Nghiên cứu Gen mã hóa Protiease HIV mang đột biến kháng thuốc114202

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
*




NGUYỄN VĂN DŨNG




NGHIÊN CỨU GEN MÃ HÓA PROTEASE HIV
MANG ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC




LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC






Hà Nội-2011

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
*

NGUYỄN VĂN DŨNG



NGHIÊN CỨU GEN MÃ HÓA PROTEASE HIV
MANG ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60.42.30


LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS. Phan Tuấn Nghĩa




Hà Nội-2011
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng

Lớp Cao học K18 Khóa 2009-2011
50
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1

Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Giới thiệu chung về HIV 3
1.1.1. HIV/AIDS 3
1.1.2. Tình hình nhiễm HIV/AIDS 5
1.1.3. Phương pháp điều trị HIV/AIDS 6
1.2. Protease của HIV-1 (gọi tắt là protease HIV-1) 7
1.2.1. Gen mã hóa protease HIV- 1 7
1.2.2. Cấu trúc của protease HIV-1 8
1.2.3. Chức năng của protease HIV-1 10
1.2.4. Tạo protease HIV-1 tái tổ hợp 12
Chƣơng 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15
2.1. Nguyên liệu 15
2.1.1. Mẫu huyết thanh 15
2.1.2.Các hệ vector và chủng vi sinh vật 15
2.1.3. Hóa chất 15
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 15
2.2.1. Tách chiết RNA hệ gen HIV-1 và tổng hợp cDNA 15
2.2.2. Tổng hợp cDNA từ RNA virus 16
2.2.2. Tách chiết và định lượng DNA 16
2.2.3. Điện di DNA trên gel agarose 17
2.2.4. Nhân bản các đoạn gen bằng kỹ thuật PCR 18
2.2.5. Nhân dòng đoạn gen mã hóa protease HIV-1 19
2.2.6. Giải trình tự các đoạn gen mã hóa protease HIV-1 bằng phương pháp
Sanger 20
2.2.7. Biểu hiện gen mã hóa protease HIV-1 ở E. coli 21
2.2.8. Tinh sạch protease HIV-1 bằng cột sắc ký ái lực His-bind (Novagen) 22

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng

Lớp Cao học K18 Khóa 2009-2011

51
2.2.9. Điện di trên gel polyacrylamide có chứa SDS (SDS-PAGE) theo phương
pháp của Laemmli [20] 23
2.2.10. Nhận dạng protease HIV-1 bằng thẩm tách miễn dịch (Western
blotting) 24
2.2.11. Phân tính hoạt độ của protease HIV-1 theo phương pháp của Richard
và tập thể [31] 25
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26
3.1. Phát hiện đột biến kháng thuốc PI trong gen mã hóa protease HIV-1 26
3.1.1. Xác định trình tự đoạn gen mã hóa protease HIV-1 26
3.1.2. Phát hiện đột biến kháng thuốc PI trong gen mã hóa protease HIV-1
(Đột biến N83T) 27
3.2. Thiết kế hệ thống biểu hiện gen mã hóa protease HIV-1 mang đột biến
N83T trong vector pET32a 29
3.2.2. Gắn sản phẩm PCR vào vector pGEM-T Easy và biến nạp vào tế bào E.
coli chủng DH5 31
3.2.4. Cảm ứng biểu hiện protease HIV-1 mang đột biến N83T trong vi khuẩn E.
coli BL21 (DE3) RIL 38
3.2.5. Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng cột sắc ký ái lực His-bind 40
KẾT LUẬN 44
KIẾN NGHỊ 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO 45


Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng

Lớp Cao học K18 Khóa 2009-2011
53
BẢNG CHỮ VIẾT TẮT
APS Ammonium Persulphate

bp Cặp bazo (base pair)
BSA Albumin huyết thanh bò (Bovine Serum Albumin)
CBB Coomassie Blue Brillant
dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate
ddNTP Dideoxyribonucleoside triphosphate
dd H
2
O Nước cất loại ion, khử trùng (deionnized distilled H
2
O)
E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid
EtBr Ethidium Bromide
IPTG Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside
kb Kilobase
kDa Kilodalton
LB Luria Bertani
MCS Multiple Cloning Sequence
OD Mật độ quang học (Optical Density)
PAGE Điện di gel polyacrylamide (Polyarylamide Gel Electrophoresis)
PBS Muối chứa đệm phosphate (Phosphate Buffered Saline)
PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polmerase Chain Reaction)
PMSF Phenyl Methylsulphonyl Fluoride
PVDF Polyvinylidene fluoride
SDS Sodium Dodecyl Sulphate
TAE Tris base-Acetic-EDTA
TEMED N, N, N’, N’-Tetramethyl-Ethylenediamine

Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng

Lớp Cao học K18 Khóa 2009-2011
54

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1. Thành phần của phản ứng PCR 18
Bảng 2. Thành phần của phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pGEM-T 19
Bảng 3. Thành phần của phản ứng cắt enzyme giới hạn 21
Bảng 4: Thành phần gel cô và gel tách acrylamide 23
Bảng 5. Thành phần của phản ứng hoạt tính protease HIV-1 25


Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng

Lớp Cao học K18 Khóa 2009-2011
55
DANH MỤC HÌNH
Hình 1: Cấu tạo của HIV [40] 4
Hình 2: Cấu trúc không gian của protease HIV-1 [39] 10
Hình 3: Sơ đồ phân cắt polyprotein gag và gag-pol của HIV-1 để hình thành
các protein chức năng [39] 11
Hình 4: Kết quả so sánh trình tự đoạn gen mã hóa cho protease HIV-1 so với
trình tự đoạn gen tương ứng EU518273 của Trung Quốc 27
Hình 5: So sánh trình tự axit amin của protease HIV-1 thu nhận ở Việt Nam
(HQ890881) so với trình tự của EU518273 trong Ngân hàng Gen quốc tế. 28
Hình 6: Kiểm tra đột biến trong của protease HIV-1 thu nhận ở Việt Nam
(HQ890881) so với cơ sở dữ liệu HIV của Đại học Stanford 28
Hình 7: Sơ đồ cấu trúc protein dung hợp với protease HIV-1 để biểu hiện
trong vector pET32a 29
Hình 8: Điện di sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen của protease HIV 31

