Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp vancomyxin của xạ khuẩn Streptomyces orientalis

1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



Chu Thanh Bình



NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP
VANCOMYXIN CỦA XẠ KHUẨN STREPTOMYCES orientalis 4912




LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC




Hà Nội – Năm 2012



2

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Chu Thanh Bình


NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP
VANCOMYXIN CỦA XẠ KHUẨN STREPTOMYCES orientalis 4912

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. NGUYỄN PHƢƠNG NHUỆ



Hà Nội – Năm 2012


3

Lời cảm ơn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS Lê Gia Hy, TS. Nguyễn
Phương Nhuệ, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam,
đã hướng cho tôi những ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức,
giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành bản luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Phí Quyết Tiến – trưởng phòng và các cán bộ

Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ và tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu.
Tôi xin trân trọng cảm ơn các thày cô giáo Khoa Sinh học, Bộ môn Vi sinh
vật học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo
điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Phân viện Công nghệ sinh học – Trung tâm Nhiệt
đới Việt – Nga đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học và bản luận văn.
Tôi xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí của đề tài: “Nghiên cứu xây dựng quy
trình sản xuất vancomyxin hydrochlorid công suất 1 kg/mẻ” mã số 032/2012/HĐ-
ĐTCNHD, thuộc “Chương trình nghiên cứu khoa học công nghệ trọng điểm quốc
gia phát triển công nghiệp Hóa dược đến năm 2020”.
Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình và bè bạn, những người luôn
bên tôi, động viên, góp ý và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học
tập và nghiên cứu.


Chu Thanh Bình
4

MỤC LỤC
Lời cảm ơn …………………………………………………………
Mục lục ……………………………………………………………….……
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt……………………………………
Danh mục các bảng …………………………………………………………
Danh mục các hình vẽ, đồ thị………………………………………………
MỞ ĐẦU …………………………………………………………… ……
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………… …

1
1.1. Chất kháng sinh vancomyxin …………………………………………
1
1.1.1. Lịch sử phát triển kháng sinh vancomyxin…………………………
1
1.1.2. Đặc tính của vancomyxin
2
1.1.3. Cơ chế kháng khuẩn của vancomyxin…………………………………
4
1.1.4. Ứng dụng trong điều trị bệnh của vancomyxin………………………
7
1.2. Streptomyces orientalis và các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp
vancomyxin …

8
1.2.1. Streptomyces orientalis
8
1.2.2. Sinh tổng hợp vancomyxin ở xạ khuẩn………………………………
9
1.2.3. Nghiên cứu qui trình công nghệ sản xuất vancomyxin ……………….
11
1.3. Nghiên cứu duy trì và nâng cao hiệu suất chủng giống sản xuất
vancomyxin……………………… ………………………………

14
1.4. Tình hình nghiên cứu và sản xuất vancomyxin…… ………
18

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………
21
2.1. Vật liệu ……………… ……………………………………………
21
2.1.1. Chủng giống vi sinh vật …………………………………………
21
2.1.2. Hoá chất ……………………………………………………………
21
2.1.3. Thiết bị ………………………………………………………………
21
2.1.4. Môi trƣờng ……………………………………………………………
22
2.1.5. Các dung dịch đệm
24
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu …… ……………………………………
24
2.2.1. Bảo quản giống ………………………………………………………
24
2.2.2. Xác định đặc điểm sinh học …………………………………
25
5

2.2.3. Xác định sinh khối …………………………………………………
25
2.2.4. Xác định hoạt tính kháng sinh………………………………………
25
2.2.5. Phƣơng pháp lên men
26
2.2.6. Phƣơng pháp phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm
28

2.2.7. Thu nhận tế bào trần xạ khuẩn…………………………………………
28
2.2.8. Nghiên cứu nâng cao hiệu suất sinh kháng sinh bằng xử lý UV và N-
metyl-N
‟
-nitro-N-Nitrosoguanidin (MNNG)…………………………

29
2.2.9. Xây dựng đƣờng cong sống sót………………………………………
30
2.2.10. Xác định sự biến đổi hình thái khuẩn lạc và hoạt tính kháng sinh…. .
30
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……………………………
32
3.1. Đặc điểm sinh học của chủng Streptomyces orientalis 4912
32
3.1.1. Đặc điểm nuôi cấy……………………………………………………
32
3.1.2. Đặc điểm hình thái…………………………………………………… .
33
3.2. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng S. orientalis 4912
34
3.3. Nâng cao hoạt tính kháng sinh của chủng S. orientalis 4912………
36
3.3.1. Thu nhận bào tử và tế bào trần từ chủng S.orientalis 4912………………
36
3.3.2. Nâng cao HTKS của chủng S. orientalis 4912 bằng phƣơng pháp gây đột
biến dùng tia UV và N-metyl-N
‟
-nitro-N-Nitrosoguanidin

(MNNG)……………………………………………………………………
40
3.4. Một số đặc điểm sinh học của biến chủng Streptomyces orientalis 4912-
81- 61………………………………………………
46
3.5. Tối ƣu hóa quy trình lên men biến chủng S. orientalis 4912-81-61….
48
3.5.1. Lựa chọn môi trƣờng nhân giống……………………………………
48
3.5.2. Lựa chọn môi trƣờng lên men………………………………………
48
3.5.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp vancomyxin của biến
chủng S. orientalis 4912-81-61……………………………………

48
3.5.4. Biến động quá trình lên men sinh tổng hợp vancomyxin của biến chủng S.
orientalis 4912-81-61 trong thiết bị lên men Bioflo………….

