Giải trình tự thế hệ mới

Giảitrìnhtự thế hệ mới
Phạm Hùng Vân
Trưởng ĐơnVị Kỹ ThuậtPhânTíchGene
Hai
giai đoạn
trong
giải
trình tự
Sanger
Ứng dụng giảitrìnhtự Sanger
1. Giảitrìnhtự gene hay bộ gen cho các nghiên cứucó
liên quan;
2. Phát hiệncácđộtbiến gene (liên quan đến ung thư,
đên kháng thuốc), các SNP (trong cá nhân hóa các
liệuphápđiềutrị), các kiểu gene (genotype của
virus gây bệnh)…;
3. Định danh vi khuẩnhay vi nấmdựatrêngiảitrìnhtự
DNA của gene qui định RNA của ribosome (16S của
vi khuẩn và 28S củavi nấm) đặcbiệt là các tác nhân
khó định danh hay thấtbại nuôi cấytừ mẫuthử;
4. Phân tích đoạn xét nghiệmdấu vân tay DNA (DNA
finger printing)
để nhậndạng cá nhân và mốiquan
hệ cá nhân (pháp y), trong chẩn đoán tiền sanh,
trong phát hiện đadạng loài…
Pyrosequencing
Nguyên tắc pyrosequencing
1. A, hay T, hay C, hay G đượclậptrìnhchovàogiếng
phản ứng; và mỗi khi dung dịch nucleotide cho vào có
nucleotide đượcbắtcặpvàosợikhuônthìmột
pyrophosphate (PPi) sẽđượcphóngthíchrađể được

enzyme sulfurylase tạoramột ATP, ATP này sẽ giúp hệ
thống phát quang luciferin-luciferase (luciferin thành
oxyluciferin phát quang)
2. dATP-S đượcsử dụng để thay thế dATP vì dATP-S
không có hoạttínhcủaATP.
3. ATP và các nucleotide tự do còn thừasaumỗilầnbổ
sung nucleotide bị huỷ nhờ apyrase đượcchovào
giếng sau khi tín hiệu phát quang được ghi nhận
Định lượng được độtbiến
Ứng dụng pyrosequencing
 Nhiềubộ thuốcthửđã đượcchấpnhậnIVD
(In-Vitro Diagnosis) trong phát hiệncácđột
biến gene ung thư liên quan đếnchỉđịnh và
theo dõi điềutrịđích,
 Epigenomic: Định lượng các CpG vớiC bị
gắn methyl (Cytosine methylation) để tiên
đoán ung thư,
 Phát hiện độtbiến gene trong chẩn đoán và
sàng lọcbệnh di truyền,
 Đặcbiệt trong vi sinh lâm sàng: định danh
các vi khuẩn.
Ba giai đoạn
của
giảitrìnhtự
thế hệ mới
Giảitrìnhtự bằng tổng hợp
thế hệ mới vs pyrosequencing
1. Thuốcthử giảitrìnhtựđượcthổichảy vào chip nano-
well hay vi bảntheochương trình và sau khi ghi
nhận đượctínhiệuthìthuốcthử củ sẽđượcthổichảy

ra để thuốcthử mớilại đượcbơmvào.
2. Tổng hợpmạch bổ sung dựatrênmạch khuôn có thể
là kéo dài đầu3’ củamạch bổ sung bằng các
nucleotide (A, T, C hay G) được ghi nhận, hay có
thể là kéo dài đầu3’ củamạch bổ sung mỗilần2
base nhờ
sự kéo dài và nốiprobe dựatrênsợi khuôn
3. Tín hiệutổng hợpcóthể là tín hiệu phát quang dựa
trên hệ thống luciferin-luciferase (454 củaRoche),
tín hiệu điệndo thayđổi pH (Ion-Tolent hay Ion-
Proton củaABI), tínhiệuhuỳnh quang được đánh
dấu trên các nucleotide A, T, C hay G (Solexa của
Illumina), hay cũng có thể là tín hiệuhuỳnh quang
đượcgắn lên probe (solid củaABI).
Công nghệ Barcode
cho phép xác định nguồngốctrìnhtựđượcgiải
Ứng dụng giảitrìnhtự thế hệ mới
 Giảitrìnhtự bộ gene, thậm chí 24h cho bộ gene
người
 Lôi ra ánh sáng bấtcứ mộttrìnhtự nucleic acid
củabấtcứ tác nhân gì có mặttrongmẫuthử lấy
từ vậtchủ hay bệnh nhân
 Công cụ nhạycảmnhất để có thể phát hiệncác
độtbiếnchodùtỷ lệđộtbiếnhiệndiệntrong
mẫuthử là rấtthấp
 Chẩn đoán tiềnsanhpháthiệndị bộicủathai
nhi bằng phân tích DNA của bào thai hiệndiện
trong máu mẹ dựatrênưu điểm độ nhạycao
củakỹ thuật
Giảitrìnhtự