Hình 9: Kết quả biến nạp hỗn hợp gắn giữa sản phẩm PCR (đoạn gen
mã hóa protease HIV-1) và vector pGEM-T Easy vào E. coli chủng DH5α 32
Hình 10: Điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của mang gen mã hóa
protease HIV-1 trong plasmid tái tổ hợp 33
Hình 11: Sơ đồ vector pET32a 34
Hình 12: Điện di sản phẩm phân cắt vector pGEM-ProtHA bằng BamHI và XhoI . 35
Hình 13: Điện di sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen mã hóa protease HIV-1 36
có trong các thể biến nạp 36
Hình 14: Trình tự đoạn gen mã hóa protease HIV-1 trong vector pET32-ProtHA 37
Hình 15: Kết quả so sánh trình tự đoạn gen mã hóa protease HIV-1 mang đột biến
N83T trong vector pET32-ProtHA và vector pGEM-ProtHA 38
Hình 16: Kết quả điện di protein tổng số có chứa protease HIV-1 tái tổ hợp mang đột
biến N83T trong phân đoạn dịch chiết và tủa tế bào E. coli BL21 (DE3) RIL 40
Hình 17: Điện di protein kiểm tra độ tinh sạch các phân đoạn qua cột His-bind 42
Hình 18: Kết quả thẩm tách miễn dịch kiểm tra độ tinh sạch các phân đoạn qua cột
His-bind 43


Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng

Lớp Cao học K18 Khóa 2009-2011
1
MỞ ĐẦU

Virus suy giảm miễn dịch ở người (Human immunodeficiency virus - HIV)
là nguyên nhân chính gây ra hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (Acquired
Immunodeficiency Syndrome - AIDS) và là một trong những virus gây bệnh nguy
hiểm nhất hiện nay. Theo các tài liệu đã công bố, có ít nhất hai type HIV gây nên
AIDS đó là HIV type 1 (HIV-1) và HIV type 2 (HIV-2), nhưng HIV-1 là nguyên
nhân chính gây ra AIDS trên toàn thế giới.

Theo số liệu của Tổ chức Y tế Thế giới, tính đến cuối năm 2009 có khoảng 33,3
triệu người đang sống chung với HIV/AIDS, khoảng 1,8 triệu người đã chết vì AIDS
và có thêm 2,6 triệu trường hợp mới bị nhiễm virus này. Ở Việt Nam, theo báo cáo Cục
phòng chống HIV/AIDS - Bộ Y tế tính đến 31/3/2011, toàn quốc đã phát hiện người
nhiễm HIV tại hơn 75,2% xã/phường, gần 97,9% quận/huyện và 63/63 tỉnh/thành phố.
Tổng số trường hợp nhiễm HIV là 235.535 người, số bệnh nhân AIDS là 94.613 người,
số trường hợp tử vong đến cuối kỳ báo cáo là 49.912 người.
Trong chu trình sống của HIV-1, protease là enzyme không thể thiếu.
Enzyme này cắt các chuỗi polyprotein (gag, gag-pol) tại những vị trí nhất định để
tạo thành các protein cấu trúc và chức năng cần thiết cho virus hoàn chỉnh. Vì thế
protease được xem là một trong các đích tác động quan trọng nhất cho liệu pháp tìm
ra thuốc điều trị HIV/AIDS. Tuy nhiên, do HIV sao chép nhanh, enzyme phiên mã
ngược có tỷ lệ sai sót cao tạo ra sự biến đổi liên tục trong cấu trúc hệ gen của các
nhóm HIV dẫn đến tình trạng kháng thuốc. Mặc dù ngày càng nhiều chất ức chế
protease chống HIV được sản xuất và thương mại hóa nhưng việc tìm các chất ức
chế mới của protease vẫn luôn được quan tâm.
Bên cạnh đó, các đột biến kháng PI tương đối đặc hiệu cho từng loại thuốc
riêng biệt, do đó thay thế một loại thuốc khác trước khi có sự tích lũy đột biến thì
các phác đồ sau vẫn thành công (Hoffmann và tập thể, 2007). Vì vậy, xét nghiệm
kháng thuốc thường theo hướng phát hiện đột biến trong gen mã hóa protease HIV
có vai trò rất quan trọng trong việc xây dựng phác đồ điều trị HIV/AIDS.
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng

Lớp Cao học K18 Khóa 2009-2011
2
Ở Việt Nam, gen mã hóa protease HIV mang đột biến kháng thuốc là vấn đề
còn ít được nghiên cứu. Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào xác định nhóm virus
gây bệnh chủ yếu ở người Việt Nam và tìm ra một số đột biến liên quan kháng
thuốc. Đặc biệt, chưa có nghiên cứu nào về biểu hiện gen mã hóa protease HIV
mang đột biến kháng thuốc phân lập từ các bệnh nhân người Việt Nam.

Đề tài nghiên cứu của chúng tôi được đặt ra là nhằm phát hiện một số đột
biến kháng thuốc trong gen mã hóa của protease của HIV, đồng thời bước đầu biểu
hiện gen này trong vi khuẩn E. coli để làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo.
Các nghiên cứu của luận văn được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm trọng
điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học
Quốc gia Hà Nội.


Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng

Lớp Cao học K18 Khóa 2009-2011
3
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về HIV
1.1.1. HIV/AIDS
Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải được gọi tắt là AIDS, do virus HIV
gây ra sự suy giảm miễn dịch ở người được phát hiện ở Mỹ năm 1981, đến nay đã
trở thành “căn bệnh thế kỷ” trên toàn thế giới.
Về phân loại, HIV là các Retrovirus có bộ máy di truyền thuộc họ
Retroviridae với hai type chính là HIV type 1 (HIV-1) và HIV type 2 (HIV-2),
trong đó HIV-1 gây ra 98% sự lan truyền còn HIV-2 chỉ chiếm ưu thế ở vùng tây
châu Phi, ít lan truyền trên thế giới [1, 15]. Vì vậy, HIV-1 được xem như là nguyên
nhân chính gây nên AIDS.
HIV-1 được chia thành 3 nhóm là M (main), O (outlier), nhóm N (new) trong
đó hơn 90% sự lây nhiễm của HIV thuộc nhóm M. Trong nhóm M gồm các phân
nhóm A, B, C, D, F, G, H, J, K và nhiều dạng tái tổ hợp khác (circulating
recombinant form-CRF). Các phân nhóm khác nhau chủ yếu ở cấu trúc của các
protein vỏ và đặc trưng cho sự truyền nhiễm theo khu vực địa lý. Đây là một đặc
điểm đáng lưu ý trong các nghiên cứu để tìm ra thuốc điều trị cho các bệnh nhân
HIV/AIDS theo từng khu vực [14].