57
KẾT LUẬN
58
TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………
59

6



DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng
Tên bảng
Trang
1.1
Phổ kháng khuẩn của vancomyxin
7
3.1
Đặc điểm nuôi cấy của chủng S. orientalis 4912
32
3.2
Hoạt tính kháng khuẩn của chủng S. orientalis 4912
35
3.3
Ảnh hƣởng của nồng độ lysozym tới khả năng tạo TBT của chủng S.
orientalis 4912
38
3.4
Ảnh hƣởng của nồng độ glyxin tới khả năng tạo TBT của chủng S.
orientalis 4912
39
3.5
Ảnh hƣởng của nồng độ MNNG tới khả năng sống sót của chủng S.
orientalis 4912
41
3.6
Ảnh hƣởng của pH khi xử lý bằng MNNG tới khả năng sống sót của
chủng S. orientalis 4912
41
3.7

Ảnh hƣởng của thời gian xử lý bằng MNNG tới khả năng sống sót của
chủng S. orientalis 4912
42
3.8
Sự biến đổi hình thái khuẩn lạc của chủng S. orientalis 4912 sau khi xử
lý UV và MNNG
44
3.9
Kết quả lên men các biến chủng sau khi đột biến
45
3.10
Một số đặc điểm sinh học của biến chủng S. orientalis 4912-81-61
47
3.11
Khả năng sinh trƣởng của biến chủng S. orientalis 4912-81-61 trên
một số môi trƣờng
48
3.12
Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh tổng hợp vancomyxin
của biến chủng S. orientalis 4912-81-61
49
3.13
Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp vancomyxin
của biến chủng S. orientalis 4912-81-61
50
7

3.14
Ảnh hƣởng của bột đậu tƣơng, glucoza và đƣờng saccaroza tới khả
năng sinh tổng hợp vancomyxxin của biến chủng S. orientalis 4912-

81-61
51
3.15
Ảnh hƣởng của CaCl
2
đến khả năng sinh tổng hợp vancomyxin của
biến chủng S. orientalis 4912-81-61
52
3.16
Ảnh hƣởng của CuSO
4
đến khả năng sinh tổng hợp vancomyxin của
biến chủng S. orientalis 4912-81-61
52
3.17
Ảnh hƣởng của pH, nhiệt độ, tỷ lệ giống đến khả năng sinh tổng hợp
vancomyxin của biến chủng S. orientalis 4912-81-61
54
3.18
Ảnh hƣởng của oxy hòa tan tới sinh trƣởng và sinh tổng hợp
vancomyxin bởi biến chủng S.orientalis 4912-81-61
56

8

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ



Hình
Tên hình
Trang
1.1
Cấu trúc hóa học của vancomyxin
3
1.2
Các bƣớc tấn công thành tế bào vi khuẩn của vancomyxin
6
1.3

Quá trình tổng hợp vancomyxin trong tế bào xạ khuẩn
10
3.1
Khuẩn lạc của chủng S. orientalis 4912 trên MT 48
33
3.2
Hình dạng bào tử của chủng S. orientalis 4912
33
3.3
Hình dạng khuẩn ty và chuỗi bào tử của chủng S. orientalis 4912
34
3.4
Hoạt tính kháng sinh kháng B. subtilis ATCC 6633 của chủng S.
orientalis 4912
35
3.5
Tế bào trần chủng S. orientalis trên kính hiển vi
36
3.6
Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy tới khả năng tạo thành TBT của
chủng S. orientalis 4912
37
3.7
Ảnh hƣởng của thời gian xử lý lysozym tới khả năng tạo thành TBT
của chủng S. orientalis 4912
37
3.8
Khả năng sống sót của tế bào trần và bào tử của chủng 4912 sau khi
xử lý UV và MNNG
40

3.9
Hình dạng khuẩn lạc của chủng S. orientalis 4912 sau khi chiếu tia
UV tế bào trần
43
3.10
HTKS của biến chủng nhận đƣợc sau khi gây đột biến tế bào trần
45
3.11
Khuẩn lạc của biến chủng S. orientalis 4912-81-61 (A) và chủng S.
orientalis 4912 (B)
46
3.12
Ảnh hƣởng của độ thông khí tới khả năng sinh tổng hợp vancomyxin
của biến chủng S. orientalis 4912-81-61
55
3.13
Biến động quá trình lên men sinh tổng hợp vancomyxin bởi biến
chủng S. orientalis 4912-81-61 trên thiết bị Bioflo 110
57


9

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT



BT
Bào tử
CKS

Chất kháng sinh
CMC
Cacboxyl metyl xenluloza
ĐKVVK
Đƣờng kính vòng vô khuẩn
HTKS
Hoạt tính kháng sinh
KS
Kháng sinh
KTCC
Khuẩn ty cơ chất
KTKS
Khuẩn ty khí sinh
MNNG
N-metyl-N‟-nitro-N-nitrosoguanidin
MT
Môi trƣờng
SK
Sinh khối
SKK
Sinh khối khô
SS
Tế bào sống sót
TBT
Tế bào trần
VSV
Vi sinh vật

10

MỞ ĐẦU

Theo thống kê, Việt Nam thuộc vào những nƣớc nhập khẩu thuốc nhiều nhất
thế giới, hàng năm khoảng 350-400 triệu USD, trong đó kháng sinh chiếm thị phần
tiêu thụ cao. Dự kiến đến năm 2020, cả nƣớc sẽ cần mỗi năm hơn 1,5 tỷ USD tiền
thuốc, trong đó kháng sinh chiếm 30%.
Theo Quyết định số 61/2007/QĐ- TTg ngày 07/5/2007 của Thủ tƣớng Chính
phủ phê duyệt “Chương trình Nghiên cứu khoa học công nghệ trọng điểm quốc gia
phát triển công nghệ hóa dược đến năm 2020” thì mục tiêu của chƣơng trình là:
“Nghiên cứu tạo ra những công nghệ có chất lƣợng cao phù hợp với điều kiện sản
xuất ở trong nƣớc, làm chủ và ứng dụng công nghệ hiện đại của nƣớc ngoài, tiến tới
chủ động việc sản xuất thuốc chữa bệnh trong nƣớc”. Do vậy, việc nghiên cứu ứng
dụng công nghệ sinh học tiên tiến, phù hợp với điều kiện kinh tế, nhằm phát triển
sản xuất kháng sinh ở Việt Nam là rất cần thiết.
Vancomyxin là nguyên liệu cơ bản để nghiên cứu tạo ra các loại kháng sinh
bán tổng hợp với đặc tính chữa bệnh cao và chọn lọc. Chất kháng sinh này đƣợc
sản xuất nhờ xạ khuẩn Streptomyces orientalis. Việc nâng cao khả năng sinh kháng
sinh vancomyxin của chủng và hạ giá thành sản phẩm là rất cần thiết. Do vậy,
chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:“Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng
hợp vancomyxin của xạ khuẩn Streptomyces orientalis” với các nội dung chính nhƣ
sau:
1. Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng S. orientalis
2. Nghiên cứu nâng cao hoạt tính kháng sinh chủng S. orientalis.
3. Nghiên cứu tối ƣu môi trƣờng và điều kiện lên men chủng S. orientalis.
11

Đề tài được thực hiện tại Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh
học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Mục tiêu:
Nâng cao hoạt tính kháng sinh vancomyxin của xạ khuẩn S. orientalis 4912
hƣớng tới sản xuất kháng sinh này phù hợp với nguyên liệu sẵn có, rẻ tiền và điều
kiện môi trƣờng khí hậu của Việt Nam.





















