nuôi cấy mô tế bào thực vật trong in vitro

Ch
Ch
ủ
ủ
đề
đề
:
:


NUÔI CẤY MÔ – TẾ BÀO
NUÔI CẤY MÔ – TẾ BÀO
THỰC VẬT TRONG IN
THỰC VẬT TRONG IN
VITRO
VITRO






L
L
ịch sử
ịch sử
nuôi c y ấ

nuôi c y ấ
mô t bàoế
mô t bàoế






-
-
Giai đoạn khởi xướng( 1898- 1930):
Giai đoạn khởi xướng( 1898- 1930):


Haberlandt(1902) là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tế
Haberlandt(1902) là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tế
bào thưc vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào dựa trên thuyết tế
bào thưc vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào dựa trên thuyết tế
bào của Schleiden-Schwann
bào của Schleiden-Schwann
Giai đoạn nghiên cứu sinh lý(1930-1950
Giai đoạn nghiên cứu sinh lý(1930-1950
):
):
Bắt đầu với công trình của White(1934) nuôi cấy thành công rễ cà chua trên
Bắt đầu với công trình của White(1934) nuôi cấy thành công rễ cà chua trên
môi trường lỏng chứa muối khoáng, glucose, dịch chiết nấm men
môi trường lỏng chứa muối khoáng, glucose, dịch chiết nấm men
1935 Thimann đã phát hiện ra auxin(IAA) trong mô thực vật. Nhiều nhà

1935 Thimann đã phát hiện ra auxin(IAA) trong mô thực vật. Nhiều nhà
nghiên cứu đã sử dụng IAA cùng các vitamin bổ sung vào môi trương
nghiên cứu đã sử dụng IAA cùng các vitamin bổ sung vào môi trương
nuôi cấy đã thu được kết quả tốt.
nuôi cấy đã thu được kết quả tốt.
Những năm 1940 nhiều chất điều hoà sinh trưởng thuộc nhóm IAA được tổng
Những năm 1940 nhiều chất điều hoà sinh trưởng thuộc nhóm IAA được tổng
hợp thành công và được sử dụng nhiều trong nuôi cấy kết quả cho thấy
hợp thành công và được sử dụng nhiều trong nuôi cấy kết quả cho thấy
chất này có tác dụng kích thích tạo mô sẹo, phân chia tế bào
chất này có tác dụng kích thích tạo mô sẹo, phân chia tế bào




Giai đoạn nghiên cứu phát sinh hình thái(1950-1960
Giai đoạn nghiên cứu phát sinh hình thái(1950-1960
)
)


1954-1955 Skoog phát hiện kinentin có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào.
1954-1955 Skoog phát hiện kinentin có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào.
1956 Skoog và Miller tìm hiểu ảnh hưởng của tỉ lệ Auxin/Cytokinin trong môi
1956 Skoog và Miller tìm hiểu ảnh hưởng của tỉ lệ Auxin/Cytokinin trong môi
trường nuôi cấy đến sự hình thành cơ quan và tạo được chồi từ lá cây thuốc lá
trường nuôi cấy đến sự hình thành cơ quan và tạo được chồi từ lá cây thuốc lá
1960 Bergman đã tái sinh tế bào đơn thuốc lá trong môi trường lỏng
1960 Bergman đã tái sinh tế bào đơn thuốc lá trong môi trường lỏng
Giai đoạn triển khai nuôi cấy mô tế bào vào công nghệ sinh học thực

