Nghiên cứu gen mã hóa protease HIV mang đột biến kháng thuốc

Nghiên cứu gen mã hóa protease HIV mang
đột biến kháng thuốc

Nguyễn Văn Dũng

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên; Khoa Sinh học
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30
Người hướng dẫn: PGS.TS. Phan Tuấn Nghĩa
Năm bảo vệ: 2011


Abstract. Tổng quan về Virus suy giảm miễn dịch ở người (Human
immunodeficiency Virus - HIV). Giới thiệu Protease của HIV-1 (gọi tắt là Protease
HIV-1). Trình bày về nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu. Phát hiện đột biến
kháng thuốc PI trong gen mã hóa protease HIV-1. Thiết kế hệ thống biểu hiện gen
mã hóa protease HIV-1 mang đột biến N83T trong vector pET32a

Keywords. Sinh học thực nghiệm; Gen; Đột biến kháng thuốc; HIV


Content

Virus suy giảm miễn dịch ở người (Human immunodeficiency virus - HIV) là
nguyên nhân chính gây ra hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (Acquired
Immunodeficiency Syndrome - AIDS) và là một trong những virus gây bệnh nguy hiểm
nhất hiện nay. Theo các tài liệu đã công bố, có ít nhất hai type HIV gây nên AIDS đó là
HIV type 1 (HIV-1) và HIV type 2 (HIV-2), nhưng HIV-1 là nguyên nhân chính gây ra
AIDS trên toàn thế giới.
Theo số liệu của Tổ chức Y tế Thế giới, tính đến cuối năm 2009 có khoảng 33,3 triệu
người đang sống chung với HIV/AIDS, khoảng 1,8 triệu người đã chết vì AIDS và có thêm 2,6
triệu trường hợp mới bị nhiễm virus này. Ở Việt Nam, theo báo cáo Cục phòng chống

HIV/AIDS - Bộ Y tế tính đến 31/3/2011, toàn quốc đã phát hiện người nhiễm HIV tại hơn
75,2% xã/phường, gần 97,9% quận/huyện và 63/63 tỉnh/thành phố. Tổng số trường hợp nhiễm
HIV là 235.535 người, số bệnh nhân AIDS là 94.613 người, số trường hợp tử vong đến cuối kỳ
báo cáo là 49.912 người.
Trong chu trình sống của HIV-1, protease là enzyme không thể thiếu. Enzyme này
cắt các chuỗi polyprotein (gag, gag-pol) tại những vị trí nhất định để tạo thành các protein
cấu trúc và chức năng cần thiết cho virus hoàn chỉnh. Vì thế protease được xem là một
trong các đích tác động quan trọng nhất cho liệu pháp tìm ra thuốc điều trị HIV/AIDS. Tuy
nhiên, do HIV sao chép nhanh, enzyme phiên mã ngược có tỷ lệ sai sót cao tạo ra sự biến
đổi liên tục trong cấu trúc hệ gen của các nhóm HIV dẫn đến tình trạng kháng thuốc. Mặc
dù ngày càng nhiều chất ức chế protease chống HIV được sản xuất và thương mại hóa
nhưng việc tìm các chất ức chế mới của protease vẫn luôn được quan tâm.
Bên cạnh đó, các đột biến kháng PI tương đối đặc hiệu cho từng loại thuốc riêng biệt, do
đó thay thế một loại thuốc khác trước khi có sự tích lũy đột biến thì các phác đồ sau vẫn
thành công (Hoffmann và tập thể, 2007). Vì vậy, xét nghiệm kháng thuốc thường theo
hướng phát hiện đột biến trong gen mã hóa protease HIV-1 có vai trò rất quan trọng trong
việc xây dựng phác đồ điều trị HIV/AIDS.
Ở Việt Nam, gen mã hóa protease HIV mang đột biến kháng thuốc là vấn đề còn ít
được nghiên cứu. Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào xác định nhóm virus gây bệnh chủ
yếu ở người Việt Nam và tìm ra một số đột biến liên quan kháng thuốc. Đặc biệt, chưa có
nghiên cứu nào về biểu hiện gen mã hóa protease HIV mang đột biến kháng thuốc phân
lập từ các bệnh nhân người Việt Nam.
Đề tài nghiên cứu của chúng tôi được đặt ra là nhằm phát hiện một số đột biến
kháng thuốc trong gen mã hóa của protease của HIV, đồng thời bước đầu biểu hiện gen
này trong vi khuẩn E. coli để làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo.
Các nghiên cứu của luận văn được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ
Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về HIV
1.1.1. HIV/AIDS

Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải được gọi tắt là AIDS, do virus HIV gây ra
sự suy giảm miễn dịch ở người được phát hiện ở Mỹ năm 1981, đến nay đã trở thành “căn
bệnh thế kỷ” trên toàn thế giới.
Về phân loại, HIV là các Retrovirus có bộ máy di truyền thuộc họ Retroviridae với hai
type chính là HIV type 1 (HIV-1) và HIV type 2 (HIV-2), trong đó HIV-1 gây ra 98% sự
lan truyền còn HIV-2 chỉ chiếm ưu thế ở vùng tây châu Phi, ít lan truyền trên thế giới [1,
15]. Vì vậy, HIV-1 được xem như là nguyên nhân chính gây nên AIDS.
HIV-1 được chia thành 3 nhóm là M (main), O (outlier), nhóm N (new) trong đó hơn 90%
sự lây nhiễm của HIV thuộc nhóm M. Trong nhóm M gồm các phân nhóm A, B, C, D, F,
G, H, J, K và nhiều dạng tái tổ hợp khác (circulating recombinant form-CRF). Các phân
nhóm khác nhau chủ yếu ở cấu trúc của các protein vỏ và đặc trưng cho sự truyền nhiễm
theo khu vực địa lý. Đây là một đặc điểm đáng lưu ý trong các nghiên cứu để tìm ra thuốc
điều trị cho các bệnh nhân HIV/AIDS theo từng khu vực [14].
Về cấu trúc, HIV có dạng hình cầu với kích thước khoảng 120 nm, được mô tả ở
hình 1. Lớp vỏ ngoài cùng của virus HIV bao gồm một lớp màng lipid kép có nguồn gốc từ
tế bào chủ, trên lớ vỏ này có chứa khoảng 72 bản sao protein env của virus, mỗi protein
env lại chứa một mũ được tạo thành từ 3 phân tử gp120 còn thân được tạo thành từ 3 phân
tử gp41 có chức năng neo giữ lõi virus với vỏ bao ngoài. Lõi virus có dạng như hạt đậu tạo
thành từ 2.000 bản sao của protein p24. Trong lõi bao gồm hệ gen của HIV là hai sợi RNA
(+) đơn, mỗi sợi có kích thước khoảng 10 kb gồm 9 gen mã hóa cho 15 protein khác nhau.
Cuối mỗi chuỗi RNA là các trình tự được gọi là trình tự lặp lại tận cùng dài (LTRs) đóng
vai trò trong việc kiểm soát sự nhân lên cũng như điều hòa quá trình tổng hợp protein của
virus. Giống như các retrovirus khác, HIV có 3 gen chính gag, pol và env mã hóa cho các
protein tham gia vào quá trình sao chép và trưởng thành của virus. Sản phẩm ban đầu của
gen gag là một protein 56 kDa, sau đó được chế biến thành ít nhất 3 sản phẩm p17, p24 và
p15 là các protein cấu trúc của virus. Gen pol mã hóa cho các enzyme reverse transcriptase
(RT), intergrase và protease trong đó enzyme RT có chức năng phiên mã ngược RNA của
virus thành cDNA; enzyme intergrase chèn cDNA vào nhiễm sắc thể của tế bào chủ còn
protease tham gia vào quá trình cắt các phân tử protein tiền thân dưới dạng polypeptide
thành các protein cấu trúc và chức năng cần cho sự hình thành của thể virus. Gen env mã

hóa cho các glycoprotein capsid của virus; sản phẩm của gen env (gp160) được cắt bởi
protease của tế bào chủ thành gp120 và gp41 sau đó lắp ráp lại thành cấu trúc tam phân
trong lớp vỏ virus. Ngoài 3 gen chính, HIV còn có 6 gen khác (tat, rev, nef, vif, vpr và vpu)
chứa thông tin mã hóa cho các protein có khả năng kiểm soát sự tái bản, các cách lây
nhiễm khác nhau hoặc nguy cơ nhiễm các loại bệnh khác nhau [5, 17, 22].

1.1.2. Tình hình nhiễm HIV/AIDS
Theo thông báo của Tổ chức y tế thế giới (WHO) và Chương trình phối hợp phòng
chống AIDS của Liên hiệp quốc (UNAIDS) đến cuối năm 2009 ước tính khoảng 33,3 triệu
người đang mang căn bệnh HIV/AIDS, trong đó số đối tượng mới là 2,6 triệu người và có
khoảng 1,8 triệu bệnh nhân đã chết vì AIDS. Tại khu vực châu Á, có khoảng 4,87 triệu
người đang sống cùng với HIV/AIDS ở các khu vực Đông Nam và Nam Á; tình hình phát
triển của bệnh này ngày càng tăng với những diễn biến phức tạp. Theo dự đoán, khu vực
này sẽ trở thành trung tâm của đại dịch HIV/AIDS trong vài thập kỉ tới [37].
Ở Việt Nam, theo UNAIDS [36], tính đến ngày 30/9/2010 trên cả nước có 180.631
trường hợp nhiễm HIV/AIDS, trong đó có 42.339 bệnh nhân AIDS và tổng số người chết
vì AIDS được báo cáo là 48.368. Cho đến nay, đã có trên 74% xã, phường và 97,8% quận,
huyện trên toàn quốc báo cáo có người nhiễm HIV/AIDS. Thành phố Hồ Chí Minh vẫn là
địa phương có tỷ lệ bệnh nhân HIV/AIDS cao nhất với 23% tổng số bệnh nhân trong cả
nước. Phân tích hình thái lây nhiễm cho thấy, trong số những người mới được phát hiện
nhiễm HIV trong 3 quí đầu năm 2010 có 49% bị nhiễm qua đường máu, 38% qua đường
tình dục, 3% qua đường mẹ - con và 10% không rõ đường lây. Tỷ lệ nam giới nhiễm HIV
chiếm 70,8% và nữ giới chiếm 29,2%. Phần lớn người nhiễm HIV được phát hiện trong 9
tháng qua ở tuổi từ 20-39 (chiếm 82%), trẻ em dưới 15 tuổi chiếm gần 3%. Theo đánh giá
chung, tình hình nhiễm HIV/AIDS có xu hướng giảm nhưng đại dịch HIV/AIDS vẫn trong
giai đoạn tập trung – xảy ra chủ yếu trong các nhóm có hành vi nguy cơ cao, đặc biệt trong
nhóm tiêm chích ma túy và nhóm người mại dâm.
Do những hậu quả to lớn của đại dịch HIV/AIDS đối với sự phát triển xã hội trên
phạm vi toàn cầu, việc tìm ra vaccine phòng ngừa hiệu quả và thuốc đặc trị cho căn bệnh này
là vấn đề cấp thiết đối với các nhà khoa học y học và sinh học phân tử.