12

CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 CHẤT KHÁNG SINH VANCOMYXIN
1.1.1. Lịch sử phát triển kháng sinh vancomyxin
Vancomyxin là CKS tiêu biểu nhất trong nhóm KS glycopeptit, đƣợc Eli
Lilly và cộng sự mô tả lần đầu tiên vào năm 1956, do xạ khuẩn S. orientalis phân
lập từ đất ở Indonexia và Ấn Độ sinh ra [45]. Ban đầu CKS này đƣợc gọi là hợp
chất 05865, nhƣng sau đó đã đƣợc đặt tên là vancomyxin (do bắt nguồn từ
“Vanquyshed” có nghĩa là “đánh bại”). Năm 1958, CKS này đƣợc đƣa vào điều trị
thử nghiệm trên ngƣời. Năm 1964, Bộ Y tế Mỹ chấp thuận đƣa vancomyxin vào sử
dụng rộng rãi trong các bệnh viện. Khi CKS bán tổng hợp nhóm penixilin là
metixilin đƣợc đƣa vào dùng trong chữa bệnh thì nhu cầu về vancomyxin đã giảm
xuống trong một thời gian. Tuy nhiên, sự xuất hiện của các chủng vi khuẩn S.
auureus kháng metixilin vào 2 thập kỷ cuối thế kỷ XX đã làm kháng sinh
glycopeptit đƣợc lựa chọn trong phác đồ điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn
kháng nhiều loại KS thông dụng gây ra. Lúc đó vancomyxin đƣợc ví nhƣ một loại
thần dƣợc hay phƣơng thuốc cuối cùng vì có khả năng điều trị đƣợc các bệnh nhiễm
trùng nguy hiểm do các chủng vi sinh vật kháng metixilin gây nên. Vancomyxin đã
mở ra liệu pháp điều trị đầu tiên khi có sự nghi ngờ về khả năng kháng penixilin của
các chủng Staphylococcus. Sau khi những nghi ngờ này đƣợc dẫn chứng bằng
những số liệu cụ thể thì liệu pháp này đƣợc điều chỉnh cho phù hợp [18], [20], [22],
[28], [36], [56]. Vancomyxin đƣợc sử dụng trong vòng hơn 30 năm mà không có
những dẫn chứng đáng kể nào về sự kháng thuốc. Nhƣng sự lạm dụng trong việc
dùng vancomyxin đã làm con ngƣời phải đối mặt trƣớc một thực tế là sự xuất hiện
và gia tăng ngày càng nhiều của các chủng vi khuẩn kháng lại CKS từng đƣợc xem
nhƣ hy vọng cuối cùng trong điều trị các bệnh truyền nhiễm hiểm nghèo. Chủng vi
sinh vật kháng vancomyxin đầu tiên đƣợc công bố vào cuối những năm 1980 và sau
đó số lƣợng này tăng lên không ngừng. Do sự xuất hiện của những chủng vi sinh
13

vật kháng vancomyxin, nhu cầu tìm kiếm các CKS thay thế với mục đích ngăn chặn
mối hiểm họa cho sức khỏe cộng đồng luôn luôn đƣợc thúc đẩy. Tuy nhiên, kể từ
khi đƣợc phát hiện, cấu trúc phân tử và đặc tính của vancomyxin đã luôn lôi cuốn
sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học thuộc nhiều chuyên ngành khác
nhau. Kháng sinh này đã đƣợc xem nhƣ cấu trúc sinh học chủ yếu, từ đó biến đổi
bằng cách bán tổng hợp hoặc bằng công nghệ sinh học tạo ra những chất thay thế
với những đặc tính ƣu việt [37], [52], [58].
Dạng vancomyxin HCl đầu tiên đã đƣợc Eli Lilly đƣa ra thị trƣờng dƣới tên
thƣơng mại là Vancoxyn. Giấy chứng nhận quyền sử dụng sản phẩm này hết hạn
vào đầu những năm 1980. Ngày nay, các dạng thuốc mang đặc tính chung của
vancomyxin đƣợc đƣa ra dƣới nhiều tên thƣơng mại khác nhau. Năm 2004, Eli Lilly
đã đăng ký bản quyền cho Vancoxyn với ViroPharma tại Mỹ, Flynn Pharma tại Anh
và Aspen Pharmacare tại Úc [58]. Vancomyxin không những là một loại thuốc
kháng sinh sử dụng điều trị bệnh nhiễm trùng rất có hiệu quả, mà còn là nguyên liệu
cơ bản để nghiên cứu tạo các loại kháng sinh bán tổng hợp đang rất đƣợc quan tâm.
Ngày nay, tầm quan trọng của vancomyxin vẫn đƣợc khẳng định, chúng đƣợc sử
dụng rộng rãi trong các bệnh viện khi kết hợp với các CKS nhóm - lactam [10],
[69]. Cho đến nay, trên thị trƣờng ít nhất đã có 10 biệt dƣợc chứa vancomyxin do
nhiều hãng thuốc nổi tiếng trên thế giới sản xuất nhƣ: Diatraxin (Dista, Tây Ban
Nha), Hanomyxin (Samjin, Hàn Quốc), Lyphoxyn (Fujisawa, Mỹ), Vancoxyn
(Lilly, Mỹ), Vancoxyna (Lilly, Mỹ), Vancoled (Lederle, Mỹ), Vancor (Andria, Mỹ),
Vancolin, Vancomyxin (Dakota Pharm, Pháp), Voncon (Lilly, Mỹ) [72].
1.1.2. Đặc tính của vancomyxin
Vancomyxin có công thức tổng quát C
66
H
75
Cl
2

N
9
O
24
. Trong phân tử có chứa
một disacarit ở vị trí axit amin thứ 4, cấu trúc hóa học đƣợc thể hiện ở hình 1.1 [9],
[16]. Vancomyxin có tổng số 18 trung tâm lập thể, với 9 trung tâm lập thể nằm trên
lõi glycol và các trung tâm còn lại nằm tại các nhóm cacbonhydrat [58]. Cấu trúc
hóa học lập thể quyết định cơ chế hoạt động của vancomyxin. Vancomyxin có một
chuỗi hexapeptit đã glycozyl hóa, chứa 7 aminoaxit gồm các loại nhƣ chloro-β-
14

hydroxytyrozin, p-hydroxylphenylglyxin, N-metylleuxin và axit aspartic tạo thành
bộ khung phân tử vững chắc [13], [43], [53], [64].


Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của vancomyxin [58], [71]
Trọng lƣợng phân tử của vancomyxin là 1449,3 Da. Các phân tử
vancomyxin thƣờng không kết hợp với nhau nên vancomyxin là một chất vô định
hình, không màu sắc và có tính chất lƣỡng tính [40]. Vancomyxin ở dạng clohydrat
hòa tan rất tốt trong nƣớc, hòa tan vừa phải trong methanol, hòa tan ít trong rƣợu
bậc cao, clorofoc, etylaxetat, butylaxetat, axeton và este. Giá trị pKa của
vancomyxin là 2,9; 7,2; 8,6; 9,6; 10,5 và 11,7. Theo những phân tích cơ bản đã chỉ
ra rằng phân tử vancomyxin chứa khoảng 1,17% nitơ và 4,26% clo. Vancomyxin
bền trong nƣớc ở pH = 3,0-7,0 và nhiệt độ 37
o
C trong 6 ngày, sau 6 ngày khả năng
ức chế vi khuẩn còn 10%. Ở nhiệt độ phòng (khoảng 22
o
C) độ bền sẽ bị giảm sau 2-

6 ngày. Nếu pH nằm trong khoảng từ 7-12 và nhiệt độ nâng nhẹ (trên 22
o
C) thì sự
phân hủy có thể quan sát đƣợc [4], [40]. CKS này có thể hòa tan trong nƣớc tại pH
7 (khoảng 1 mg/ml) và hòa tan tốt hơn ở pH kiềm (khoảng pH 8,5 – 9,0).
Vancomyxin bền ở dạng rắn và trong dịch lỏng tại nhiệt độ lớn hơn 70
o
C
trong khoảng pH từ 2,5-9,0. Nhờ đặc điểm lƣỡng tính, vancomyxin phản ứng với
axit vô cơ nhƣ: HCl, H
2
SO
4
, H
3
PO
4
và các axit khác… [36], [40]. Vancomyxin có 3
hệ thống vòng, 2 nhóm cacbonhydrat, 5 vòng thơm, 9 nhóm OH trong đó có 3 nhóm
phenol, 7 liên kết amit và 2 liên kết amin, điểm đẳng điện pI 7,2. Vancomyxin khác
15

với các kháng sinh thuộc nhóm glycopeptit khác bởi cấu trúc phức tạp. Sự khác biệt
này thể hiện trong cấu trúc của vancomyxin chứa một disacarit ở vị trí axit amin thứ
4, là vị trí cho phép gắn phân tử ngoại lai (nhƣ đƣờng glucoza …) để tạo nên các
vancomyxin bán tổng hợp có hoạt tính cao và bền vững với các tác nhân kháng.
Đây là hƣớng đang đƣợc quan tâm nghiên cứu nhằm mở ra một thế hệ KS mới có
hoạt tính cao và chọn lọc [34], [58].
Theo “Sổ tay Kháng sinh” của Navashin, S.M. & Fomina, I.P., 1974, 1 mg
vancomyxin dạng sunphat chuẩn cần đạt 1007 đơn vị hay một đơn vị vancomyxin

dạng sunphat tƣơng đƣơng 0,993 mcg. Khi tiêm tĩnh mạch chuột nhắt trắng theo
chuẩn dƣợc, độ nhạy độc của vancomyxin HCl biểu hiện ở LD50 (liều gây chết
50% động vật thí nghiệm) đƣợc tìm thấy trong khoảng 435,7 ± 4,22 mg/kg.
Ngƣời ta thƣờng sử dụng vancomyxin khi biết hoặc nghi ngờ về khả năng
nhiễm trùng máu, hoặc sử dụng cho các bệnh nhân bị viêm xƣơng, viêm khớp,
nhiễm trùng da và mô mềm [4], [10], [56]. Tác dụng của vancomyxin cao hơn khi
kết hợp với các CKS khác (ví dụ KS nhóm β-lactam) trong điều trị một số loại vi
sinh vật có thể thay đổi cấu trúc thành tế bào để kháng lại vancomyxin [28], [58].
1.1.3. Cơ chế kháng khuẩn của vancomyxin
Vancomyxin và các kháng sinh nhóm glycopeptit có hoạt tính kháng vi sinh
vật thông qua việc ức chế sự tổng hợp thành tế bào. Vị trí mà các tác nhân tấn công
vào thành tế bào là lớp peptidoglycan. Đây là lớp cơ bản để vi khuẩn chống lại các
điều kiện bất lợi của môi trƣờng. Nếu không có lớp này hoặc vì một lý do nào đó
mà lớp peptidoglycan bị phá hủy thì tế bào vi khuẩn trở nên cứng nhắc, không linh
động, kết qủa tế bào bị chết [33]. Vancomyxin ức chế giai đoạn cuối của quá trình
sinh tổng hợp peptidoglycan qua 3 giai đoạn [58]:
- Giai đoạn 1: Vancomyxin không xâm nhập vào tế bào chất để ức chế các
bƣớc sinh tổng hợp thành tế bào tiếp theo mà chỉ hoạt động ở bên ngoài màng tế
bào chất. Sự ức chế các chất màng trên đã ngăn cản chu trình lặp lại các chất mang
C55 lipit làm gia tăng sự tích lũy tiền chất của tế bào chất. Đây là một cơ chế không
16

thƣờng xuyên xảy ra đối với một tác nhân kháng vi sinh vật bao gồm việc sử dụng
cơ chất thay vì điều khiển hoạt tính của enzyme sinh tổng hợp.
- Giai đoạn 2: Nhờ cấu tạo hình xoắn của phân tử mà gần đây ngƣời ta đã
phát hiện ra khả năng kháng vi sinh vật của vancomyxin tác động ngƣợc lại với sự
mẫn cảm penixilin. Ở màng ngoài tế bào vi khuẩn, enzyme transglycosylaza bổ
sung các mảnh disacaryl pentapeptit để hình thành lớp peptidoglycan của tế bào.
Sau đó, enzyme transpeptidaza nối các peptit ở bên trong với các sợi của lớp
peptidoglycan ở bên ngoài bề mặt của màng tế bào. Đích tác dụng của vancomyxin

