-ợc khi dùng enzym HaeII cắt đoạn ITS2 (Torress và cs, 2000). Favia và cs (1997) phân biệt 3 dạng An.
gambiae bằng PCR-RFLP.
- Kỹ thuật sử dụng mẫu dò ADN (DNA - probe): Sử dụng mẫu dò ADN dùng phân loại các loài vectơ sốt rét
dựa trên đặc tính bắt cặp bổ sung của nucleotit. Các dòng mẫu dò ADN để có thể phân biệt đ-ợc 5 trong 6 loài
thuộc phức hợp Anopheles gambiae (Collins và cs, 1987).
- Kỹ thuật đa hình cấu tạo sợi đơn (Single strand conformational polymorphism-SSCP): Kỹ thuật này phát
hiện điểm đột biến trong các sản phẩm của phản ứng PCR. Sharpe và cs (1999) dùng SSCP để phân loại các loài
thuộc series Myzomyia là An. aconitus, An. varuna và An. minimus.
- Kỹ thuật khuếch đại một allen đặc biệt (Allene-specific amplification-ASA) Dựa vào thiết kế những mồi chỉ
bắt cặp với một allen nhất định và allen đó đặc tr-ng cho loài. Walton và cs (1999), Manguin và cs (2002) nghiên
cứu phức hợp loài An. dirus bằng ASA. Năm 1999, Sharp và cs đã phân biệt các loài trong series Myzomyia bằng

ASA.
- Microsattellite ADN-SSR: Microsattellite đã đ-ợc chứng minh là đặc biệt hữu ích cho việc nghiên cứu di truyền
quần thể và lập bản đồ di truyền. ở châu á , Rongnoparus và cs (1996, 1999) đã phân tích các locut ở An.
maculatus. ở Nam Mỹ, Conn và cs (2001) đã mô tả tính chất của 8 locut đa hình ở muỗi An.darlingi và ở châu Phi,
Sharakhov và cs (2001) đã mô tả tính chất của 31 locut ở An.funestus.
- Ph-ơng pháp giải trình tự: Giải trình tự ADN là quá trình xác định trật tự nucleotit của một đoạn ADN nhất
định. Các đoạn gen đ-ợc giải trình tự nhiều ở muỗi là IST1, IST2, COI và COII cũng nh- D3. Việc giải mã toàn bộ
hệ gen An. gambiae, vectơ truyền bệnh sốt rét chính ở Châu Phi đã đ-ợc bắt đầu vào năm 2001. Tháng 5/2007 các
nhà khoa học đã phác thảo xong trình tự bộ gen của muỗi Aedes aegypti, vectơ truyền bệnh sốt dengue, dengue xuất
huyết, sốt vàng.
1.3. Những nghiên cứu về vai trò truyền bệnh và tính -a vật chủ của các vectơ
1.3.1. Những nghiên cứu về vai trò truyền bệnh sốt rét của muỗi
Để chứng minh vai trò truyền bệnh của một vectơ ng-ời ta phải chứng minh đ-ợc chúng có mang vật gây
bệnh. Có nhiều ph-ơng pháp để chứng minh điều này nh-: mổ muỗi phát hiện thoa trùng (Ronal Ross, 1901). Kỹ
thuật miễn dịch liên kết enzym (ELISA) và kỹ thuật PCR.
1.3.2. Xác định tính -a vật chủ của vectơ
Một biện pháp cơ bản để chứng minh đ-ợc một loài muỗi có truyền bệnh hay không là xem muỗi có hút
máu ng-ời hay không. Nếu xác định đ-ợc một loài muỗi có tính -a thích vật chủ là con ng-ời thì chúng ta có bằng
chứng để nghĩ tới loài muỗi này có khả năng truyền bệnh cho ng-ời nhiều hơn loài khác không thích đốt máu
ng-ời.
Ph-ơng pháp miễn dịch, xác định máu vật chủ trên thạch; năm 1986, Bukort và cs, đã áp dụng ph-ơng pháp
ELISA; và gần đây là sử dụng kỹ thuật PCR để xác định máu vật chủ.
1.4. Những nghiên cứu về nhóm loài An. maculatus
1.4.1. Nghiên cứu về An. maculatus ngoài n-ớc




- 3 -
- Từ loài muỗi Anopheles maculatus đến nhóm loài An. maculatus: Loài muỗi Anopheles maculatus đ-ợc

Theobald phát hiện năm 1901 tại Hồng Kông. Hiện nay, tổng số loài đã đ-ợc định tên là 12 loài, ngoài ra còn có
một số dạng ch-a đ-ợc định tên.
- Vấn đề xác định các thành viên trong nhóm loài An. maculatus
Các thành viên trong nhóm loài An. maculatus đ-ợc định loại bằng nhiều ph-ơng pháp nh-: hình thái (th-ờng
chỉ dựa vào dấu hiệu muỗi tr-ởng thành, Rattanarithikul và Green [1986] cũng chỉ mô tả muỗi tr-ởng thành và
trứng của An. notanandai và An. sawadwongporni. Hai loài mới An. dispar và An. greeni ở Philippine của
Rattanarithikul và Harbach (1990) có thể nói là bản mô tả đầy đủ nhất); dấu hiệu di truyền tế bào (Năm 1993,
Baimai và cs đã mô tả bộ NST (Karyotype) của các thành viên trong nhóm loài An. maculatus ở vùng Đông Nam
á, điện di enzym và phân tích ADN (những nghiên cứu điển hình là của Torres, 1999; C.Walton, 2007 và Ma Ya
Jun 2002, 2006).
- Phân bố: Nhóm loài An. maculatus phân bố rộng trong vùng Đông Ph-ơng từ ấn Độ, qua Miến Điện, Thái Lan,
Lào, Campuchia, Việt Nam, Nam Trung Quốc; phía Đông Bắc đến Đài Loan, Trung Quốc; phía Tây Nam đến bán
đảo Mã Lai, phía Đông đến quần đảo Philippine.
- Đặc điểm sinh học: Tuỳ từng vùng phân bố, các thành viên trong nhóm loài có đặc điểm sinh học và sinh thái học
khác nhau. Bọ gậy của chúng th-ờng thấy ở các mạch n-ớc, suối nhỏ có ánh sáng rọi trực tiếp hoặc không trực tiếp.
Muỗi thích sống gần chuồng gia súc, ở những vùng muỗi -a đốt máu ng-ời và là vectơ truyền bệnh chính, còn đại
đa số các thành viên trong nhóm loài -a đốt máu súc vật hơn và không có vai trò truyền bệnh.
-Vai trò truyền bệnh: Anopheles maculatus s.l đ-ợc coi là vectơ sốt rét quan trọng ở bán đảo Malaysia, Thái Lan,
ấn Độ, Nepal, Miến Điện (Rao, 1984).
1.4.2. Nghiên cứu về An. maculatus trong n-ớc
- Những nghiên cứu về sinh học, sinh thái học của muỗi An. maculatus: An. maculatus là loài muỗi hoang dại
phân bố khá rộng, trú ẩn tiêu máu ngoài nhà là chủ yếu. An. maculatus phát triển mạnh vào mùa m-a. Bọ gậy bắt
đ-ợc ở các suối ven rừng, có ánh sáng nhiều, đôi khi bắt đ-ợc ở các ruộng lúa, giếng, vũng n-ớc ven suối.
- Về vai trò truyền bệnh của An. maculatus: An. maculatus s.l đ-ợc xác định là một vectơ truyền sốt rét thứ yếu ở
Việt Nam, Toumanoff (1936) đã mổ thấy loài muỗi này mang thoa trùng và oocysts, Đặng Văn Ngữ (1966) cũng
xác định tỷ lệ mang KST của loài muỗi này khoảng 1,9%.
Ch-ơng 2: Đối t-ợng và ph-ơng pháp nghiên cứu
2.1. Đối t-ợng nghiên cứu:
Các loài muỗi thuộc nhóm loài Anopheles maculatus ở Việt Nam.
2.2. Thời gian nghiên cứu, địa điểm nghiên cứu

