NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN RHODOTORULA CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢ P BETACAROTENE TRÊN MÔI TRƯỜ
NG BÁN RẮ N LÀM THỨC ĂN BỔ SUNG CHO GÀ ĐẺ TRỨNG (140 trang)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA



NGUYỄN THỊ MINH NGUYỆT


NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN RHODOTORULA CÓ
KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BETA-CAROTENE
TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN LÀM THỨC ĂN
BỔ SUNG CHO GÀ ĐẺ TRỨNG



LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT









ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGUYỄN THỊ MINH NGUYỆT

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN RHODOTORULA CÓ
KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BETA-CAROTENE
TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN LÀM THỨC ĂN
BỔ SUNG CHO GÀ ĐẺ TRỨNG


CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG
MÃ SỐ CHUYÊN NGÀNH : 62.54.02.01

Phản biện độc lập 1 : PGS.TS NGUYỄN THỊ XUÂN SÂM
Phản biện độc lập 2 : PGS.TS LƯU HỮU MÃNH

Phản biện 1 : PGS. TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG
Phản biện 2 : TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN
Phản biện 3 : PGS. TS NGUYỄN TIẾN THẮNG

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1. PGS.TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO
2. TS. NGUYỄN HỮU PHÚC




LỜI CAM ĐOAN

Nghiên cứu sinh








NGUYỄN THỊ MINH NGUYỆT


















Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu
của riêng tôi. Các kết quả nêu trong luận án là

trung thực và chưa từng được ai công bố trong
bất kỳ công trình nào khác.

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng tri ân đến Cô PGS.TS. Đống Thị Anh Đào và Thầy
TS. Nguyễn Hữu Phúc đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất để
tôi hoàn thành Luận án này.
Chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô trong Bộ môn Công nghệ thực phẩm - Khoa
Công nghệ Hóa học và Dầu khí, quý Thầy Cô trong Hội đồng bảo vệ các chuyên đề
NCS và đặc biệt là Thầy PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn đã có những đóng góp, những nhận
xét chân thành cho kết quả đạt được của Luận án.
Đồng cảm ơn Ban lãnh đạo cùng giảng viên, cán bộ nhân viên Viện Công nghệ
Thực phẩm – Sinh học, Trường Đại học Công Nghiệp TP. HCM; Bộ môn chăn nuôi
chuyên khoa, Khoa Chăn nuôi – Thú y trường Đại học Nông Lâm TP. HCM; Khoa
Hóa học và Công nghệ Thực phẩm trường Đại học Bà Rịa-Vũng Tàu đã tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi học tập, nghiên cứu.
Cảm ơn anh Trần Văn Nam, chủ cơ sở Mai Thủy, thành phố Vũng Tàu, tỉnh Bà
Rịa-Vũng Tàu đã tạo điều kiện cho tôi làm thực nghiệm trên đàn gia cầm chuyên trứng
IsaBrown của cơ sở.
Xin gửi lời cảm ơn đến học viên cao học Nguyễn Thị Tú Minh và cử nhân
Nguyễn Minh Nhựt đã hỗ trợ, giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình tiến hành thực
nghiệm.
Xin cảm ơn Ba, Mẹ và các Anh Chị trong đại gia đình Đức Hải đã giúp con có
được sự thành đạt ngày hôm nay.
Lời cuối cùng tôi xin cảm ơn anh Phan Trung Viên đã luôn cận kề, động viên,
chia sẻ, tạo mọi điều kiện về vật chất lẫn tinh thần cho tôi học tập và nghiên cứu. Cảm
ơn hai con Phan Trung Thành Nhân và Phan Nguyễn Minh Tâm đã ngoan, khỏe mạnh
và học giỏi trong những năm mẹ học tập.
NGUYỄN THỊ MINH NGUYỆT

MỤC LỤC
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
MỤC LỤC
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các sơ đồ và hình
MỞ ĐẦU
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 NẤM MEN RHODOTORULA 1
1.1.1 Giới thiệu chung và đặc điểm phân loại 1
1.1.2 Đặc điểm sinh lý, hình thái 3
1.1.3 Đặc điểm sinh hóa 4
1.1.4 Khả năng sinh tổng hợp carotenoid của Rhodotorula 4
1.1.5 Khả năng sinh tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất khác của Rhodotorula .
11
1.2 KỸ THUẬT NUÔI CẤY BÁN RẮN 12
1.2.1 Khái quát về lên men bán rắn 12
1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men bán rắn 14
1.2.3 Phương pháp định lượng sinh khối trong lên men bán rắn 15
1.2.4 Lên men bán rắn nấm men Rhodotorula 17
1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy nấm men Rhodotorula 18
1.3 VAI TRÒ CỦA MỘT SỐ CHẤT DINH DƯỠNG ĐỐI VỚI GIA CẦM ĐẺ
TRỨNG 22
1.3.1 Vai trò dinh dưỡng của protein và acid amin 23
1.3.2 Vai trò của sắc tố carotenoid đối với gà đẻ 24
1.3.3 Vai trò của enzym phytase 25
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH NẤM MEN RHODOTORULA 28
2.1.1 Vật liệu phân lập 28