là gắn với các peptit cơ chất, ngăn cản chúng liên kết với vị trí hoạt động của
enzyme. Khi đó, phân tử vancomyxin có dạng hình chiếc cốc liên kết với ái lực cao
nhờ bề mặt lõm của nó tạo năm liên kết hydro với đoạn cuối N-acyl-D-Alanyl-D-
Alanin của cầu liên kết chéo peptit chƣa nối với pentapeptit.
- Giai đoạn 3: Liên kết của vancomyxin với chuỗi lipit-PP-Glc NAC-
pentapeptit là liên kết vật lý tƣơng đối bền vững đã ngăn cản tác động tiếp theo của
transglycosylaza/transpeptidaza. Vancomyxin không tấn công đƣợc disacaryl
pentapeptit mà làm giảm các liên kết đồng hóa trị, giảm tính bền cơ học của lớp
peptidoglycan và làm cho tế bào vi khuẩn dễ dàng bị phân giải nhờ những thay đổi
xảy ra do áp suất thẩm thấu.
Vancomyxin có hoạt tính mạnh với các cầu khuẩn và vi khuẩn Gram (+)
nhƣ: Staphylococcus, Streptococcus, Corynebacterium, Enterococcus và xoắn
khuẩn (Bảng 1.2) [58], [62]. CKS này có khả năng tiêu diệt tốt vi khuẩn đang ở
trong giai đoạn sinh sản, pH tối ƣu là 8,0 và hoạt tính giảm mạnh khi pH dƣới 6,0.
Điều này đƣợc giải thích bởi hai nguyên nhân: một là do sự khác biệt của cấu trúc
thành tế bào giữa vi khuẩn Gram (+) và vi khuẩn Gram (-). Cấu trúc thành tế bào vi
khuẩn Gram (+) gồm có lớp peptidoglycan dầy, axit teichoic và axit teichoronic, có
thể có hoặc không có màng protein hoặc polysaccarit bao quanh. Trong khi đó
thành tế bào vi khuẩn Gram (-) gồm có lớp peptidoglycan mỏng, lipopolysacarit,
lipoprotein, photpholipit và protein. Trong các tế bào vi khuẩn Gram (-), lớp
peptidoglycan và lớp màng bên trong đƣợc bao bọc bởi một lớp màng ngoài ngăn
17

chặn sự khuếch tán vancomyxin đến lớp peptidoglycan. Ngƣợc lại, lớp
peptidoglycan của vi khuẩn Gram (+) đƣợc xác định trên bề mặt ngoài của thành tế
bào và do đó nó mẫn cảm với kháng sinh vancomyxin. Hai là có thể do phân tử
glycopeptit là những phân tử lớn, chúng không thể hòa tan lớp lipit của màng tế bào
vi khuẩn Gram (-), do đó khó có thể xâm nhập đƣợc vào lớp bên trong của thành tế
bào [40], [58], [71]

Hình 1.2. Các bƣớc tấn công thành tế bào vi khuẩn của vancomyxin [71]
18

Bảng 1.1. Phổ kháng khuẩn của vancomyxin [58], [62]
Vi sinh vật
Nồng độ ức chế
tối thiểu (mcg/ml)
Vi sinh vật
Nồng độ ức chế tối

thiểu (mcg/ml)
Staphylococcus
aureus
0,2 – 6,2
Haemophilus
influenza
100 và hơn 100
Streptococcus
pyogenes
0,2 – 0,3
Clostridium sp
0,3 - 0,5
Streptococcus
viridians
0,3 – 20
Escherrichia
coli
100 và hơn 100
Streptococcus
faecalis
0,3 – 30
Klebssiellae
100 và hơn 100
Corynebacterium
diphtheria
0,3 – 1,0
Pasteurllae
100 và hơn 100
Actinomyces
israeli

1,5 – 4,0
Shigellae
100 và hơn 100
Bacillus
anthracis
2,5
Salmonella
100 và hơn 100

Ngoài ra, vancomyxin còn có tác dụng ức chế quá trình sinh tổng hợp ARN.
Mặt khác, cũng nhƣ penixilin, nó có thể tác dụng thẳng lên màng tế bào chất theo
cơ chế tác dụng giống nhƣ ristomyxin và baxitraxin. Có thể do cơ chế tác động kép
này mà sự kháng vancomyxin ít xảy ra. Những vi sinh vật nhạy cảm với
vancomyxin thƣờng bị tiêu diệt ở nồng độ từ 1-5 mcg/ml, kể cả những chủng kháng
metixilin [53]
1.1.4. Ứng dụng trong điều trị bệnh của vancomyxin
Vancomyxin từng đƣợc xem nhƣ phƣơng thuốc cuối cùng, chỉ sử dụng sau
khi việc điều trị bệnh bằng các kháng sinh khác không có hiệu quả. Không lâu sau
khi đƣợc phát hiện, vancomyxin đƣợc xếp vào danh mục những loại dƣợc phẩm
hàng đầu và đƣợc đƣa vào dùng rộng rãi trong bệnh viện để điều trị các bệnh nhiễm
trùng nguy hiểm do các vi sinh vật kháng KS nhóm β-lactam gây nên [15], [58]
Vancomyxin đặc biệt có hiệu quả cao khi dùng trong điều trị các bệnh do
MRSA gây nên, vi khuẩn này là mối nguy hiểm với bệnh nhân cao tuổi, bệnh nhân
sau phẫu thuật và những ngƣời có hệ miễn dịch suy giảm [30]. Vancomyxin còn
đƣợc chỉ định để điều trị cho các bệnh nhân dị ứng với penixilin, các bệnh nhân
19

không thể sử dụng các loại thuốc nhƣ penixilin hoặc cephalosporin và sử dụng khi
những chủng vi sinh vật mẫn cảm với vancomyxin. Dƣới tác dụng của vancomyxin
tính bền vững vốn có của các cầu khuẩn Gram (+) đối với penixilin không phát hiện