- Tháng 10-2001 đến tháng 12-2006
- Địa điểm thu mẫu trên toàn quốc
2.3. Ph-ơng pháp nghiên cứu: Mô tả thực địa và phòng thí nghiệm.
2.3.1. Ph-ơng pháp thu thập và xử lý mẫu vật tại thực địa
Muỗi đ-ợc thu thập và bảo quản theo ph-ơng pháp chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới và Viện Sốt rét, Ký sinh
trùng, Côn trùng (1975, 1987).
2.3.2. Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm
-Nuôi muỗi: Theo dòng gia đình để làm tiêu bản đồng bộ và phân tích các dấu hiệu di truyền theo dòng gia đình.
- Phân loại muỗi dựa trên các dấu hiệu hình thái: theo R.Rattanarithikul và C. A. Green, 1986, R.Rattanarithikul
và R.E. Harbach, 1990, Rattanarithikul và cs, 2006, J. A. Reid, 1968 , Lục Bảo Lân, 1997.
- Phân tích đặc điểm di truyền tế bào: Làm tiêu bản bộ NST từ tế bào não bọ gậy tuổi 4 theo 2 ph-ơng pháp:
Ph-ơng pháp của V.Baimai (1997) có sửa đổi và ph-ơng pháp của Frank (1962) có cải tiến.
Phân tích kết quả theo Baimai và cs (1993), xác định các đặc điểm cấu trúc, cân tâm, lệch tâm, cận tâm mút
- Điện di enzym và phân tích kết quả điện di: Điện di trên gel cellullose acetate (Itan II, Helana Laboratories,
U.K) theo ph-ơng pháp của Smith và cs, 1996 với 11 hệ enzym: ODH, LDH, MDH, GPI, PGM, MPI, IDH, 6-PGD,
-GPD, GOT, HAD.
Phân tích kết quả theo Futuyma, D.J. 1986, sử dụng phần mềm TFPGA version 1.3 (Mark P. Miller, 1997): tính
tần số alen, tính phù hợp với định luật cân bằng Hardy Weinberg, hệ số t-ơng đồng di truyền và khoảng cách di
truyền.
- Tách chiết ADN của muỗi: theo Collin và cs (1987) tủa ADN bằng ethanol.
- Ph-ơng pháp PCR-RFLP : Cắt sản phẩm nhân bản đoạn ITS2 của các loài trong nhóm An. maculatus bằng 10
enzym cắt giới hạn AluI, EcoRI, BamHI, HindIII, XbaI, MspI, Cfr131, HaeII, HindII, HeaIII.
- Ph-ơng pháp RAPD-PCR: tiến hành PCR với 7 mồi A1, A5, F2, F4, OPL1, OPA4, OPA10.
Phân tích số liệu bằng phần mềm TFPGA 1.3, tính hệ số t-ơng đồng di truyền, khoảng cách di truyền và lập cây
chủng loại phát sinh.
- Ph-ơng pháp giải trình tự: giải trình tự đoạn ITS2 trên máy AB3730. Xử lý và phân tích kết quả bằng phần mềm
MEGA version 3.1.

- 4 -
- Xác định ký sinh trùng trong muỗi bằng ph-ơng pháp ELISA: Theo ph-ơng pháp của Wirtz và cs (1987) với

3 loại kháng thể đơn dòng là P.falciparum, P.vivax 210 và P.vivax 247.
- Kiểm tra lại mẫu ELISA d-ơng tính: bằng ph-ơng pháp PCR lồng theo G.Snounou và
cs (1992).
Ch-ơng 3: Kết quả nghiên cứu
3.1. Đa hình dấu hiệu kiểu hình của các thành viên trong nhóm loài An. maculatus
3.1.1. Đa hình các dấu hiệu hình thái của các thành viên trong nhóm loài An.
maculatus
Tổng số mẫu vật có thể sử dụng để nghiên cứu là 9583 mẫu bao gồm các mẫu vật nuôi theo dòng gia đình,
muỗi tr-ởng thành và bọ gậy thu thập từ tự nhiên (bảng 3.2).
Bảng 3.1: Số l-ợng mẫu vật đã thu thập trong giai đoạn 2001-2005
Stt
Tên muỗi
Muỗi
bắt TN
Muỗi nuôi
theo GĐ
Bọ
gậy
Tổng
cộng
1
An. maculatus
1161
483
1450
3544
2
An. dravidicus
18
26

19
63
3
An. notanandai
28
52
595
675
4
An. pseudowillmori
104
247
247
598
5
An. sawadwongporni
1950
386
1187
3523
6
An. willmori
36
104
249
389
7
Các dạng khác
324
189

278
791
Tổng cộng
4071
1487
4025
9583
Ghi chú: TN: tự nhiên GĐ: gia đình
- Đa hình hình thái muỗi tr-ởng thành của các thành viên trong nhóm loài An. maculatus
Các thành viên của nhóm loài An. maculatus ở Việt Nam rất đa dạng về dẫn liệu hình thái.
- An. maculatus: Tấm l-ng các đốt bụng II-IV không có vẩy trắng. Đốt bụng V-VIII đặc biệt là các đốt bụng
VII-VIII tập trung nhiều vẩy trắng hình thìa. Không có vẩy đen chỗ chia nhánh gân cánh L
2
.

Gân L
3
không có điểm
đen dài ở giữa.
- An. dravidicus: Các đốt bụng II-VIII đều có phủ vẩy trắng hình thìa. Gân L
3
ngoài 2 điểm đen ở gốc và ngọn, ở
giữa còn có một băng đen dài hoặc một vài băng đen nhỏ ít nhất là ở một bên cánh.
- An. notanandai: Tất cả các tấm l-ng đốt bụng II- VIII đều phủ vảy trắng, chỗ chia nhánh gân L
2

cánh có đám vảy
đen. Phần cuối các tấm l-ng đốt bụng IV-VII có một hàng vẩy đen.
- An. pseudowillmori: Tấm l-ng đốt bụng II- VII không có vảy trắng, chỉ có vảy trắng ở đốt bụng VIII. Thân L
2

ngắn, ô tr-ớc cánh dài.
- An. sawadwongporni: Tấm l-ng đốt bụng II- VIII phủ đầy vảy trắng hình thìa, đôi khi còn có một vài vảy đen ở 2
bên mép. Chỗ chia nhánh gân L
2

th-ờng có đám vảy đen ít nhất ở một bên cánh. Cuối các tấm l-ng đốt bụng chỉ có
một chùm vẩy đen ở hai bên.
- An. willmori: Các tấm l-ng trên các đốt đốt bụng II- VII phủ đầy vảy trắng, chỗ chia nhánh gân L
2
không có chùm
vẩy đen.