Về cấu trúc, HIV có dạng hình cầu với kích thước khoảng 120 nm, được mô
tả ở hình 1. Lớp vỏ ngoài cùng của virus HIV bao gồm một lớp màng lipid kép có
nguồn gốc từ tế bào chủ, trên lớp vỏ này có chứa khoảng 72 bản sao protein env của
virus, mỗi protein env lại chứa một mũ được tạo thành từ 3 phân tử gp120 còn thân
được tạo thành từ 3 phân tử gp41 có chức năng neo giữ lõi virus với vỏ bao ngoài.
Lõi virus có dạng như hạt đậu tạo thành từ 2.000 bản sao của protein p24. Trong lõi
bao gồm hệ gen của HIV là hai sợi RNA (+) đơn, mỗi sợi có kích thước khoảng 10
kb gồm 9 gen mã hóa cho 15 protein khác nhau. Cuối mỗi chuỗi RNA là các trình
tự được gọi là trình tự lặp lại tận cùng dài (LTRs) đóng vai trò trong việc kiểm soát
sự nhân lên cũng như điều hòa quá trình tổng hợp protein của virus. Giống như các
retrovirus khác, HIV có 3 gen chính gag, pol và env mã hóa cho các protein tham
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng

Lớp Cao học K18 Khóa 2009-2011
4
gia vào quá trình sao chép và trưởng thành của virus. Sản phẩm ban đầu của gen
gag là một protein 56 kDa, sau đó được chế biến thành ít nhất 3 sản phẩm p17, p24
và p15 là các protein cấu trúc của virus. Gen pol mã hóa cho các enzyme reverse
transcriptase (RT), intergrase và protease trong đó enzyme RT có chức năng phiên
mã ngược RNA của virus thành cDNA; enzyme intergrase chèn cDNA vào nhiễm
sắc thể của tế bào chủ còn protease tham gia vào quá trình cắt các phân tử protein
tiền thân dưới dạng polypeptide thành các protein cấu trúc và chức năng cần cho sự
hình thành của thể virus. Gen env mã hóa cho các glycoprotein capsid của virus; sản
phẩm của gen env (gp160) được cắt bởi protease của tế bào chủ thành gp120 và
gp41 sau đó lắp ráp lại thành cấu trúc tam phân trong lớp vỏ virus. Ngoài 3 gen
chính, HIV còn có 6 gen khác (tat, rev, nef, vif, vpr và vpu) chứa thông tin mã hóa
cho các protein có khả năng kiểm soát sự tái bản, các cách lây nhiễm khác nhau
hoặc nguy cơ nhiễm các loại bệnh khác nhau [5, 17, 22].

Hình 1: Cấu tạo của HIV [40]

HIV truyền nhiễm theo 4 con đường, bao gồm con đường tiêm truyền do
dùng chung kim tiêm, lây nhiễm do truyền máu và các sản phẩm của máu, từ mẹ bị
nhiễm bệnh sang thai nhi và qua quan hệ tình dục không an toàn [1, 15].
Quá trình tiến triển của bệnh được chia thành 3 thời kì. Sự lây nhiễm HIV
ban đầu gọi là quá trình nhiễm sơ cấp, thường kéo dài từ 3-6 tuần, sau đó virus đi
khắp cơ thể, nhân bản mạnh trong khi không có bất cứ đáp ứng miễn dịch thích hợp
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng

Lớp Cao học K18 Khóa 2009-2011
5
nào được phát hiện [1, 7, 15]. Người bệnh sốt nhẹ, có triệu chứng như cảm cúm,
hạch lympho sưng to, cũng có khi không thấy triệu chứng gì. Tiếp theo là giai đoạn
tiềm ẩn kéo dài từ 1 đến 12 năm (tùy theo từng người nhiễm). Trong giai đoạn này,
quá trình sao chép của virus giảm và số lượng tế bào lympho T CD4
+
tăng lên, virus
HIV có thể được phát hiện bằng PCR hoặc RT-PCR trong các lympho của máu và
trong các mô bạch huyết [1]. Khoảng vài năm sau, mật độ các virus trong máu tăng
nhanh và giữ ở mức đó cho tới lúc chết, các kháng thể kháng virus giảm dần. Giai đoạn
này gọi là giai đoạn toàn phát hay giai đoạn cuối. Lúc này hội chứng lâm sàng của bệnh
suy giảm miễn dịch xuất hiện, các vi sinh vật cơ hội có điều kiện tấn công, người bệnh
chết dần [7, 16, 28].
Chính những đặc trưng phân tử trong cách tấn công hệ thống miễn dịch
của HIV mà AIDS trở thành một trong những bệnh nguy hiểm nhất trong lịch
sử loài người.
1.1.2. Tình hình nhiễm HIV/AIDS
Đại dịch HIV/AIDS đã và đang là một thách thức to lớn đối với tiến trình
phát triển xã hội. Sau gần 3 thập kỷ phát hiện, bắt đầu ở các nước phát triển, HIV/
AIDS đã lan rộng trên toàn thế giới, đặc biệt phát triển ở khu vực châu Phi và các nước
châu Á. Đến nay vẫn chưa có vaccine phòng ngừa HIV và thuốc chữa trị đặc hiệu.

Theo thông báo của Tổ chức y tế thế giới (WHO) và Chương trình phối hợp
phòng chống AIDS của Liên hiệp quốc (UNAIDS) đến cuối năm 2009 ước tính
khoảng 33,3 triệu người đang mang căn bệnh HIV/AIDS, trong đó số đối tượng mới
là 2,6 triệu người và có khoảng 1,8 triệu bệnh nhân đã chết vì AIDS. Tại khu vực
châu Á, có khoảng 4,87 triệu người đang sống cùng với HIV/AIDS ở các khu vực
Đông Nam và Nam Á; tình hình phát triển của bệnh này ngày càng tăng với những
diễn biến phức tạp. Theo dự đoán, khu vực này sẽ trở thành trung tâm của đại dịch
HIV/AIDS trong vài thập kỉ tới [37].
Ở Việt Nam, theo UNAIDS [36], tính đến ngày 30/9/2010 trên cả nước có
180.631 trường hợp nhiễm HIV/AIDS, trong đó có 42.339 bệnh nhân AIDS và tổng
số người chết vì AIDS được báo cáo là 48.368. Cho đến nay, đã có trên 74% xã,
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng

Lớp Cao học K18 Khóa 2009-2011
6
phường và 97,8% quận, huyện trên toàn quốc báo cáo có người nhiễm HIV/AIDS.
Thành phố Hồ Chí Minh vẫn là địa phương có tỷ lệ bệnh nhân HIV/AIDS cao nhất
với 23% tổng số bệnh nhân trong cả nước. Phân tích hình thái lây nhiễm cho thấy,
trong số những người mới được phát hiện nhiễm HIV trong 3 quí đầu năm 2010 có
49% bị nhiễm qua đường máu, 38% qua đường tình dục, 3% qua đường mẹ - con và
10% không rõ đường lây. Tỷ lệ nam giới nhiễm HIV chiếm 70,8% và nữ giới chiếm
29,2%. Phần lớn người nhiễm HIV được phát hiện trong 9 tháng qua ở tuổi từ 20-39
(chiếm 82%), trẻ em dưới 15 tuổi chiếm gần 3%. Theo đánh giá chung, tình hình
nhiễm HIV/AIDS có xu hướng giảm nhưng đại dịch HIV/AIDS vẫn trong giai đoạn
tập trung – xảy ra chủ yếu trong các nhóm có hành vi nguy cơ cao, đặc biệt trong
nhóm tiêm chích ma túy và nhóm người mại dâm.
Do những hậu quả to lớn của đại dịch HIV/AIDS đối với sự phát triển xã hội
trên phạm vi toàn cầu, việc tìm ra vaccine phòng ngừa hiệu quả và thuốc đặc trị cho
căn bệnh này là vấn đề cấp thiết đối với các nhà khoa học y học và sinh học phân tử.
1.1.3. Phƣơng pháp điều trị HIV/AIDS