Giai đoạn triển khai nuôi cấy mô tế bào vào công nghệ sinh học thực
vật(1960 đến nay)
vật(1960 đến nay)
1960 Cooking đã dùng enzym cellulase phân huỷ vỏ cellulose của tế bào thực vật thu
1960 Cooking đã dùng enzym cellulase phân huỷ vỏ cellulose của tế bào thực vật thu
được tế bào không vỏ gọi là tế bào trần
được tế bào không vỏ gọi là tế bào trần
1968 Nakata và Tanaka tạo được cây thuốc lá đơn bội bằng cách nuôi cấy bao phấn
1968 Nakata và Tanaka tạo được cây thuốc lá đơn bội bằng cách nuôi cấy bao phấn
Từ 1977 Melchers dung hợp tế bào trần giữa khoai tây và cà chua thành công tạo ra
Từ 1977 Melchers dung hợp tế bào trần giữa khoai tây và cà chua thành công tạo ra
cây lai khoai tây-cà chua
cây lai khoai tây-cà chua
Từ năm 1980 hàng loạt nghiên cứu trong lĩnh vực công nghệ sinh học đã được công
Từ năm 1980 hàng loạt nghiên cứu trong lĩnh vực công nghệ sinh học đã được công
bố
bố
Ngày nay nuôi cấy mô tế bào không những là cơ sở quan trọng của công nghệ sinh
Ngày nay nuôi cấy mô tế bào không những là cơ sở quan trọng của công nghệ sinh
học hiên đại mà còn là công cụ quan trong trong chon tạo nhân giống, đóng
học hiên đại mà còn là công cụ quan trong trong chon tạo nhân giống, đóng
góp cơ sơ ly luận mới cho sinh học hiên đại
góp cơ sơ ly luận mới cho sinh học hiên đại




KHÁI NIỆM
KHÁI NIỆM
Nuôi cấy mô- tế bào thực vật là kĩ thuật cho phép

Nuôi cấy mô- tế bào thực vật là kĩ thuật cho phép
nuôi cấy dễ dàng những tế bào thực vật hay mô
nuôi cấy dễ dàng những tế bào thực vật hay mô
phân sinh sạch bệnh trong môi trường nhân tạo
phân sinh sạch bệnh trong môi trường nhân tạo
thích hợp để tạo ra những khối tế bào hay
thích hợp để tạo ra những khối tế bào hay
những cây hoàn chỉnh trong ống nghiệm
những cây hoàn chỉnh trong ống nghiệm
.
.




C
C
Ơ SỞ KHOA H
Ơ SỞ KHOA H
ỌC C
ỌC C
ÔNG NGHỆ
ÔNG NGHỆ
NUÔI CẤY MÔ- TẾ BÀO
NUÔI CẤY MÔ- TẾ BÀO
Tính toàn năng
Tính toàn năng
:
:

-
-
Tế bào bất kì của cơ thể
Tế bào bất kì của cơ thể
simh vật nào cũng mang
simh vật nào cũng mang
toàn bộ lượng thông tin
toàn bộ lượng thông tin
di truyền cần thiết và đủ
di truyền cần thiết và đủ
của sinh vật đó,khi gặp
của sinh vật đó,khi gặp
điều kiện thích hợp mỗi
điều kiện thích hợp mỗi
tế bào đều có thể phát
tế bào đều có thể phát
triển thành cá thể hoàn
triển thành cá thể hoàn
chỉnh
chỉnh


Tùy từng tế bào, từng
Tùy từng tế bào, từng
loại mô, từng thời kì sinh
loại mô, từng thời kì sinh
trưởng, phát triển mà
trưởng, phát triển mà
các gen phù hợp hoạt

các gen phù hợp hoạt
động; các gen không
động; các gen không
cùng hoạt động như
cùng hoạt động như
nhau trong các giai đoạn
nhau trong các giai đoạn
phát triển của cơ thể (do
phát triển của cơ thể (do
cơ chế điều hòa hoạt
cơ chế điều hòa hoạt
động của gen).
động của gen).





S
S
PHÂN CHIA, PHÂN HOÁ, PH N PHÂN HOÁ C A Ự Ả Ủ
PHÂN CHIA, PHÂN HOÁ, PH N PHÂN HOÁ C A Ự Ả Ủ
CÔNG NGH NUÔI C Y MÔ-T BÀOỆ Ấ Ế
CÔNG NGH NUÔI C Y MÔ-T BÀOỆ Ấ Ế