1.1.3. Phƣơng pháp điều trị HIV/AIDS
Cách điều trị HIV/AIDS phổ biến nhất là dùng thuốc chống virus, đây là thuốc có
tác dụng ức chế sự phát triển và nhân lên của HIV ở những giai đoạn khác nhau trong vòng
đời của virus. Hiện tại có một số nhóm chất chống HIV đang được sử dụng dựa trên cơ chế
tương đồng về cấu trúc dẫn đến cạnh tranh hoạt động. Chúng được chia thành 5 nhóm
chính gồm: các chất có bản chất nucleoside (NRTI) ức chế enzyme phiên mã ngược RT,
các chất ức chế protease (PI), các chất ức chế enzyme phiên mã ngược không phải loại
nucleoside (NNRTI), các chất ức chế enzyme phiên mã ngược dạng nucleotide (NTRTI) và
các chất ức chế hòa nhập không cho virus nhân bản. HIV/AIDS còn có thể được điều trị
bằng các thuốc điều hòa miễn dịch như alpha-interferon, interleukin 2, loprinasine với tác
dụng tăng cường khả năng bảo vệ hệ miễn dịch. Ngoài ra, bệnh nhân HIV/AIDS còn có thể
được điều trị với một số thuốc phòng ngừa các bệnh cơ hội [15].
Tuy nhiên, do HIV có tỷ lệ đột biến cao dẫn đến tình trạng kháng thuốc và việc sử
dụng thuốc điều trị trong thời gian dài dẫn đến các tác dụng phụ. Chính vì vậy, hướng
nghiên cứu tìm ra các loại thuốc chống HIV/AIDS mới cũng như liệu pháp điều trị bằng
cách kết hợp các loại thuốc khác nhau đã và đang là vấn đề cấp bách hiện nay.
1.2. Protease của HIV-1 (gọi tắt là protease HIV-1)
Protease HIV-1 là một enzyme không thể thiếu trong chu trình sống của virus.
Protease cần thiết để phân cắt các tiền chất polyprotein virus gag và gag-pol thành những
protein cấu trúc và chức năng trong quá trình trưởng thành của virus [39]. Các nghiên cứu
cho thấy, khi ức chế hoạt tính của protease hoặc gây đột biến trên gen mã hóa cho protease,
các hạt virus được hình thành nhưng không có khả năng xâm nhiễm vào tế bào vật chủ
[19]. Với vai trò đặc biệt quan trọng như trên, protease HIV-1 là một trong các đích nghiên
cứu nhằm tìm ra loại thuốc ngăn chặn sự nhân lên của HIV.
1.2.1. Gen mã hóa protease HIV- 1
Hệ gen của HIV-1 nằm trong phần lõi của virus và bao gồm hai sợi RNA (+) đơn, mỗi
sợi có chiều dài khoảng 9,8 kb và có 9 gen mã hóa cho 15 protein khác nhau. Trên mỗi sợi
RNA có 3 gen cấu trúc là gag, pol và env; trong đó gag có nghĩa “group-antigen” (kháng
nguyên nhóm), pol là “polymerase” và env là “envelope” (vỏ). Các gen gag và env mã hóa cho
nucleocapsid và glycoprotein của màng virus; gen pol mã hóa cho 3 enzyme: reverse

transcriptase, integrase và protease. Ngoài ra, HIV-1 còn có 6 gen (vif, vpu, vpr, tat, rev và nef)
ở vùng RNA 9 kb (Hoffmann và tập thể, 2007).
Do tốc độ sinh sản nhanh của HIV – 1, có khoảng 10 triệu hạt virus mới được tạo ra mỗi
ngày và tỷ lệ sai sót rất cao của enzyme reverse transriptase (1/10.000 base) dẫn đến tình
trạng kháng thuốc phổ biến ở những bệnh nhân nhiễm bệnh thậm chí khi chưa dùng thuốc.
Nghiên cứu trên các bệnh nhân nhiễm chủng CRF01_AE thất bại trong điều trị HAART ở
Nonthaburi, Thailand được đăng ký trên GenBank với số hiệu từ FJ463512- FJ463596,
phát hiện các đột biến phụ (minor) kháng thuốc PI là M36I và H69K ở hầu hết các bệnh
nhân, I13V, E35D và L89M ở hơn 84% các bệnh nhân được điều trị ATV, ATV/r, IDV/r,
NFV, TPV/r.
Các nghiên cứu về gen mã hóa protease HIV-1 ở Việt Nam chủ yếu tập trung vào xác
định nhóm virus gây bệnh chủ yếu ở người Việt Nam và tìm ra một số đột biến liên quan đến
tính kháng thuốc. Năm 2003, Nguyễn Hoàng Lan và tập thể [21] đã tiến hành đọc trình tự các
gen mã hóa RT, protease và env trên các bệnh nhân nhiễm HIV-1 ở miền Nam, chủ yếu là ở
thành phố Hồ Chí Minh. 198 trong số 200 bệnh nhân nghiên cứu thuộc phân nhóm
CRF01_AE. Nghiên cứu cũng xác định được 6,5% đột biến kháng thuốc chính khi sử dụng
HAART đối với 200 bệnh nhân này. Ishizaki và tập thể [15] cũng tiến hành đọc trình tự gen
mã hóa protease và RT trên đối tượng các bệnh nhân nhiễm HIV-1 ở Hải Phòng. Phân tích
hình thái di truyền của hơn 1.000 bệnh nhân cũng cho thấy phân nhóm HIV-1 gây bệnh của
yếu là CRF01_AE (chiếm 98,3%). Phân tích đột biến kháng thuốc trên 294 bệnh nhân đã chỉ
ra có 0,3% đột biến liên quan đến kháng thuốc ức chế protease tại vị trí M46I.
Trong các đột biến kháng thuốc thì phổ các đột biến kháng PI rất rộng có thể do sự
đa hình xảy ra ở 49 gốc axit amin trong tổng số 99 axit amin của protease. Mặc dù có sự
kháng chéo từ mức độ vừa đến mức độ cao giữa các PI, các đột biến chính là tương đối đặc
hiệu cho từng thuốc riêng biệt. Phần lớn các dữ liệu về đột biến chính phát sinh từ các bệnh
nhân điều trị PI không tăng cường (PI thế hệ thứ nhất). Đột biến chính rất hiếm gặp ở các
phác đồ điều trị bằng PI tăng cường (Hoffmann và tập thể, 2007). Khi điều trị saquinavir
không tăng cường chủ yếu xảy ra đột biến G48V và làm giảm độ nhạy với saquinavir 10
lần; nếu kèm thêm đột biến L90M, mức độ nhạy cảm với saquinavir giảm rõ hơn trên 100
lần (Jacobsen và tập thể, 1995). Trong khi đó, phải cần ít nhất 4 trong số các đột biến