An. maculatus
An. pseudowillmori
An. sawadwongporni
An. willmori
An. notanandai
An. dravidicus
Hình 3.1: Đa hình hình thái muỗi tr-ởng thành của các thành viên thuộc nhóm loài An. maculatus


- Đa hình hình thái cơ quan sinh dục đực
Đặc điểm cơ quan sinh dục đực các thành viên trong nhóm loài An. maculatus cũng rất đa hình dựa vào cấu
trúc của thuỳ l-ng, thuỳ bụng và lá phụ gai giao cấu.
Thuỳ l-ng
Thuỳ bụng
Lá phụ gai
giao cấu

- 5 -

- Đa hình hình thái quăng
Các dấu hiệu hình thái
chủ yếu dùng để phân tích
tính đa hình giai đoạn
quăng gồm các chỉ số bánh
lái (chiều dài bánh lái/chiều
rộng), độ dài của gai bên
đốt bụng IV, phân bố các
gai cứng ở bờ cong ngoài
bánh lái. (Hình 3.3)
Phiến đỉnh
Gai bên đốt bụng 4
Bánh lái con đực
Bánh lái con cái
Hình 3.3. Dấu hiệu hình thái bọ gậy
của An. maculatus
- Đa hình hình thái bọ gậy

Đầu

Lông số 4
ngực giữa
Bọ gậy các thành viên trong
nhóm loài rất đa hình và có

nhiều dấu hiệu gối nhau. Một
số dấu hiệu th-ờng dùng để
phân tích đa hình hình thái
giai đoạn bọ gậy là: cấu trúc
lông lá cọ (lông số 1) và hình
thể các tấm kitin của các đốt
bụng, số l-ợng các nhánh của
lông số 4 đốt ngực giữa.(Hình
3.4)

Lông lá cọ đốt
bụng 2

Tấm kitin trên các
đốt bụng
Hình 3.4. Dấu hiệu hình thái quăng
của An. maculatus

- Đa hình hình thái trứng
Các dấu hiệu dễ nhận biết tính
đa hình hình thái của pha trứng
các thành viên trong nhóm loài là
cấu trúc khoang trứng, cấu trúc,
số l-ợng các rẻ phao nổi.


Hình 3.25. Dấu hiệu hình thái
trứng của An.sawadwongporrni
3.1.2. Đa hình các dấu hiệu sinh học, sinh thái học của các thành viên trong nhóm loài An. maculatus.
- Đa hình dấu hiệu sinh học, sinh thái học giai đoạn tr-ớc tr-ởng thành: Nghiên cứu các ổ bọ gậy của thành

viên nhóm loài.
ổ n-ớc đứng có l-u thông nhiều bọ gậy hơn: 62,26% (2506/4025). Nhiều nhất là các vũng n-ớc mạch:
45,69%, tiếp theo là các hố đào vàng, các đáy suối cạn.
Có thể bắt đ-ợc bọ gậy của
tất cả các loài muỗi ở ổ n-ớc
chảy nh-ng thấp hơn (37,74%).
Hai loài muỗi An.
sawadwongporni và An.
notanandai chiếm tỷ lệ cao nhất
ở ổ n-ớc chảy (40,68% và
28,53%).

Hình 3.26: ổ bọ gậy của An.
notanandai và An. sawadwongporni ở
suối lớn
- Đa hình dấu hiệu sinh học, sinh thái học giai đoạn tr-ởng thành: Các loài muỗi chủ yếu bắt đ-ợc ở chuồng
trâu (83,5% - 95,21%). Tỷ lệ muỗi bắt đ-ợc bằng ph-ơng pháp mồi ng-ời rất thấp (mồi ng-ời trong nhà 0,7 -
Khoang trứng
Phao nổi
Hình3.2. Cơ quan sinh dục
đực của An.maculatus

- 6 -
1,32%; mồi ng-ời ngoài nhà 0,94- 4,49%). Nh- vậy, muỗi An. maculatus chủ yếu trú ẩn ngoài nhà và -a đốt máu
súc vật.
3.2. Đa hình kiểu gen của các thành viên trong nhóm loài An. maculatus
3.2.1. Đa hình di truyền các dấu hiệu di truyền tế bào của các thành viên trong nhóm loài An. maculatus: Bộ
NST 2n = 6, NST giới tính X, Y có hình thái khác nhau (Hình 3.30).
- An. maculatus: Các dạng có NST th-ờng giống nhau, khác nhau ở NST giới tính, có ba kiểu NST X: X1, X2, X3
và hai kiểu NST Y: Y1, Y2.

- An. sawadwongporni: NST X tâm cận mút gồm có một khối dị NS ở tâm động. NST Y cận tâm mút và xấp xỉ
bằng độ lớn khối dị nhiễm sắc ở NST X. Những khối dị nhiễm sắc ở quanh tâm động rất rõ.
- An. dravidicus: Bộ NST giống với của An. sawadwongporni nh-ng khối dị nhiễm sắc trung tâm lớn hơn.
- An. notanandai: NST X tâm cận giữa. Vai ngắn hầu hết là đồng nhiễm sắc trong khi đó vai dài toàn bộ dị nhiễm
sắc.
- An. willmori: NST giới tính lớn bất th-ờng. NST X tâm cận giữa và vai ngắn có phần đồng nhiễm sắc bằng phần
dị nhiễm sắc, vai dài toàn dị nhiễm sắc.
- An. pseudowillmori: Cả NST X và Y của loài này cận tâm giữa lớn; NST X hơi lớn hơn NST Y.


NST An. maculatus cái dạng 5
NST An. maculatus đực dạng 5


NST An. pseudowillmori cái
NST An. pseudowillmori đực
Hình 3.30. Bộ NST của thành viên nhóm loài An. maculatus
3.2.2. Đa hình di truyền các đặc điểm điện di enzym của các thành viên trong nhóm loài An. maculatus.
- Hệ izozym ODH: Hệ izozym này có 4 alen đồng trội trong một locut, cấu trúc dimer. Các alen gồm: Odh
a
, Odh
b
,

Odh
c
,Odh
d
; với Rf t-ơng ứng: 96, 100, 109, 116.
- Hệ izozym LDH: Tần số alen và sự phân bố tần số alen của hệ izozym LDH phù hợp với định luật Hardy

Weinberg.
- Hệ izozym MDH: MDH có tính đa hình cao, hai phần ba các quần thể nghiên cứu có tính đa hình. Phân thành 2
vùng là Mdh1 và Mdh2, mỗi vùng do một gen riêng biệt kiểm soát.
-Hệ izozym GOT: ở hai locut của hệ enzym GOT, alen chiếm -u thế là Got1
b
với Rf = 100 và Got2
c
với Rf = 160.
- Hệ izozym 6PGD
Hệ izozym 6PGD thể hiện tính đa
hình cao và là một hệ enzym có
khả năng phân biệt giữa các thành
viên của nhóm loài An. maculatus
một cách rõ ràng nhất. An.
notanandai alen 6Gpd
a
(Rf = 83),
alen 6Gpd (Rf = 86) đặc tr-ng
cho An. pseudowillmori. Các
dạng An. sawadwongporni có
alen 6Gpd
f
(Rf = 114), An.
dravidicus có alen 6Gpd
d
(Rf =
100) chiếm -u thế (Hình 3.34).