Cách điều trị HIV/AIDS phổ biến nhất là dùng thuốc chống virus, đây là
thuốc có tác dụng ức chế sự phát triển và nhân lên của HIV ở những giai đoạn khác
nhau trong vòng đời của virus. Hiện tại có một số nhóm chất chống HIV đang được
sử dụng dựa trên cơ chế tương đồng về cấu trúc dẫn đến cạnh tranh hoạt động.
Chúng được chia thành 5 nhóm chính gồm: các chất có bản chất nucleoside (NRTI)
ức chế enzyme phiên mã ngược RT, các chất ức chế protease (PI), các chất ức chế
enzyme phiên mã ngược không phải loại nucleoside (NNRTI), các chất ức chế
enzyme phiên mã ngược dạng nucleotide (NTRTI) và các chất ức chế hòa nhập
không cho virus nhân bản. HIV/AIDS còn có thể được điều trị bằng các thuốc điều
hòa miễn dịch như alpha-interferon, interleukin 2, loprinasine với tác dụng tăng
cường khả năng bảo vệ hệ miễn dịch. Ngoài ra, bệnh nhân HIV/AIDS còn có thể
được điều trị với một số thuốc phòng ngừa các bệnh cơ hội [15].
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng

Lớp Cao học K18 Khóa 2009-2011
7
Tuy nhiên, do HIV có tỷ lệ đột biến cao dẫn đến tình trạng kháng thuốc và
việc sử dụng thuốc điều trị trong thời gian dài dẫn đến các tác dụng phụ. Chính vì
vậy, hướng nghiên cứu tìm ra các loại thuốc chống HIV/AIDS mới cũng như liệu
pháp điều trị bằng cách kết hợp các loại thuốc khác nhau đã và đang là vấn đề cấp
bách hiện nay.
1.2. Protease của HIV-1 (gọi tắt là protease HIV-1)
Protease HIV-1 là một enzyme không thể thiếu trong chu trình sống của
virus. Protease cần thiết để phân cắt các tiền chất polyprotein virus gag và gag-pol
thành những protein cấu trúc và chức năng trong quá trình trưởng thành của virus
[39]. Các nghiên cứu cho thấy, khi ức chế hoạt tính của protease hoặc gây đột biến
trên gen mã hóa cho protease, các hạt virus được hình thành nhưng không có khả
năng xâm nhiễm vào tế bào vật chủ [19]. Với vai trò đặc biệt quan trọng như trên,
protease HIV-1 là một trong các đích nghiên cứu nhằm tìm ra loại thuốc ngăn chặn
sự nhân lên của HIV.

1.2.1. Gen mã hóa protease HIV- 1
Hệ gen của HIV-1 nằm trong phần lõi của virus và bao gồm hai sợi RNA (+)
đơn, mỗi sợi có chiều dài khoảng 9,8 kb và có 9 gen mã hóa cho 15 protein khác nhau.
Trên mỗi sợi RNA có 3 gen cấu trúc là gag, pol và env; trong đó gag có nghĩa “group-
antigen” (kháng nguyên nhóm), pol là “polymerase” và env là “envelope” (vỏ). Các
gen gag và env mã hóa cho nucleocapsid và glycoprotein của màng virus; gen pol mã
hóa cho 3 enzyme: reverse transcriptase, integrase và protease. Ngoài ra, HIV-1 còn có
6 gen (vif, vpu, vpr, tat, rev và nef) ở vùng RNA 9 kb (Hoffmann và tập thể, 2007).
Do tốc độ sinh sản nhanh của HIV – 1, có khoảng 10 triệu hạt virus mới được
tạo ra mỗi ngày và tỷ lệ sai sót rất cao của enzyme reverse transriptase (1/10.000
base) dẫn đến tình trạng kháng thuốc phổ biến ở những bệnh nhân nhiễm bệnh thậm
chí khi chưa dùng thuốc. Nghiên cứu trên các bệnh nhân nhiễm chủng CRF01_AE
thất bại trong điều trị HAART ở Nonthaburi, Thailand được đăng ký trên GenBank
với số hiệu từ FJ463512- FJ463596, phát hiện các đột biến phụ (minor) kháng thuốc
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng

Lớp Cao học K18 Khóa 2009-2011
8
PI là M36I và H69K ở hầu hết các bệnh nhân, I13V, E35D và L89M ở hơn 84% các
bệnh nhân được điều trị ATV, ATV/r, IDV/r, NFV, TPV/r.
Các nghiên cứu về gen mã hóa protease HIV-1 ở Việt Nam chủ yếu tập trung
vào xác định nhóm virus gây bệnh chủ yếu ở người Việt Nam và tìm ra một số đột biến
liên quan đến tính kháng thuốc. Năm 2003, Nguyễn Hoàng Lan và tập thể [21] đã tiến
hành đọc trình tự các gen mã hóa RT, protease và env trên các bệnh nhân nhiễm HIV-1
ở miền Nam, chủ yếu là ở thành phố Hồ Chí Minh. 198 trong số 200 bệnh nhân nghiên
cứu thuộc phân nhóm CRF01_AE. Nghiên cứu cũng xác định được 6,5% đột biến
kháng thuốc chính khi sử dụng HAART đối với 200 bệnh nhân này. Ishizaki và tập thể
[15] cũng tiến hành đọc trình tự gen mã hóa protease và RT trên đối tượng các bệnh
nhân nhiễm HIV-1 ở Hải Phòng. Phân tích hình thái di truyền của hơn 1.000 bệnh nhân
cũng cho thấy phân nhóm HIV-1 gây bệnh của yếu là CRF01_AE (chiếm 98,3%).