L10I/R/V, G48V, I54V/L, A71V/T, V77A, V82A, I84V và L90M mới có thể làm giảm
hiệu lực của saquinavir tăng cường (Valer và tập thể, 2002).
1.2.2. Cấu trúc của protease HIV-1
Navia và tập thể tại phòng thí nghiệm Mecrk [27] là nhóm đầu tiên tạo được cấu
trúc tinh thể của protease HIV-1 vào năm 1989, kể từ đó cấu trúc của protease đã được
nghiên cứu rộng rãi cả về chức năng, tính đặc hiệu cơ chất cũng như sự liên kết với các
chất ức chế. Protease HIV-1 là một dimer, chứa hai tiểu phần giống hệt nhau được sắp xếp
gần như theo kiểu đối xứng, mỗi tiểu phần có khối lượng khoảng 11 kDa gồm 99 axit amin
1.2.3. Chức năng của protease HIV-1
Protease là enzyme không thể thiếu có vai trò quan trọng trong quá trình tái bản của
HIV-1. Nó cắt phân tử polyprotein (gag, gag-pol) thành các protein cấu trúc, có chức năng
cần thiết cho virus trưởng thành. Cụ thể, protease HIV-1 nhận biết 9 trình tự peptide khác
nhau trên polypeptide gag để tạo ra các protein cấu trúc: matrix, capsid, nucleocapsid cùng
với các protein có khối lượng phân tử bé p2, p1 và p6 có vai trò trong quá trình lắp ráp và
xác định hình thái của lớp vỏ trưởng thành; thủy phân polypeptide gag-pol tạo thành 3
enzyme: protease, RT và intergrase cần thiết cho quá trình sao chép của virus HIV và thủy
phân polypeptide env thành các protein vỏ gp120 và gp41 của HIV-1 [4, 39] (Hình 3).
Hoạt tính của protease HIV-1 bị ức chế bởi pepstatin A [21] giống như các protease
aspartyl khác. Khi ức chế hoạt tính của protease hoặc gây đột biến trên gen mã hóa cho
protease, các hạt virus được hình thành nhưng không đóng gói phù hợp để tạo thành thể
virus trưởng thành, nên chúng không có khả năng xâm nhiễm vào tế bào vật chủ. Ngoài ra,
protease HIV-1 còn đóng vai trò trong quá trình phát sinh bệnh. Khi chuyển vào tế bào
người hoặc virus, protease HIV-1 gây độc và cắt nhiều protein của vật chủ như actin, Bcl2
và procaspase 8. Các nghiên cứu cũng khẳng định, sử dụng các chất ức chế protease có thể
ngăn chặn hiện tượng chết theo chương trình do protease HIV-1 gây nên [34].
1.2.4. Tạo protease HIV-1 tái tổ hợp
Nhìn chung, các nghiên cứu về biểu hiện protease HIV-1 cho thấy quá trình sản
xuất enzyme này gặp nhiều khó khăn do: protease gây độc với tế bào chủ; protein đích
được biểu hiện chủ yếu ở dạng không hòa tan (90% ở dạng thể vùi); hàm lượng thu được
rất thấp chỉ có thể phát hiện bằng phương pháp thẩm tách miễn dịch [19, 23]. Tuy nhiên,

các nghiên cứu cũng cho thấy, bằng việc đồng biểu hiện với plasmid pLysS, pLysE có thể
hạn chế được tính độc và protease HIV-1 khi được biểu hiện cùng với các protein dung
hợp sẽ làm tăng hiệu suất biểu hiện, tăng tính tan và thuận tiện cho tinh sạch nhưng vẫn
đảm bảo hoạt tính [10, 23-24, 35].
Ở Việt Nam, protease HIV-1 là một trong số những enzyme được nghiên cứu nhiều
nhất trong những thập kỷ qua và các nghiên cứu chủ yếu là điều tra, tách chiết và nghiên
cứu một số tính chất trên đối tượng vi sinh vật. Tuy nhiên, protease HIV-1 từ các bệnh
nhân Việt Nam là vấn đề chưa được nghiên cứu nhiều.
Năm 2010, Nguyễn Thị Hồng Loan và tập thể [2] đã thành công trong biểu hiện và tinh
sạch protease HIV-1 trên hệ thống vector pET32a, ở tế bào E. coli. Protease HIV-1 biểu
hiện có hoạt tính cắt cơ chất tổng hợp giống trong tế bào chủ.
Chƣơng 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu
2.1.1. Mẫu huyết thanh
Mẫu huyết thanh đã bất hoạt virut lấy từ các bệnh nhân đang điều trị kháng
virut tại Bệnh viện Nhiệt đới Trung ương.
2.1.2.Các hệ vector và chủng vi sinh vật
Đoạn gen mã hóa protease của HIV được đưa vào vector nhân dòng pCR2.1 là
kết quả của nghiên cứu của Nguyễn Thị Hồng Loan và tập thể [2].
Vector nhân dòng pGEM-T của hãng Promega. Các vector: pET28a, pET32a và
pET43a của hãng Novagen (Mỹ).
Các chủng vi khuẩn E. coli DH5α; E. coli BL21 (DE3) pLysS; E. coli BL21 (DE3)
RIL được mua từ hãng Novagen.
2.1.3. Hóa chất
Thang chuẩn protein nhuộm sẵn, hỗn hợp dNTP (dATP, dCTP, dGTP và dTTP)
của hãng Fermentas. Các oligonucleotide được thiết kế và đặt mua từ hãng Invitrogen. Kit
tinh sạch DNA trên gel điện di của hãng Bioneer và Fermentas. Các hoá chất giải trình tự
do hãng Beckman Coulter cung cấp. Kháng thể đơn dòng kháng protease HIV-1 được mua
từ hãng Gene-Tex. Gel sắc ký ái lực His-bind của hãng Novagen. Các hoá chất còn lại đều
đạt độ tinh khiết dùng cho nghiên cứu sinh học phân tử.

