Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện nhanh virus cúm gia cầm A H5N1 trong mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật multiplex reverse transcription polymerase chain reacti

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



TRẦN THỊ TÌNH



NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN NHANH VIRUS
CÚM GIA CẦM A/H5N1 TRONG MẪU BỆNH PHẨM BẰNG
KỸ THUẬT MULTIPLEX REVERSE TRANSCRIPTION
POLYMERASE CHAIN REACTION



LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC





Hà Nội – Năm 2011

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



TRẦN THỊ TÌNH

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN NHANH VIRUS
CÚM GIA CẦM A/H5N1 TRONG MẪU BỆNH PHẨM BẰNG
KỸ THUẬT MULTIPLEX REVERSE TRANSCRIPTION
POLYMERASE CHAIN REACTION


Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 30


LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS. LƯƠNG XUÂN HIẾN


Hà Nội – Năm 2011




73
MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1
 5
1.1.3. H otein ca virus A/H5N1 6
n c/H5N1 9
 11
1.1.6. Kh ng vt ch c 12
c l nh c 14

 15
1.2. CHẨN ĐOÁN, ĐIỀU TRỊ VÀ DỰ PHÒNG BỆNH CÚM GIA CẦM
A/H5N1 16
 17
u tr nhi i 23
1.2.4. Ki  24
1.3. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VIRUS CÚM A/H5N1 Ở VIỆT NAM VÀ TRÊN
THẾ GIỚI 25
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 27
 27
 27
 28
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28
2.2.1. . Chn mu 28
2.2.3. u bnh phm 29
2.2.4.  30
2.2.5. Tn ng RT-n t 32
ng Multiplex RT- 38
Chƣơng 1. TỔNG QUAN 3
1.1. ĐẠI CƢƠNG VỀ VIRUS CÚM A/H5N1 3
i h 3
1.2.1. Triu chng nhi 16
2.2.2. ,  28





74

2.2.7. Th nghim phn ng Multiplex RT-u bnh phm 40
2.2.8. 







41
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43
3.1. Thiết kế mồi 43
3.1.1. Thit k mc hiu cho gen M c 43
3.1.2. Thit k mc hiu cho gen HA c 44
3.2. Tối ƣu phản ứng RT-PCR phát hiện từng gen M, HA và NA 47
3.2.1 T gn mi 47
3.2.2. T mi 49
3.2.3. Ti 50
3.2.4-PCR 51
3.2.5 c hiu ca phn ng RT-PCR 53
3.3. Tối ƣu phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện virus A/H5N1 56
3.3.1. T gn mi 56
3.3.2. T mi 56
 58
 nhy ca phn ng multiplex RT-PCR 59
3.3.6. 
















-PCR 59
3.4. Ứng dụng kỹ thuật multiplex RT-PCR phát hiện virus A/H5N1 trên mẫu
bệnh phẩm 61
Kết luận 67
Kiến nghị 67
TÀI LIỆU THAM KHẢO 68







3.1.3. Thit k mc hiu cho gen NA c 45
 57

77
CHỮ VIẾT TẮT

bp: Base pair
DEPC-treated water: Diethylpyrocarbonate treated water
DNA: Deroxi ribonucleic acid
dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate
EDTA: Etilendiamin tetraaxetic acid
HA (H): Haemagglutinin
LB: Luria-Bertani media
M: Matrix protein
NA (N): Neuraminidase
NP: Nucleoprotein
NS: Non-structural protein
PA: Polymerase A protein
PB: Polymerase B protein
RT-PCR: Reverse Transcription - Polymerase Chain
Reaction
RNA: Ribonucleic acid
TBE: Tris Base, Acid Boric, EDTA
vRNP: Viral ribonucleoprotein