2.1.2 Môi trường phân lập 28
2.1.3 Các thí nghiệm định danh nấm men 29
2.2 THU NHẬN CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ NẤM MEN RHODOTORULA
THEO KỸ THUẬT NUÔI CẤY BÁN RẮN 29
2.2.1 Khảo sát phương pháp phá vỡ thành tế bào nấm men 29
2.2.2 Thành phần môi trường cơ bản cho quá trình LBR Rhodotorula 33
2.2.3 Tối ưu hàm lượng các chất dinh dưỡng bổ sung cho quá trình sinh tổng hợp
beta-carotene của nấm men Rhodotorula theo qui hoạch thực nghiệm Box-Hunter .
35
2.2.4 Tối ưu điều kiện nuôi cấy bán rắn nấm men Rhodotorula 37
2.2.5 Phương pháp khảo sát động học sinh tổng hợp sinh khối và các sản phẩm
trao đổi chất khác 39
2.2.6 Khảo sát sự tự phân của nấm men Rhodotorula 40
2.2.7 Các phương pháp phân tích hóa lý 40
2.3 THỬ NGHIỆM TÍNH AN TOÀN CỦA CHẾ PHẨM TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ
NGHIỆM 41
2.3.1 Đối tượng thí nghiệm 41
2.3.2 Thành phần thức ăn đối chứng 42
2.3.3 Bố trí thí nghiệm trên đàn chuột 43
2.3.4 Các chỉ tiêu và phương pháp khảo sát 43
2.4 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CHẾ PHẨM TRÊN GÀ ĐẺ TRỨNG 45
2.4.1 Đối tượng và địa điểm thí nghiệm 45
2.4.2 Thành phần thức ăn đối chứng 46
2.4.3 Các nguyên liệu phối trộn thức ăn thí nghiệm 46
2.4.4 Bố trí thí nghiệm trên đàn gà 47
2.4.5 Các chỉ tiêu khảo sát năng suất và phẩm chất trứng 48
2.4.6 Quan sát sự tiêu huỷ của tế bào nấm men và phương pháp thu nhận chế
phẩm 51
2.4.7 Xác định mối tương quan giữa tổng hàm lượng carotenoid trong thức ăn với
năng suất cho trứng của gà 52

2.5 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 52
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1 KẾT QUẢ CHỌN RHODOTORULA CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP
BETA-CAROTENE TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN 53
3.1.1 Phân lập các nấm men sinh sắc tố carotenoid 53
3.1.2 Tuyển chọn và định danh các nấm men thuộc giống Rhodotorula trên cơ sở
thực hiện các thí nghiệm theo khoá phân loại của Kreger-van Rij 53
3.1.3 Chọn chủng nấm men nghiên cứu chính từ các chủng phân lập được trên cơ
sở khả năng sinh tổng hợp beta-carotene 56
3.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ NẤM
MEN RHODOTORULA THEO PHƯƠNG PHÁP BÁN RẮN 59
3.2.1 Khảo sát các phương pháp phá vỡ thành tế bào nấm men 59
3.2.2 Tối ưu hàm lượng các chất dinh dưỡng bổ sung cho quá trình sinh tổng hợp
beta-carotene của Rhodotorula 62
3.2.3 Điều kiện nuôi cấy tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp beta-carotene của
nấm men Rhodotorula 71
3.2.4 Khảo sát khả năng sinh tổng hợp sinh khối, phytase, carotenoid tổng và
beta-carotene của nấm men Rhodotorula theo thời gian 77
3.2.5 Khảo sát quá trình tự phân của nấm men 81
3.2.6 Đề xuất quy trình thu nhận chế phẩm 82
3.2.7 Phân tích thành phần dinh dưỡng của chế phẩm 83
3.3 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM TÍNH AN TOÀN CỦA CHẾ PHẨM TRÊN
ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM 87
3.4 KẾT QUẢ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CHẾ PHẨM TRÊN GÀ ĐẺ
TRỨNG 90
3.4.1 Công thức thức ăn cho gà đẻ trứng sử dụng trong thí nghiệm 90
3.4.2 Năng suất trứng 92
3.4.3 Mối tương quan giữa hàm lượng carotenoid tổng và năng suất trứng gà
93
3.4.4 Tỷ lệ gà sống 94

3.4.5 Các chỉ tiêu phẩm chất trứng 94
3.4.6 Hàm lượng beta – carotene và vitamin A trong lòng đỏ trứng 97
Chương 4: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ
4.1 KẾT LUẬN 99
4.2 ĐỀ NGHỊ 100
TÀI LIỆU THAM KHẢO
CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ
GIẤY KHEN, GIẤY CHỨNG NHẬN CỦA BAN TỔ CHỨC HỘI THI SÁNG TẠO
KỸ THUẬT TỈNH BÀ RỊA – VŨNG TÀU NĂM 2008 – 2009
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT


CB : cân bằng
CFU : đơn vị hình thành khuẩn lạc
CK : chất khô
DM : dung môi
ĐC : đối chứng
HSPL : hệ số pha loãng
KL : khuẩn lạc
Klg : khối lượng
LBR : lên men bán rắn
% Klg : phần trăm khối lượng
MT : môi trường
ME : năng lượng trao đổi
NT : nghiệm thức
OD : mật độ quang
TB : trung bình
TYT : tối ưu các yếu tố toàn phần
TN : thí nghiệm