-Hệ izozym IDH: IDH cũng thể hiện tính đa hình cao và có khả năng phân biệt các thành viên trong nhóm loài An.

maculatus ở Việt Nam.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Hình 3.34: Hình ảnh điện di enzym
6PGD của các thành viên trong nhóm
loài An.maculatus.
Giếng 1, 2, 3, 6, 10, 11: An. sawadwongporni
Giếng 4,7: An.maculatus dạng 3
Giếng 5: An.maculatus dạng 4
Giếng 8: An. willmori
Giếng 12: An. pseudowillmori
Giếng 9: An.maculatus





- 7 -
- Hệ izozym PGM: PGM đ-ợc kiểm soát bởi 3 alen đồng trội Pgm
a
(Rf = 85), Pgm
b
(Rf = 100), Pgm
c
(Rf = 120).
Cấu trúc của enzym là monomer.
- Hệ izozym GPI: Đây là enzym có cấu trúc dimer các alen t-ơng ứng với Rf bằng 91, 100 và 109. An. willmori
phân biệt với các loài khác dựa vào alen Gpi
c
.
- Hệ izozym - GPD: Enzym này có tính đa hình rất cao, 100% các quần thể nghiên cứu đều thể hiện tính đa hình.

Cấu trúc monomer, do 5 alen đồng trội thuộc cùng một locut kiểm soát.
- Hệ izozym MPI: ở các loài đã đ-ợc đặt tên thì alen Mpi
d
chiếm tần số cao, trong khi đó ở các dạng ch-a đ-ợc đặt
tên chính thức thì tần số lại cao ở alen Mpi
a
.
- Hệ izozym HAD: HAD là hệ enzym ít đa hình nhất do 2 alen đồng trội quy định là Had
a
(Rf = 89) và Had
b
(Rf =
100).
Mối quan hệ di truyền (Hệ số t-ơng đồng di truyền: I và khoảng cách di truyền: D) giữa các thành viên
trong phức hợp An. maculatus đ-ợc tổng kết ở bảng 3.18, hình 3.38, 3.39.
Bảng 3.18: Hệ số t-ơng đồng di truyền (I) và khoảng cách di truyền (D) giữa các thành viên đã định tên trong nhóm loài An.
maculatus dựa trên số liệu phân tích izozym
Hệ số t-ơng đồng di truyền (I)

An. maculatus
An. notanandai
An. sawadwongporni
An. pseudowillmori
An. willmori
An. dravidicus
An. maculatus
****
0,70
0,76
0,55

0,57
0,80
An. notanandai
0,35
****
0,85
0,60
0,50
0,54
An.
sawadwongporni
0,28
0,17
****
0,72
0,52
0,56
An. pseudowillmori
0,64
0,50
0,33
****
0,50
0,46
An. willmori
0,57
0,70
0,65
0,70
****

0,52
An. dravidicus
0,23
0,61
0,58
0,78
0,66
****
Khoảng cách di truyền (D)


Hình 3.38: Sơ đồ hình cây biểu thị mối quan hệ di truyền của các thành viên đã định tên trong nhóm loài An. maculatus dựa
trên số liệu phân tích izozym
Sáu loài này là những loài độc lập nh-ng thể hiện trên sơ đồ hình cây gồm 4 nhánh khá rõ: (1) An.
sawadwongporni và An. notanandai, (2) An. pseudowillmori, (3) An. maculatus và An. dravidicus, (4) An. willmori
trong đó nhánh An.
willmori tách xa nhất

Khoảng cách di truyền
giữa An. maculatus với
các dạng An.
pseudowillmori là xa nhất
(D = 0,65 và 0,67); tiếp
theo là nhóm An.
willmori (D = 0,64 và 0,57),
gần hơn là An.
An. sawadwongporni
An. notanandai
An. speudowillmori
An. maculatus

An. dravidicus
An. willmori
D
An. maculatus s.s
An. maculatus dạng 5
An. dravidicus
An. willmori
An. willmori dạng 2
An. sawadwongporni dạng 2
An. sawadwongporni dạng 3
An. sawadwongporni
An. notanandai
An. maculatus dạng 4
An. maculatus dạng 6
An. maculatus dạng 3
An. pseudowillmori dạng 3
An. pseudowillmori
D
Hình 3.39: Sơ đồ hình cây biểu thị mối quan hệ di truyền của các thành viên
trong toàn bộ nhóm loài An.maculatus dựa trên số liệu phân tích izozym

- 8 -
sawadwongporni (D = 0,31; 0,28). An. maculatus có quan
hệ gần gũi với An. notanandai (D = 0,35) và An. dravidicus
(D = 0,23). Đối với các dạng An. maculatus, An.
maculatus dạng 5 gần gũi nhất (D = 0,01), An. maculatus
dạng 3 xa nhất giống nh- một loài tách biệt (D = 0,53).
3.2.3. Kết quả phân tích sự đa hình dựa vào chỉ thị PCR-
RFLP ở nhóm loài An. maculatus: Đoạn ITS2 có kích
th-ớc 500bp đ-ợc cắt với 10 enzym.

- Enzym HaeIII: Enzym HeaIII cắt các sản phẩm PCR
đoạn ITS2 của nhóm loài An. maculatus thành 3 nhóm: nhóm 1 gồm An. sawadwongporni, An. maculatus và An.
pseudowillmori; nhóm 2: An. notanandai, An. willmori dạng 2 và An. maculatus dạng 5. Nhóm 3 cắt thành 2 băng
rõ rệt 350 bp và 150 bp là An. sawadwongporni dạng 2 và An. dravidicus.
- Enzym HindII: Chỉ cắt đoạn ITS2 của An. dravidicus.
- Enzym Cfr131: Cfr131 chỉ có thể phân biệt An. notanandai.
- Enzym HindIII: phân biệt đ-ợc An. notanandai.
- Enzym HeaIII: phân biệt đ-ợc An. willmori dạng 2.
- Enzym MspI: đoạn ITS2 của An. sawadwongporni đ-ợc MspI cắt thành hai băng 330 bp và 170 bp, ITS2 của An.
maculatus cắt thành 4 băng 330 bp, 200 bp, 170 bp và 100 bp. Đoạn ITS2 của An. willmori cắt thành 3 băng có
kích th-ớc 300 bp, 150 và 150bp.








Hình 3.43. Sản phẩm cắt đoạn ITS2 của các thành viên trong
nhóm loài An. maculatus bằng enzym MspI
Làn 1: Thang chuẩn 50 bp Làn 2: An. sawadwongporni
Làn 3: An. maculatus Làn 4: An. sawadwongporni dạng 2
Làn 5: An. notanandai Làn 6: An. maculatus dạng 3
Làn 7: An. willmori dạng 2 Làn 8: An. willmori
Làn 9: Đối chứng âm Làn 10: An. pseudowillmori
Làn 11: An. dravidicus Làn 12: An. maculatus dạng 4
- Enzym XbaI: phân biệt đ-ợc một số thành viên.
- Enzym AluI: Enzym AluI cắt An. sawadwongporni và An. willmori giống nhau, cắt An. maculatus thành 3 băng
còn không cắt sản phẩm PCR đoạn ITS2 của các dạng và loài khác.