thấy [58]. Mặc dù có nhiều CKS chữa trị các bệnh do vi khuẩn Gram (+) gây ra đã
đƣợc công bố trong những năm gần đây, nhƣng vancomyxin vẫn là kháng sinh
không thể thay thế trong việc chữa trị những bệnh do Staphyloccus, Enterococcus
và các chủng vi sinh vật kháng nhiều loại kháng sinh thông dụng gây nên [5], [30].
Vancomyxin có tác dụng cao khi dùng phối hợp hoặc thay thế kháng sinh
nhóm β-lactam để chữa các bệnh nhiễm trùng do các loại vi khuẩn đã nhờn với
kháng sinh thông dụng gây nên nhƣ: bệnh nhiễm trùng máu, viêm xƣơng, viêm
đƣờng hô hấp … [17], [34]. Ngoài ra, CKS này còn có tác dụng điều trị bệnh do vi
khuẩn bạch hầu gây nên [41], [45]. Các chủng Staphylococcus có khả năng đề
kháng với penixilin G, streptomyxin, tetraxyclin, macrolit và các loại khác, nhƣng
mẫn cảm với vancomyxin [36], [44].
1.2. Streptomyces orientalis VÀ CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG TỚI SINH
TỔNG HỢP VANCOMYXIN
1.2.1. Streptomyces orientalis
Streptomyces orientalis có khả năng sinh CKS vancomyxin. Lúc đầu, khi
mới phát hiện, xạ khuẩn này có tên là Amycolatopsis orientalis, đƣợc xếp vào chi
Nocardia, sau đó loài này đƣợc phân loại lại và xếp vào chi Streptomyces, đặt tên là
S. orientalis, tuy nhiên, nhiều tài liệu vẫn gọi tên truyền thống là Amycolatopsis
orientalis. Cho đến nay, vẫn chỉ phát hiện thấy kháng sinh vancomyxin từ loài xạ
khuẩn này [23], [26], [31], [35], [51]. S. orientalis đƣợc phân biệt với các loài khác
thuộc chi Streptomyces bởi các đặc điểm nuôi cấy, hình thái, sinh lý, sinh hóa…
[23].
Hình thái hiển vi: Khi nuôi trên môi trƣờng thạch tổng hợp, quan sát thấy
khuẩn ty khí sinh dạng thẳng hoặc tạo thành các chuỗi nhánh không đồng đều. Bào
tử của chủng có dạng từ hình trụ đến hình trứng, có kích thƣớc 0,7-1,0 x 1,4-1,8
µm, có chuỗi bào tử hình xoắn rõ ràng.
20

Hình dáng khuẩn lạc lồi cao hoặc hơi lồi, khô, xù xì, tạo rãnh, có vùng khuẩn
ty màu trắng nhạt rất mỏng bao quanh, mặt dƣới không màu.

Đặc điểm nuôi cấy riêng: khi nuôi trên môi trƣờng thạch tổng hợp, khuẩn ty
cơ chất có màu vàng kem sau 7 ngày và chuyển sang màu vàng sẫm sau 14 ngày,
khuẩn ty khí sinh có màu trắng sau 7 ngày và có màu xám sau 14 ngày nuôi do có
sự hình thành bào tử, không có sắc tố tan trên môi trƣờng nuôi cấy.
Trong tự nhiên, sự phát triển của vi sinh vật, trong đó có xạ khuẩn, liên quan
mật thiết đến nguồn thức ăn và mối liên hệ của chúng với nhau. Mối quan hệ đối
kháng giữa các vi sinh vật đã đƣợc Pasteur (1887) khẳng định là hiện tƣợng phổ
biến. Riêng đối với xạ khuẩn tính đối kháng thể hiện khá rõ rệt. Kháng sinh là
trƣờng hợp riêng của tính đối kháng, hiện tƣợng một vi sinh vật với sản phẩm trao
đổi chất của mình tạo điều kiện không thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật
khác [8], [20], [23]. Cơ chế hình thành CKS:
- Đối với các CKS tƣơng tự với các chất trao đổi sơ cấp (axit amin, nucleotit,
coenzyme) thì sự sinh tổng hợp giống nhƣ sự sinh tổng hợp của các chất trao đổi sơ
cấp.
- Đối với kháng sinh đƣợc tạo ra bằng con đƣờng polymer hóa bao gồm: các
chất là dẫn xuất polypeptit đƣợc tạo thành bằng cách ngƣng tụ axit amin, mạch
polypeptit đƣợc tạo thành có thể bị cải biến trong các phản ứng tiếp theo (sự ngƣng
tụ axit amin không theo cơ chế cổ điển sinh tổng hợp protein); các chất đƣợc tạo
thành từ các đơn vị axetat và propionate thì theo con đƣờng tổng hợp axit béo; các
chất tecpen đƣợc tạo thành từ các đơn vị izopren (chỉ do khuẩn ty sinh ra); đối với
các chất aminoglucozit thì tạo thành bằng con đƣờng ngƣng tụ các phân tử đƣờng,
axit amin thông thƣờng và các rƣợu amin mạch vòng [14], [27], [46].
1.2.2. Sinh tổng hợp vancomyxin ở xạ khuẩn
Cũng giống nhƣ con đƣờng sinh tổng hợp KS nhóm glycopeptit, vancomyxin
đƣợc tổng hợp bằng cách ngƣng tụ các đơn vị nhỏ mà mỗi đơn vị này lại đƣợc tạo
thành từ các con đƣờng sinh tổng hợp riêng (Hình 1.3).
21

Hình 1.3. Quá trình tổng hợp vancomyxin trong tế bào xạ khuẩn [71]
Quá trình tổng hợp chịu sự chi phối của các gen nằm trên cluster trong bộ

gen. Các gen này quyết định sự tổng hợp vancomyxin theo con đƣờng riêng, khác
con đƣờng tổng hợp axit amin để hình thành nên protein [58]. Ngƣời ta có thể biết
đƣợc điều này khi tiến hành phân tích một cách chi tiết thành phần các axitamin của
vancomyxin. Trong khoảng 20 axit amin cơ bản đƣợc tạo thành trong tổng hợp
protein thì có p-hydroxyphenylglyxin, hydroxyltyrozin và 3,5 di-hydroxylphenyl-
glyxin α và β là các thành phần chính của kháng sinh (Hình 1.3). Quá trình tổng hợp
glycopeptit có những yêu cầu giống nhƣ tổng hợp protein nhƣng sự tham gia axit
amin theo con đƣờng khác [40], [57], [58]. Quá trình hình thành vòng heptapeptit
không phải ở trên riboxom. Để thay thế riboxom, các mạch peptit đƣợc tổng hợp
nhờ enzyme NRPSs (nonribosomal protein synthase). NRPSs là một enzyme có
khối lƣợng phân tử lớn, cấu tạo chia làm 4 phần, bao gồm vùng A (adenyl hóa),
vùng ngƣng tụ hoặc kéo dài (C), vùng E (epime hóa) và T (thioesterase). Tại các
vùng tổng hợp, NRPSs chịu trách nhiệm phát hiện, loại bỏ các axit amin có những
22

