Nghiên cứu và thử nghiệm hạt từ nano được chức năng hóa bề mặt trong chẩn đoán Virus Epstein Barr

Khoa Sinh häc Khãa 2009 2011
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN





PHẠM THỊ TRÀ



NGHIÊN CỨU VÀ THỬ NGHIỆM HẠT TỪ NANO
ĐƢỢC CHỨC NĂNG HÓA BỀ MẶT TRONG
CHẨN ĐOÁN VIRUS EPSTEIN BARR


Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60.42.30


LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC



NGƢỜI HƢỚNG DẪN
TS. Nguyễn Thị Vân Anh

Hà Nội – 2011


Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà
Khoa Sinh học Khóa 2009 - 2011

1
MC LC
M U 1
Chng 1: TNG QUAN TI LIU 6
1.1. TNG QUAN V EPSTEIN BARR VIRUS (EBV) 6
1.1.1. Gii thiu chung v EBV 6
1.1.2. Vai trũ gõy ung th vũm mi hng ca EBV 10
1.1.3. Quỏ trỡnh nhõn lờn, tng nhim v kh nng gõy ung th ca EBV 11
1.1.4. Cỏc phng phỏp phỏt hin EBV 12
1.2. NHNG KHI NIM C BN V HT NANO T V NG DNG 13
1.2.1. Ht nano t 13
1.2.2. Cỏc phng phỏp ch to ht nano t [3] 14
1.2.2.1. Phng phỏp nghin 15
1.2.2.2. Phng phỏp ng kt ta 15
1.2.2.3. Phng phỏp vi nh tng 16
1.2.3. ng dng ht nano t trong lnh vc y sinh 17
1.2.3.1. Phõn tỏch v chn lc t bo 18
1.2.3.2. Dn truyn thuc 20
1.2.3.3. Tng thõn nhit cc b 23
1.2.3.4. Tng tng phn cho nh cng hng t 23
1.3. VAI TRế CA VIC TINH SCH AXIT NUCLEIC 23
1.4. MT S PHNG PHP TINH SCH V LM GIU AXIT NUCLEIC
CA SINH VT 24
1.4.1. Nguyờn lý chung 24

1.4.2. Phng phỏp tinh sch axớt nucleic bng dung mụi hu c 25
1.4.3. Phng phỏp tinh sch axớt nucleic bng mng xp silica 27
1.4.4. Phng phỏp tinh sch axớt nucleic bng ht t nano bc silica 28
1.4.5. iu kin v c ch phõn t ADN hp th lờn b mt ht nano t bc silica . 29
1.5. TèNH HèNH NGHIấN CU V NG DNG HT NANO T BC SILICA
TINH SCH AXT NUCLEIC 32

Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà
Khoa Sinh học Khóa 2009 - 2011

2
Chng 2: NGUYấN LIU V PHNG PHP NGHIấN CU 34
2.1. NGUYấN LIU 34
2.1.1. Mu mỏu 34
2.1.2. Mi 34
2.1.3. Cỏc húa cht, nguyờn liu khỏc 35
2.1.4. Mỏy múc v thit b 36
2.2. PHNG PHP 36
2.2.1. Tỏch chit axit nucleic 36
2.2.1.1. Tỏch chit ADN bng MinElute Virus Spin Kit 36
2.2.1.2. Tỏch chit ADN bng kớt Dynabead Myone SILANE
đ
37
2.2.1.3 Tỏch chit ADN bng b kớt Virus Magnet Nano Kit 37
2.2.2. Nhõn bn on gen ớch c hiu bng k thut PCR 39
2.2.3. Nhõn dũng sn phm PCR vo vector pGEM-T easy 43
2.2.4. Tinh sch plasmid theo kớt ca Qiagen 44
2.2.5. Gii trỡnh trỡnh t gen ó c nhõn dũng 45
2.2.6. nh lng gen ớch bng k thut PCR ti thi im (Real-time PCR) 46
Chng 3: KT QU NGHIấN CU V THO LUN 48

3.1. NHN DếNG ON GEN EBNA-2 KCH THC 250 BP C HIU CHO EBV
48
3.1.1. Nhõn bn on gen c hiu ca EBV bng nested PCR vi hai ln phn
ng PCR c lp 48
3.1.2. Nhõn bn on gen c hiu ca EBV bng nested PCR vi mt ln PCR
v mt chu trỡnh nhit duy nht 49
3.1.3. Kt qu nhõn dũng on gen EBNA-2/250 53
3.2. KT QU NHN DếNG ON GEN M HểA PROTEIN MNG BNRF1
p143 KHễNG CHA NHểM GLYCOSYL KCH THC 74 bp (EBV- 74) 57
3.2.1. Nhõn bn on gen EBV-74 58
3.2.2. Kt qu nhõn dũng on gen EBV-74 59
3.3. KT QU TCH CHIT ADN EBV BNG B KT VIRUS MAGNET
NANO KIT 60

Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà
Khoa Sinh học Khóa 2009 - 2011

3
3.4. NH GI CHNH XC CA B KT VIRUS MAGNET NANO KIT
VI HAI B KT THNG MI BNG PCR 62
3.5. SO SNH KH NNG TCH CHIT ADN EBV CA VIRUS MAGNET
NANO KIT VI HAI B KT THNG MI BNG REAL-TIME PCR 64
KT LUN V HNG NGHIấN CU TIP THEO 67
TI LIU THAM KHO 69


BNG Kí HIU VIT TT

Amp Ampicillin
BL Burkits Lymphoma (U lympho xng hm trờn)

bp base pair (cp baz)
C
t
Cycle of Threshold (Chu k ngng)
EA Early Antigen (Khỏng nguyờn sm)
EBNA Epstein Barr Virus nuclear (Khỏng nguyờn nhõn EBV)
EBV Epstein Barr Virus
EDTA Ethylene Diamine Tetra acetic acid
ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
(Xột nghim min dch liờn kt Enzyme)
Gp Glycoprotein
GuSCN Guanidine thiocyanate
IPTG Isopropyl -D-Thiogalactopyranoside
kb kilobase
LB Luria Bertani

Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà
Khoa Sinh học Khóa 2009 - 2011

4
LMP Latent Membral Protein (Protein mng tim tng)
PCR Polymerase chain reaction (Phn ng chui trựng hp)
VCA Virus capsid antigen (Khỏng nguyờn v capsid)



M U
Cụng ngh nano ngy nay ang cú nhng bc tin rt quan trng, c bit l
vt liu nano ngy cng c ng dng rng rói mi lnh vc. Mt trong nhng
hng i quan trng ca cụng ngh nano l ng dng ca nú trong Y sinh bao

gm s dng vt liu nano vo cỏc nghiờn cu, cụng c dn thuc, liu phỏp iu tr,
chn oỏn v h tr iu tr bnh [6, 14, 29, 33] nhm mc ớch ci thin v nõng
cao sc khe ca con ngi. Trong s ú, cỏc ht nano t tớnh c chc nng húa
b mt ó v ang c nghiờn cu v ng dng rng rói trong nhng nm gn õy,
vớ d nh tỏch chit axớt nucleic (ADN, ARN), phõn tỏch t bo, vn chuyn thuc,
liu phỏp tr nhit t v nhiu ng dng khỏc na [3, 21, 26, 33].
Vic tinh sch axớt nucleic ca vi sinh vt trong cỏc mu bnh phm l mt
bc rt quan trng vỡ cỏc nghiờn cu, xột nghim sinh hc phõn t bng PCR,
Real-time PCR u cn n ngun axit nucleic tinh sch. Vỡ vy, rt nhiu phng
phỏp tỏch chit v tinh sch axớt nucleic ó c nghiờn cu, phỏt trin v ng dng
rng rói, trong ú phng phỏp do Renộ Boom v cng s phỏt minh vo nm 1990
l phng phỏp c s dng nhiu nht. Nguyờn lý ca phng phỏp ny da trờn
kh nng hỡnh thnh liờn kt bn vng ca ht silica vi axớt nucleic thụng qua cu
ni cation trong mụi trng cú nng mui cao [8, 9]. Mt ci tin mang tớnh t
phỏ ca phng phỏp Boom c nhiu cụng ty cụng ngh sinh hc hng u trờn
th gii nh Roche, Invitrogen, Promega, phỏt trin l s dng ht nano t tớnh bc

Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà
Khoa Sinh học Khóa 2009 - 2011

5
silica tinh sch axớt nucleic, giỳp nõng cao hiu qu tỏch chit v tit kim thi
gian thao tỏc. c bit, ci tin ny ó giỳp ch to c cỏc mỏy t ng tỏch chit
v tinh sch axớt nucleic [27, 39]. Tuy nhiờn, giỏ thnh ca cỏc b kớt tinh sch axớt
nucleic bng ht nano t bc silica rt cao. Do ú, vic nghiờn cu v phỏt trin b
kớt tỏch chit axit da trờn nguyờn lý ht t bc silica cú ý ngha khoa hc v ng
dng thc tin cao giỳp cho vic gim chi phớ trong khõu tỏch chit, ch ng cung
cp kớt tỏch chit axit nucleic khi cn.
Trong nghiờn cu ny, chỳng tụi ó x lý ht t nano c chc nng húa b
mt bng silica (Silica-coated magnetic nano-particles) hay cũn gi l ht Magsi

nano do nhúm nghiờn cu thuc Trung tõm Khoa hc Vt liu ca Trng i hc
Khoa hc T nhiờn ch to v b m thớch hp (k tha kt qu ca nhúm nghiờn
cu phũng Sinh hc nano v ng dng) th nghim kh nng tỏch chit axit
nucleic ca virus Epstein Barr trong cỏc bnh phm ca bnh nhõn ghi nhim EBV.
EBV l virus truyn nhim trờn ngi, lõy truyn qua ng n ung, tip xỳc.
EBV liờn quan n nhiu bnh lý nghiờm trng nh: ung th vũm hng, Burkitt
lymphoma, ung th lymphoma v cỏc trng thỏi bin i t bo lympho [1]. ADN
tỏch chit bi b kớt Virus Magnet Nano Kit bao gm ht Magsi nano v b m
thớch hp s c s dng trong phn ng PCR v Real-time PCR phỏt hin v
nh lng nng EBV trong mỏu hay cỏc mu bnh phm nghi nhim, h tr
trong cụng tỏc chn oỏn, iu tr, tiờn lng cỏc bnh liờn quan n EBV.
Xut phỏt t thc t trờn chỳng tụi tin hnh: Nghiờn cu v th nghim ht t
nano c chc nng húa b mt trong chn oỏn Virus Epstein Barr vi cỏc
mc tiờu sau:
1. Xõy dng phng phỏp phỏt hin nh tớnh v nh lng EBV bng PCR
v Real-time PCR.

Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà
Khoa Sinh học Khóa 2009 - 2011

6
2. Nghiờn cu th nghim kh nng tỏch chit ADN ca EBV trong mu mỏu
bng b kớt t ch to (Virus Magnet Nano Kit) gm ht t nano c chc nng
húa b mt (c th l ht t nano c bc silica hay cũn ký hiu MagSi nano) v
b m kốm theo (k tha kt qu ca nhúm nghiờn cu thuc phũng Sinh hc
Nano v ng dng th nghim trờn i tng HBV, HCV).
3. So sỏnh kh nng tỏch chit ADN EBV bng k thut PCR, Real-time PCR
vi ngun ADN khuụn tỏch bng ba b kớt: MinElute
đ
Virus Spin Kit ca hóng

Qiagen, Dynabead Myone Silane
đ
Kit ca hóng Invitrogen, Virus Magnet Nano
Kit trong cựng iu kin thớ nghim

Chng 1: TNG QUAN TI LIU
1.1. TNG QUAN V EPSTEIN BARR VIRUS (EBV)
1.1.1. Gii thiu chung v EBV








Hỡnh 1.1: Hỡnh nh Epstein Barr Virus di kớnh hin vi in t [47]



Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà
Khoa Sinh học Khóa 2009 - 2011

7
Nm 1958, Burkitt phỏt hin ra khi u lympho xng hm trờn tr em Chõu
Phi, t ú bnh ny c mang tờn ụng: Burkitts Lymphoma (BL). Vo nm 1964
nhúm tỏc gi Epstein, Barr v Pulvertaft phõn lp c loi virus dũng
lymphoblastes trong khi u LB (Lymphos Burkitt) bng kớnh hin vi in t [15].
T ú virus ny c mang tờn l Epstein Barr Virus. Nm 1975, tỏc gi Nadol v
cs phõn lp c cỏc ht (virion) ca EBV trong t bo biu mụ ung th vũm bng

kớnh hin vi in t. õy l ln u ngi ta quan sỏt c cỏc th virus thuc h
Herpesviridae trong t bo ung th ngi, do ú EBV b nghi ng l nguyờn nhõn
gõy ung th ngi [1].

EBV thuc h virus Herpesviridae, cú h gen thuc loi ADN si ụi xon
kộp mch h, kớch thc h gen khong 184 kb nu tớnh c phn lp li hai u.
H gen EBV cú 6 t hp gen mó húa cho cỏc loi protein khỏng nguyờn nhõn
(Epstein Barr Virus nuclear antigen), c ký hiu l: EBNA-1, EBNA-2,
EBNA-3A, EBNA-3B, EBNA-3C, EBNA-LB v 3 gen mó húa cho protein mng
tim tng (latent membral protein), c ký hiu l: LMP-1, LMP-2A, LMP-2B
[13]. Vai trũ ca sỏu protein EBNA cú liờn quan n quỏ trỡnh nhõn lờn ca EBV
trong t bo lympho B giai on u xõm nhim cũn 3 loi protein LMP cú liờn
quan n chu k nhõn lờn ca EBV trong t bo lympho B.

Gen mó húa cho protein EBNA-2 l mt phõn on c bn trong gen EBNA
ca h gen EBV. EBNA -2 cú vai trũ bit húa t bo lympho B thnh t bo mm
non húa EBV thc hin quỏ trỡnh gõy ung th. Hn na gen EBNA-2 l gen
c sao chộp sm nht do vai trũ ca nú trong quỏ trỡnh iu tit s nhõn lờn ca t
bo b nhim. EBNA-2 iu hũa quỏ trỡnh sao chộp gen v tng hp protein ca c
virus v t bo b nhim EBV, protein EBNA-2 c coi l yu t quan trng trong
cm ng tng sinh dũng t bo lympho B [25].


Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà
Khoa Sinh học Khóa 2009 - 2011

8
Ton b h gen EBV c cha trong mt v capsid. V capsid ny cú hỡnh
thỏi i xng hỡnh khi, ú l cu trỳc protein úng kớn bo v nhõn ADN ca virus
v mang tớnh khỏng nguyờn c hiu ca EBV (khỏng nguyờn VCA), c xỏc nh

bi 20 mt bờn, 12 nh v 3 trc ng dng i xng. V capsid li c bao bc
bi mt v bao ngoi khỏc gi l v ngoi (envelope) cu trỳc t thnh phn ch
yu l glycoprotein. V bao ngoi ny cng c mó húa bi gen virus v cng
mang du n min dch (hỡnh 1.2).








Hỡnh 1.2: Cu trỳc ca EBV [43]
Gia v capsid v v ngoi l khong cha ng cỏc protein m cu trỳc
v cỏc enzyme ca virus (Tegument). V ngoi ca EBV cú s nhy cm vi cỏc
tỏc ng ca axit, ether, cỏc dung dch hũa tan sỏt khun v ụng khụ [13].

EBV l loi virus truyn nhim gõy bnh trờn ngi v lõy truyn qua
ng tiờu húa, tip xỳc. Do ú, virus ny thng c phỏt hin thy trong cht
thi t bo v cht tit phn trờn ca h tiờu húa v hụ hp nh nc bt, niờm
dch vựng hng. EBV cú c tớnh hng bch huyt hp ph lờn t bo lympho B
thụng qua tng tỏc ca glycoprotein gp350/220 cú trờn b mt virus vi th th
CR2/CR21 ca b th CD3 trờn t bo lympho B ca ngi (hỡnh 1.3).



Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà
Khoa Sinh học Khóa 2009 - 2011

9

Hỡnh 1.3: S hp ph ca EBV lờn t bo lympho B qua th th CR21 [46]

EBV trng thỏi tim tan, nhiu bn sao ADN ca EBV c tỡm thy trong
t bo cht ca nhng t bo lympho B b nhim nhng ch cú vi gen c sao
chộp. EBV cú th gõy nhim dng tim tan v tn ti lõu di trong c th m
khụng gõy bnh. Nhng trong nhng c th cú th trng h min dch suy yu thỡ
EBV cú th l nguyờn nhõn gõy bnh tng bch cu n nhõn nhim khun
(IM-infectious mononucleosis), liờn quan n c ch tin trin ca mt s loi ung
th nh tng lympho B, UTVMH, Burkitt lymphoma. c trng ca cỏc khi u
trong cỏc bnh ung th ny l trong cỏc t bo ca khi u cú cha mt lng ln
cỏc bn sao h gen EBV v xut hin s biu hin nhiu protein cú vai trũ chuyn
húa khi u t lnh tớnh thnh khi u ỏc tớnh [25].
V mt sinh bnh hc, s nhim virus xy ra u tiờn vựng ming, hu ri
lan vo mỏu, ti õy t bo lympho B b nhim. S ỏp ng min dch u tiờn
trong nhim EBV l c th sinh khỏng th IgM chng li khỏng nguyờn VCA ca
EBV, ỏp ng khỏng th IgM ch xut hin trong vi tun u sau khi nhim, tip
theo l khỏng th IgG v khỏng th IgG ny tn ti sui i ngi nhim [19]. EBV
thng gõy ra nhim trựng cp vựng ming hng, cú th hoc khụng biu hin
triu chng gỡ. Sau quỏ trỡnh nhim ú EBV tn ti tim tng trong cỏc t bo biu

Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà
Khoa Sinh học Khóa 2009 - 2011

10
mụ hoc lympho B. Tựy theo hon cnh hoc tỡnh trng bnh lý c bit nhng
ngi b suy gim min dch vớ d do HIV/ AIDS, b suy dinh dng, hay ngi
ph n nhim m mang thai thỡ EBV tỏi hot húa tr li.