Phân hóa
Phân hóa
: 1 t b o,1kh i t b oế à ố ế à
: 1 t b o,1kh i t b oế à ố ế à



phân hóa t o mô c ạ ơ
phân hóa t o mô c ạ ơ
quan h c quan.ệ ơ
quan h c quan.ệ ơ

Ph n phân hóaả
Ph n phân hóaả
: khi các t b o ã phân hóa th nh các mô ế à đ à
: khi các t b o ã phân hóa th nh các mô ế à đ à
ch c n ng riêng bi t nh ng v n có th quay v tr ng thái ứ ă ệ ư ẫ ể ề ạ
ch c n ng riêng bi t nh ng v n có th quay v tr ng thái ứ ă ệ ư ẫ ể ề ạ
ch c n ng phôi sinh ban u khi g p i u ki n thu n l i.ứ ă đầ ặ đ ề ệ ậ ợ
ch c n ng phôi sinh ban u khi g p i u ki n thu n l i.ứ ă đầ ặ đ ề ệ ậ ợ




Sự trẻ hoá
Sự trẻ hoá




-
-
Khả năng ra
Khả năng ra
chồi,rễ ở các
chồi,rễ ở các

thành phần khác
thành phần khác
nhau là rất khác
nhau là rất khác
nhau
nhau


- Trong nuôi cấy
- Trong nuôi cấy
invitro các bộ
invitro các bộ
phận non trẻ sẽ ra
phận non trẻ sẽ ra
chồi,rễ tốt hơn các
chồi,rễ tốt hơn các
bộ phận trưởng
bộ phận trưởng
thành
thành




CÁC NHÂN TỐ ĐẢM BẢO THÀNH
CÁC NHÂN TỐ ĐẢM BẢO THÀNH
CÔNG TRONG CÔNG NGHỆ NUÔI
CÔNG TRONG CÔNG NGHỆ NUÔI
CẤY MÔ- TẾ BÀO THỰC VẬT
CẤY MÔ- TẾ BÀO THỰC VẬT

:
:

Đảm bảo điều kiện
Đảm bảo điều kiện
vô trùng, phòng thí
vô trùng, phòng thí
nghiệm phải chuyên
nghiệm phải chuyên
hóa cao.
hóa cao.

Chọn đúng môi
Chọn đúng môi
trường và chuẩn bị
trường và chuẩn bị
môi trường đúng
môi trường đúng
cách.
cách.

Chọn mô cấy, xử lí
Chọn mô cấy, xử lí
mô cấy thích hợp
mô cấy thích hợp
trước và sau khi cấy.
trước và sau khi cấy.

C¸c ®iÒu kiÖn cÇn thiÕt cña nu«i
C¸c ®iÒu kiÖn cÇn thiÕt cña nu«i
cÊy m« - tÕ bµo thùc vËt.
cÊy m« - tÕ bµo thùc vËt.
Phßng thÝ nghiÖm.
Phßng thÝ nghiÖm.
Bố trí theo sơ đồ:
Bố trí theo sơ đồ:
Phòng chuẩn bị và giữ môi trường
Phòng chuẩn bị và giữ môi trường


Phòng cấy
Phòng cấy




Phòng nuôi c
Phòng nuôi c
ây
ây

Môi tr ờng vật lý.
-
ánh sáng: Bao gồm:
+ Chất l ợng ánh sáng
+ Thời gian chiếu sáng
+ C ờng độ chiếu sáng

-
Nhiệt độ: Thích hợp nhất là 25
0
C.
Môi tr ờng hoá học
Hầu hết các loại môi tr ờng nuôi cấy mô và tế bào thực vật
đều bao gồm:
Các loại muối khoáng đa l ợng và vi l ợng, nguồn cacbon,
vitamin, các chất điều hoà sinh tr ởng, các nhóm chất b
sung, ch t n





Các nguyên tố khoáng đa l ợng.
Các nguyên tố khoáng đa l ợng.
-Nitơ (N):
-Nitơ (N):
dạng NO-3 và NH+4 riêng rẽ hoặc phối hợp với
dạng NO-3 và NH+4 riêng rẽ hoặc phối hợp với
nhau
nhau
-Phốtpho (P): th ờng ở dạng ortophotphat hoặc đ ờng phốtpho.
-Phốtpho (P): th ờng ở dạng ortophotphat hoặc đ ờng phốtpho.
-L u huỳnh (S): ở dạng muối SO4-2 với nồng độ thấp
-L u huỳnh (S): ở dạng muối SO4-2 với nồng độ thấp
-Các ion Na+ và Cl- cần ở nồng độ thấp
-Các ion Na+ và Cl- cần ở nồng độ thấp
Các nguyến tố khoáng vi l ợng.