75
DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ HÌNH VẼ

Hình 1.1. Cấu trúc của virus cúm A 5
Hình 1.2. Các phân đoạn gen và các protein của virus cúm A/H5N1 6
Hình 1.3. Chu trình tái bản của virus cúm A… 10
Hình 1.4. Các vật chủ tự nhiên và khả năng lây nhiễm giữa các loài vật chủ của
virus cúm A 13
Bảng 2.1: Các thành phần của phản ứng RT-PCR 33
Bảng 2.2: Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR 33
Bảng 2.3: Thành phần của phản ứng multiplex RT-PCR 37
Bảng 2.4: Chu trình nhiệt của phản ứng multiplex RT-PCR 38
Bảng 3.1: Cặp mồi phát hiện gen M của virus cúm A 43
Hình 3.1: Đặc điểm cặp mồi phát hiện gen M của virus cúm A 43
Bảng 3.2: Cặp mồi phát hiện gen HA của virus cúm A/H5N1 44
Hình 3.2: Đặc điểm cặp mồi phát hiện gen HA của virus cúm A/H5 45
Bảng 3.3: Cặp mồi phát hiện gen NA của virus cúm A/H5N1 46
Hình 3.3: Đặc điểm cặp mồi phát hiện gen NA của virus cúm A/N1 46
Bảng 3.4: Trình tự các mồi được lựa chọn để thực hiện phản ứng RT-PCR… 47
Hình 3.4. Ảnh điện di kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng RT-PCR phát
hiện từng gen riêng biệt 49
Hình 3.5. Ảnh kết quả điện di tối ưu nồng độ mồi cho phản ứng RT-PCR 50
Hình 3.6. Ảnh điện di kết quả tối ưu thời gian kéo dài chuỗi 51
Bảng 3.5: Giá trị đo độ hấp thụ OD của RNA 3 gen M, HA và NA 51
Hình 3.7. Ảnh điện di đánh giá độ nhạy của phản ứng RT-PCR 52
Bảng 3.6: Thành phần phản ứng RT-PCR phát hiện gen M 53
Bảng 3.7: Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR phát hiện gen M 54
Bảng 3.8: Thành phần phản ứng RT-PCR phát hiện gen H5 54
Bảng 3.9: Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR phát hiện gen H5 54
Bảng 3.10: Thành phần phản ứng RT-PCR phát hiện gen N1 55

76
Bảng 3.11: Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR phát hiện gen N1 55
Hình 3.8: Ảnh điện di tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho pha
̉
n ư
́
ng multiplex RT-PCR 56
Hình 3.9. Ảnh điện di tối ưu nồng độ mồi phản ứng multiplex RT-PCR 57
Hình 3.10: Ảnh điện di tối ưu thời gian kéo dài chuỗi phản ứng multiplex RT-PCR 58
Hình 3.11: Ảnh điện di tối ưu số chu kỳ phản ứng multiplex RT-PCR 59
Hình 3.12: Thư
̉
nghiê
̣
m đa
́
nh gia
́
đô
̣
nha
̣
y cu
̉
a pha
̉

n ư
́
ng multiplex RT-PCR… 59
Hình 3.13: Ảnh điện di đa
́
nh gia
́
độ đă
̣
c hiệu của phản ứng multiplexRT-PCR 60
Bảng 3.12: Thành phần phản ứng multiplex RT-PCR 60
Bảng 3.13: Chu trình nhiệt của phản ứng multiplex RT-PCR ……………………….61
Hình 3.14: Kết qua
̉
thư
̉
nghiê
̣
m phản ứng multiplex RT-PCR trên mâ
̃
u bê
̣
nh phâ
̉
m
dương tính………………………………………………………………………………… 62
Hình 3.15: Kết qua
̉
thư
̉

nghiê
̣
m phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện virus cúm
gia cầm A/H5N1 trên một số mẫu bê
̣
nh phâ
̉
m………………………………………….63
Hình 3.16: Kết qua
̉
thư
̉
nghiê
̣
m phản ứng RT-PCR phát hiện virus cúm gia cầm
A/H5N1 trên một số mẫu bê
̣
nh phâ
̉
m………………………………………………….…64
Bảng 3.14: So sánh kết quả xét nghiệm phản ứng RT-PCR và multiplex RT-PCR
trên mẫu bệnh phẩm……………………………………………………………………… 64
Bảng 3.15: So sánh thời gian và chi phí hoá chất làm xét nghiệm giữa phản ứng
multiplex RT-PCR và RT-PCR………………………………………………………………65

1
M U
Trong nhng nm gn m do virus A/n quan
 i vi c th gii, c bi  i v     nh Vit Nam,
    c K  cui nm 2003    
A/H5N1 t hi rt l vong cho
m ngi. C  gii ang lo s trc nguy c  th xy ra mt ch
i do virus A/H5N1 ging nh  
k  gii n h c chu chng li
mt  th xy ra trong tng lai nh mua thu
u sn xut vaccine, thch, thc
hin lc nhm kit ch ng bi
 Vit Nam, k  nm 2003 c xy ra  hu
nh  c. Mi n u gia c
hy. Theo tha T ch gii, Vit Nam ang ng th 
gii (s s ngi nhi vong do virus A/H5N1.
 kh nn 
ng virus mc s dng vaccine  d 
t c hiu qu cao.  Vit Nam hin nay, dA/H5N1 vc xy ra
i, mc  m trng nh giai on trc 
nh p th
th tr 