Sac. : đường saccharose
UI : đơn vị hoạt độ





DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1 Các sắc tố chính do nấm men Rhodotorula tổng hợp 8
Bảng 1.2 Các nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp carotenoid và beta-
carotene của nấm men Rhodotorula theo phương pháp nuôi cấy chìm 10
Bảng 1.3 Sắc tố carotenoid do Rh. glutinis DBVPG 3853 tổng hợp được sau
120 giờ trên môi trường nước ép nho ở các nhiệt độ khác nhau 21
Bảng 2.1 Các nguồn phân lập nấm men sinh sắc tố carotenoid 28
Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát phương pháp phá vỡ thành tế bào 31
Bảng 2.3 Thành phần nguyên liệu sử dụng 33
Bảng 2.4 Mức khảo sát của hàm lượng saccharose, nitơ, phosphor và lưu
huỳnh để tìm thí nghiệm tại tâm 35
Bảng 2.5 Ma trận qui hoạch thực nghiệm 4 yếu tố theo phương án quay bậc 2
36
Bảng 2.6 Mức biến thiên hàm lượng saccharose, nitơ, phosphor và lưu huỳnh
(mg/Kg MT) 37
Bảng 2.7 Các mức khảo sát độ ẩm, độ dày lớp môi trường và tỷ lệ giống để
tìm thí nghiệm tại tâm 37
Bảng 2.8 Ma trận qui hoạch thực nghiệm tối ưu 3 yếu tố theo phương án toàn
phần 38
Bảng 2.9 Mức biến thiên của các yếu tố điều kiện nuôi 38
Bảng 2.10 Thành phần dinh dưỡng của thức ăn đối chứng cho chuột 42
Bảng 2.11 Thành phần dinh dưỡng thức ăn đậm đặc GD 26 Star Feed 46

Bảng 2.12 Công thức thức ăn cho gà mái đẻ đối chứng 47
Bảng 3.1 Đặc điểm tế bào và tốc độ phát triển của 8 chủng Rhodotorula phân
lập được 54
Bảng 3.2 Kết quả khảo sát đặc điểm sinh lý và sinh hóa của 8 nấm men
Rhodotorula phân lập được 55
Bảng 3.3 Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của các chủng nấm men
Rhodotorula trên môi trường cơ bản ……… 57
Bảng 3.4 Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của Rhodotorula ở các hàm
lượng saccharose khác nhau 63
Bảng 3.5 Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của Rhodotorula ở các hàm
lượng nitơ khác nhau 64
Bảng 3.6 Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của Rhodotorula ở các hàm
lượng phosphor khác nhau 65
Bảng 3.7 Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của Rhodotorula ở các hàm
lượng lưu huỳnh khác nhau 66
Bảng 3.8 Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của Rhodotorula từ thực
nghiệm tối ưu dinh dưỡng 67
Bảng 3.9 Các hằng số b
j
tính theo các số liệu thực nghiệm tối ưu dinh dưỡng . 68
Bảng 3.10 Các hệ số hồi qui t
j
tính theo các số liệu thực nghiệm tối ưu dinh
dưỡng … 69
Bảng 3.11 Các phương sai và F theo các số liệu thực nghiệm tối ưu dinh
dưỡng bổ sung 69
Bảng 3.12 Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene ở các mức độ ẩm ban đầu
khác nhau 71
Bảng 3.13 Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene ở các lớp môi trường có độ
dày khác nhau 72

Bảng 3.14 Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene ở các tỷ lệ giống khác nhau 73
Bảng 3.15 Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của Rhodotorula từ thực
nghiệm tối ưu điều kiện nuôi cấy 74
Bảng 3.16 Các hằng số b
j
tính theo các số liệu thực nghiệm tối ưu điều kiện
nuôi cấy ………. 75
Bảng 3.17 Các hệ số hồi qui t
j
tính theo các số liệu thực nghiệm tối ưu điều
kiện nuôi cấy 75
Bảng 3.18 Các phương sai và F theo số liệu thực nghiệm tối ưu điều kiện nuôi
cấy 75
Bảng 3.19 Kết quả xác định hàm lượng beta-carotene, carotenoid tổng theo
thời gian LBR 79
Bảng 3.20 Kết quả phân tích thành phần dinh dưỡng của chế phẩm βCR 84
Bảng 3.21 Thành phần acid amin trong chế phẩm βCR … 85
Bảng 3.22 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của chế phẩm βCR biểu hiện lên chuột 87
Bảng 3.23 Công thức thức ăn gà đẻ sử dụng trong thí nghiệm 91
Bảng 3.24 Kết quả trung bình khảo sát các chỉ tiêu chất lượng trứng qua các
tuần thí nghiệm 95
Bảng 3.25 Hàm lượng beta-carotene và vitamin A trong lòng đỏ trứng ở các lô
thí nghiệm 97

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ VÀ HÌNH
Trang
Sơ đồ
Sơ đồ 2.1 Sơ đồ khảo sát và thu nhận chế phẩm sinh học βCR từ Rhodotorula 32
Sơ đồ 3.1 Tóm tắt quy trình thu nhận chế phẩm βCR 83