Phân tích đột biến kháng thuốc trên 294 bệnh nhân đã chỉ ra có 0,3% đột biến liên quan
đến kháng thuốc ức chế protease tại vị trí M46I.
Trong các đột biến kháng thuốc thì phổ các đột biến kháng PI rất rộng có thể
do sự đa hình xảy ra ở 49 gốc axit amin trong tổng số 99 axit amin của protease.
Mặc dù có sự kháng chéo từ mức độ vừa đến mức độ cao giữa các PI, các đột biến
chính là tương đối đặc hiệu cho từng thuốc riêng biệt. Phần lớn các dữ liệu về đột
biến chính phát sinh từ các bệnh nhân điều trị PI không tăng cường (PI thế hệ thứ
nhất). Đột biến chính rất hiếm gặp ở các phác đồ điều trị bằng PI tăng cường
(Hoffmann và tập thể, 2007). Khi điều trị saquinavir không tăng cường chủ yếu xảy
ra đột biến G48V và làm giảm độ nhạy với saquinavir 10 lần; nếu kèm thêm đột
biến L90M, mức độ nhạy cảm với saquinavir giảm rõ hơn trên 100 lần (Jacobsen
và tập thể, 1995). Trong khi đó, phải cần ít nhất 4 trong số các đột biến L10I/R/V,
G48V, I54V/L, A71V/T, V77A, V82A, I84V và L90M mới có thể làm giảm hiệu
lực của saquinavir tăng cường (Valer và tập thể, 2002).
1.2.2. Cấu trúc của protease HIV-1
Có nhiều cách phân loại protease, dựa vào vị trí cắt trên chuỗi polypeptide,
protease được chia thành hai nhóm chính: exopeptidase và endopeptidase.
Exopeptidase cắt liên kết peptide ở gần đầu N hoặc đầu C của cơ chất, trong khi đó
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng

Lớp Cao học K18 Khóa 2009-2011
9
endopeptidase cắt liên kết peptide nội chuỗi. Dựa vào cấu trúc của “nhóm chức” có
mặt trong trung tâm hoạt động, protease lại được chia thành bốn nhóm chính:
protease serine, protease aspartyl, protease cysteine/thiol và protease chứa kim loại
(metallo protease), tiếp đó protease lại tiếp tục được phân chia thành nhiều họ khác
nhau dựa vào trình tự axit amin [34]. Theo cách phân loại này, protease HIV-1 là
một protease aspartyl hay protease axit.
Navia và tập thể tại phòng thí nghiệm Mecrk [27] là nhóm đầu tiên tạo được
cấu trúc tinh thể của protease HIV-1 vào năm 1989, kể từ đó cấu trúc của protease

đã được nghiên cứu rộng rãi cả về chức năng, tính đặc hiệu cơ chất cũng như sự liên
kết với các chất ức chế. Protease HIV-1 là một dimer, chứa hai tiểu phần giống hệt
nhau được sắp xếp gần như theo kiểu đối xứng, mỗi tiểu phần có khối lượng khoảng
11 kDa gồm 99 axit amin (Hình 2). Sự tương tác giữa chúng tạo thành cấu trúc
không gian với 3 miền (domain) chính quyết định chức năng và các tính chất khác
của protease HIV-1 [39]. Đầu tiên là miền kết thúc (terminal domain) gồm phiến
gấp nếp β được tạo thành từ 4 đầu cuối của cả 2 tiểu phần (axit amin 1-4 và 90-95
của mỗi tiểu phần), vòng quay tạo thành từ các axit amin 4-9 và vòng xoắn α (các
axit amin 86-94 của mỗi tiểu phần). Miền này khá quan trọng trong việc hình thành
và ổn định dạng dimer của một protease có hoạt tính. Tiếp theo là 2 miền lõi (core
domain) với sự tham gia của các axit amin từ 10-32 và 63-85 của mỗi tiểu phần.
Trung tâm hoạt động của enzyme với một trình tự bảo thủ cao Asp25-Thr26-Gly27
được tạo thành ở mặt phân giới của các miền lõi từ cả 2 tiểu phần. Miền lõi có tính
quyết định đối với sự ổn định của dimer cũng như hoạt tính xúc tác của protease.
Miền cuối cùng còn được gọi là “mũ” (flap domain) gồm một vòng được tiếp xúc
phần lớn với dung môi (gốc 33-43) trước một cấu trúc cặp tóc có chứa mũ (các axit
amin 44-63). Các chất ức chế hoặc cơ chất liên kết giữa hai tiểu phần bằng liên kết
hydro và tương tác Van der Waals với vị trí hoạt động gồm hai bộ ba đặc trưng và
hai mũ linh hoạt. Các mũ gấp xuống cơ chất hoặc các chất ức chế và hoạt động
trong suốt quá trình xúc tác cùng với việc liên kết cơ chất cũng như loại trừ phân tử
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng

Lớp Cao học K18 Khóa 2009-2011
10
nước từ vị trí hoạt động. Có một phân tử nước được giữ lại hình thành nên cầu nối
giữa chất ức chế và nhóm –NH- của Ile 50/50’ –NH- ở các mũ. Phân tử nước này
rất thiết yếu cho sự thủy phân của protease và có thể bị thay thế bởi một nhóm
cacbonyl có trong một chất ức chế thích hợp nào đó. Các nghiên cứu cũng đã chứng
minh rằng các mũ của protease thực sự mềm dẻo và tính chất mềm dẻo này có thể
quan trọng đối với hoạt tính của enzyme. Nếu đột biến xuất hiện ở vị trí mũ có thể

làm giảm mạnh hoạt tính của enzyme [11, 39].

Hình 2: Cấu trúc không gian của protease HIV-1 [39]
1.2.3. Chức năng của protease HIV-1
Protease là enzyme không thể thiếu có vai trò quan trọng trong quá trình tái
bản của HIV-1. Nó cắt phân tử polyprotein (gag, gag-pol) thành các protein cấu
trúc, có chức năng cần thiết cho virus trưởng thành. Cụ thể, protease HIV-1 nhận
biết 9 trình tự peptide khác nhau trên polypeptide gag để tạo ra các protein cấu trúc:
matrix, capsid, nucleocapsid cùng với các protein có khối lượng phân tử bé p2, p1
và p6 có vai trò trong quá trình lắp ráp và xác định hình thái của lớp vỏ trưởng
thành; thủy phân polypeptide gag-pol tạo thành 3 enzyme: protease, RT và
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng

Lớp Cao học K18 Khóa 2009-2011
11
intergrase cần thiết cho quá trình sao chép của virus HIV và thủy phân polypeptide
env thành các protein vỏ gp120 và gp41 của HIV-1 [4, 39] (Hình 3).
Mặc dù, các tế bào ở động vật có vú cũng có protease aspartyl và các
protease khác nhưng chúng không có khả năng phân cắt các polyprotein gag, gag-
pol như protease của HIV-1. Ngoài ra, protease HIV-1 không những cắt các
polyprotein của chính nó mà còn thủy phân rất nhiều protein của vật chủ như actin,
Bcl2, procaspase 8 [29]. Đây chính là cơ sở để tạo ra các cơ chất đặc hiệu của
protease HIV-1 [4].