sai khác, chỉ sử dụng các axit amin có hoạt tính, adenozin tri photphat (ATP) đƣợc
dùng làm năng lƣợng cho hoạt động của enzyme. Đầu tiên các axit amin đƣợc biến
đổi. L-tyrozin đƣợc biến đổi thành β-hydroxyclorotyrozin (β-hTyr) và 4-
hydroxyphenylglyxin (HPG). Mặt khác, axetat đƣợc chuyển hóa từ vòng 3,5-
dihydroxyphenylglyxin. Tại vùng A, axit amin đặc hiệu đƣợc hoạt hóa bằng cách
biến đổi thành phức hệ enzyme aminoaxyl adenyl hóa và gắn với 4 photpho-
pantethein ở vùng T bởi thioesteraza, có sự giải phóng adenozin mono photphat
(AMP). Vùng A có trách nhiệm cung cấp liên tục axit amin cho quá trình liên kết.
Phức hệ này sau đó chuyển qua vùng E thực hiện phản ứng epime hóa các axit
amin. Kết thúc ở vùng C, các liên kết peptit đƣợc hình thành giữa các axit amin hoạt
tính. Sự tổng hợp này mới hình thành nên các mạch heptapeptit thẳng. Việc tạo nên
các dạng mạch khác sẽ đƣợc thực hiện ở các vị trí khác, tùy thuộc theo từng chủng
xạ khuẩn. Sau khi mạch heptapeptit thẳng đƣợc tổng hợp, vancomyxin phải trải qua
một loạt các biến đổi tiếp theo nhờ hoạt động của 8 enzym nhƣ oxy hóa liên kết
chéo, quá trình glycozyl hóa… để trở thành phân tử có hoạt tính học. Sự tƣơng tác

giữa các cầu nối đƣợc thực hiện bởi P450, đây là một enzyme tƣơng tự NRPSs, có
vai trò gắn thêm phân tử đƣờng vào lõi heptapeptit để hình thành glycopeptit theo
con đƣờng glycozyl hóa. Ngoài ra còn có sự tham gia của nhóm sulphat vào phần
cuối N. Việc gắn nguyên tử Clo và vòng 2 và 6 nhờ enzyme haloperoxydaza thông
qua quá trình oxy hóa. Qúa trình hình thành glycopeptit chịu sự chi phối của rất
nhiều gen, mỗi gen hoạt động lại chịu sự chi phối của rất nhiều yếu tố, do vậy
không thể tách các gen đơn chiếc để tạo ra đƣợc vancomyxin.
1.2.3. Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất vancomyxin
1.2.3.1. Điều kiện nuôi cấy
Theo các tài liệu đã công bố [30], [33], [41], [42], [44], [59], xạ khuẩn S.
orientalis sử dụng trong sản xuất vancomyxin thƣờng phát triển tốt ở nhiệt độ 20-
35
o
C, nhiệt độ tối ƣu cho quá trình sinh vancomyxin là 28
o
C, ở nhiệt độ 20
o
C và
35
o
C chủng này sinh trƣởng yếu, sinh khối tích lũy và lƣợng kháng sinh tạo ra thấp.
23

Độ pH thích hợp cho tổng hợp kháng sinh ở xạ khuẩn thƣờng là trung tính.
Tuy nhiên dải pH cho phép chủng sinh trƣởng thƣờng lớn hơn so với pH tối ƣu cho
hoạt tính sinh tổng hợp kháng sinh. Đối với xạ khuẩn S. orientalis thì pH thích hợp
cho sinh trƣởng là 6-8, còn pH thích hợp cho sinh vancomyxin chỉ từ 6,5-7,5. Môi
trƣờng kiềm hay axit đều ảnh hƣởng trực tiếp đến quá trình sinh kháng sinh [25].
Xạ khuẩn có nhu cầu thông khí cao hơn so với vi sinh vật khác, nhất là trong
giai đoạn nhân giống (khoảng từ giờ thứ 6 đến giờ 12 của quá trình nuôi). Theo

nhiều nghiên cứu, nếu nuôi trong bình tam giác, trên máy lắc, thì thể tích môi
trƣờng chỉ nên bằng 10-15% so với thể tích bình lên men là thích hợp cho việc tạo
kháng sinh, khi độ thông khí cao hơn hoặc thấp hơn đều ảnh hƣởng đến quá trình
này. Lên men khối lƣợng lớn hơn phải thƣờng xuyên cấp khí vô trùng và khuấy trộn
cho phân tử oxy hòa tan đều trong môi trƣờng lên men, đảm bảo lƣợng ôxy hòa tan,
nhƣng cũng làm tăng lƣợng sinh khối, rút ngắn thời gian pha tích tụ, có thể tạo thêm
nhiều sản phẩm không mong muốn. Trong thực tế, để đảm bảo lƣợng ô xy hòa tan,
ngƣời ta thƣờng phối hợp điều chỉnh cả hai thông số cƣờng độ sục khí và khuấy
trộn theo hƣớng đủ tạo ra các hạt nhỏ và mịn trong điều kiện khuấy trộn hơi dƣ so
với nhu cầu. Sục khí còn có tác dụng đuổi khí CO
2
có trong dịch lên men, vì CO
2

làm cản trở quá trình hấp thụ và chuyển hóa cơ chất của chủng, nghĩa là cản trở sinh
tổng hợp KS [21], [49], [50].
Vancomyxin đƣợc tạo thành chủ yếu trong pha thứ hai (pha tổng hợp) của
qúa trình lên men. Vì vậy, cần xác định đƣợc đúng thời điểm kết thúc lên men trƣớc
khi xạ khuẩn bị phân hủy làm giảm lƣợng KS tạo thành. Thời gian kết thúc lên men
đƣợc xác định bằng cách nghiên cứu động thái, thƣờng kéo dài 120 giờ.
Theo nhiều tài liệu công bố, sinh tổng hợp CKS không chỉ phụ thuộc vào
điều kiện lên men mà còn phụ thuộc vào chất lƣợng của bào tử và giống sinh
dƣỡng. Môi trƣờng nhân giống giàu chất dinh dƣỡng hơn môi trƣờng lên men sẽ
cho hiệu suất sinh tổng hợp CKS cao hơn. Lƣợng giống và tuổi giống đƣợc bổ sung
vào môi trƣờng lên men cũng có ảnh hƣởng không nhỏ đến khả năng tổng hợp KS.
Thông thƣờng lƣợng giống bổ sung vào môi trƣờng lên men là 2 – 10% [38], [47
24