Hình (hình, biểu đồ, đồ thị)
Hình 1.1 Hình thái tế bào và hình thức sinh sản nẩy chồi Rhodotorula
glutinis 3
Hình 1.2 Sự chuyển hóa beta-carotene dưới tác dụng của nhiệt, ánh sáng và
bức xạ 5
Hình 1.3 Con đường mevalonate sinh tổng hợp isoprenoid 6
Hình 1.4 Quá trình sinh tổng hợp carotenoid từ isoprenoid 7
Hình 1.5 Quá trình sinh tổng hợp beta-carotene, torulene và torularhodin của
Rhodoturula 9
Hình 1.6 Sự sắp xếp của cơ chất rắn ẩm và pha khí liên tục trong hệ thống
lên men bán rắn đối với nấm sợi và vi sinh vật đơn bào 12
Hình 1.7 Thành phần thể tích của dòng khí đi vào và đi ra trong lên men bán
rắn 15
Hình 2.1 Gạo tấm và bã đậu nành dùng trong nghiên cứu 33
Hình 2.2 Chuột nhắt trắng dùng trong nghiên cứu 42
Hình 2.3 Gà IsaBrown tại trại thực nghiệm 45
Hình 2.4 Trứng gà đập trên mặt phẳng kính 49
Hình 2.5 Quạt so màu lòng đỏ trứng 50

Hình 3.1 Các nấm men sinh sắc tố carotennoid phân lập được 53
Hình 3.2 Giống nấm men Rhodotorula phân lập được 54
Hình 3.3 Trình tự nucleotid đoạn 28S DNA 58
Hình 3.4 Giải trình tự 28S DNA của chủng MN12 58
Hình 3.5 Kết quả tra cứu trình tự 28S DNA của chủng MN12 58
Hình 3.6 Biểu đồ biểu diễn hàm lượng beta-carotene thu được theo các
phương pháp phá vỡ tế bào 60
Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn khả năng sinh tổng hợp sinh khối của Rhodotorula
theo thời gian 77
Hình 3.8 Biểu đồ biểu diễn khả năng sinh tổng hợp phytase theo thời gian 78
Hình 3.9 Biểu đồ biểu diễn khả năng sinh tổng hợp beta-carotene và
carotenoid tổng theo thời gian . 80
Hình 3.10 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của thời gian tự phân đến hàm lượng
beta-carotene giữa hai nghiệm thức có bổ sung và không bổ sung chitinase 81
Hình 3.11 Khay lên men bán rắn Rhodotorula và chế phẩm βCR thu được 82
Hình 3.12 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của chế phẩm βCR lên hàm lượng
calci, phosphor trong xương và phosphor trong phân của chuột thí nghiệm 88
Hình 3.13 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của chế phẩm βCR lên hàm lượng
hemoglobin, beta-carotene và vitamin A trong huyết thanh chuột 89
Hình 3.14 Đồ thị biểu diễn năng suất cho trứng (%) của gà qua các tuần khảo
sát 92
Hình 3.15 Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa hàm lượng carotenoid tổng với
năng suất cho trứng 93
Hình 3.16 Quan sát hệ vi sinh vật trong phân gà 96





TÓM TẮT LUẬN ÁN

Luận án được thực hiện nhằm tìm ra nấm men Rhodotorula có khả năng sinh tổng
hợp beta-carotene cao trên môi trường nuôi cấy bán rắn để sản xuất ra chế phẩm sinh
học làm thức ăn bổ sung cho gà đẻ, góp phần tạo ra nguồn trứng chất lượng cao. Với
các mục tiêu ban đầu đặt ra, sau thời gian nghiên cứu chúng tôi đã đạt được các kết quả
sau:
- Đã tuyển chọn một chủng giống Rhodotorula sp.3 có khả năng tổng hợp sinh khối
giàu carotenoid đặc biệt là beta-carotene và có hoạt tính phytase trên môi trường nuôi
cấy bán rắn.
- Đã xác định được điều kiện tách chiết beta-carotene có trong tế bào nấm men thu
được từ môi trường lên men bán rắn (xử lý thành tế bào theo phương pháp kết hợp
Lạnh đông - Rã đông - Siêu âm).
- Đã xác định được các thông số tối ưu cho quá trình lên men bán rắn nấm men
Rhodotorula sp.3 nhằm thu beta-carotene cao trên cơ chất gạo tấm đã qua hồ hoá có bổ
sung bã đậu nành và đã xây dựng được quy trình thu nhận chế phẩm sinh học từ
Rhodotorula sp.3 (gọi tắt là βCR).
- Qua khảo sát tính an toàn của chế phẩm βCR, chúng tôi đã thử nghiệm dùng βCR
để làm thức ăn nuôi gà đẻ trứng công nghiệp Isa Brown. Kết thu được cho thấy năng
suất đẻ trứng của gà có thể tăng thêm 8-10 %, các chỉ tiêu chất lượng trứng như màu
của lòng đỏ, kết cấu albumin của lòng trắng trứng đặc, độ dày vỏ cùng với hàm lượng
beta-carotene và vitamin A trong lòng đỏ trứng được cải thiện đáng kể.
- Mối quan hệ giữa hàm lượng carotenoid tổng trong thức ăn đến năng suất trứng
của gà ở giai đoạn gà cho trứng có năng suất cao và ổn định được thể hiện qua phương
trình y = - 0,0007 x2 + 0,1842 x + 82,21 (R
2
= 0,9976) với x là hàm lượng carotenoid
tổng (mg/Kg), y là năng suất cho trứng của gà (%).