Hình 3: Sơ đồ phân cắt polyprotein gag và gag-pol của HIV-1 để hình thành
các protein chức năng [39]
Hoạt tính của protease HIV-1 bị ức chế bởi pepstatin A [21] giống như các
protease aspartyl khác. Khi ức chế hoạt tính của protease hoặc gây đột biến trên gen
mã hóa cho protease, các hạt virus được hình thành nhưng không đóng gói phù hợp
để tạo thành thể virus trưởng thành, nên chúng không có khả năng xâm nhiễm vào

tế bào vật chủ. Ngoài ra, protease HIV-1 còn đóng vai trò trong quá trình phát sinh
bệnh. Khi chuyển vào tế bào người hoặc virus, protease HIV-1 gây độc và cắt nhiều
protein của vật chủ như actin, Bcl2 và procaspase 8. Các nghiên cứu cũng khẳng
định, sử dụng các chất ức chế protease có thể ngăn chặn hiện tượng chết theo
chương trình do protease HIV-1 gây nên [34].
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng

Lớp Cao học K18 Khóa 2009-2011
12
1.2.4. Tạo protease HIV-1 tái tổ hợp
Do vai trò quan trọng của protease HIV-1, việc sản xuất và tinh sạch với
lượng đủ lớn enzyme này là cần thiết cho các nghiên cứu nhằm phát triển các loại
thuốc ức chế protease trong điều trị bệnh HIV/AIDS. Chính vì vậy từ khi HIV được
phát hiện cho đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu để sản xuất protease HIV-
1 bằng cách biểu hiện trên vi khuẩn E. coli hoặc trên nấm men Saccharomyces
cerevisiae hoặc bằng cách tổng hợp hóa học monomer 99 axit amin. Tuy nhiên, quá
trình sản xuất protease HIV-1 gặp nhiều trở ngại trong việc biểu hiện và tinh sạch.
Năm 1989, Darke và tập thể [8] đã sử dụng promoter trp của vector pPRT để
biểu hiện protease HIV-1. Protease sau khi được tinh sạch qua hệ thống cột DEAE-
sephadex A-25 và phosphocellulose có khối lượng khoảng 11 kDa, bao gồm 99 axit
amin, có hoạt tính phân cắt protein gag p55 thành p24 và p17 cũng như phân cắt cơ
chất tổng hợp. Kết quả nghiên cứu tính chất cũng cho thấy, hoạt tính của protease
tinh sạch bị ức chế bởi pepstatin A và khi gây đột biến thay Asp-25 thành Asn-25,
protease chỉ còn 1% hoạt tính so với dạng protease nguyên bản ban đầu.
Năm 1990, Cheng và tập thể [6] đã sử dụng tế bào E. coli JM105 đồng nhiễm
với phage αCE6 để biểu hiện và tinh sạch protease HIV-1 với số lượng lớn. Protease
HIV-1 thu được chủ yếu ở dạng thể vùi, sau đó được hòa tan bằng ure 8 M, tinh sạch
qua cột lọc gel ACA54 rồi được hồi tính để thu được dạng hoạt động và thử hoạt tính
với cơ chất tổng hợp. Kết quả, protease HIV-1 được tinh sạch với hiệu suất 20 mg từ
1 lít môi trường nuôi cấy, có khả năng phân giải peptide với hoạt độ 450

nmol/phút/mg protein, một bước tinh sạch qua cột tiếp theo làm tăng hoạt độ lên 800
nmol/phút/mg. Khi so sánh với protease HIV-1 thu được từ các điều kiện không biến
tính cho thấy protease ở dạng biến tính sau đó sẽ được hồi tính hiệu quả.
Năm 1992, Rangwala và tập thể [32] đã biểu hiện protease HIV-1 ở vi khuẩn
E. coli và thu được protease tái tổ hợp chiếm từ 8 đến 10% protein tổng số của tế
bào bằng cách thay đổi một số thông số như: promoter; sử dụng các codon ưa thích
đối với E. coli; thêm trình tự giàu A+T ở vùng 5’ mã hoá; gen được biểu hiện dưới
dạng protein dung hợp với hai trình tự tự cắt trong tế bào.
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng

Lớp Cao học K18 Khóa 2009-2011
13
Leuthardt và Roesel [23] đã nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch protease HIV-
1 tái tổ hợp bằng hệ thống vector pDS56/3H-3H ở E. coli. Bằng hệ thống biểu hiện
này, protease được gắn thêm 3 gốc Histidine (His) ở đầu cùng N và đầu cuối C để
thuận tiện cho quá trình tinh sạch. Nghiên cứu cho thấy 90% protease HIV-1 sau
biểu hiện thu được ở phân đoạn kết tủa (pellet) của tế bào vi khuẩn và được hòa tan
hiệu quả bằng đệm ly giải có guanidine 6 M. Sau khi tinh sạch bằng hệ thống cột
trao đổi anion và sắc ký ái lực Ni-agarose, protease tái tổ hợp được hồi tính và có
hoạt tính cắt cơ chất gag p55 của HIV-1 và cơ chất tổng hợp đặc hiệu giống như
protease tự nhiên.
Năm 2007, Chen và tập thể [5] đã sử dụng hệ thống biểu hiện bên ngoài tế
bào (E. coli cell-free system) của hãng Roche, Grenzacherstrasse (Thụy Sỹ) để biểu
hiện trực tiếp protease HIV-1 trong điều kiện in vitro. Để nhân bản DNA cho biểu
hiện protein in vitro, hai phản ứng PCR đã được tiến hành. Phản ứng PCR thứ nhất
nhân bản đoạn gen mã hóa protease HIV-1 đặc hiệu. Trong phản ứng PCR thứ hai,
C-terminal His-tag và các nhân tố điều hòa cần thiết cho biểu hiện protein ở hệ
thống tế bào nhân sơ dựa trên T7 polymerase (T7 promoter, vị trí liên kết ribosome
của vi khuẩn, T7 terminator, mã mở đầu, mã kết thúc) được bổ sung vào. Sản phẩm
PCR cuối cùng có thể biểu hiện trực tiếp protein không cần bất kỳ bước tinh sạch

nào. Phân tích phân đoạn hòa tan và không tan của hệ thống biểu hiện bằng điện di
protein cho thấy thu nhận được protease mong muốn chủ yếu ở phân đoạn hòa tan.
Khi được biểu hiện ở E. coli, protease HIV-1 có khả năng gây độc giết chết tế
bào [34]. Để hạn chế tính độc này, một vài nhóm nghiên cứu đã nhân dòng và biểu
hiện protease HIV-1 bằng cách sử dụng các hệ thống biểu hiện và quy trình biểu hiện
khác nhau như sử dụng các promoter trp, λP
L
, T7, araBAD và tac [8, 18, 35]. Nghiên
cứu biểu hiện protease dưới dạng dung hợp với nhiều protein khác nhau để tăng tính
tan của protease như -galactosidase, dihydrofolate reductase, -lactamase, maltose
hoặc gắn với phân tử IgG [10, 24, 35]. Protease được liên kết với IgG bởi liên kết
peptide Asp-Pro, liên kết này không bị cắt bởi protease của virus. Protein dung hợp
có khối lượng phân tử 25,4 kDa vẫn có hoạt tính xúc tác, cắt cơ chất peptide tại đúng
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng

Lớp Cao học K18 Khóa 2009-2011
14
vị trí liên kết Tyr-Pro. Protease nguyên bản có thể được thu lại bằng cách ủ protease
dung hợp với axit formic, cắt liên kết Asp-Pro [10]. Komai và tập thể [18] đã biểu
hiện protease HIV-1 trên hệ thống vector có sử dụng T7 promoter trong tế bào E. coli
chủng BL21 (DE3) với chế phẩm protease có hoạt tính cao gấp mười lần so với khi
sử dụng các vector tương tự. Nghiên cứu của nhóm tác giả cho thấy hệ thống biểu
hiện này cũng phù hợp với việc biểu hiện các protein độc khác trong E. coli.
Nhìn chung, các nghiên cứu về biểu hiện protease HIV-1 cho thấy quá trình
sản xuất enzyme này gặp nhiều khó khăn do: protease gây độc với tế bào chủ;
protein đích được biểu hiện chủ yếu ở dạng không hòa tan (90% ở dạng thể vùi);
hàm lượng thu được rất thấp chỉ có thể phát hiện bằng phương pháp thẩm tách miễn
dịch [19, 23]. Tuy nhiên, các nghiên cứu cũng cho thấy, bằng việc đồng biểu hiện
với plasmid pLysS, pLysE có thể hạn chế được tính độc và protease HIV-1 khi
được biểu hiện cùng với các protein dung hợp sẽ làm tăng hiệu suất biểu hiện, tăng

tính tan và thuận tiện cho tinh sạch nhưng vẫn đảm bảo hoạt tính [10, 23-24, 35].
Ở Việt Nam, protease HIV-1 là một trong số những enzyme được nghiên cứu
nhiều nhất trong những thập kỷ qua và các nghiên cứu chủ yếu là điều tra, tách chiết
và nghiên cứu một số tính chất trên đối tượng vi sinh vật. Tuy nhiên, protease HIV-
1 từ các bệnh nhân Việt Nam là vấn đề chưa được nghiên cứu nhiều.
Năm 2010, Nguyễn Thị Hồng Loan và tập thể [2] đã thành công trong biểu
hiện và tinh sạch protease HIV-1 trên hệ thống vector pET32a, ở tế bào E. coli.
Protease HIV-1 biểu hiện có hoạt tính cắt cơ chất tổng hợp giống trong tế bào chủ.
Xuất phát từ thực tế, ở tế bào E. coli, protease HIV-1 thường chỉ có hoạt tính
khi được biểu hiện ở dạng tự cắt tại liên kết Phe (Tyr)-Pro để giải phóng chuỗi
polypeptide với axit amin mở đầu chuỗi là Pro [8]. Các nghiên cứu cũng cho thấy,
protease HIV-1 khi được biểu hiện cùng các protein dung hợp sẽ làm tăng hiệu suất
biểu hiện, tăng độ hòa tan và thuận tiện cho quá trình tinh sạch mà vẫn đảm bảo
được hoạt tính tự cắt [25, 32, 35, 37].
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng

Lớp Cao học K18 Khóa 2009-2011
15
Chƣơng 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu
2.1.1. Mẫu huyết thanh
Mẫu huyết thanh đã bất hoạt virut lấy từ các bệnh nhân đang điều trị
kháng virut tại Bệnh viện Nhiệt đới Trung ương.
2.1.2.Các hệ vector và chủng vi sinh vật
Đoạn gen mã hóa protease của HIV được đưa vào vector nhân dòng
pCR2.1 là kết quả của nghiên cứu của Nguyễn Thị Hồng Loan và tập thể [2].
Vector nhân dòng pGEM-T của hãng Promega. Các vector: pET28a,
pET32a và pET43a của hãng Novagen (Mỹ).
Các chủng vi khuẩn E. coli DH5α; E. coli BL21 (DE3) pLysS; E. coli BL21

(DE3) RIL được mua từ hãng Novagen.
2.1.3. Hóa chất
Thang chuẩn protein nhuộm sẵn, hỗn hợp dNTP (dATP, dCTP, dGTP và dTTP)
của hãng Fermentas. Các oligonucleotide được thiết kế và đặt mua từ hãng Invitrogen.
Kit tinh sạch DNA trên gel điện di của hãng Bioneer và Fermentas. Các hoá chất giải
trình tự do hãng Beckman Coulter cung cấp. Kháng thể đơn dòng kháng protease HIV-
1 được mua từ hãng Gene-Tex. Gel sắc ký ái lực His-bind của hãng Novagen. Các hoá
chất còn lại đều đạt độ tinh khiết dùng cho nghiên cứu sinh học phân tử.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Tách chiết RNA hệ gen HIV-1 và tổng hợp cDNA
RNA của HIV-1 được tách và tinh sạch từ các mẫu huyết thanh bệnh nhân
nhiễm HIV-1 theo kit QIAamp Ultrasen virus của Qiagen với các dung dịch (đệm) kèm
theo với các ký hiệu là AR, AB, AW1, AW2, AVE. Quy trình thực hiện như sau:
Huyết thanh (400 µl) đã được tách sẵn từ máu tổng số được chuyển sang ống
eppendorf, 400 µl dung dịch đệm phosphate chứa muối (PBS) và 640 µl đệm AC,
0,56 µl dung dịch chất mang RNA (RNA carrier) được bổ sung nhằm tăng khả năng
gắn RNA virus, hỗn hợp được trộn đều và ủ ở nhiệt độ phòng 10 phút. Mẫu sau đó
được ly tâm ở 3.000 vòng/phút trong 3 phút ở nhiệt độ phòng để loại bỏ dịch nổi.
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng

Lớp Cao học K18 Khóa 2009-2011
16
Kết tủa được hoà tan trở lại trong 240 µl đệm AR đã được làm nóng tới 60
o
C, 16 µl
proteinase K được bổ sung, hỗn hợp được trộn đều trên máy vortex 3-5 lần, mỗi lần
5-10 giây. Tiếp theo, hỗn hợp được ủ tiếp ở 40
o
C trong 10 phút và lắc đều cứ sau 5
phút 1 lần. 240 µl đệm AB được bổ sung vào hỗn hợp và trộn đều bằng máy vortex.

Sau đó, hỗn hợp được đưa vào cột QIAamp Spin và được ly tâm ở 7.000 vòng/phút
trong 1 phút ở nhiệt độ phòng. Có thể lặp lại bước này nhiều hơn 1 lần để RNA gắn
với cột được nhiều nhất. Cột sau đó được chuyển sang ống eppendorf mới và được
rửa 2 lần bằng đệm AW1 và AW2 kết hợp ly tâm ở 14.000 vòng/phút trong 3 phút.
Cuối cùng, cột được chuyển sang một ống eppendorf mới. 60 µl đệm AVE được bổ
sung, hỗn hợp được ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 1 phút để thu hồi lại RNA.
Mẫu được bảo quản ở -20
o
C đến khi sử dụng.
2.2.2. Tổng hợp cDNA từ RNA virus
RNA của HIV-1 được chuyển thành cDNA bằng enzyme M-MLV reverse
transcriptase của Hãng Enzynomics.
cDNA được tổng hợp theo quy trình: 10 l RNA của HIV-1 và 1 l mồi
ngẫu nhiên (0,2 g) được biến tính ở 70
o
C trong 5 phút, làm lạnh trên đá. Hỗn hợp
phản ứng sau đó được bổ sung 2 l đệm M-MLV reverse transcriptase 10x, 2,5 l
hỗn hợp dNTP (dATP, dCTP, dGTP và dTTP) 2 mM, 3,5 l H
2
O, 0,5 µl chất ức
chế ribonuclease và 0,5 l M-MLV reverse transcriptase, hỗn hợp phản ứng được ủ
ở 37
o
C trong 90 phút, phản ứng được kết thúc bằng xử lý nhiệt ở 70
o
C trong 10 phút
và làm lạnh trên đá. Các mẫu cDNA sau đó được bảo quản ở -20
o
C để dùng cho các
thí nghiệm tiếp theo.