.  5u bnh phm  ngi
m, hin nay ht nghim ng k thut RT-PCR
(Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction).    thut  
n virus vi  t nghim
khong 4- u thc hin Realtime RT--u thc hin RT-



2
PCR in di  agarose.  - , ngi ta phi thc
hin ba phn ng  chn  phn
ng   phn nh subtype H5 v phn ng
nh subtype N1.  n git nghin tht
nghit ki ng th ng dng k thut multiplex RT-PCR,
p chn  vi mt phn ng RT-
phn ng RT-vic ngh ng
c hin k thut multiplex RT-c tn nay h
t nghim trong nc chng k thun 
c hin ng quy tr
hi     m A/H5N1 trong mu bnh phm bng k thut
Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction ti Labo Trng
i hi m
1.  a chn p  thc hin phn ng multiplex
RT-A/H5N1.
2. u ti a u kin ca phn ng multiplex RT-PCR:
nhit  i gian gn mi, nng  
3. Th nghim  phn ng multiplex RT-t
s mu bnh phm thu th .

3
Chng 1. TNG QUAN
/H5N1
i h

Theo y ban Qu i virus (ICTV - International Committee on
      m V, h Orthormyxoviridae  3
type   C  vt li RNA si  [32].
   
a nucleopr  n M1  
gen c 8   c 7  RNA
[36].
Trong 3 type type  gii hn vt ch rt rng
bit s ng vt n, ngi cu, 
c i [32]. c lc mnh nh i
gen rt lch yu  i dm trong th k qua.
D          a   
euraminidase (NA)c  16
subtype HA (H1-subtype NA (N1-N9). subtype
 subtype 

[2]. Tt c subtype HA u hin ding virus
l y cm   mt s subtype nht nh
th     i nh H1N1, H1N2, H2N2, H3N2 [11]. 
subtype   


  
 mc  .




4
1.1.1.2
A/H5N1 t vsubtype 
s  t v c t        kh n n i di
       A/H5N1 ang l  c
    clade/subclade ( ),  clade/subclade 
c in c trng [2].

Trong nhng nm gn  nhng bin i di truyn
u nhm d t v kiu gen (genotype).
Kiu gen c hin c in ca virus 
 t hp co s a chng gc
Goose/Guangdong/1/96, virus A/H5N1        
nhau vc in   h

nh bao gm A, B, C, D, E, G, V, W, X
0,
X

1
, X
2
, X
3
, Y, 
+
[26]. Trong s 
ki mt s ki
0
) l
2 nm, chng t ch nghi   th tn ti [22]. Kiu gen
l n  a nam Trung Qu
nm 2003 n nay [14].

  chc WHO (World Health Organization), OIE (Organisation for
Animal Health)   (Food and Agriculture Organization)    
dng mt h thng nht  c th  clade A/H5N1 [50].
 h thA/nh 10 clade 
mi clade  th subclade  [5, 46]. Hin ti ch 
           m cho ngi. Clade 2 gm mt s
subclade n ang lp tmi [5].
K  A/H5N1 hin ang lnh  ngi g



5
clade 2.3.2 (Trung Quc), 2.3.4 (Trung Qu  t Nam) 2.2 (Ai Cp), 2.1
(Indonc) [51].
1.1.1.3


: type virus (A, B hoc C), vt ch ( th b u vt ch 
ngi), a il ch
 hiu ca    t trong
du ngoc n.
 d ng
lp   chp n 

p  i
Vit Nam n    ch         

u  A/H5N1
V

 5N1   , 



 Orthomyxoviridea.
Virus H5N1 









 .


human-antibodies-neutralize-avian-flu.html



6
 bc, cu vi  80-
120 nm (nanomet) ho-300 nm,  bc ca
n gc t t t chng 500
c        mt ca
ng 10-14 nm, -6 nm, bn ch
m xen k vi nhau. S  c mt ca
hng u, t l HA/NA khong 4-
bi mt lp protein nn M1 (kho M1) [36].
RNA (-)ssRNA,
     11 protein virus (
 1-F2)t virus, mi
    t v     u   ca enzyme
polymerase (bao gm PB1        c hp
ribonucleoprotein (viral ribonucleoprotein - vRNP) [37].
1.1.3. H /H5N1
H5N1 RNA 
1-8  
 , PB1-F2, PA, HA, NP, NA, M   