Trong số 10 enzym sử dụng, hai enzym EcoRI, BamHI không cắt đoạn ITS2. Các enzym còn lại là Cfr13l,
MspI, Alul, HindII, HindIII, HaeII, HaeIII và XbaI đều có khả năng cắt đoạn ITS2 và tạo các băng đa hình giữa các
thành viên trong nhóm loài An. maculatus ở các mức độ khác nhau.
3.2.4. Kết quả đánh giá sự đa hình di truyền của các thành viên trong nhóm loài An. maculatus dựa vào chỉ
thị RAPD.
- Mồi A1: Các băng rõ nét và đa hình cao, tạo ra 26 băng có kích th-ớc từ 0,15 đến 1,5 kb. Vùng có kích th-ớc là 0,
15 đến 0,4 kb chứa 12 băng đa hình có khả năng phân biệt các loài trong nhóm loài An. maculatus rõ rệt nhất.
- Mồi A5: khuếch đại 23 băng đa hình có kích th-ớc 0,12 đến 1,4 Kb, trong đó 17 băng có kích th-ớc 0,25 đến 0,9
Kb cho phép phân biệt các loài trong nhóm loài An. maculatus.
- Mồi F2: Đây là mồi tạo ra nhiều băng đa hình nhất 26 băng, trong đó có tới 20 băng nằm trong khoảng từ 0,1 đến
1,1 Kb thể hiện sự khác biệt giữa các loài trong nhóm loài An. maculatus.







1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17




- 9 -


Hình 3.47: Sản phẩm của phản ứng RAPD- PCR sử dụng mồi F2
Làn 1: Thang chuẩn 50 bp Làn 2: Đối chứng âm
Làn 3, 16: An. maculatus Làn 4: An. maculatus dạng 5

Làn 5: An. notanandai Làn 6: An. sawadwongporni
Làn 7: An. sawadwongporni dạng 2 Làn 8: An. sawadwongporni dạng 3
Làn 9: An. maculatus dạng 4 Làn 10: An. pseudowillmori dạng 1
Làn 11: An. pseudowillmori dạng 2 Làn 12: An. willmori
Làn 13: An. willmori dạng 2 Làn 14: An. dravidicus
Làn 15: An. maculatus dạng 3 Làn 17: Thang chuẩn 100 bp
- Mồi OPL1: Phân biệt các thành viên bởi 12 băng đa hình nằm trong khoảng kích th-ớc từ 0,1 đến 0,6 Kb.
- Mồi OPA10: 25 băng đa hình kích th-ớc từ 0,2 đến 1,5 kb. chỉ có 9 băng kích th-ớc từ 0,2 đến 0,5 kb phân biệt
đ-ợc các loài.
- Mồi F4 và mồi OPA4: Các băng rõ nét, tính đa hình thấp khó phân biệt các thành viên trong nhóm loài An.
maculatus.
Năm mồi có mức độ đa hình cao có thể phân biệt các loài là A1, A5, F2, OPL1, OPA10; hai mồi F2 và OPA4 có
mức độ đa hình thấp và khó có thể phân biệt đ-ợc các loài với nhau. áp dụng phần mềm TFPGA 3.1 để xử lý kết
quả đ-a ra bảng ma trận t-ơng đồng di truyền và cây quan hệ di truyền giữa các thành viên trong nhóm loài An.
maculatus (Bảng 3-20; Hình 3-59).

Bảng 3.20: Hệ số t-ơng đồng di truyền(I) và khoảng cách di truyền (D) giữa các thành viên đã định tên trong nhóm loài An.
maculatus dựa trên số liệu RAPD-PCR
Hệ số t-ơng đồng di truyền (I)

An. maculatus
An. notanandai
An. sawadwongporni
An. pseudowillmori
An. willmori
An. dravidicus
An. maculatus
****
0,67
0,69

0,53
0,64
0,72
An. notanandai
0,40
****
0,72
0,64
0,72
0,61
An. sawadwongporni
0,37
0,32
****
0,67
0,70
0,56
An. pseudowillmori
0,62
0,45
0,40
****
0,62
0,60
An. willmori
0,44
0,33
0,37
0,47
****

0,57
An. dravidicus
0,32
0,49
0,57
0,52
0,56
****
Khoảng cách di truyền (D)










Hình 3.50: Sơ đồ hình cây biểu thị mối quan hệ di truyền của các thành viên đã định tên trong nhóm loài An.
maculatus dựa vào số liệu RAPD-PCR
Khoảng cách di truyền biến động trong khoảng từ 0,12 đến 0,62. An. pseudowillmori và An. maculatus dạng
3 có khoảng cách di truyền lớn nhất (D = 0,62) . Các thành viên có quan hệ gần gũi nhau là An. willmori và An.
willmori dạng 2 (D = 0,12); An. maculatus dạng 4 và An. maculatus dạng 6 (D = 0,14). Khoảng cách di truyền giữa
3 dạng An. sawadwongporni dao động từ 0,25 và 0,28. Khoảng cách di truyền giữa 2 dạng An. pseudowillmori là
0,26.
Sơ đồ hình cây dựa trên kết quả phân tích RAPD-PCR cũng t-ơng tự nh- sơ đồ hình cây dựa trên kết quả
phân tích điện di enzym.
3.2.5. Định loại các thành viên của nhóm loài An. maculatus bằng PCR đa mồi
Trong 6 loài muỗi thử nghiệm với các mồi của C.Walton có 4 loài bắt đúng vị trí thiết kế là An. maculatus,

An. sawadwongporni, An. dravidicus và An. pseudowillmori. Muỗi An. notanandai bắt mồi vào vị trí của An.
maculatus dạng K. An. willmori bắt vào vị trí của An. sawadwongporni hoặc bắt vào vị trí của An. maculatus.
Hệ thống mồi của Ma Ya Jun có 4 loài bắt đúng vị trí là An. maculatus, An. dravidicus, An. pseudowillmori
và An. willmori. Trong khi đó An. sawadwongporni của chúng tôi không bắt vào vị trí mồi của Ma Ya Jun thiết kế
cho An. sawadwongporni ở Trung Quốc.
An .dravidicus
An. notanandai
An. pseudowillomri
An. willmori
An. maculatus
An. sawadwongporni
D

- 10 -
3.2.6. Kết quả đánh giá sự đa hình di truyền của các thành viên trong nhóm loài An. maculatus dựa vào kết
quả giải trình tự đoạn ITS2
Trình tự đoạn ITS2 của các thành viên trong nhóm loài có kích th-ớc từ 507 đến 519 bp. Các đỉnh đồ thị thu
đ-ợc rõ ràng, sắc nét, không có sự chồng chéo, chứng tỏ các kết quả thu đ-ợc là đáng tin cậy.