2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Tách chiết RNA hệ gen HIV-1 và tổng hợp cDNA
2.2.2. Tổng hợp cDNA từ RNA virus
2.2.2. Tách chiết và định lƣợng DNA
2.2.3. Điện di DNA trên gel agarose
2.2.4. Nhân bản các đoạn gen bằng kỹ thuật PCR
2.2.5. Nhân dòng đoạn gen mã hóa protease HIV-1
2.2.6. Giải trình tự các đoạn gen mã hóa protease HIV-1 bằng phƣơng pháp Sanger
2.2.7. Biểu hiện gen mã hóa protease HIV-1 ở E. coli
2.2.8. Tinh sạch protease HIV-1 bằng cột sắc ký ái lực His-bind (Novagen)
2.2.10. Nhận dạng protease HIV-1 bằng thẩm tách miễn dịch (Western blotting)
2.2.11. Phân tính hoạt độ của protease HIV-1 theo phƣơng pháp của Richard va
̀
tâ
̣
p
thê
̉

Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phát hiện đột biến kháng thuốc PI trong gen mã hóa protease HIV-1
3.1.1. Xác định trình tự đoạn gen mã hóa protease HIV-1
Trong một nghiên cứu trước đây, Nguyễn Thị Hồng Loan và tập thể [3] đã tiến
hành nhân bản đoạn gen mã hóa cho protease của HIV đã sử dụng kỹ thuật PCR lồng với
hai cặp mồi HIV Fw1/Rv1 (cặp mồi ngoài) và HIV FW2/RV2 (cặp mồi trong). Trong
nghiên cứu này, các tác giả (chúng tôi là đồng tác giả) đã nhân bản thành công đoạn gen
kích thước khoảng 0,34 kb mã hóa cho protease HIV từ 8 trong số 50 bệnh nhân được bệnh
viện xác nhận là nhiễm HIV-1. Trong số 8 mẫu dương tính này chỉ có 2 bệnh nhân thuộc
nhóm đã và đang điều trị thuốc kháng virus (trong đó có thuốc ức chế protease-PI). Đoạn
gen cũng đã được nhóm tác giả nhân dòng và lưu giữ trong vector pCR2.1 dưới dạng

pCR2.1-Prot. Vì vậy chúng tôi đã chọn vector pCR2.1-Prot mang đoạn gen của 01 bệnh
nhân điều trị thuốc kháng virus ký hiệu là 02VN.HN27510 cho các nghiên cứu tiếp theo.
Trước hết, chúng tôi đã tiến hành giải trình tự đoạn gen thu được sau đó được so sánh với
trình tự của đoạn gen tương ứng của HIV thuộc phân nhóm CRF01_AE, mã số EU518273
của Trung Quốc [41].
Kết quả giải trình tự (hình 4) cho thấy đoạn gen mã hóa protease HIV-1 từ vector
tái tổ hợp pCR2.1-Prot có độ tương đồng 96% so với đoạn gen mã hóa protease HIV-1
phân nhóm CRF01_AE mã số EU518273 của Trung Quốc. Các vị trị có sự sai khác về
trình tự nucleotide so với trình tự EU518273 trên Ngân hàng gen là: A6G, A37G, A43G,
T105A, A120G, G225A, A248C, T282C, T285C, C297T. Trình tự gen này đã được chúng
tôi đăng ký trong Ngân hàng gen quốc tế với số hiệu HQ890881.
3.1.2. Phát hiện đột biến kháng thuốc PI trong gen mã hóa protease HIV-1 (Đột biến
N83T)
Chúng tôi đã sử dụng phần mềm Genetyx để dịch trình tự nucleotide của gen mã
hóa proteaase thành trình tự axit amin và so sánh trình tự axit amin suy diễn thu được với
trình tự axit amin được suy ra từ trình tự gen EU518273 (hình 5) và thấy rằng trình tự axit
amin của mẫu virus trong nghiên cứu của chúng tôi có độ tương đồng 96 % so với trình tự
axit amin của đối chứng. Các vị trí thay đổi về axit amin là I13V, I15V, D36E, N83T. Đặc
biệt, đối chiếu trình tự axit amin của protease với ngân hàng dữ liệu HIV quốc tế cho thấy
sự thay thế axit amin Asn ở vị trí 83 bằng Thr (N83T) là một đột biến bất thường và có tính
kháng nhẹ thuốc PI (hình 6). Những bệnh nhân nặng được điều trị PI hay xảy ra đột biến
N83D với sự thay thế N bằng D ở vị trí axit amin 83 [42]. Trong trường hợp bệnh nhân
02VN.HN27510, đột biến N83T là loại đột biến lần đầu tiên được tìm thấy trong gen mã
hóa của protease HIV-1.

Hình 5: So sánh trình tự axit amin của protease HIV-1 thu nhận ở Việt Nam
(HQ890881) so với trình tự của EU518273 trong Ngân hàng Gen quốc tế.