/H5N1

7

 o  mt ca viru
):
- on 4 (gen HA)-1707 bases, mang gen
HA, m mt c bn
ch n vi
 t ch vn chuyn vt lin c t ch.
    th  chn l      c hiu g t v 
 mt ca virus.  b mt quan
trng c ng min dch dch th c
hiu vi tng subn  
va quya quyc lc ca bo
v min dch nhn s m ca virus   nhim,  u
ch   n nay. Mt c in  t gia
m ch gn vi 
alpha 2-3 sialic i ch gn vi  alpha 2-6 sialic acid
 . 
 [24]. Ngi ta  n ra s t
n  mt s   th gn v 
ngnh cho ngi [11]. Mt s u trong thi gian gn 
cho thy  ng  th alpha 2-3 sialic acid vi mt  rt th
gia c  th alpha 2-6 sialic acid vi mt  rt thp [28]. Ngi ta
ng nhn thu n xy ra   ng ng vi axit amin
 th gn vi c th th ca ngm [10, 27].
-  6 (gen NA):  50-1410 bases, mang gen
       
                
,  .

 t glycoside, gi



8
y b mt bip, tu ki
tip cn t t c ch c hiu. Gi
 yu c bo v min dch c ch,
  c hiu v  NA cc chm.
 m u ch 
n ni n ch i [2].
on ca enzyme polymerase

- on 1 (gen PB2) s, mang gen a
protein PB2,  
       virus [2].   
            axit      
n  A/ 
.   s to thun
ln  c p di ca ng vt
 cho A/ c lc cao [29].
- Pon 2 (gen PB1s
-e
polymerRNA [5]. PB1-n c lc ca
 th ng trong vinh mc  nguy him cch
[43]. ng virus trong v ch  Hong Kong nm 1997, ngi
ta nhn thy s n i axit amin asparagine   66 (N66S) 
PB1- n c lc ca virus. S thay ng c
-F2 cm 1918 [17].
- gen PA) 2233 bases

               
 RNA RNA 
[40].



9
o, 
 
- on 5 (gen ases
nucleoprotein (NP), RNA 

RNA.
- on 7 (gen Ms
    t hp v 
 mt tp v capsid cc t 
mn on RNA v n vi RNA
c  v bc ca virus  gion
RNA  t c  bn cht
m ca virus [36]. S  axit amin 
 31  a mt s ch
a virus [25].
- on 8 (gen NSs, cha cho
 (nuclear export protein) (thng
c gc lc cn protein NS [39]. 
protein  p nn chuy
 NEP  vn chuya
viru .
n c/H5N1
n c

 ).



10


Khi u   g a virus v  th   
sialic acid K


 . , 














 . 
       
 
        

. 

  
 
g
 i  


              
neuraminidase.



11
Th virus con trung
ng 6 gi
  
 
1.1.5. Hin tn 
i virus c bit nhh
  nn i . Kh nng
n  qu c n i di
n c n n ca virus bao gm:
- Hin tng trao (antigenic shc
n n ln co ra chng virus m ng virus ban
u bp li h 
ng nhit vt ch ( d nh hai chi
 m ng nhi
 


  [2].
- Hin tng l(antigenic drift): 
ng ca
 c 
c sn tn s n  virus ri
ln h gen ca virus s  n i [21].  h
n dn y ln m s 
i a virus [21]. Ch
 th i h thng mich ca c th  n
trong qun th.
- Hin tna:   gt ca
mt chui oligosaccharide vi amino acid asparagine  mt s  nht nh trong



12
chui polypeptide HA hay NA, hay mt s 
thng chui oligosaccharide c gn t   N-X-S/T (N = asparagine; X =
amino acid b proline; S/T = serine hoc threonine) [7]. 
t v c c th ch c
m bo v c th nhim. Hin tng ln
i a asparagine, tn  cho hin ta xy
ra khi tng hp chui 
cng mich bo  ca c th ch
 a virus [7].
Hing l  











 . 


, hing 

  xy ra vi tt c ng ca virus






 ng nhim, 
          i c  
A/H5N1 hin nay, m   m d  
 







 . 

/H5N1 

 , hoc c 






    i ( 1N1 

3N2)  o ra chng
virus m m d  i,  a mi d
mi [25].
1.1.6. Kh nch ng vt ch 
                


trong  4).