Hình 0.53: Hình ảnh giải trình tự đoạn gen ITS2 của An. maculatus dạng 5

Dựa trên sự sai khác về trình tự nucleotit chúng tôi lập cây quan hệ di truyền của các thành viên trong nhóm
loài này. Kết quả ở hình 3.67

Hình 3.58: Sơ đồ hình cây biểu thị mối quan hệ di truyền của các thành viên đã định tên trong nhóm loài An. maculatus dựa
vào số liệu giải trình tự đoạn ITS2
Sự sai khác về trình tự nucleotit của đoạn ITS2 giữa các loài thành viên của nhóm loài An. maculatus là khá
nhỏ d-ới 15%. Trình tự của các loài thu thập từ Việt Nam trùng khớp với trình tự của các loài này đ-ợc l-u giữ trên
Genebank. Tr-ờng hợp của An. sawadwongporni do Y.J. Ma (2002) thu thập tại Vân Nam Trung Quốc, trình tự
trùng khớp với An. maculatus, còn An. maculatus dạng K theo C.Walton và cộng sự (2006) thì có trình tự giống với
An. notanandai trong nghiên cứu của chúng tôi.
3.3. Thành phần loài và phân bố của các thành viên trong nhóm loài An. maculatus
ở Việt Nam nhóm loài An. maculatus có 14 thành viên, trong đó có 6 loài đã đ-ợc định tên là: An. maculatus
Theoblad, 1901; An. dravidicus Christophers, 1924; An. notanandai Rattanarithikul and Green, 1986; An.
pseudowillmori (Theobald, 1910), An. sawadwongporni Rattanarithikul and Green, 1986; và An. willmori (James,
1903). Tám thành viên ch-a đ-ợc định tên : An. maculatus dạng 3, An. maculatus dạng 4, An. maculatus dạng 5,
An. maculatus dạng 6, An. pseudowillmori dạng 2, An. sawadwongporni dạng 2, An. sawadwongporni dạng 3, An.
willmori dạng 2.
3.3.1. Bảng định loại các thành viên đã xác định tên trong nhóm loài An. maculatus: Dựa trên các số liệu phân
tích hình thái đã lập các bảng định loại bao gồm:
- Bảng định loại muỗi tr-ởng thành nhóm loài An. maculatus
- Bảng định loại quăng nhóm loài An. maculatus
- Bảng định loại bọ gậy nhóm loài An. maculatus
- Bảng định loại trứng của nhóm An. maculatus
3.3.2. Phân bố của các thành viên trong nhóm loài An. maculatus
Muỗi An. maculatus là loài phân bố rộng, tìm thấy ở tất cả các điểm điều tra. Muỗi An. sawadwongporni chiếm
-u thế ở miền rừng núi từ tỉnh Quảng Bình trở vào phía Nam. Muỗi An. willmori và An. pseudowillmori thì ng-ợc
lại. Muỗi An. notanandai và An. dravidicus chỉ mới thấy ở một vài địa điểm.
3.4. Vai trò truyền bệnh của các thành viên trong nhóm loài An. maculatus
Tại Khánh Phú, Khánh Vĩnh, Khánh Hoà, muỗi thử nghiệm nhiễm KST P.vivax chiếm tỷ lệ 0,57%. Tại Đắc Ơ,
Ph-ớc Long, Bình Ph-ớc An. maculatus nhiễm KST P.falciparum với tỷ lệ 0,58%. Nh- vậy tính chung cho cả hai
điểm, loài An. maculatus nhiễm KST với tỷ lệ là 0,58%, (0,29% P.falciparum và 0,29% P.vivax).

Ch-ơng 4: Bàn luận
4.1. Đa hình di truyền và mối quan hệ di truyền của các thành viên trong nhóm loài An. maculatus
sawadwongporni VNQBP12-16
maculatus NA126
maculatus QN80
dravidicus Vietnam
willmori Vietnam
pseudowillmori Vietnam
100
99
54
36
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
An.notanandai
D




- 11 -
4.1.1.Đa hình các dấu hiệu kiểu hình của các thành viên trong nhóm loài An. maculatus
- Đa hình các dấu hiệu hình thái.
- Đa hình hình thái muỗi tr-ởng thành: Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tính đa hình dấu hiệu hình thái
giai đoạn muỗi tr-ởng thành của các thành viên trong nhóm loài An. maculatus ở Việt Nam có nhiều điểm giống
với muỗi ở Thái Lan.

- Về hình thái cơ quan sinh dục đực của các thành viên trong nhóm loài An. maculatus: cơ quan sinh dục đực của
các thành viên trong nhóm loài An. maculatus rất đa hình và có những dấu hiệu gối nhau nh-ng vẫn đ-ợc di truyền
và có thể tách biệt giữa các loài với nhau dựa vào phân tích chi tiết các cấu tạo của nắp gai giao cấu (cấu tạo thuỳ
l-ng, thuỳ bụng), của gai giao cấu (hình dạng gai giao cấu, số l-ợng và cấu tạo lá phụ gai giao cấu), tấm hậu môn
v.v.
- Về hình thái giai đoạn nhộng: Dấu hiệu hình thái ở nhộng của các thành viên trong nhóm loài An. maculatus
cũng rất đa hình và biến đổi. Trong nghiên cứu của chúng tôi, có một điều khác rõ nét so với nghiên cứu của
Rattanarithikul và Harbach (1990) là: muỗi An. pseudowillmori (dạng 1 và dạng 2) của chúng tôi có gai bên đốt
bụng IV dài và nhọn giống nh- của An. greeni và An.dispar phân bố ở Philippine. Theo hai tác giả trên, An.
pseudowillmori phân bố ở đất liền Thái Lan có gai bên đốt bụng IV của nhộng ngắn và tù.
- Về hình thái giai đoạn bọ gậy: Theo nghiên cứu của chúng tôi, muỗi An. willmori (dạng 1 và 2) là loài muỗi có
lông lá cọ các đốt bụng phát triển nhất, nó phát triển từ đốt bụng II đến đốt bụng VII với các ngọn lá cọ rất rõ ràng.
Khác với Rattanarithikul và Green (1986) cho rằng loài An. pseudowillmori có lông lá cọ các đốt bụng phát triển
nhất.
- Về đa hình hình thái trứng của các thành viên nhóm loài An. maculatus: Kết quả t-ơng tự với kết quả của
Rattanarithikul và Green (1986) ở Thái Lan và thấy rằng có những biến đổi trong nội bộ loài nh-ng dấu hiệu kiểu
hình thái của khoang trứng là đặc điểm nổi bật nhất để nhận dạng các thành viên nhóm loài An. maculatus.
- Tổng kết đa hình các dấu hiệu hình thái liên quan đến phân loại các thành viên nhóm loài An. maculatus: Kết
quả của chúng tôi cũng ủng hộ ý kiến của các nghiên cứu của Rattanarithikul và Green (1986); Rattanarithikul và
Harbach (1990); Lục Bảo Lân (1997) rằng: tuy các dấu hiệu hình thái có đa hình và biến đổi, có nhiều dấu hiệu gối
nhau nh-ng vẫn có thể xác định đ-ợc đặc điểm của các loài riêng biệt của nhóm loài qua dấu hiệu của các giai
đoạn phát triển.
- Tính đa dạng các dấu hiệu sinh học, sinh thái học của các thành viên trong nhóm loài An. maculatus
- Đa dạng các kiểu ổ bọ gậy: Các kiểu ổ bọ gậy của các thành viên trong nhóm loài này đều có những đặc điểm
chung: nguồn n-ớc th-ờng trong, có ánh sáng, các ổ n-ớc ngầm, đứng nh-ng có l-u thông phù hợp cho tất cả các
loài giống nh- các nghiên cứu của Rattanarithikul v Lục Bảo Lân. Riêng An. notanandai và An. sawadwongporni
có mật độ cao ở các thuỷ vực n-ớc chảy.
- Đa dạng sinh học, sinh thái học giai đoạn muỗi tr-ởng thành: Muỗi thuộc nhóm An. maculatus là muỗi trú ẩn tiêu
máu ngoài nhà. Rất hiếm gặp muỗi trú ẩn tiêu máu trong nhà ban ngày. Điều này cũng phù hợp với những kết quả
nghiên cứu của Nguyễn Đức Mạnh (1988), Reid (1968), Lục Bảo Lân (1997), Toumanoff (1936), Lindsay và cs