EBV gõy ra ba loi bnh ch yu, khỏc nhau tựy theo c im dõn tc, a lý,
iu kin kinh t xó hi c th nh: vựng Chõu Phi l bnh lymphos Burkitt;
Chõu õu, M, c l bnh tng bch cu n nhõn; cũn vựng ụng Nam chớnh
l bnh NPC (Naso-pharyngeal carcinoma tc l ung th vũm hng). Hin nay cú 2
type EBV c xỏc nh l gõy nhim ngi l EBV type 1 v EBV type 2 [1].

1.1.2. Vai trũ gõy ung th vũm mi hng ca EBV

Biu mụ vựng vũm mi hng l v trớ ch yu cho EBV tỡm kim t bo thớch
ng thc hin s nhõn lờn to ra nhiu th virus hon chnh mi. Ung th vũm mi
hng l mt khi u ỏc tớnh xut phỏt t lp biu mụ ph ca vũm mi hng [38].
Vựng mi hng cũn cú h thng dn lu bch huyt rt phong phỳ, nờn trong ung
th vũm mi hng cỏc hch vựng c thng b di cn rt sm. Ung th vũm mi
hng c xp vo cỏc khi u ng tiờu húa v hụ hp trờn. õy l mt trong nm
loi ung th ph bin nht ca ngi Vit Nam v l loi hay gp nht trong cỏc
ung th vựng tai mi hng. Trờn th gii, ung th vũm mi hng cng hay gp
cỏc nc ụng Nam v phớa nam Trung Quc. V mt lõm sng ung th vũm
mi hng cú triu chng khỏ phong phỳ, d b chn oỏn nhm vi cỏc bnh thụng
thng khỏc trong tai mi hng. Do vy, cỏc bnh nhõn thng n khỏm v c
chn oỏn cỏc giai on mun ca bnh, iu ny lm nh hng n kt qu iu
tr bnh [24].

Ngi ta a ra rt nhiu gi thit v nguyờn nhõn ca bnh ung th vũm hng.
Cỏc gi thit ny c tp trung thnh ba nhúm ch yu ú l: do EBV, do di truyn,

Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà
Khoa Sinh học Khóa 2009 - 2011

11
do cỏc yu t mụi trng, tp quỏn n ung, li sng, húa cht [34]. ó cú rt nhiu
cụng trỡnh nghiờn cu v mi liờn quan gia EBV v bnh ung th vũm mi hng, cỏc
nghiờn cu ny cho thy s biu l cỏc khỏng nguyờn virus trong cỏc giai on ca
bnh v vai trũ ca EBV trong phỏt sinh bnh [11, 17, 22, 23].

1.1.3. Quỏ trỡnh nhõn lờn, tng nhim v kh nng gõy ung th ca EBV















EBV sau khi nhim vo c th cú cỏc hng tin trin c minh ha hỡnh
1.4 gm hai trng hp:

1. EBV xõm nhp trc tip vo t bo biu mụ v nhõn lờn ((1))









T bo biu mụ
Virus nhõn lờn
T bo lympho B
hng ming
Nhim khi phỏt
EBV nhõn lờn
trong t bo B
Chuyn dng t
bo B
Ly gii t bo
Nhim
tim tng
T bo B
tim tng
EBV c bi tit qua
nc bt
TNG
NHIM,
TIN
TRIN

UNG
TH
7
T bo
biu mụ
T bo B
khỏc
Nhõn lờn
2
1
4
5
3
6


8


Hỡnh 1.4: S minh ha quỏ trỡnh tin trin ca Epstein Barr Virus
trong c th ngi b nhim [45]


Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà
Khoa Sinh học Khóa 2009 - 2011

12
2. Gõy nhim trc tip vo t bo lympho B, cú tim nng cm ng bin i t
bo nhim tin trin gõy ung th ((2) (3) (4) (5) (6) (7) (8))
- i vi trng hp th nht, EBV tỡm thy s thớch ng trong t bo biu

mụ v s nhõn lờn ca EBV thuc loi hỡnh gõy nhim sinh tan. Cỏc th EBV hon
chnh cú th nhõn lờn trong t bo biu mụ hoc chuyn t s nhim sang gõy
nhim th cp vo t bo lympho B.
- Trng hp th hai, EBV nhim khi phỏt vo t bo lympho B cú trong
vựng hng, thc hin s xõm nhp v nhõn lờn trong t bo lympho B v gõy
chuyn dng t bo ny. Nhng virus trong cỏc t bo lympho ny tip tc tin trin
theo hng: i) EBV nhõn lờn hng lot v ly gii (sinh tan) t bo B, cỏc th virus
hon chnh cú th i theo cỏc con ng bi tit qua nc bt, xõm nhim vo t
bo B khỏc hay xõm nhim vo cỏc t bo biu mụ ((6), (7), (8)); ii) EBV tn ti
dng tim tan trong cỏc t bo B v gõy ra ỏp ng min dch qua trung gian t bo.
trng thỏi tim tan cú th EBV thc hin s bin i t bo lympho B, non húa
cỏc t bo ny v bit húa chỳng tng sinh v tin trin chỳng thnh ung th vũm
hng. Tuy nhiờn, quỏ trỡnh ung th do EBV cũn chu nhiu tỏc ng ca cỏc yu t
h tr v thc cht ra thỡ ngy nay cũn cha rừ.
1.1.4. Cỏc phng phỏp phỏt hin EBV
Hin nay cú hai phng phỏp phỏt hin nhim EBV c s dng trong cỏc
phũng xột nghim cỏc bnh vin.
Phng phỏp min dch hc: ELISA phỏt hin khỏng th khỏng EA (early
antigen - khỏng nguyờn sm). Tuy nhiờn khỏng th ny ch xut hin trong khong
vi tun sau khi nhim EBV do ú khú cú th bit c s biu hin ca EBV trong
c th ngi nhim khi ó qua giai on u sau khi nhim vi tun. Khỏng th
khỏng li VCA (khỏng nguyờn v capsid) gm cú hai loi l IgG v IgM. Tng t
nh khỏng th khỏng EA, khỏng th IgM cng ch xut hin vi tun sau khi nhim

Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà
Khoa Sinh học Khóa 2009 - 2011

13
nờn xột nghim ELISA i vi hai loi khỏng th khỏng EA v khỏng th IgM ch
cú giỏ tr khi phỏt hin nhim EBV cp giai on u khi nhim. Khỏng th IgG

ti ti trong c th ngi bnh sut i sau khi nhim nờn kt qu chn oỏn thng
khụng cú ý ngha do t l dng tớnh rt cao khụng phõn bit c ngi ó tng b
nhim trong quỏ kh ó khi bnh v ngi ang b nhim EBV [19]. Cỏc phng
phỏp min dch thng khụng em li hiu qu nhiu trong chn oỏn v h tr
iu tr cỏc bnh liờn quan n EBV.
Phng phỏp phỏt hin EBV bng PCR/ Real-time PCR vi chớnh xỏc, c
hiu v nhy cao cho phộp phỏt hin nh tớnh, nh lng s lng EBV trong
mỏu, cỏc mụ bnh phm ca ngi nhim h tr cho chn oỏn, iu tr, tiờn lng
cỏc bnh do tỏc nhõn EBV gõy ra [4, 26]. Trong khuụn kh ti cp nh nc v
nghiờn cu c im cu trỳc phõn t virus Epstein Barr Vit Nam v qui trỡnh
sn xut b sinh phm chn oỏn (KC.10.31/06-10) do TS. Nguyn ỡnh Phỳc
(Trng i hc Y H ni) ch trỡ ó bc u thnh cụng trong vic ch to b kớt
sinh hc phõn t chn oỏn EBV bng PCR nhõn bn c hiu on gen EBNA-1
cú kớch thc khong 0.8 kb. Tỏc gi Van Baarle Debbie v cs s dng nested PCR
nhõn bn c hiu on gen ENBA-2 kớch thc 250 bp nghiờn cu t l
nhim EBV trờn cỏc i tng b hi chng suy gim min dch HIV/AIDS [32].

1.2. NHNG KHI NIM C BN V HT NANO T V NG DNG
1.2.1. Ht nano t






Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà
Khoa Sinh học Khóa 2009 - 2011

14
Hỡnh 1.5: Hỡnh nh TEM ca ht nano t Fe

3
O
4

Ht nano t l vt liu nano khụng chiu tc l c ba chiu ca nú u cú kớch
thc nano (<100 nm). Ht nano t c dựng trong y sinh cn phi tha món ba
iu kin sau:
- Tớnh ng nht ca cỏc ht cao
- T bóo hũa ln
- Vt liu cú tớnh tng hp sinh hc cao (khụng cú c tớnh)
Tớnh ng nht v kớch thc liờn quan nhiu n phng phỏp ch to cũn t
bóo hũa v tớnh tng hp sinh hc liờn quan n bn cht ca vt liu. Trong t
nhiờn, st l vt liu cú t bóo hũa ln nht ti nhit phũng. Ngoi ra st cũn
l nguyờn t khụng c, rt quan trng i vi c th v cú tớnh n nh trong mụi
trng khụng khớ nờn cỏc vt liu nh oxit st t c nghiờn cu rt nhiu lm
ht nano t ng dng trong y sinh hc.
Ht nano t dựng trong y sinh hc thng dng dung dch nờn cũn gi l
cht lng t. Mt dung dch gm ba thnh phn: lừi l ht Fe
3
O
4
cú kớch thc nano,
cht chc nng húa b mt (cht hot húa b mt) v dung mụi. Trong ú: i) lừi
Fe
3
O
4
cú kớch thc nano l thnh phn duy nht quyt nh n tớnh cht t ca
dung dch t; ii) cht hot húa b mt cú tỏc dng lm cho ht nano t phõn tỏn
trong dung mụi, trỏnh kt t vi nhau, ngoi ra nú cũn cú tỏc dng che ch ht

nano khi s phỏt hin ca h thng min dch ca c th v to cỏc mi liờn kt
húa hc vi cỏc phõn t khỏc trong iu kin phự hp. Dung mụi l cht lng mang
ton b h.
1.2.2. Cỏc phng phỏp ch to ht nano t [3]
Cỏc ht nano t tớnh cú th c ch to theo cỏc phng phỏp thụng dng
di õy.

Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà
Khoa Sinh học Khóa 2009 - 2011

15
1.2.2.1. Phng phỏp nghin
Phng phỏp nghin c phỏt trin t rt sm ch to cht lng t dựng
cho cỏc ng dng vt lý nh truyn ng t mụi trng khụng khớ vo bung chõn
khụng, lm cht dn nhit trong cỏc loa cụng sut cao. Trong nhng nghiờn cu u
tiờn v cht lng t, vt liu t tớnh oxit st Fe
3
O
4
, c nghin cựng vi cht hot
húa b mt (acid Oleic) v dung mụi (du, hexane). Cht hot húa b mt giỳp cho
quỏ trỡnh nghin c d dng v ng thi trỏnh cỏc ht kt t vi nhau. Sau khi
nghin, sn phm phi tri qua mt quỏ trỡnh phõn tỏch ht rt phc tp cú c
cỏc ht tng i ng nht. Phng phỏp nghin cú u im l n gin v ch to
c vt liu vi khi lng ln. Vic thay i cht hot húa b mt v dung mụi
khụng nh hng nhiu n quỏ trỡnh ch to. Nhc im ca phng phỏp ny l
tớnh ng nht ca cỏc ht nano khụng cao vỡ khú cú th khng ch quỏ trỡnh hỡnh
thnh ht nano. Cht lng t ch to bng phng phỏp ny thng c dựng cho
cỏc ng dng vt lý.
1.2.2.2. Phng phỏp ng kt ta