2.2.2. Tách chiết và định lƣợng DNA
DNA plassmid được tách chiết theo kit của Hãng Fermentas.
Nguyên lý: Màng tế bào bị dung giải bằng SDS để giải phóng plasmid. Trong
môi trường kiềm, trong khi DNA nhân sẽ bị biến tính và kết tủa khi hỗn hợp được
trung hòa bằng axit thì plasmid do có cấu trúc siêu xoắn nên quá trình biến tính xảy
ra ở mức độ vừa phải và sẽ nhanh chong được hồi tính khi trung hòa, do vậy,
plasmid được tách riêng khỏi DNA nhân. Mặc khác, sự phá vỡ màng tế bào được
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng

Lớp Cao học K18 Khóa 2009-2011
17
điều khiển bằng thời gian tiếp xúc với SDS sao cho màng nhân không bị phá hủy,
sự giải phóng DNA nhân là tối thiểu.
Quy trình: Một khuẩn lạc trên đĩa thạch được cấy vào 1,5 ml môi trường LB
lỏng có chứa kháng sinh phù hợp, được nuôi cấy lắc ở 37
0
C, 180 vòng/phút trong 14-
16 giờ. Dịch nuôi cấy được ly tâm ở 8.000 vòng/phút trong 2 phút ở 25
0
C để thu tế
bào. Sau đó, tủa tế bào được hòa trong 250 l dung dịch I đã được bổ sung RNase và
ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút, tiếp tục bổ sung 250 l dung dịch II, lắc đều rồi ủ ở nhiệt
độ phòng trong 5 phút và trung hòa bằng 350 l dung dịch III, ủ trên đá từ 3-5 phút.
Sau các bước phá màng, giải phóng DNA, hỗn hợp được ly tâm 13.000 vòng/phút
trong 20 phút, thu dịch trong. Dịch này được nạp lên cột (kèm theo kit) và để tĩnh một
phút ở nhiệt độ phòng. Trong giai đoạn này, DNA plasmid có ái lực với gel sẽ được
giữ lại trên cột. Cột được rửa với 500 l đệm PE 2 lần, ly tâm 13.000 vòng/phút trong
1 phút để loại dịch rửa. Cột được ly tâm thêm một lần nữa nhằm loại hết EtOH còn
sót lại sau bước rửa. DNA plasmid được đẩy ra khỏi gel bằng 30-50 l đệm EB. Độ
tinh sạch của DNA plasmid sau đó được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose.

DNA plasmid sau khi tinh sạch được định lượng bằng cách đo độ hấp thụ ánh
sáng tử ngoại của các axit nucleic ở bước sóng 260 nm (A
260
). A
260
= 1 tương đương
với hàm lượng DNA là 50 μg/ml và tương đương với hàm lượng RNA là 40 μg/ml.
DNA plasmid được cho là sạch khi giá trị A
260
/A
280
nằm trong khoảng 1,8-2,0.
2.2.3. Điện di DNA trên gel agarose
Nguyên tắc: Các phân tử DNA là các polyanion nên trong môi trường trung
tính và kiềm, dưới tác dụng của điện trường chúng sẽ di chuyển về cực dương. Mức
độ di chuyển của các phân tử DNA trong điện trường phụ thuộc chủ yếu vào kích
thước của chúng và nồng độ gel.
Quy trình tiến hành: Gel agarose được chuẩn bị trong đệm TAE với
nồng độ EDTA 1-2 mM để tránh sự phân cắt DNA bởi nuclease. Mẫu DNA
được trộn với đệm mẫu có chứa chất chỉ thị màu là bromophenol xanh, xylene
cyanol và Ethidium bromide 50 g/ml sau đó tra vào Đường chạy. Điện di được
tiến hành với điện thế ổn định khoảng 10 volt/cm gel và chạy trong vòng 25-30
Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Văn Dũng

Lớp Cao học K18 Khóa 2009-2011
18
phút. Sau khi kết thúc điện di bản gel được lấy ra soi và chụp ảnh dưới ánh
sáng tử ngoại của máy soi gel Doc (Bio-Rad).
2.2.4. Nhân bản các đoạn gen bằng kỹ thuật PCR
Sử dụng cặp mồi HIV Fw/Rv được thiết kế để nhân bản đặc hiệu đoạn gen

mã hóa cho protease HIV-1 từ nghiên cứu của Nguyễn Thị Hồng Loan và tập thể
[2]. Để thuận tiện cho quá trình biểu hiện sau này, có vị trí cắt giới hạn của enzyme
BamHI trên mồi xuôi và enzyme XhoI trên mồi ngược. Ngoài ra, trên mồi xuôi còn
có thêm 21 nucleotide mã cho trình tự tự cắt gồm 7 axit amin, Gly-Thr-Val-Ser-
Phe-Asn-Phe, tương ứng với vị trí cắt đặc hiệu giữa p17 và p24 trên gen gag của
HIV-1. Trình tự cặp mồi như sau (vị trí cắt enzyme giới hạn được thể hiện bằng chữ
có gạch chân; trình tự tự cắt được thể hiện bằng chữ in nghiêng):
 HIV-Fw: 5’-GGGCGGATCCACTAGT
(BamHI)
GGAACTGTATCCTTTAACTTCCCTCAGATCACTCTTTGGC-3’
 HIV-Rv: 5’ GAGTCCTCGAGAAAATTTAAAGTGCAGCCAATCTG-3’
(XhoI)
PCR được tiến hành với khuôn là vector pCR2.1 mang đoạn gen mã hoá protease
HIV-1 (pCR2.1-Prot) [2]. Thành phần của phản ứng PCR được trình bày ở bảng 1.

Bảng 1. Thành phần của phản ứng PCR

Thành phần
Thể tích (μl)
dd H
2
O
17
Đệm Taq DNA polymerase 10X
2,5
Taq DNA polymerase (5 đơn vị/l)
0,5
dNTPs 2 mM
2,5
HIV-F

w
10 pmol
1
HIV-R
w
10 pmol
1
pCR2.1-Prot
0,5
Tổng thể tích
25