(2004).
4.1.2. Đa hình di truyền các dấu hiệu kiểu gen của các thành viên trong nhóm loài An. maculatus ở Việt nam
- Đa hình các dấu hiệu di truyền tế bào ở các thành viên trong nhóm loài An. maculatus
Có thể dựa trên sự sai khác về cấu trúc phần nguyên nhiễm và dị nhiễm trên NST giới tính để phân biệt giữa
các loài. giữa các dạng An. maculatus với nhau, có sự khác biệt về tổ hợp NST giới tính X và Y. Sự khác biệt giữ các
kiểu tổ hợp này cho thấy có thể đây là những biến đổi trong loài, hoặc giữa các loài với nhau.
- Đa hình di truyền các dấu hiệu điện di enzym của các thành viên trong nhóm loài An. maculatus
Kết quả điện di 11 hệ izozym thấy hầu hết các locut gen của các thành viên trong nhóm loài An. maculatus
là đa hình, có giá trị để phân biệt các thành viên trong nhóm. Tuy nhiên, sự đa hình của enzym 6GPD là có giá trị
nhất trong việc phân loại các loài đồng hình.
- Phân tích đa hình dựa vào chỉ thị PCR-RFLP
M-ời enzym giới hạn đ-ợc sử dụng cắt đoạn ITS2 của các thành viên trong nhóm loài An. maculatus ở
Việt Nam, hai enzym EcoRI và BamHI không cắt. Các enzym Cfr131, MspI, AluI, HindI, HindIII, HeaII, HeaIII và
XbaI đều có khả năng cắt đoạn ITS2 và tạo ra các băng đa hình khác biệt giữa các thành viên trong nhóm loài ở các
mức độ khác nhau.
- Phân tích đa hình di truyền dựa vào chỉ thị RAPD-PCR
Sử dụng 7 mồi đơn ngẫu nhiên và có 5 mồi cho mức độ đa hình cao có thể phân biệt khá rõ ràng các loài đó
là các mồi A1, A5, F2, OPL1 và OPA10. Kết quả phù hợp với kết quả điện di izozym, tuy nhiên hệ số t-ơng đồng di
truyền không cách biệt rõ ràng nh- ở kết quả điện di izozym.
- Kiểm định phân biệt các loài trong nhóm bằng PCR đa mồi

- 12 -
Hệ thống mồi của Walton, các loài An. maculatus, An. sawadwongporni, An. dravidicus là chuẩn. Riêng
với mẫu An. notanandai của Việt Nam thì lại bắt mồi t-ơng ứng với vị trí của An. maculatus dạng K của Thái Lan.
Mẫu vật của An. willmori lúc thì bắt mồi của An. maculatus, lúc bắt mồi của An. sawadwongporni.
Với hệ thống mồi của Ma Ya Jun và cs (2002) các loài An. maculatus, An. willmori, An. dravidicus và An.
pseudowillmori đều bắt cặp đúng vị trí thiết kế, chỉ có An.sawadwongporrni không bắt cặp mồi.
- Phân tích đa hình di truyền bằng giải trình tự ADN
Tất cả các loài và dạng của nhóm loài An. maculatus đã đ-ợc giải trình tự đoạn ITS2. Đối chiếu với
Genebank thấy rằng những loài đã đ-ợc định tên thì đều trùng khớp với trình tự đã đ-ợc l-u giữ trừ tr-ờng hợp của

An. notanandai lại giống với An. maculatus dạng K ở Thái Lan. Riêng muỗi An. sawadwongporni thu thập tại Vân
Nam Trung Quốc thì trình tự không trùng khớp với trình tự của An. sawadwongporni ở Thái Lan và Việt Nam.
4.2. Thành phần loài và phân bố của các thành viên trong nhóm loài An. maculatus
Nghiên cứu của chúng tôi đã khẳng định sáu loài muỗi đã định tên ở Việt Nam là: An. maculatus, An.
notanandai, An. dravidicus, An. pseudowillmori, An. sawadwongporni và An. willmori. Tám dạng ch-a định tên
gồm: An. maculatus dạng 3, An. maculatus dạng 4, An. maculatus dạng 5, An. maculatus dạng 6, An.
pseudowillmori dạng 2, An. willmori dạng 2, An. sawadwongporni dạng 2, An. sawadwongporni dạng 3.
- Công bố đầy đủ nhất các bảng định loại cả bốn giai đoạn phát triển cho sáu thành viên đã định tên của
nhóm loài này.
- Lần đầu tiên, các thành viên đã đ-ợc định tên của nhóm loài An. maculatus đ-ợc lập bản đồ phân bố trên
toàn quốc.
4.3. Vai trò truyền bệnh của các thành viên trong nhóm loài An. maculatus: Kết quả thử nghiệm ELISA và
kiểm tra PCR khẳng định loài An. maculatus tại hai điểm Khánh Phú, Khánh Vĩnh, tỉnh Khánh Hoà và Đắc Ơ,
Ph-ớc Long, tỉnh Bình Ph-ớc nhiễm ký sinh trùng sốt rét P.vivax và P.falciparum với tỷ lệ 0,57 và 0,58%.