MỞ ĐẦU
Nhu cầu phải có thức ăn sạch, an toàn, đảm bảo dinh dưỡng và sức khoẻ cộng
đồng để cải thiện và phát triển thể lực, trí lực của các thế hệ người Việt trong tương lai

là một đòi hỏi cấp thiết cho ngành công nghệ thực phẩm. Trong khẩu phần thức ăn của
người, ngoài nền tảng tinh bột như cơm, ngô, khoai , lượng đạm cơ bản được cung cấp
chủ yếu từ các sản phẩm vật nuôi và cây trồng như thịt, trứng, sữa, rau, đậu, … đặc biệt
trong đó là các sản phẩm từ chăn nuôi. Theo số liệu thống kê, trong những năm đầu của
thế kỷ 21, ước tính tổng giá trị gia cầm đã đóng góp khoảng 5% GDP của Việt Nam
[139]. Tiềm năng và kỳ vọng đóng góp của ngành chăn nuôi này vào việc cung cấp đủ
nhu cầu thức ăn đáp ứng tiêu chuẩn và cho sự phát triển của nền kinh tế đất nước trong
tương lai là rất lớn. Tuy nhiên, tại Việt Nam, gia cầm chủ yếu được nuôi bằng nguồn
thức ăn tự nhiên sẵn có thiếu hoặc không cân đối về dinh dưỡng hay bằng nguồn thức
ăn nhập từ nước ngoài với giá cao [6].
Thức ăn là vấn đề quan trọng nhất trong chăn nuôi, nó quyết định trực tiếp đến
năng suất, chất lượng và giá thành của các sản phẩm thịt, trứng, sữa, Đặc biệt, sắc tố
carotenoid là yếu tố cần phải có trong thức ăn. Ngoài tác dụng cung cấp chất tiền
vitamin A, sắc tố carotenoid còn là chất chống oxi hóa sinh học để bảo vệ tế bào,
buồng trứng, làm tăng năng suất và sản lượng trứng [9, 84, 97]. Tuy nhiên nguồn thức
ăn thực vật dồi dào tại Việt Nam như tấm, khoai mì, cám, v.v… dùng trong chăn nuôi
gia cầm nói chung hay gà đẻ hầu như không có sắc tố carotenoid. Do đó, gia cầm bị
thiếu sắc tố vàng nên sức đề kháng yếu, dễ sinh bệnh tật, giảm tỷ lệ đẻ và chất lượng
trứng kém [9].
Trong số các vi sinh vật có khả năng tổng hợp carotenoid thì giống nấm men
Rhodotorula có khả năng sản xuất carotenoid [14, 37-39, 55-59] trong đó có beta-
carotene [91, 116] đang được nghiên cứu sản xuất ở quy mô công nghiệp để làm chất
màu thực phẩm [51] và đã được dùng làm thức ăn chăn nuôi [80, 110].
Đề tài luận án: “Nghiên cứu tuyển chọn Rhodotorula có khả năng sinh tổng
hợp beta-carotene trên môi trường bán rắn làm thức ăn bổ sung cho gà đẻ trứng”
được thực hiện nhằm phân lập, tuyển chọn, tối ưu môi trường nuôi cấy dòng vi sinh vật
để sản xuất nguồn thức ăn giàu beta-carotene và sản phẩm này sử dụng có hiệu quả cho
chăn nuôi gia cầm đẻ trứng. Ngoài ra, các loại thực phẩm tự nhiên dùng cho người hiện
tại đang rất thiếu và cần bổ sung vitamin A. Đề tài luận án còn giải quyết bài toán là cải
tạo nguồn thức ăn cho vật nuôi với nguyên liệu sẵn có và rẻ, thông qua đó nâng hàm

lượng vitamin A trong trứng, tạo nguồn trứng chất lượng cao. Đồng thời, để đánh giá
tính an toàn và hiệu quả của chế phẩm, đề tài còn thực hiện nghiên cứu thử nghiệm trên
chuột và xác định năng suất và chất lượng trứng khi dùng chế phẩm này bổ sung vào
thức ăn cho gà đẻ.
CÁC NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CHÍNH CỦA ĐỀ TÀI
 Phân lập và chọn từ tự nhiên các nấm men sinh sắc tố carotenoid thuộc giống
Rhodotorula có khả năng tổng hợp sinh khối giàu beta-carotene trên môi trường bán
rắn.
 Xác định các thông số kỹ thuật của quá trình nuôi cấy bán rắn nấm men
Rhodotorula trên cơ chất gạo tấm và bã đậu nành có bổ sung dinh dưỡng.
 Khảo sát ảnh hưởng của chế phẩm sinh học đến năng suất và chất lượng cho
trứng của gà đẻ, trong đó xác định được mối quan hệ giữa hàm lượng carotenoid tổng
trong thức ăn và năng suất cho trứng của gà chuyên trứng. Kết quả của quá trình
nghiên cứu cho thấy tính ưu việt và hiệu quả kinh tế rõ nét của nguồn thức ăn được tạo
ra theo phương cách sử dụng chế phẩm sinh học trên.
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI
 Phân lập và chọn được Rhodotorula có khả năng tổng hợp carotenoid giàu beta-
carotene, sinh khối và phytase trên môi trường bán rắn.
 Tối ưu thành phần dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy bán rắn nấm men
Rhodotorula trên cơ chất chính là gạo tấm và bã đậu nành với hàm mục tiêu là hàm
lượng beta-carotene, đồng thời đã đề xuất quy trình thu nhận chế phẩm sinh học có giá
trị dinh dưỡng cao từ nấm men Rhodotorula theo phương pháp bán rắn.
 Thử nghiệm dùng chế phẩm làm nguyên liệu bổ sung nuôi gà đẻ trứng công
nghiệp cho kết quả tăng năng suất và chất lượng trứng.
 Tìm ra phương trình biểu diễn mối quan hệ giữa hàm lượng carotenoid tổng
trong thức ăn và năng suất cho trứng của gà chuyên trứng thuộc giống IsaBrown.
Tóm lại, ý nghĩa của đề tài là bằng con đường công nghệ sinh học, chuyển nguồn
phụ phẩm dồi dào, rẻ tiền tại Việt Nam thành nguồn nguyên liệu giàu dinh dưỡng, có
hoạt tính sinh học cao, cải thiện năng suất và chất lượng sản phẩm chăn nuôi gia cầm,
thay thế các nguồn thức ăn nhập khẩu, góp phần tích lũy ngoại tệ cho quốc gia và đóng