3.2. Thiết kế hệ thống biểu hiện gen mã hóa protease HIV-1 mang đột biến N83T trong
vector pET32a

Việc thiết kế hệ thống biểu hiện gen mã hóa cho protease HIV-1 mang đột biến
N83T được dựa trên cơ sở kết quả biểu hiện gen protease HIV-1 của Nguyễn Thị Hồng
Loan và tập thể (dẫn liệu chưa công bố). Cụ thể là đoạn gen mã hóa cho protease HIV
mang đột biến kháng thuốc N83T được đưa vào vector pET32a dưới dạng protein dung
hợp như được mô tả ở hình 7. Trong đó thioredoxin và đuôi his-tag là của vector pET32a,
còn trình tự nhận biết và phân cắt của protease HIV-1, đoạn HA mã hóa cho epitope của
kháng nguyên vỏ hemagglutinin (HA) của virus cúm tại đầu C cu
̉
a protease HIV -1 là do
chúng tôi dự kiến thiết kế để đưa vào cùng với gen mã hóa cho protease HIV-1. HA có ái
lực rất mạnh với gel protein G-sepharose hay gel anti-HA-agarose, nhờ đó sẽ giúp tăng khả
năng tinh sa
̣
ch protease tái tổ hợp. Epitope của HA bao gồm 9 axit amin là YPYDVPDYA,
kích thước nhỏ nên thường không ảnh hưởng đến đặc tính của protein đích.
Theo cách thiết kế này, nếu gen mã hóa cho protease HIV-1 được biểu hiện và
không có hoạt tính tự cắt của protease HIV-1 tại liên kết Phe-Pro thì protein tái tổ hợp
được tạo thành sẽ dung hợp thioredoxin tại đầu N, có đuôi HA và His-tag, với tổng số 282
gốc axit amin với khối lượng phân tử khoảng 31 kDa. Ngược lại, nếu protein tái tổ hợp tự
cắt tại vị trí đặc hiệu của protease HIV-1 thì sẽ tạo ra protease HIV-1 tái tổ hợp gắn đuôi
HA và His-tag với KLPT khoảng 12 kDa.





Hình 7: Sơ đồ cấu trúc protein dung hợp với protease HIV-1để biểu hiện trong
vector pET32a

3.2.1. Nhân bản đoạn gen mã hóa protease HIV-1 mang đột biến kháng thuốc
N83T
3.2.2. Gắn sản phẩm PCR vào vector pGEM-T Easy và biến nạp vào tế bào E. coli
chủng DH5
3.2.3. Đƣa gen mã hóa protease HIV-1 mang đột biến kháng thuốc vào vector pET32a
Để khẳng định chắc chắn vector pET32a tái tổ hợp thu được mang đoạn gen mã
hoá protease HIV-1, chúng tôi đã tiến hành đọc trình tự gen mã hóa protease HIV-1 trong
vector pET32a.

Hình 14: Trình tự đoạn gen mã hóa protease HIV-1 trong vector pET32-ProtHA
: Axit amin mở đầu và trình tự Trx.Tag
: Vị trí cắt giới hạn của enzyme BamHI và Spe I
: Trình tự tự cắt
: Trình tự protease HIV-1 mang đột biến N83T
: Trình tự 9 axit amin HA
: Trình tự của enzyme XhoI
: Trình tự 6 His.Tag
3.2.4. Cảm ứng biểu hiện protease HIV-1 mang đột biến N83T trong vi khuẩn E. coli BL21
(DE3) RIL
Kết quả điện di cũng còn cho thấy protein tái tổ hợp có mặt trong phân đoạn kết tủa
nhiều hơn trong dịch chiết. Tuy vậy, băng protein tái tổ hợp 19 kDa là không tương đương với
KLPT của protease HIV-1 tái tổ hợp dạng dung hợp gắn với thioredoxin (KLPT tổng cộng là
31 kDa) hay dạng tự cắt khỏi thioredoxin (12 kDa).
3.2.5. Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng cột sắc ký ái lực His-bind
Kết quả điện di protein cho thấy phân đoạn không hấp thụ trên cột có chứa một số
băng protein khác nhau, phân đoạn rửa chiết bằng imidazol gần như chỉ có một băng
protein khoảng 19 kDa, chứng tỏ protein này đã được tinh sạch.
Kết quả phân tích thẩm tách miễn dịch sử dụng kháng thể đơn dòng kháng protease
HIV-1 cho thấy kháng thể đơn dòng kháng protease HIV-1 không nhận biết băng protein
19 kDa trong dịch hòa tan kết tủa của tế bào cũng như băng protein tái tổ hợp đã được tinh

sạch. Chúng tôi cũng đã thử khả năng phân cắt cơ chất đặc hiệu của chế phẩm protein tái
tổ hợp thu được, tuy nhiên kết qủa cho thấy protein thu được là không có hoạt tính. Kết
quả khẳng định rằng protein mà chúng tôi thu được không phải là protease HIV-1 hoặc chỉ
chứa một phần nhỏ của protein nên không thể hiện tính kháng nguyên cũng như hoạt tính
xúc tác của protease HIV-1.
Tóm lại, chúng tôi đã phát hiện được một đột biến kháng nhẹ thuốc PI trong gen
mã hóa protease HIV-1 phân lập từ một bệnh nhân Việt Nam đang điều trị bằng thuốc
kháng virus và đã bước đầu đưa được gen này vào hệ thống vector biểu hiện pET32a dưới
dạng dung hợp với gen mã hóa cho thioredoxin cùng với trình tự nhận biết và phân cắt của
protease HIV-1. Tuy vậy chúng tôi chưa thành công trong việc biểu hiện được gen mã hóa
protease HIV-1 để tạo ra một protein có hoạt tính

KẾT LUẬN
Từ các kết quả thu được trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi rút ra một số kết luận sau:
1. Đã nhân bản, nhân dòng và xác định được trình tự đoạn gen mã hóa protease HIV-
1 thu nhận tại Việt Nam và phát hiện được một đột biến thay thế nucleotide A bằng C ở vị trí
248 (A248C), dẫn đến sự thay thế asparagine (N) ở trí 83 bằng threonine (T) trong protein.
Đột biến này được xác nhận là có tính kháng nhẹ thuốc ức chế protease.
2. Đã đưa được gen mã hóa protease HIV-1 mang đột biến N83T vào vector biểu
hiện pET32a dạng dung hợp với thioredoxin cùng với trình tự nhận biết và phân cắt của
protease HIV-1 và biến nạp được vào tế bào E. coli BL21 (DE3) RIL. Protein biểu hiện từ
tế bào mang vector tái tổ hợp có khối lượng phân tử khoảng 19 kDa, được tinh sạch qua
cột sắc ký ái lực hisbind nhưng không được nhận biết bởi kháng thể đơn dòng kháng
protease HIV-1 cũng như không có hoạt tính phân cắt cơ chất đặc hiệu của enzyme.

KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục nghiên cứu một cách có hệ thống trên diện rộng gen mã hóa protease
HIV để phát hiện các đột biến kháng PI mới phục vụ công tác điều trị và nghiên cứu.
2. Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa cho protease HIV-1 mang đột biến N83T và
các đột biến kháng PI khác để tìm hiểu các đặc trưng xúc tác cũng như ảnh hưởng của các

thuốc ức chế protease lên hoạt độ của chúng, góp phần làm sáng tỏ tính chất kháng thuốc
trong điều trị bệnh AIDS.

References

Tài liệu tiếng Việt:
1. Đỗ Ngọc Liên (2008), Miễn dịch học cơ sở, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội.
2. Nguyễn Thị Hồng Loan, Hồ Xuân Hùng, Ngô Thị Huyền Trang, Nguyễn Thị Vân Anh, Phan
Tuấn Nghĩa (2010), “Nhân dòng và bước đầu biểu hiện gen mã hóa protease của HIV
type 1 phân lập ở Việt Nam”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 8(2), tr. 227-233.
3. Nguyễn Thị Hồng Loan, Nguyễn Văn Dũng, Nguyễn Thị Trang Huyền, Nguyễn Thị
Vân Anh, Phan Tuấn Nghĩa (2011), “Một số đột biến trong gen mã hóa protease
HIV type 1 phân lập ở Việt Nam”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ (ĐHQGHN)
(đang in).
Tài liệu tiếng Anh
4. Alastair, J. J., Wood, M. D. (1998), “HIV protease inhibitors”, Engl. J. Med, 338, pp.
1281-1292.
5. Chen, H., Xu, Z., Yin, X., Cen, P. (2007), “Cloning and expression of the HIV
protein in Escherichia coli cell-free system”, Appl. Micrbiol. Biotechnol, 77, pp.
347–354.
6. Cheng, Y. S. E, McGowan, M. H, Kettner C. A, Schloss, J. V., Erickson, S., Yin F. H.
(1990), “High-level synthesis of recombinant HIV-1 protease and the recovery of active
enzyme from inclusion bodies”, Gene, 87, pp. 243-248.
7. Daar, E. S., Little, S., Pitt, J., Santagelo, J., Ho, P., Harawa, N., Kemdt, P., Giogi, J. V.,
Bai, J., Gaut, P., Richman, D. A., Mandel, S., Nicholas, S. (2001), “Diagnosis of primary
HIV-1 infection”, Ann. Int. Med, 134, pp. 25-29.
8. Darke, P. L., Leu, C. T., Davis, L. J., Heimbach, J. C., Diehl, R.E., Hill, W. S.,
Dixon, R. A , Sigal, I. S. (1989), “Human immunodeficiency virus protease:
bacterial expression and characterization of the purified aspartic protease”, J. Biol.
Chem, 264, pp. 2307-2312.

9. Debouck, C., Gorniak, J. G., Strickler, J. E., Meek, T. D., Metcalf B. W., Rosenberg,
M. (1987), “Human immunodeficiency virus protease expressed in Escherichia coli
exhibit autoprocessing and specific maturation of the gag precursor”, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 84, pp. 8903-8906.
10. Dergousova, N. L., Amerik, A. Y., Volynskaya, A. M., Rumsh, A. D. (1996), “HIV-1
protease cloning, expression, and purification”, Appl. Biochem. Biotechnol, 61, pp.
97-108.
11. Francessca, C., Gago, F., Bertoli, A., Forbici, F. (2004), “Identification of the
minimal conserved structure of HIV-1 protease in the presence and absence of drug
pressure”, AIDS, 12, pp. 9-11.
12. Geoghegan, K. F., Spender, R. W., Danley, D. E., Contillo, L. G., Andrews, G. C.,
(1990), “Fluorescence-based continuous assay for the aspartyl protease of human
immunodeficiencyl virus HIV-1”, FEBS Lett, 262(1), pp. 119-122.
13. Graves, M. C., Lim J. J., Heimer, E. P. (1988) “An 11-kDa form of human
immunodeficiency virus protease expressed in Escherichia coli is sufficient for
enzymatic activity”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, pp. 2449-2453.
14. Hare, B. C. (2006), “Clinical overview of HIV”, HIV Insite Knowledge Base
Chapter. Nguồn www.hivinsite.ucsf.edu.
15. Hoffman, C., Rockstroh, J., Kamps, B. S., HIV Medicine (2006) from www.
HIVMedicine.com.
16. Ishizaki, A., Cuong, N. H., Thuc, P. V., Trung, N. V., Saijoh, K., Kageyama, S.,
Ishigaki, K., Tanuma, J., Oka, S., Ichimura, H. (2009), “Profile of HIV type 1
infection and genotypic resistance mutations to antiretroviral drugs in treatment-
naive HIV type 1-infected individuals in Hai Phong, Viet Nam”, AIDS Res. Hum.
Retrovir., 25, pp. 175-182.
17. Janeway, C. (2001), Immunobiology, Garland Science, USA.
18. Komai, T., Ishikawa, Y., Yagi, R., Suzuki-Sunagawa, H., Nishigaki ,T., Handa, H.
(1997), “Development of HIV-1 protease expression methods using the T7 phage
promoter system”, Appl. Microbiol. Biotechnol., 47, pp. 241-245.
19. Krauslicht, H. G., Ingrahams, R. H., Skoog, M. T.,Wimmert, E., Pallait, P. V.,