1.2.3.2. Thành phần môi trƣờng
Quá trình sinh tổng hợp kháng sinh từ xạ khuẩn phụ thuộc rất nhiều vào

thành phần môi trƣờng lên men. Mỗi chủng xạ khuẩn cần một nguồn cơ chất khác
nhau. Để xạ khuẩn phát triển tốt môi trƣờng phải có đầy đủ nguồn cacbon, nitơ và
các nguyên tố vi lƣợng. Nguồn cacbon có ảnh hƣởng rất lớn đến quá trình sinh
trƣởng cũng nhƣ sinh tổng hợp CKS của xạ khuẩn S. orientalis, do nguồn cacbon
không những tham gia vào cấu tạo tế bào mà còn tham gia quá trình hình thành nên
cấu trúc của sản phẩm [59]. Tuy nhiên, tùy thuộc vào từng chủng mà cần chọn
nguồn cacbon thích hợp gồm các loại đƣờng đơn nhƣ glucoza, fructoza … hay các
loại đƣờng kép nhƣ sacaroza, maltoza, lactoza… cũng có thể là các loại tinh bột
hoặc rỉ đƣờng hoặc đại mạch… Glucoza là nguồn đƣờng dễ sử dụng nhất, tuy nhiên
nếu hàm lƣợng glucoza trong môi trƣờng quá cao hiệu suất lên men sẽ giảm đi [60].
Nguyên nhân là glucoza làm tăng lƣợng axit hữu cơ trong môi trƣờng đồng thời làm
tăng các chất hữu cơ và axit nucleic trong khuẩn ty, dẫn tới thay đổi hoạt tính các
enzyme phân giải glucoza. Có thể khắc phục hiện tƣợng này bằng cách bổ sung
định kỳ một lƣợng nhỏ glucoza để không xảy ra sự tích lũy các chất trao đổi ức chế
[54], [59].
Quá trình sinh tổng hợp CKS từ xạ khuẩn đòi hỏi cung cấp đầy đủ nguồn
nitơ vô cơ và nitơ hữu cơ. Trong đó nguồn ni tơ vô cơ cho khả năng sinh CKS
không cao, còn nguồn ni tơ hữu cơ có ảnh hƣởng tốt đến khả năng sinh tổng hợp
CKS do nó cung cấp các nguồn axit amin quan trọng dễ dàng đi vào chu trình tổng
hợp để hình thành nên mạch heptapeptit, là bộ khung của vancomyxin. Nguồn nitơ
thích hợp thƣờng đƣợc sử dụng là cao nấm men, cao thịt, pepton, bột đậu tƣơng…
nguồn nitơ vô cơ thƣờng sử dụng là các muối amon, muối nitrat…[65].
Vi sinh vật nói chung và xạ khuẩn nói riêng rất cần chất khoáng trong quá
trình trao đổi chất của chúng. Một lƣợng nhỏ các nguyên tố vi lƣợng cũng có ảnh
hƣởng nhất định đến sự hình thành CKS của xạ khuẩn. Sự có mặt của một số muối
khoáng nhƣ Na, Fe, Al, Bo, K, Cr, Cu, Mn, Zn… [29] trong môi trƣờng lên men sẽ
tác dụng khác nhau đến khả năng sinh kháng sinh của VSV. Có thể sự có mặt của
25

nguyên tố này sẽ làm giảm tác dụng kìm hãm hoặc làm tăng tác dụng kích thích của

nguyên tố kia. Một số muối khoáng nhƣ Ca
2+
, Cu
2+
… đƣợc cho là có ảnh hƣởng tới
khả năng sinh ra một vài loại kháng sinh trong đó có vancomyxin. Các khoáng chất
này có tác động lên hoạt động của các enzyme trong sinh tổng hợp kháng sinh [29].
1.3. NGHIÊN CỨU DUY TRÌ VÀ NÂNG CAO HIỆU SUẤT CHỦNG GIỐNG
SẢN XUẤT VANCOMYXIN
Một yếu tố quan trọng hàng đầu cho mọi quá trình lên men sinh tổng hợp
hoạt chất sinh học là chủng giống vi sinh vật. Do các chủng VSV dễ bị biến dị và
hoạt tính bị thoái hóa trong quá trình nuôi cấy nhiều lần bởi tác động của môi
trƣờng sống của chúng, nên phải tiến hành chọn lọc thƣờng xuyên chủng giống cho
lên men. Phần lớn các chủng sản sinh KS phân lập từ tự nhiên thƣờng có hiệu suất
thấp vì thế không thể dùng ngay cho sản xuất [6], [7], [12], [26]. Để thu đƣợc các
chủng có khả năng siêu tổng hợp KS, có giá trị trong công nghiệp cần phải áp dụng
các phƣơng pháp đột biến nhân tạo (đột biến cảm ứng). Các phƣơng pháp hiện đại
về sinh tổng hợp, kỹ thuật di truyền và công nghệ gen, siêu tổng hợp, điều khiển
hoạt động của gen, gây đột biến định hƣớng, tạo và dung hợp tế bào trần
(protoplas)… không những nâng cao hiệu suất chủng giống trong thời gian ngắn mà
còn mở ra phƣơng hƣớng đầy triển vọng trong sản xuất các CKS [58].
*Chọn lọc tự nhiên
Bào tử hoặc tế bào sinh dƣỡng của chủng sinh kháng sinh đƣợc pha loãng
trong nƣớc muối sinh lý, sau đó cấy lên môi trƣờng dinh dƣỡng trong hộp petri sao
cho chỉ hình thành 40-50 khuẩn lạc trong mỗi hộp. Nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ
thích hợp 4-5 ngày cho khuẩn lạc phát triển tốt và xác định hoạt tính kháng sinh
bằng phƣơng pháp cục thạch. Khi tuyển chọn chủng sinh kháng sinh cao theo
phƣơng pháp này, cần phải kiểm tra lại bằng lên men để xác định hiệu suất sinh
kháng sinh so với chủng ban đầu. Phƣơng pháp chọn chủng có hoạt tính cao theo
cách này chỉ là những đột biến tự nhiên, không có ý nghĩa tạo chủng có năng suất

cao, đáp ứng đƣợc nhu cầu của sản xuất [15], [69].