Các nguyến tố khoáng vi l ợng.
-Sắt (Fe): thiếu sắt tế bào mất khả năng phân chia
-Sắt (Fe): thiếu sắt tế bào mất khả năng phân chia
-Mangan (Mn): Thiếu Mn kém phân bào.
-Mangan (Mn): Thiếu Mn kém phân bào.
- Bo (B): Thiếu B trong môi tr ờng gây nên biểu hiện nh thừa
- Bo (B): Thiếu B trong môi tr ờng gây nên biểu hiện nh thừa
auxin vì thực tế Bo làm cho các chất ức chế auxin
auxin vì thực tế Bo làm cho các chất ức chế auxin
oxydase trong tế bào giảm. Mô nuôi cấy có biểu hiện
oxydase trong tế bào giảm. Mô nuôi cấy có biểu hiện
mô sẹo hoá mạnh, nh ng th ờng là loại mô sẹo xốp, mọng
mô sẹo hoá mạnh, nh ng th ờng là loại mô sẹo xốp, mọng
n ớc, kém tái sinh.
n ớc, kém tái sinh.

Cây in vitro sống chủ yếu theo ph ơng thức dị d ỡng, mặc dù d ới ánh sáng
Cây in vitro sống chủ yếu theo ph ơng thức dị d ỡng, mặc dù d ới ánh sáng
nhân tạo chúng có khả năng hình thành diệp lục và quang hợp nh ng bị
nhân tạo chúng có khả năng hình thành diệp lục và quang hợp nh ng bị
hạn chế cho nên việc đ a vào môi tr ờng nuôi cấy nguồn các bon d ới dạng
hạn chế cho nên việc đ a vào môi tr ờng nuôi cấy nguồn các bon d ới dạng
hữu cơ là bắt buộc, giúp cho tế bào phân chia và tăng sinh khối.
hữu cơ là bắt buộc, giúp cho tế bào phân chia và tăng sinh khối.
Tuỳ thuộc mục đích và sự đòi hỏi của từng hệ mô có thể dùng các loại đ
Tuỳ thuộc mục đích và sự đòi hỏi của từng hệ mô có thể dùng các loại đ
ờng khác nhau: Sucrose, Maltose, Glucose, Galactose và Lactose. Hàm l
ờng khác nhau: Sucrose, Maltose, Glucose, Galactose và Lactose. Hàm l
ợng đ ờng bổ sung vào môi tr ờng nuôi cấy th ờng là 20 - 40 g/l.
ợng đ ờng bổ sung vào môi tr ờng nuôi cấy th ờng là 20 - 40 g/l.

Các vitamin.
Các vitamin.
Các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro đều có khả năng tự tổng
Các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro đều có khả năng tự tổng
hợp đ ợc hầu hết các loại vitamin, nh ng th ờng không đủ về l ợng nên phải
hợp đ ợc hầu hết các loại vitamin, nh ng th ờng không đủ về l ợng nên phải
bổ sung thêm từ bên ngoài vào, đặc biệt là các vitamin nhóm B.
bổ sung thêm từ bên ngoài vào, đặc biệt là các vitamin nhóm B.
- Vitamin B
- Vitamin B
1
1
(thiamin) đóng vai trò quan trọng trong quá trình biến đổi
(thiamin) đóng vai trò quan trọng trong quá trình biến đổi
cacbon và tham gia vào thành phần tổ hợp enzym xúc tác quá trình oxy
cacbon và tham gia vào thành phần tổ hợp enzym xúc tác quá trình oxy
hoá khử cacbon ở axit hữu cơ. Nồng độ th ờng dùng từ 0,1- 10 mg/l.
hoá khử cacbon ở axit hữu cơ. Nồng độ th ờng dùng từ 0,1- 10 mg/l.
- Vitamin B
- Vitamin B
6
6
(piridoxin) tham gia vào thành phần các enzym khử cacbon và
(piridoxin) tham gia vào thành phần các enzym khử cacbon và
thay đổi vị trí nhóm amin trong các axitamin. Nồng độ dùng từ 0,1 - 1 mg/l.
thay đổi vị trí nhóm amin trong các axitamin. Nồng độ dùng từ 0,1 - 1 mg/l.
-
Myo - inositol cần đ ợc bổ sung một l ợng khá lớn từ 50 - 500 mg/l và tỏ ra