Cartert, C. A. (1989), “Activity of purified biosynthetic proteinase of human
immunodeficiency virus on natural substrates and synthetic peptides”, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 86, pp. 807-811.
20. Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the
head of bacteriophage T4. Nature.227, pp: 680-685.
21. Lan, N. T., Recordon-Pinson, P., Hung, P. V., Uyen, N. T., Lien, T. T. (2003), “HIV
type 1 isolates from 200 untreated individuals in Ho Chi Minh City (Vietnam):
ANRS 1257 study, Large predominance of CRF01_AE and presence of major
resistance mutations to antiretroviral drugs”, AIDS Res. Hum. Retrovir., 19, pp. 925–
928.
22. Lech, W. J., Wang, G., Yang, Y. L., Chee, Y., Dorman, K., McCrae, D., Lazzeroni, L. C.,
Erickson, J.W., Sinsheimer, J. S., Kaplan, A. H. (1996), “In vivo sequence diversity of the
protease of human immunodeficiency virus type 1: presence of protease inhibitor-resistant
variants in untreated subjects”, J. Virol., 70, pp. 2038–2043.
23. Leuthardt, A., Roesel, J. L. (1993), “Cloning, expression and purification of a recombinant poly-
histidine-linked HIV-1 protease”, FEBS Lett, 326 (1, 2,3), pp. 275-280.
24. Louis, J. M., Mcdonald, R. A., Nashed, N. T., Wondraku, E. M., Jerina, D. M.,
Oroszilan S., Mora, P. T. (1991), “Autoprocessing of the HIV-1 protease using
purified wild-type and mutated fusion proteins expressed at hing level in Escherichia
coli”, Eur. J. Biochem., 199, pp. 361-369
25. Louis, J. M., Nashed, N. T., Parris, K. D., Kimmel, A. R., Jerina D. M. (1994),
“Kinetics and mechanism of autoprocessing of human immunodeficiency virus type
1 protease from an analog of the Gag-pol protein”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91,
pp. 7970- 7974.
26. Nashed, N. T., Louis, J. M., Sayer, J. M., Wondrak, E. M., Mora, P. T., Oroszlan,
S., Jerina, D. M. (1989), “Continuos spectrophotometric assay for retroviral
protease of HIV-1 and AMV”, Biochem. Biophys. Research. Commun., 163(2),
pp. 1079-1085.
27. Navia, M. A., Fitzgerald, P. M., McKeever, B. M., Leu, C.T., Heimback, J. C.,
Herber W. K., Sig, I. S., Darke P.L., Springer J. P. (1989), “Three-dimensional

structure of aspartyl protease from human immunodefiency virus HIV-1”, Nature
Rev., 337 (6208), pp. 615-620.
28. Nijhuis, M., Maarseveen, N. M., Lastere, S., Schipper, P., Coakley, E., Glass, B.
(2007), “A novel substrate-based HIV-1 protease inhibitor drug resistance
mechanism”, Plos. Med., pp. 152-163.
29. Nutt, R. F., Brady, S. F., Darke, P. L., Ciccarone, T. M., Nutt, E. M., Rodkey, J. A.,
Bennett, C.D., Waxman, L. H., Sigal, I. S., Anderson, P. S., Veber D. F. (1988),
“Chemical synthesis and enzymatic activity of a 99-residue peptide with a sequence
proposed for the human immunodeficiency virus protease”, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 85, pp. 7129-7133.
30. Rao, M., Tanksale, A., Ghatge, M. S., Deshpande, V. V. (1998), “Molecular and
biotechnological aspects of microbial proteases”, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62, pp.
600-601.
31. Richards, A. D., Phylip, L.H., Farmerie, W. G., Scarborough, P. E., Alvares, A.,
Dunn, B. M., Hirel, H., Konvalinka, J., Strop, P., Pavlickova, L., Kostla, J., Kay V.
(1990), “Sensitive, soluble chromogenic substrates for HIV-1 Proteinase”, J. Biol.
Chem. USA, 265 (14), pp. 7733-7736.
32. Rangwala, S. H., Finn, R. F., Smith, C.E., Berberich, S. A., Salsgiver, W. J.,
Stallings, W. C., Glover, G. I., Olins, P. O. (1992), “High-level production of active
HIV-1 protease in Escherichia coli”, Gene, 122, pp. 263-269.
33. Sambrook, J., Russell, D. W. (2000), Molecular cloning, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, pp. 15-22.
34. Shedlock, D. J., Daniel H., Andy, Y. C., Christopher, W. C., Karuppiah, M., David,
B. W. (2008), Apoptosis, Spingerlink, USA.
35. Taylor, A., Brown, P. D., Kadam, S., Maus, M., Kohlbrenner, E. W., Weigl, D.,
Turon, C. M., and Katz, L. (1992), “High-level expression and purification of mature
HIV-I protease in Escherichia coli under control of the araBAD promoter”, Appl.
Microbiol. Biotechnol., 37, pp. 205-210.
36. UNAIDS in Vietnam, from www.unaids.org.vn.
37. United nations program on HIV/AIDS, UNAIDS/WHO AIDS, Epidemic update:

December 2010.
38. Wan, M., Takagi, M., Loh, N. B., Xu, X. Z., Imanaka T. (1996),
“Autoprocessing: an essential step for the activation of HIV-1 protease”,
Biochem. J., 316, pp. 569-573.
39. Yunfeng, T. (2006), “Crystallographic analysis and kinetic studies of HIV-1 protease
and drug-resistant mutants”, pp. 25-34. Chemistry Dissertations. Paper 2 (from

40.
41.
42.