13

  



  


- - 
- - 
                 



 [15].
u v virus H5N1 trong thi gian gn y virus 
nhng bin i  thi. Hai chn lp
i nm 2003 (Hong Kong) cho thn tng gic vi th th
ca gia cc (m  mc thp) vi th th ca ng thay
i axit amin  c hiu
vi th th ca virus [23].       c 192 (Asn182Lys hoc



14
i n th thc vi th
th ca gia cm chuyc vi th th ca ngi [52].
Trong th k 20, ch c nu
ng nm gn subtype 
gia cm nh m cho ngi.
V ng
v  o, h
1.1.7. h nnh c/H5N1
Kh nnh c thuc lch ng
vt ch cng chnh hoc ch 
bnh nh gii hn  p cm, nhng mt s
chng thuc subtype H5, H7  th nh nng  u c quan
trong c th  gia ci [52]. D n

bnh cm, virus  c
lc cao (Highly Pathogenic Avian Influenza -  c lc thp (Low
Pathogenic Avian Influenza - LPAI)m LPAI thng ch nh nh 
p, gim sc  c gim trng lng, m th 
bnh vi t l cao nhng t l t thng thi, virus HPAI tht
gia cm vi t l t nht 75% gia cm nhim t [45]. Cho n nay, tt
c ng HPAI t u thuc subtype H5 hoc H7, tuy ni tt
c   mt s ng virus thuc subtype 
HA c c i  mt axit a 
c tr t 3 hoc 4 axit amin (tc
ng subtype). Do , protein HA ca LPAI ch  t b
ngo c vi khun t m
 d nh  qui, protein HA ca HPAI lit
m t t, do  th ng c
(intracellular protease) ph n nh furin [44].  th 



15
bnh  , c  th vt ch u chng
nng n  l t vong cao.
A/
-F2:  b
m



 ,  











 ,  . V  


 A/H5N1 








,  



















 . Protein PB2 










 , 













 . Protein NS1  















,





















 . PB1-
ng apoptosis  nhim.
1.1.8 

 ..
l

-propiolacton, sodium hypochloride, acid
 


o


o

-70
o

o

C-
- 
o


o
C.





16
1.2. CHN N,  D NG BM GIA CM A/H5N1
1.2.1. Triu chng nhi
 
t, da
   xut huyt, ch    m. Con vt khi s   u hin
ng  h thp, sinh sn kinh. Triu chng
m hong, gi thy yng hp nu
hi, ri lon thn kinh, a chy, mt s u hin co git hoc 
 ng. Nhng triu tr xc
 [3, 4].
 nh 
  h ng hp nhim A/ -
nhng mt s trng h n, 8-[16]. u ch
  th u hin hoc biu hiu chng 
 mc   nh nh b th th, ho, st) cho
n biu hii nng, hi chp cp (ARDS- Acute Respiratory
Distress Syndrome) hay hi chng suy a tng (MODS- Multiorgan Disfunction

Syndrome)u cho thy mt s bu hin triu chng
t nghi trng hp biu hiu ch
ia) [6]. 



 ,




 A/H5N1 














tr
























 .
 c hiu vi HA c
A/H5N1  . Triu ch



 






:
 , 







 , , 
; 





 ,


 ; 

 

, 















 [31].  

























 , 







17












 









 , 







 -6, 








interferon, 














[19]. 


, 



/

RNA 




, : 

, , gan, 



, 




,
.
T l t vong i vi bA/H5N1 nhp vin tng i cao,
xp x 60% [13, 16], m l t  l thp hc
vi nm 1997, khi phn l vong xy ra  b
A/H5N1 hi l t vong cao  tr nh.  tr di 15 tui, t l t vong
[16]. Th triu chng n khi t 
9- 6-t b n
trin [5, 16].
t nghin 
Chn  u chng ca bnh rt
a dng t nh mt s b chn nh ngi ta thng
phi dt qu t nghinh s  mt c
 hoc RNA ca virus trong mu bnh phm.
t nghi
 thut
t nghim i   tin c nh tht nghim
nhanh [34].  thut nghi th ng trong chn 
A/H5N1 bao g         n RNA ca
virus bng k thut RT-PCR, realtime RT-PCR   n s tng hi 
 t thanh boch ang
 thut chn  th thc hin vu
mu bnh pht sc quan trng.




18
p virus
n H

 
gisubtypen tng
 hp   nn, kh nm cn
tc ca virus. Virus A/ th p by
              
(Mardin-Darby canine kidney - MDCK) ho m nhim vi virus

 trng: hn n nh trong 
niu hoi ca -m trng 48-72 gi,
ch khoang ninh s  mnh subtype virus b
phn ng mich (HA, HI) hoc RT-PCR. Vi ch c l
 th  m.
  
ngi ta phi b sung trypsin   th i v
cA/ th n b sung trypsin.
, p virus i ph 
hc cp 3 (BioSafety Level 3 - y tng  2-6
 p c virus vn phi thc hit nghi
 chn subtype virus.
Ph

Ng th a virus tr mu bnh phm bng
mt s k thu thut c s dng ph n hn do thi
t nghi
K thut mich hunh quang trp (direct immunofluorescence assay):
 c p c c a virus