tóm tắt luận án NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT, PHÂN TÍCH ADN VÀ TẾ BÀO PHÔI THAI TỰ DO TRONG MÁU NGOẠI VI CỦA MẸ ĐỂ CHẨN ĐOÁN TRƢỚC SINH

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN


Triệu Tiến Sang

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT, PHÂN TÍCH ADN
VÀ TẾ BÀO PHÔI THAI TỰ DO TRONG MÁU NGOẠI VI CỦA
MẸ ĐỂ CHẨN ĐOÁN TRƢỚC SINH

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 62 42 70 01

DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC






Hà Nội, 2014


Công trình đƣợc hoàn thành tại:
Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN và
Học viện Quân y



Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. Trần Văn Khoa
PGS.TS. Đinh Đoàn Long

Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 3:




Luận án sẽ đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng cấp Đại học Quốc gia chấm luận án tiến sĩ
họp tại: Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN
Vào hồi giờ ngày tháng năm 2015









Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thƣ viện Quốc gia Việt Nam
- Trung tâm thông tin –Thƣ viện, Đại học Quốc gia Hà Nội

MỞ ĐẦU
 Tính cấp thiết của đề tài
Dị tật bẩm sinh đã và đang là một vấn đề lớn không chỉ đối với ngành sản khoa mà
còn thu hút sự quan tâm của toàn xã hội. Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới tỷ lệ dị
tật bẩm sinh chiếm khoảng 1,73%. Ở Việt Nam, các nghiên cứu cũng cho thấy tỷ lệ dị tật
bẩm sinh 2,4% đến 3,6%. Hiện nay, việc điều trị các dị tật bẩm sinh vẫn còn hết sức khó

khăn và phức tạp. Các DTBS hiện nay đa số đều không thể chữa khỏi đƣợc hoặc kết quả
điều trị rất hạn chế, thai nhi sau khi sinh ra kém phát triển cả về thể lực và trí lực, giảm
khả năng lao động hay tự chăm sóc, kém hoà nhập với xã hội. Chính vì vậy việc chẩn
đoán trƣớc sinh để có biện pháp tƣ vấn, dự phòng và can thiệp vẫn là biện pháp hàng đầu,
hết sức cần thiết và cấp thiết nhằm làm giảm tỷ lệ dị tật bẩm sinh. Việc nghiên cứu ứng
dụng các phƣơng pháp chẩn đoán trƣớc sinh các dị tật bẩm sinh đã đƣợc tiến hành từ lâu.
Đã có nhiều phƣơng pháp khả thi đƣợc công bố và ứng dụng trong thực tiễn nhƣ: siêu âm
sản khoa, test sàng lọc bộ ba (triple test)…. là những phƣơng pháp không mang tính can
thiệp nhƣng chẩn đoán muộn và có độ đặc hiệu thấp. Bên cạnh đó, các phƣơng pháp nhƣ:
chọc hút nƣớc ối, sinh thiết gai rau, lấy máu cuống rốn… có độ đặc hiệu cao thông qua
phân tích vật liệu di truyền thai nhi, nhƣng mang tính can thiệp, gây tỷ lệ tai biến đáng kể
cho thai nhi và thai phụ nhƣ sẩy thai, rò ối, thai chết lƣu, đẻ non, ….
Năm 1969, Walknowska và cộng sự đã phát hiện ra sự có mặt của tế bào phôi thai
tự do trong máu ngoai vi của ngƣời mẹ. Năm 1997, Lo và cộng sự đã phát hiện DNA tự
do của thai nhi (free fetal DNA: ADN phôi thai tự do) trong huyết tƣơng mẹ đây là một
bƣớc đột phá trong lĩnh vực chẩn đoán trƣớc sinh. Đây là phát hiện vô cùng quan trọng
mở ra một hƣớng mới đầy triển vọng trong chẩn đoán trƣớc sinh bằng biện pháp không
can thiệp.Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu quy trình tách
chiết, phân tích ADN và tế bào phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ để chẩn đoán
trước sinh” nhằm mục đích tách đƣợc ADN phôi thai tự do và tế bào phôi thai tự do trong
máu ngoại vi của mẹ ứng dụng để chẩn đoán trƣớc sinh bằng phƣơng pháp không can
thiệp.
 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
 Xây dựng đƣợc quy trình tách chiết ADN phôi thi tự do trong máu ngoại vi của mẹ.
 Xây dựng đƣợc quy trình tách chiết và phân lập tế bào phôi thai tự do trong máu
ngoại vi của mẹ.
 Ứng dụng ADN phôi thai chẩn đoán bất đồng nhóm máu Rh và tế bào phôi thai
chẩn đoán hội chứng Trisomy 21, XXY.
 Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu của đề tài
Đối tượng nghiên cứu của đề tài