góp vào sự phát triển đất nước.










1

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 NẤM MEN RHODOTORULA
1.1.1 Giới thiệu chung và đặc điểm phân loại
Hiện nay có hai cách phân loại vi sinh vật. Cách thứ nhất dựa vào đặc điểm sinh lý,
sinh hoá; cách thứ hai dựa vào cơ sở cấu trúc phân tử của tế bào. Nấm men thuộc giới
(Regnum) nấm (Fungi). Giới này bao gồm nấm và nấm lớn (hay nấm quả thể). Ước tính
có khoảng 1,5 triệu loài nấm [74] và giới này cho đến nay vẫn còn là điều bí ẩn [106].
Đại diện tiêu biểu của giới nấm là nấm mốc (Mold), nấm men (Yeast) và nấm lớn
(Mushroom). Nấm men được chia thành 2 ngành là nấm túi (Ascomycota) và nấm đảm
(Basidiomycota) [15]. Trong mỗi ngành (Phylum) có các lớp (Classis), trong mỗi lớp
chia thành các bộ (Ordo), trong mỗi bộ chia thành nhiều họ (Familia), trong mỗi họ
chia thành nhiều giống (Genus), trong mỗi giống có nhiều loài (Species) và loài là đơn
vị cơ bản của hệ thống phân loại.
Năm 1928, Harrison F.C. phân lập và định danh được loài Rhodotorula
mucilaginosa và một số loài khác thuộc giống này. Sau đó giống nấm men trên được
đặt tên là nấm men Rhodotorula Harrison [54]. Theo Harrison, nấm men Rhodotorula

có vị trí trong hệ thống phân loại như sau [129]:
• Giới: Fungi
• Ngành : Basidiomycota
• Lớp: Urediniomycetes
• Bộ: Sporidiales
• Họ: Sporidiobolaceae
• Giống: Rhodotorula
Theo thời gian, đã hình thành và tồn tại nhiều khoá phân loại và định danh nấm
men. Đầu tiên là khóa phân loại của Hensen (đầu thế kỷ 20) sau đó là khóa của Lodder
và Kreger-van Rij (1952), Lodder (1971), Kreger-van Rij (1984) và hiện nay là khóa
2

phân loại của Barnett và cộng sự (1990) hay Kurtzman và Fell (1998). Trong luận án
này, chúng tôi sử dụng khóa phân loại của Kreger-van Rij (1984). Theo khóa phân loại
này, nấm men gồm 60 giống, trong đó có 25 giống xếp vào nhóm có khả năng tạo và
không tạo bào tử, và giống Rhodotorula thuộc nhóm này. Đặc điểm phân loại của
Rhodotorula theo mô tả của Kreger-van Rij như sau [95]:
- Không hình thành bào tử và không sinh sản hữu tính;
- Nẩy chồi theo nhiều hướng;
- Tạo sắc tố đỏ, hồng, cam hay vàng;
- Khuẩn lạc nhầy;
- Không lên men các loại đường;
- Có hay không đồng hóa nitrat NO
3
-
;
- Không đồng hoá nguồn carbon inositol, đây là nét đặc trưng khác
nhau cơ bản nhất giữa giống Rhodotorula và giống Cryptococcus.
Theo Lodder và Kreger-van Rij, cơ sở để xếp Rhodotorula vào một giống riêng là
do sự hiện diện của sắc tố carotenoid có các màu từ vàng đến đỏ bên trong tế bào và

không có khả năng đồng hóa nguồn carbon inositol.
Thực tế, khóa phân loại của Lodder và Kreger-van Rij được sử dụng khá phổ biến ở
Việt Nam. Tuy nhiên, hiện tại phương pháp phân loại nấm chính xác là phương pháp
dựa trên cơ sở vật chất di truyền [75]. Theo Swarajit và cộng sự (2001) việc định danh
các loài nấm men thuộc giống Rhodotorula phải trên cơ sở cấu trúc của rARN [143].
Guinet F. (2007) cho rằng khi định danh giống Rhodotorula nếu chỉ dựa vào kết quả
phản ứng từ bộ test- KIT thì chỉ chính xác khoảng 72%. Nếu kết hợp với các quan sát
đại thể, vi thể về đặc trưng hình thái, các phản ứng sinh hóa trên thạch đĩa sẽ nâng độ
chính xác lên 87,8% [69]. Thực tế hiện nay, một số loài thuộc giống Rhodotorula và
Rhodosporidium tuy có tên gọi khác nhau nhưng có cấu trúc ADN giống nhau [16,
134]. Nghiên cứu của Belloch C. và cộng sự (2007) cũng kết luận rằng giống
Rhodotorula đã xuất hiện nhiều loài mới và nhiều chủng mới ngay trong cùng một loài
3