Myo - inositol cần đ ợc bổ sung một l ợng khá lớn từ 50 - 500 mg/l và tỏ ra
có tác dụng rất rõ đến sự phân chia của mô.
có tác dụng rất rõ đến sự phân chia của mô.


-
Các chất bổ sung:
Các chất bổ sung:


Bao gồm n ớc dừa,dịch chiết nấm men,chất độn
Bao gồm n ớc dừa,dịch chiết nấm men,chất độn
Ngun cacbon
Ngun cacbon




Các chất điều hoà sinh trưởng
Các chất điều hoà sinh trưởng

Chất điều hoà sinh trưởng gồm có các phytohormone và
Chất điều hoà sinh trưởng gồm có các phytohormone và
các chất điều chỉnh sinh trưởng tổng hợp nhân tạo.
các chất điều chỉnh sinh trưởng tổng hợp nhân tạo.

Phytohormone là các chất hoá học được thực vật tổng
Phytohormone là các chất hoá học được thực vật tổng
hợp với một lượng rất nhỏ ở các bộ phận, cơ quan nhất
hợp với một lượng rất nhỏ ở các bộ phận, cơ quan nhất

định và được vận chuyển đến các cơ quan, bộ phận khác
định và được vận chuyển đến các cơ quan, bộ phận khác
để điều hoà các quá trình sinh lý trong cây, đảm bảo mối
để điều hoà các quá trình sinh lý trong cây, đảm bảo mối
quan hệ hài hoà giữa các cơ quan, bộ phận.
quan hệ hài hoà giữa các cơ quan, bộ phận.




Auxin
Auxin

Auxin - hormone kích
Auxin - hormone kích
thích th c v t sinh ự ậ
thích th c v t sinh ự ậ
tr ngưở
tr ngưở



Auxin được định nghĩa là chất có hoạt tính sinh
Auxin được định nghĩa là chất có hoạt tính sinh
học giống với IAA:
học giống với IAA:

kích thích kéo dài các tế bào lá bao mầm và lát cắt thân
kích thích kéo dài các tế bào lá bao mầm và lát cắt thân
cây tách rời.

cây tách rời.

cùng với cytokinin kích thích sự phân chia của các tế
cùng với cytokinin kích thích sự phân chia của các tế
bào mô sẹo
bào mô sẹo
(callus culture).
(callus culture).

kích thích hình thành rễ từ lá và thân cây tách rời.
kích thích hình thành rễ từ lá và thân cây tách rời.

kích thích một số hiện tượng sinh trưởng và phát triển
kích thích một số hiện tượng sinh trưởng và phát triển
khác tượng tự như hoạt tính của IAA.
khác tượng tự như hoạt tính của IAA.





Kích thích s hình th nh,s sinh tr ng c a qu v t o q a ự à ự ưở ủ ả à ạ ủ
Kích thích s hình th nh,s sinh tr ng c a qu v t o q a ự à ự ưở ủ ả à ạ ủ
không h tạ
không h tạ

Gây ra tính h ng ng c a cây,kìm hãm s r ng lá,hoa,quướ độ ủ ự ụ ả
Gây ra tính h ng ng c a cây,kìm hãm s r ng lá,hoa,quướ độ ủ ự ụ ả