Kết luận và đề nghị
I. Kết luận
1. Tất cả các thành viên trong nhóm loài An. maculatus đều biểu hiện đa hình cao về các dấu hiệu hình thái, và đa
dạng các đặc điểm sinh học, sinh thái học. Tuy có những đặc điểm hình thái đa hình gối nhau nh-ng vẫn có thể sử
dụng các dấu hiệu này trong phân loại các thành viên trong nhóm loài. Đa hình di truyền tế bào của nhóm loài An.
maculatus đ-ợc thể hiện ở sự khác biệt về hình dạng và cấu trúc nhiễm sắc thể, đặc biệt là các nhiễm sắc thể giới
tính.
2. Các locut của các hệ izozym trong nghiên cứu này thể hiện tính đa hình cao, trong đó hệ enzym 6GPD có giá trị
nhất trong việc phân loại các thành viên trong nhóm loài. Số liệu điện di isozym của 6 loài đã định tên thể hiện
chúng là những loài đồng hình các dạng nằm trong mối quan hệ các quần thể địa lý - bán loài - phân loài. Riêng
An. maculatus dạng 3 có thể là một loài đồng hình độc lập trong nhóm.
3. RFLP-PCR cũng cho thấy tính đa hình di truyền cao của nhóm loài nh-ng ch-a có một enzym thử nghiệm nào
có thể phân biệt đ-ợc tất cả các thành viên trong nhóm, enzym có -u thế cao nhất là MspI. Tất cả 7 mồi đơn ngẫu
nhiên trong phản ứng RAPD-PCR đều cho băng nhân bản rõ nét và biểu hiện mức độ đa hình khác nhau, trong đó 5
mồi cho tính đa hình cao là A1, A5, F2, OPL1, OPA10 và hai mồi cho tính đa hình thấp là F4 và OPA4. Thử

nghiệm PCR đa mồi khẳng định sự tồn tại của các loài đã đ-ợc định tên ở Việt Nam. Số liệu giải trình tự ADN
khẳng định tính đa hình và vị trí phân loại của 6 thành viên đã xác định tên. Sự sai khác giữa các dạng không rõ nét
trừ An. maculatus dạng 3.
4. Muỗi An. maculatus ở Việt Nam là một nhóm loài đồng hình. Cho đến nay, nhóm loài này gồm 14 thành viên,
trong đó có 6 loài đã xác định tên là An. maculatus Theobald, 1901; An. dravidicus Christophers, 1924; An.
notanandai Rattanarithikul et Green, 1986, An. pseudowillmori (Theobald, 1910), An. sawadwongporni
Rattanarithikul et Green, 1986 và An. willmori (James, 1903). Tám thành viên khác ch-a xác định chính xác vị trí
phân loại là: An. maculatus dạng 3, An. maculatus dạng 4, An. maculatus dạng 5, An. maculatus dạng 6, An.
pseudowillmori dạng 2 và An. willmori dạng 2, An. sawadwongporni dạng 2 và An. sawadwongporni dạng 3.
5. Muỗi An. maculatus phân bố rộng rãi ở các vùng rừng núi toàn quốc. An. sawadwongporni chiếm -u thế ở vùng
rừng núi từ Quảng Bình vào phía Nam. An. pseudowillmori và An. willmori có mặt ở các tỉnh phía Bắc. An.
dravidicus và An. notanandai có mặt rải rác ở một số địa ph-ơng. Các loài muỗi thuộc nhóm An. maculatus -a đốt
máu súc vật, trú đậu tiêu máu ngoài nhà. Các kiểu ổ bọ gậy của các thành viên trong nhóm loài này đều có những




- 13 -
đặc điểm chung: nguồn n-ớc th-ờng trong, có ánh sáng; các ổ n-ớc ngầm đứng nh-ng có l-u thông là phù hợp cho
tất cả các loài. Riêng hai loài An. notanandai và An. sawadwongporni có thể sống ở các thuỷ vực n-ớc chảy.
6. Có ít nhất một loài trong nhóm loài (An. maculatus s.s.) có khả năng truyền hai loại ký sinh trùng sốt rét
P.falciparum và P.vivax với tỷ lệ nhiễm thoa trùng 0,58% (P.falciparum: 0,29%; P.vivax: 0,29%), khẳng định vai
trò vectơ thứ yếu của An. maculatus s.l.


II. Đề nghị
1. Tiếp tục giải trình tự ADN tập trung vào một số gen đích nh- ITS2 và các gen ty thể (COI, COII, D3), so
sánh để xác định chính xác vị trí phân loại của các thành viên nhóm loài An. maculatus, thiết lập hệ thống PCR
đa mồi để phân biệt các thành viên trong nhóm loài này.
2. Tiếp tục sử dụng các kỹ thuật ELISA, PCR để xác định vai trò truyền bệnh của các thành viên trong nhóm

loài, tập trung vào những trọng điểm sốt rét miền Trung, Tây Nguyên và Đông Nam Bộ.





Các công trình của tác giả
đã công bố liên quan đến luạn án

1. Nguyễn Thị H-ơng Bình, Nguyễn Đức Mạnh, Trần Đức Hinh (2005), Dấu hiệu hình thái xác định các thành
viên đã đ-ợc định tên thuộc nhóm loài An. maculatus ở Việt Nam, Hội nghị Côn trùng toàn quốc lần thứ 5, tr. 565-
570.
2. Nguyễn Thị H-ơng Bình, Nguyễn Đức Mạnh, Trần Đức Hinh, Lê Xuân Hợi (2005), Một vài dấu hiệu về đặc
điểm ổ bọ gậy của các thành viên trong nhóm loài An. maculatus ở Việt Nam, Hội nghị Côn trùng toàn quốc lần thứ
5, tr. 571- 577.
3. Nguyễn Thị H-ơng Bình, Nguyễn Đức Mạnh, Hồ Đình Trung, Trần Đức Hinh (2006), Đặc điểm cấu tạo cơ
quan sinh dục đực của các thành viên trong nhóm loài An. maculatus ở Việt Nam, Tạp chí phòng chống bệnh sốt rét
và các bệnh ký sinh trùng, (4), tr. 35-40.
4. Nguyễn Thị H-ơng Bình, Nguyễn Đức Mạnh, Hồ Đình Trung, Nguyễn Thị Hồng Ngọc, Trần Đức Hinh
(2006), Đặc điểm bộ nhiễm sắc thể nguyên phân của các thành viên trong nhóm loài An. maculatus ở Việt Nam,
Tạp chí phòng chống bệnh sốt rét và các bệnh ký sinh trùng, số 6, tr. 35-42.
5. Nguyễn Đức Mạnh, Nguyễn Thị H-ơng Bình, Trần Đức Hinh, Trịnh Đình Đạt (2005), Định loại các thành
viên trong nhóm loài Anopheles maculatus tại v-ờn Quốc Gia Phong Nha- Kẻ Bàng và Cát Tiên bằng PCR đa mồi,
Báo cáo khoa học hội nghị toàn quốc 2005 nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, tr. 1298- 1300.
6. Nguyễn Đức Mạnh, Trần Đức Hinh, Nguyễn Thị H-ơng Bình (2005), Định loại Anopheles minimus s.l. tại
V-ờn Quốc Gia Phong Nha Kẻ Bảng bằng các kỹ thuật sinh học phân tử, Báo cáo khoa học hội nghị toàn quốc
2005 nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, tr. 101-104
7. Nguyen Thi Huong Binh, Nguyen Duc Manh, Vu Viet Hung, Ho Dinh Trung, Le Khanh Thuan, Toshihiko
Sunahara, Masahiro Takagi (2006), Genetic diversity of Anopheles maculatus species group, secondary vectors in
Viet Nam, The 4

th
international seminar on emerging and re-emerging Infectious Disease, Ha Noi, Viet Nam 4-6
December 2006, pp. 36-37
8. Nguyen Thi Huong Binh, Nguyen Duc Manh, Ho Dinh Trung, Nguyen Hong Ngoc, Tran Duc Hinh, Trinh
Dinh Dat (2007), Random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis of Anopheles maculatus group
(Diptera/Culicidea) in Vietnam", International colloquium Malaria control in the Mekong Region: Challenges and
opportunities, Hanoi 3-5 December 2007.pp. 38.