bộ gene
(Crag Venter)
Ứng dụng giảitrìnhtự thế hệ mới
 Giảitrìnhtự bộ gene, thậm chí 24h cho bộ gene
người
 Lôi ra ánh sáng bấtcứ mộttrìnhtự nucleic acid
củabấtcứ tác nhân gì có mặttrongmẫuthử lấy
từ vậtchủ hay bệnh nhân
 Công cụ nhạycảmnhất để có thể phát hiệncác
độtbiếnchodùtỷ lệđộtbiếnhiệndiệntrong
mẫuthử là rấtthấp
 Chẩn đoán tiềnsanhpháthiệndị bộicủathai
nhi bằng phân tích DNA của bào thai hiệndiện
trong máu mẹ dựatrênưu điểm độ nhạycao
củakỹ thuật
ABL1 EGFR GNAS MLH1 RET
AKT1 ERBB2 HNF1A MPL SMAD4
ALK ERBB4 HRAS NOTCH1 SMARCB1
APC FBXW7 IDH1 NPM1 SMO
ATM FGFR1 JAK2 NRAS SRC
BRAF FGFR2 JAK3 PDGFRA STK11
CDH1 FGFR3 KDR PIK3CA TP53
CDKN2A FLT3 KIT PTEN VHL
CSF1R GNA11 KRAS PTPN11
CTNNB1 GNAQ MET RB1
FFPESample
QualityControl
•qPCR‐based
samplequality
control

• Ensure
sampleswillbe
successfulin
assay
Prepare
Amplicons
• Prepare
librariesw/
TruSeq
Amplicon
assay
• Indexupto96
samples
• Built‐insample
normalization
Sequenceon
MiSeq
•Simplesample
sh eet creation
withIllumina
Experiment
Manager
• Bidirectional
amplicon
sequenc ing
with2x150bp
reads(2x250
soon)
• >75%bases@
>Q30(>99.9%

accuracy)
Automated
analysis
• Alignreads
withMiSeq
Reporter
•Calllow
frequency
variants(<5%)
•Analyzedata
withAmplicon
Viewer
New!
Kếtquả giảitrìnhtự bộ genevirustrên
máy MiSeq ‐ Illumina
Các bướctiến hành:
 Bảoquảnmẫuvàbấthoạtchủng virut Rubella
bằng dung dịch RNA Shield™ củahãngZymo
Research – Mỹ.
 Tách chiếtmẫu Virut Rubella bằng Direct-zol™
RNA MiniPrep Kit. (P/N: R2050) củahãngZymo
Research .
 Chuẩnbị thư việnvớibộ kit TruSeq RNA LT của
Illumina.
 Chạygiảitrìnhtự vớibộ kít MiSeq 300 cycle V2
trên MiSeq.
 Phân tích kếtquả sử dụng phầnmềmSeqManvà
Blast trên NCBI
 Tổng thờigianchuẩnbị mẫuvàchạygiảitrình

tự, phân tích kếtquả: 3 ngày.
Kếtquả
 Phân tích kế quả bằng phầnmềmSeqMan thu
đượctoànbộ genome của virut Rubella
(9.762bp)
So sánh trình tự thu đượctrên
ngân hàng gene NCBI
 Trình tự thu đượcgiống với: Rubella virus strain
RVi/LA.CA.USA/45.08/2B CRS, complete genome
 Các vùng giàu GC vủa virut đều có thể đọc trình
tự được (việc này rất khó khi thực hiện bằng
máy giải trình tự thế hệ cũ)
 Độ chính xác cao: 51782 coverage với Q >30.