do đó khi định danh nấm men cần phải có sự hỗ trợ của sinh học phân tử để xác định
cấu trúc của nhân tế bào [21].
1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý
1.1.2.1 Đặc điểm hình thái
Tế bào nấm men Rhodotorula là tế bào sinh dưỡng ở thể đơn bào, quan sát dưới kính
hiển vi có dạng hình tròn, hình oval, tế bào có thể bị kéo dài và bị uốn cong. Kích
thước tế bào nấm men trung bình khoảng 5µm x 8µm [4, 10].

Hình 1.1 Hình thái tế bào và hình thức sinh sản nẩy chồi của Rhodotorula glutinis [95]
Thành tế bào nấm men Rhodotorula bao gồm nhiều lớp, thành phần chủ yếu là các
polysaccharid như: 1,3-alpha-glucan; mannan; 1,3-beta-1,6-beta-glucan và chitine (n-
acetyl glucosamine). Các cấu tử tham gia vào cấu tạo của tế bào nấm men Rhodotorula
thường khác nhau ở các loài, đa số các loài có thành phần cấu tạo gồm glucose,
mannose, galactose và fucose [18, 95].
Khuẩn lạc Rhodotorula phát triển nhanh, bề mặt trơn nhẵn, bóng sáng hoặc mờ đục,
đôi khi gồ ghề, mịn và nhớt. Bờ khuẩn lạc Rhodotorula không có răng cưa, có màu từ

kem, hồng đến đỏ san hô, cũng có khi có màu vàng và đỏ cam thuộc nhóm sắc tố
carotenoid [10, 89, 129]. Kích thước khuẩn lạc tuỳ thuộc vào thành phần môi trường
dinh dưỡng và nhiệt độ nuôi cấy. Đường kính khuẩn lạc Rhodotorula có thể từ 1 ÷ 10
mm [109]. Trên bề mặt dịch chúng tạo thành các vòng có màu từ vàng đến đỏ [10].
1.1.2.2 Đặc điểm sinh lý
Đa số loài thuộc giống Rhodotorula sinh sản bằng cách nẩy chồi đa cực, một số loài
sinh sản theo kiểu nẩy chồi có cực. Ngoài ra, Rhodotorula còn sinh sản theo kiểu phân
4

đôi nhưng giống Rhodotorula không có hình thức sinh sản theo kiểu hữu tính [3, 18].
Nấm men Rhodotorula không hình thành sợi nấm, một số loài có sinh sợi nấm giả
nhưng rất kém phát triển, không hình thành bào tử túi [4, 10].
Theo Phaff và cộng sự (1969), khả năng hình thành sắc tố carotenoid là một đặc
điểm sinh lý quan trọng dùng trong phân loại của các giống Rhodotorula và
Cryptococcus [117].
1.1.3 Đặc điểm sinh hóa
Ngoài các đặc điểm sinh hoá dùng để phân loại giống nấm men Rhodotorula theo
Kreger-van Rij (mục 1.1.1.), nấm men này còn có một số đặc điểm sinh hóa sau:
- Không tạo ra acid acetic [91];
- Sinh enzyme urease [91];
- Có hoạt tính protease ngoại bào trên các nguồn cơ chất khác nhau [121];
- Đồng hóa tốt các hydrocarbon dầu mỏ [10, 91, 122].
- Không sinh enzyme amyloglucosidase và cellulase [93, 121];
- Không hình thành hợp chất loại tinh bột [18, 95];
- Sinh tổng hợp enzyme D-amino-acid oxidase (EC 1.4.3.3) [16, 60, 96, 153, 155];
- Có chứa enzyme khử bão hòa (desaturase), đặc biệt có khả năng chuyển hóa acid
oleic (C18:1) thành acid linolenic (C18:3) [154].
1.1.4 Khả năng sinh tổng hợp carotenoid của Rhodotorula
1.1.4.1 Sơ lược về carotenoid
Các carotenoid chủ yếu được tách từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên như thực vật và

vi sinh vật nhưng có chức năng sinh lý đặc hiệu đối với cơ thể người và động vật. Số
lượng các carotenoid tìm thấy trong tự nhiên lên đến 700 loại với các màu sắc khác
nhau. Carotenoid được tổng hợp từ các tiền chất isoprenoid (C5), hợp chất này sau đó
chuyển thành geranyl diphosphat (C20). Sau đó, chuỗi phân tử 20 nguyên tử carbon
này liên kết đuôi – đuôi để tạo thành chuỗi C40. Do đó các carotenoid còn được gọi là
5

tetraterpenoid [35].
Các carotenoid được sử dụng nhiều trong công nghệ thực phẩm dưới dạng các chất
màu bổ sung vào thức ăn chăn nuôi cá hồi [34], gia cầm [84]. Trong số hàng trăm loại
carotenoid được biết thì beta-carotene được xem là tiền chất cao nhất của vitamin A
[20]. Phân tử beta-carotene có cấu tạo cân đối, được hình thành do một chuỗi prolene
và 2 vòng beta-ionone ở hai đầu, khi thủy phân cho hai phân tử vitamin A. Dưới tác
dụng của nhiệt độ cao, ánh sáng và bức xạ, beta-carotene bị mất màu do xảy ra quá
trình chuyển hóa như hình 1.2.