Trong cây c t ng h p mô non, c bi t lá ang phát đượ ổ ợ ở đặ ệ đ

Trong cây c t ng h p mô non, c bi t lá ang phát đượ ổ ợ ở đặ ệ đ
tri n v vùng nh sinh tr ngể à đỉ ưở
tri n v vùng nh sinh tr ngể à đỉ ưở









Hiện đã xác định được 136 GA, chúng có cấu trúc
Hiện đã xác định được 136 GA, chúng có cấu trúc
hoá học khác nhau song có đều có bộ khung
hoá học khác nhau song có đều có bộ khung
gibberellase
gibberellase

GA được đặt tên theo thứ tự phát hiện: GA1, GA2, ,
GA được đặt tên theo thứ tự phát hiện: GA1, GA2, ,
GAn, trong đó GA3 là loại được phân tích cấu trúc
GAn, trong đó GA3 là loại được phân tích cấu trúc
đầu tiên, đây cũng là loại GA có hoạt tính mạnh và
đầu tiên, đây cũng là loại GA có hoạt tính mạnh và
được ứng dụng rộng rãi.
được ứng dụng rộng rãi.
Gibberellin - chất điều hoà phân chia
Gibberellin - chất điều hoà phân chia
tế bào thực vật

tế bào thực vật




Trao đổi gibberellin
Trao đổi gibberellin

Tổng hợp : Các GA bản chất là các acid diterpene được tổng hợp
Tổng hợp : Các GA bản chất là các acid diterpene được tổng hợp
bằng con đường terpenoid trong lạp bào, sau đó được biến đổi hoá
bằng con đường terpenoid trong lạp bào, sau đó được biến đổi hoá
học trong lưới nội chất và tế bào chất cho tới khi hoàn thiện cấu trúc
học trong lưới nội chất và tế bào chất cho tới khi hoàn thiện cấu trúc
để trở thành dạng hoạt động
để trở thành dạng hoạt động

GA được tổng hợp
GA được tổng hợp
–
Trong phôi đang sinh trưởng, lá non, rễ non, quả non;
Trong phôi đang sinh trưởng, lá non, rễ non, quả non;
–
Chủ yếu trong lục lạp
Chủ yếu trong lục lạp

Vận chuyển không phân cực trong xylem và phloem hay giữa các tế
Vận chuyển không phân cực trong xylem và phloem hay giữa các tế
bào cạnh nhau
bào cạnh nhau


Có thể liên kết với đường (thường là glucose) trở thành dạng không
Có thể liên kết với đường (thường là glucose) trở thành dạng không
hoạt động
hoạt động

GA khá bền vững trong cây, ít bị phân huỷ
GA khá bền vững trong cây, ít bị phân huỷ




Cơ chế
Cơ chế
Sự sinh trưởng kéo dài của thân:
–
GA kích thích sự kéo dài của tế bào (không bằng cơ chế
sinh trưởng acid như auxin), tuy nhiên trong thực tế GA
luôn xuất hiện cùng auxin  có thể tác dụng kéo dài của
GA phụ thuộc vào auxin.
–
GA kích thích sự phân chia tế bào bằng cách khởi động
một số gene CDK (cyclin-dependent protein kinase) có
vai trò trong điều hoà chu trình tế bào (chuyển tế bào từ
pha G1 sang pha S).




Hiệu quả sinh lý

Hiệu quả sinh lý
Kích thích sự sinh trưởng
Kích thích sự sinh trưởng
kéo dài của thân (được xác
kéo dài của thân (được xác
định do vai trò của GA1)
định do vai trò của GA1)
Sinh trưởng các đột biến
lùn (thiếu gene chịu
trách nhiệm tổng hợp
enzyme trong con đường
tổng hợp GA)

Hiệu quả sinh lý
Hiệu quả sinh lý
Kích thích sự nảy mầm của hạt, củ
Kích thích sự nảy mầm của hạt, củ
Kích thích sự vươn dài của
các gióng cây họ lúa




Kích thích sự ra hoa
Ức chế phát triển hoa cái,
kích thích phát triển hoa đực
Hiệu quả sinh lý
Hiệu quả sinh lý