Phng phỏp ng kt ta l mt trong nhng phng phỏp thng c dựng
to cỏc ht oxớt st. Cú hai cỏch to oxớt st bng phng phỏp ny ú l
hydroxide st b oxy húa mt phn bng mt cht oxy húa no ú v gi húa hn
hp dung dch cú t phn hp thc Fe
+2
v Fe
+3
trong dung mụi nc. Cỏch th nht
cú th thu c ht nano cú kớch thc t 30 nm 100 nm. Cỏch th hai cú th to
ht nano cú kớch thc t 2 nm 15 nm [3]. Bng cỏch thay i pH v nng ion
trong dung dch m ngi ta cú th cú c kớch thc ht nh mong mun ng
thi lm thay i in tớch b mt ca cỏc ht ó c hỡnh thnh.

Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà
Khoa Sinh học Khóa 2009 - 2011

16
1.2.2.3. Phng phỏp vi nh tng

Hỡnh 1.6: H nh tng nc trong du v du trong nc.
Vi nh tng (microemulsion) cng l mt phng phỏp c dựng khỏ ph
bin to ht nano. Vi nh tng nc-trong-du, cỏc git dung dch nc b
by bi cỏc phõn t cht hot húa b mt (CHHBM) trong du (cỏc mixen) (hỡnh
1.6). õy l mt dung dch trng thỏi cõn bng nhit ng trong sut, ng hng.
Do s gii hn v khụng gian ca cỏc phõn t CHHBM, s hỡnh thnh, phỏt trin
cỏc ht nano b hn ch v to nờn cỏc ht nano rt ng nht. Kớch thc ht cú th
t 4-12 nm vi sai khỏc khong 0.2-0.3 nm.
Phng phỏp vi nh tng cng l mt phng phỏp ch to ht nano ó c
th gii ng dng t lõu do kh nng iu khin kớch thc ht d dng ca nú. C
ch c th ca phn ng xy ra trong h vi nh tng nh sau (hỡnh 1.7): Phn ng

húa hc to cỏc cht mong mun s xy ra khi ta hũa trn cỏc h vi nh tng ny
li vi nhau. Cú 2 cỏch cỏc phõn t cht phn ng gp nhau:
Cỏch th nht: Cỏc phõn t cht phn ng thm qua lp mng cht hot húa b
mt ra ngoi v gp nhau. Nhng thc t thỡ t l sn phm to thnh theo cỏch ny
l rt nh, khụng ỏng k.
Cỏch th hai: Khi cỏc ht vi nh tng ca cỏc cht phn ng gp nhau, nu

Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà
Khoa Sinh học Khóa 2009 - 2011

17
cú lc tỏc ng thỡ 2 ht nh (A, B) cú th to thnh mt ht ln hn (C). Cỏc
cht phn ng trong 2 ht nh s hũa trn, phn ng xy ra trong lũng ht ln v sn
phm mong mun c to thnh ( õy l cỏc ht nano t Fe
3
O
4
). Cỏc ht nano t
Fe
3
O
4
sau khi to thnh s b cht hot húa b mt bao ph v ngn cn khụng cho
phỏt trin thờm v kớch thc.


Hỡnh 1.7: C ch hot ng ca phng phỏp vi nh tng.

Cng bng phng phỏp ny, ngi ta cú th ch to ht oxớt st bao ph bi
mt lp vng trỏnh oxy húa v tng tớnh tng hp sinh hc.

Ngoi cỏc phng phỏp thụng dng trờn cũn cú cỏc phng phỏp khỏc ch to
ht nano t nh: phng phỏp phõn li cỏc tin cht hu c nhit cao, phng
sinh hc, húa siờu õm, in húa
1.2.3. ng dng ht nano t trong lnh vc y sinh

Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà
Khoa Sinh học Khóa 2009 - 2011

18
Cỏc ng dng ca ht nano t c chia lm hai loi: ng dng ngoi c th
v trong c th. Chỳng tụi ch trỡnh by mt s ng dng tiờu biu trong rt nhiu
ng dng ó v ang c nghiờn cu. Phõn tỏch v chn lc t bo l ng dng
ngoi c th nhm tỏch nhng t bo cn nghiờn cu ra khi cỏc t bo khỏc. Tỏch
v lm giu axit nucleic ca cỏc tỏc nhõn gõy bnh nh vi khun, virus trong cỏc
mu bnh phm. Cỏc ng dng ht nano t trong c th gm: dn thuc, nung núng
cc b v tng tng phn trong nh cng hng t [28].
1.2.3.1. Phõn tỏch v chn lc t bo
Trong y sinh hc, ngi ta thng xuyờn phi tỏch mt loi thc th sinh hc
no ú ra khi mụi trng ca chỳng lm tng nng khi phõn tớch hoc cho
cỏc mc ớch nghiờn cu khỏc. Phõn tỏch t bo s dng cỏc ht nano t tớnh l mt
trong nhng phng phỏp thng c s dng. Quỏ trỡnh phõn tỏch ny c chia
lm hai giai on:
i) ỏnh du thc th sinh hc cn nghiờn cu
ii) Tỏch cỏc thc th c ỏnh du ra khi mụi trng bng t trng.
Vic ỏnh du c thc hin thụng qua cỏc ht nano t tớnh. Ht nano
thng dựng l ht oxit st. Cỏc ht ny c chc nng b mt húa bng cỏch bao
ph bi mt loi húa cht cú tớnh tng hp sinh hc nh l dextran, polyvinyl
alcohol (PVA), silica (SiO
2
). Húa cht bao ph khụng nhng cú th to liờn kt vi

mt v trớ no ú trờn b mt t bo hoc phõn t m cũn giỳp cho cỏc ht nano
phõn tỏn tt trong dung mụi, tng tớnh n nh ca cht lng t. Ging nh trong h
min dch, v trớ liờn kt c bit trờn b mt t bo s c cỏc khỏng th hoc cỏc
phõn t khỏc nh cỏc hormone, axớt folic tỡm thy. Cỏc khỏng th s liờn kt vi cỏc
khỏng nguyờn. õy l cỏch rt hiu qu v chớnh xỏc ỏnh du t bo. Cỏc ht t
tớnh c bao ph bi cỏc cht hot húa tng t cỏc phõn t trong h min dch
nờn cú th to ra cỏc liờn kt vi cỏc t bo hng cu, t bo ung th phi, vi khun,

Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà
Khoa Sinh học Khóa 2009 - 2011

19
t bo ung th ng tit niu v th golgi [28]. i vi cỏc t bo ln, kớch thc
ca cỏc ht t tớnh ụi lỳc cng cn phi ln, cú th t kớch thc vi trm nano
một. Quỏ trỡnh phõn tỏch c thc hin nh mt gradient t trng ngoi. T
trng ngoi to mt lc hỳt cỏc ht t tớnh cú mang cỏc t bo c ỏnh du. Cỏc
t bo khụng c ỏnh du s khụng c gi li v thoỏt ra ngoi.

Hỡnh 1.8: Nguyờn tc chn lc v phõn tỏch t bo bng t trng
(a) Nam chõm c t bờn ngoi hỳt cỏc t bo ó c ỏnh du v loi
b cỏc t bo khụng c ỏnh du; (b) Nam chõm cú th t vo mt dũng chy cú
cha t bo cn tỏch
Tỏch t bo bng t trng ó c ng dng thnh cụng trong Y-Sinh hc.
õy l mt trong nhng phng phỏp rt nhy cú th tỏch t bo ung th t mỏu,
c bit l khi nng t bo ung th rt thp, khú cú th tỡm thy bng cỏc phng
phỏp khỏc. Ngi ta cú th phỏt hin kớ sinh trựng st rột trong mỏu bng cỏch o t

Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà
Khoa Sinh học Khóa 2009 - 2011

20
tớnh ca kớ sinh trựng ỏnh du t hoc ỏnh du cỏc t bo hng cu bng cht lng
t tớnh.
Vi nguyờn tc tng t nh phõn tỏch t bo, ht nano t tớnh cũn c
dựng phõn tỏch axit nucleic. Cú hai loi phõn tỏch axit nucleic l phõn tỏch c
hiu v khụng c hiu. Phõn tỏch khụng c hiu nhm tỏch axit nuclecic ra khi
mt hn hp cỏc thnh phn khụng cn thit. Phõn tỏch c hiu l phõn tỏch mt
loi axit nucleic quan tõm ra khi hn hp cỏc nucleic khỏc. i vi phõn tỏch
khụng c hiu, ngi ta thng dựng ht nano t tớnh cú bc silica (ht MagSi
nano) hoc mt s nhúm chc cú kh nng liờn kt vi cỏc ADN. Sau khi gn kt
thỡ ADN c tỏch ra bng t trng ngoi. Vi phõn tỏch c hiu, ht nano c
gn vi ADN dũ, thụng qua lai húa ADN dũ v ADN ớch m dựng t trng
phõn tỏch. Nguyờn tc ny s c trỡnh by chi tit phn ng dng ht nano t
bc silica trong tỏch chit axit nucleic.
1.2.3.2. Dn truyn thuc

Hỡnh 1.9: Mụ hỡnh ht nano t vn chuyn thuc [37]


Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà
Khoa Sinh học Khóa 2009 - 2011

21
Ht nano t tớnh ging nh mt con tu vn chuyn hng húa. Nú bao gm lừi
l oxit st; tip theo lừi c bao bc bi lp lipid; ngoi cựng cỏc phõn t thuc
nm xen k gia cỏc phõn t axớt oxalic
Mt trong nhng nhc im quan trng nht ca húa tr liu ú l tớnh khụng
c hiu. Khi vo trong c th, thuc cha bnh s phõn b khụng tp trung nờn cỏc
t bo mnh khe b nh hng do tỏc dng ph ca thuc. Chớnh vỡ th vic dựng
cỏc ht nano t tớnh nh l ht mang thuc n v trớ cn thit trờn c th (thụng

thng dựng iu tr cỏc khi u ung th). Nhng ng dng ny c gi l dn
truyn thuc bng ht nano t tớnh. Cú hai li ớch c bn l: (i) thu hp phm vi
phõn b ca cỏc thuc trong c th nờn lm gim tỏc dng ph ca thuc; (ii) gim
lng thuc iu tr.
Ht nano t tớnh cú tớnh tng hp sinh hc c gn kt vi thuc iu tr.
Lỳc ny ht nano cú tỏc dng nh mt ht mang. Thụng thng phc h ht
nano-thuc to ra mt cht lng t v i vo c th thụng qua h tun hon. Khi cỏc
ht i vo mch mỏu, ngi ta dựng mt gradient t trng ngoi rt mnh tp
trung cỏc ht vo mt v trớ nht nh trờn c th. Mt khi phc h ht nano-thuc
c tp trung ti v trớ cn thit thỡ quỏ trỡnh nh thuc cú th din ra thụng qua c
ch hot ng ca cỏc enzyme hoc cỏc tớnh cht sinh lý hc do cỏc t bo ung th
gõy ra nh pH, quỏ trỡnh khuych tỏn hoc s thay i ca nhit .
Quỏ trỡnh vt lý din ra trong vic dn truyn thuc cng tng t nh trong
phõn tỏch t bo. Gradient t trng s giỳp tp trung phc h ht nano-thuc. Hiu
qu ca vic dn truyn thuc ph thuc vo cng t trng, gradient t trng,
th tớch v tớnh cht t ca ht nano. Cỏc cht mang (cht lng t) thng i vo
cỏc tnh mnh hoc ng mch nờn cỏc thụng s thy lc nh thụng lng mỏu,
nng cht lng t, thi gian tun hon úng vai trũ quan trng nh cỏc thng s
sinh lý hc nh khong cỏch t v trớ ca thuc n ngun t trng, mc liờn

Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà
Khoa Sinh học Khóa 2009 - 2011

22
kt gia ht nano vi cỏc phõn t thuc v th tớch ca khi u. Cỏc ht cú kớch
thc micromet hot ng hiu qu hn trong h thng tun hon c bit l cỏc
mch mỏu ln v cỏc ng mch. Quỏ trỡnh dn thuc bng ht nano t tớnh cú hiu
qu nhng vựng mỏu chy chm v gn ngun t trng.
Cỏc ht nano t tớnh thng dựng l ụxớt st bao ph xung quanh bi mt hp
cht cao phõn t cú tớnh tng hp sinh hc nh PVA, dextran hoc silica. Cht bao

ph cú tỏc dng chc nng húa b mt cú th liờn kt vi cỏc phõn t khỏc nh
nhúm chc carboxyl, biotin, amin. Nghiờn cu dn truyn thuc ó t c nhng
thnh cụng nht nh trờn ng vt, c bit nht l dựng iu tr u nóo. Vic dn
truyn thuc n cỏc u nóo rt khú khn vỡ thuc cn phi vt qua hng ro bng
cỏch gia nóo v mỏu, nh cú tr giỳp ca ht nano t cú kớch thc 10-20 nm, vic
dn truyn thuc cú hiu qu hn rt nhiu.


Hỡnh 1.10: H thng vn chuyn thuc t tớnh
nam chõm
mụ
mch mỏu
mụ
ht nano t

Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà
Khoa Sinh học Khóa 2009 - 2011

23
Nam chõm c t bờn ngoi c th vi mc ớch to ra gradient t trng
giỳp cho con tu ht nano t vn chuyn thuc di chuyn v ớch theo dũng mỏu
1.2.3.3. Tng thõn nhit cc b
Phng phỏp tng thõn nhit cc b cỏc t bo ung th m khụng nh hng
n cỏc t bo bỡnh thng l mt trong nhng ng dng quan trng khỏc ca ht
nano t tớnh. Nguyờn tc hot ng l cỏc ht nano t tớnh cú kớch thc t 20-100
nm c phõn tỏn trong cỏc mụ mong mun sau ú tỏc dng mt t trng xoay
chiu bờn ngoi ln v cng v tn s lm cho cỏc ht nano hng ng
m to ra nhit nung núng nhng vựng xung quanh. Nhit khong 42C trong
khong 30 phỳt cú th git cht cỏc t bo ung th. Nghiờn cu v k thut
tng thõn nhit cc b c phỏt trin t rt lõu v cú rt nhiu cụng trỡnh cp

n k thut ny nhng cha cú cụng b no thnh cụng trờn ngi. Khú khn ch
yu ú l vic dn truyn lng ht nano t phự hp to ra nhit lng khi cú
s cú mt ca t trng ngoi mnh trong phm vi iu tr cho phộp [28].
1.2.3.4. Tng tng phn cho nh cng hng t
Cỏc ht nano siờu thun t c to thnh t oxit st thng c s dng
nh cỏc tỏc nhõn lm tng tng phn nh trong chp cng hng t. S cú mt
ca chỳng lm nhiu loi t trng a phng nờn lm thay i giỏ tr t trng i
rt nhiu. Da trờn c tớnh ca tng mụ trong c th m hp th ht nano mnh
hay yu. Vớ d, ht nano cú kớch thc 30nm c bc dextran cú th nhanh chúng
i vo gan v lỏch trong khi cỏc c quan khỏc thỡ chm hn. Nh vy, mt ht
nano cỏc c quan l khỏc nhau dn n s nhiu loi t trng a phng cng
khỏc nhau lm tng tng phn trong nh cng hng t.
1.3. VAI TRề CA VIC TINH SCH AXIT NUCLEIC

Luận văn thạc sĩ Phạm Thị Trà
Khoa Sinh học Khóa 2009 - 2011

24
Axớt nucleic cú vai trũ quan trng, trung tõm ca sinh hc thc nghim. Hu
ht cỏc nghiờn cu, cỏc ng dng ca sinh hc phõn t u cn vic tinh sch v
lm giu c axớt nucleic.
Cỏc ng dng quan trng ú cú th c k n nh chn oỏn v nh
lng tỏc nhõn vi sinh vt gõy bnh trong cỏc mu bnh phm bng phng phỏp
PCR hay Real-time PCR, xỏc nh quan h huyt thng, truy tỡm ti phm v
nghiờn cu gen.
Trong ú, tin hnh phỏt hin hay nh lng tỏc nhõn vi sinh vt gõy
bnh trong cỏc mu bnh phm bng phng phỏp PCR hay Real-time PCR thỡ u
cn ngun axớt nucleic tinh sch. Do ú quỏ trỡnh tinh sch acid nucleic l rt quan
trng do quỏ trỡnh ny cung cp nguyờn liu cho phn ng PCR, Real-PCR xỏc nh
tỏc nhõn gõy bnh. Tựy thuc vo tng tỏc nhõn vi sinh vt, axớt nucleic ớch l

ADN hay ARN, tựy thuc vo mu bnh phm m ngi lm xột nghim cú th la
chn phng phỏp tinh sch v lm giu phự hp.
Vi tm quan trng nh vy, ó cú rt nhiu phng phỏp tinh sch v lm
giu axớt nucleic khụng ngng c phỏt trin v ci tin.
1.4. MT S PHNG PHP TINH SCH V LM GIU AXIT NUCLEIC
CA SINH VT
Ngi ta s dng rt nhiu phng phỏp tỏch chit axit nucleic. Trong phn
ny chỳng tụi ch trỡnh by nhng phng phỏp thụng dng trong cỏc phũng nghiờn
cu v xột nghim.
1.4.1. Nguyờn lý chung
Dự l tỏch chit axớt nucleic t ng vt hay thc vt, vi khun hay virus,
thỡ bc u tiờn l phi phỏ v mụ, t bo, lp v protein gii phúng ra axớt