Hình 1.2 Sự chuyển hóa beta-carotene dưới tác dụng của nhiệt độ, ánh sáng và bức xạ [35]
1.1.4.2 Sinh tổng hợp carotenoid ở nấm men
Nấm men sinh tổng hợp sắc tố carotenoid qua hai giai đoạn. Giai đoạn đầu sinh tổng
hợp các isoprenoid gồm dimethyallyl-pyrophosphat (DMAPP) và isopentenyl-5-
pyrophosphat (IPP) từ acetyl-CoA. Giai đoạn tiếp theo, DMAPP và IPP sẽ tham gia
vào quá trình sinh tổng hợp carotenoid [137, 144].
- Giai đoạn 1: Sinh tổng hợp isoprenoid (DMAPP và IPP)
Sau phát minh ra con đường mevalonate về quá trình sinh tổng hợp isopenoid ở
sinh vật [20], các tác giả Boll M. và cộng sự (1975) [32], Trocha và cộng sự (1976)
[146], Ratledge (1982) [119], Servouse M. và cộng sự (1986) [132] khẳng định quá
trình sinh tổng hợp isoprenoid IPP của nấm men cũng theo hướng mevalonate. Nghiên
cứu của Chappell (1995), McGarvey và Croteau (1995) về quá trình đồng phân hóa
6

isoprene (C
5
) chuyển IPP thành DMAPP do enzyme isomerase xúc tác cho thấy tất cả
các sinh vật từ vi khuẩn đến người đều tổng hợp các isoprenoid theo con đường
mevalonate [20, 36, 41, 82]. Theo Ratledge C. (2002) [119], giống nấm men
Rhodotorula và Rhodosporidium sinh tổng hợp carotenoid theo hướng mevalonate.
Như vậy, con đường sinh tổng hợp tiền chất isoprenoid ở Rhodotorula diễn ra như sau:

Hình 1.3 Con đường mevalonate sinh tổng hợp isoprenoid [20]
Nghiên cứu của Rohmer và cộng sự (1993) [127], tiếp đến là của Broers (1994)
[36], Schwarz (1994) cho rằng vi khuẩn, thực vật tổng hợp diệp lục tố và sinh vật
quang dưỡng còn có thể tổng hợp các tiền chất IPP không theo hướng mevalonate
(non-mevalonate pathway). Các nghiên cứu tiếp theo của Lichtenthaler và cộng sự
(1997, 1999), Eisenreich và cộng sự (1998, 2001), Rohmer (1999) đã khẳng định thực
vật và vi sinh vật trong nhiều trường hợp có thể tổng hợp các tiền chất IPP không theo
hướng mevalonate. Do đó, con đường non-mevalonate còn có tên gọi là Rohmer
pathway – tên của chính tác giả tìm ra và sau này đổi tên thành methylerythritol 4-
phosphat pathway (MEP pathway) [127]. Tuy nhiên, cho đến nay chúng tôi chưa tìm
thấy công trình nghiên cứu nào cho khẳng định rằng quá trình sinh tổng hợp isoprenoid
ở nấm men xảy ra theo hướng non-mevalonate.
- Giai đoạn 2: Sinh tổng hợp carotenoid từ DMAPP và IPP
Ở giai đoạn này (như hình 1.4), các isoprenoid DMAPP và IPP (còn gọi là
hemiterpenes – C
5
) tham gia trực tiếp vào quá trình sinh tổng hợp GGPP. Hai phân tử
7

GGPP kết hợp tạo ra carotenoid (tetraterpenes – C
40
) có tên là phytoene, phân tử này

không màu. Quá trình khử phytoene sẽ hình thành lycopene, là một chuỗi các nối đôi
liên hợp có màu đỏ. Lycopene bị đóng vòng để hình thành beta-carotene có màu vàng
[41, 83].

Hình 1.4 Quá trình sinh tổng hợp carotenoid từ isoprenoid [83]
Chú thích: IPP- isopentenyl diphosphat, acetyl-CoA - acetyl coenzym A, HMG-CoA-
3-hydroxi-3-methylglutaryl coenzym A, DMAPP- dimethylallyl diphosphat; FPP-
farnesyl diphosphat, GPP- geranyl diphosphat, GGPP- geranylgeranyl diphosphat.
Sự hình thành các carotenoid của nấm men xảy ra theo kiểu chuỗi từ nhiều tiền chất
bão hòa giống các sinh vật tổng hợp carotenoid khác. Theo Daisuke Umeno và cộng sự
(2003) [43], các enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp carotenoid không được phân
loại cụ thể bằng cách dựa vào cơ chất. Theo Simpson và cộng sự (1964) [137],
Kocková (1990) [89], Visser H. và cộng sự (2003) [152] từ phytoene sẽ xảy ra các quá
trình khử, tạo vòng và oxi hóa để tạo ra các carotenoid riêng biệt và các quá trình này ở
nấm men có thể xảy ra theo nhiều hướng khác nhau.
1.1.4.3 Khả năng sinh tổng hợp carotenoid của Rhodotorula
Khả năng hình thành sắc tố carotenoid là một đặc điểm sinh lý quan trọng dùng để