Các mẫu máu ngoại vi của các phụ nữ mang thai bị dị tật và mang thai không bị dị
tật.
Nội dung nghiên cứu của đề tài
 Hoàn thiện quy trình tách chiết ADN phôi thai trong máu mẹ.
 Nghiên cứu sự biến đổi hàm lƣợng ADN phôi thai tự do trong máu theo thai kỳ và
thời gian tồn tại của chúng sau khi sinh.
 Xây dựng quy trình phân lập tế bào phôi thai trong máu mẹ.
 Kiểm tra, đánh giá ADN phôi thai trong máu mẹ.
 Kiểm tra, đánh giá tế bào phôi thai trong máu mẹ
 Ứng dụng sàng lọc và chẩn đoán di truyền trƣớc sinh: tăng sản thƣợng thận, teo cơ
Duchenne, bất đồng nhóm máu, hội chứng trisomy 21, XXY
 Địa điểm thực hiện của đề tài
Các nghiên cứu đƣợc thực hiện chủ yếu tại Phòng Công nghệ gen và Di truyền tế
bào – Trung tâm Sinh Y dƣợc học – Học viện Quân y
 Đóng góp mới của đề tài
 Đánh giá đƣợc nồng độ ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ ứng dụng
chẩn đoán trƣớc sinh ở thời điểm thích hợp nhất trong thời gian phát triển của thai kỳ.
 Xây dựng đƣợc quy trình phân lập tế bào phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ,
ứng dụng cho chẩn đoán các dị tật bẩm sinh.
 Góp phần sàng lọc và chẩn đoán các bệnh di truyền trƣớc sinh bằng biện pháp không
can thiệp.
 Ứng dụng thực tiễn của đề tài
 Lý luận: Góp phần làm sáng tỏ sự tồn tại ADN và tế bào phôi thai tự do trong máu
ngoại vi của mẹ ứng dụng sàng lọc và chẩn đoán trƣớc sinh các bệnh di truyền.
 Hoàn thiện đƣợc các quy trình tách chiết ADN tự do và phân lập tế bào phôi thai tự
do trong máu ngoại vi của mẹ.
 Thực tiễn: Góp phần giảm thiểu các trƣờng hợp sinh con bị bệnh di truyền, DTBS,
giảm gánh nặng cho gia đình và xã hội.
 Bố cục của luận án
Luận án gồm 157 trang bao gồm: Phần đặt vấn đề (3 trang); Tổng quan tài liệu (39

trang); Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu (21 trang); Kết quả và thảo luận (56 trang);
Kết luận và kiến nghị (1 trang), Các công trình khoa học của tác giả liên quan đến luận
án (2 trang), Tài liệu tham khảo (29 trang),với 251 tài liệu gồm 2 thứ tiếng tiếng Việt (37
tài liệu) và tiếng Anh (214 tài liệu). Luận án có 26 bảng, 43 hình.
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
 Phƣơng pháp chẩn đoán không can thiệp
Phƣơng pháp không can thiệp là phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào phân tích vật
liệu di truyền của thai nhi nhƣng không từ các mẫu can thiệp vào tử cung buồng ối mà từ
vật liệu di truyền thai nhi có trong máu ngoại vi của ngƣời mẹ.
Ngày nay, việc chẩn đoán sớm các dị tật trƣớc sinh là một vấn đề rất quan trọng.
Nó góp phần quan trọng cho việc giảm bớt gánh nặng cho xã hội, giảm bớt sự bất hạnh
của các gia đình có những đứa trẻ khuyết tật đó. Những gia đình mà bố mẹ mang các di
chứng của chất độc màu da cam, những gia đình tiếp xúc nhiều với hóa chất độc hại hay
những gia đình gặp khó khăn do việc sinh con muộn, đó là những gia đình mang tần suất
sinh con mắc các dị tật cao. Những thai nhi thì ngày một lớn lên, thai nhi càng lớn thì các
tai biến do đình chỉ thai ngày càng cao. Do vậy việc lựa chọn các phƣơng thức và các kỹ
thuật dùng cho việc chuẩn đoán sớm rất có ý nghĩa trong việc chẩn đoán trƣớc sinh. Có 2
phƣơng thức chẩn đoán sớm trƣớc sinh qua máu mẹ:
-Phân tích di truyền ADN phôi thai tự do lƣu hành trong máu mẹ
-Phân tích di truyền tế bào phôi thai lƣu hành trong máu mẹ
 Sàng lọc và chẩn đoán di truyền qua ADN phôi thai tự do trong máu mẹ
Sự phát hiện DNA tự do của thai nhi (free fetal DNA: ADN phôi thai tự do) trong
huyết tƣơng mẹ là một bƣớc đột phá trong lĩnh vực chẩn đoán trƣớc sinh (Lo và cộng sự,
1997. Các ứng dụng lâm sàng của DNA phôi thai đã đƣợc tiến hành gần 10 năm sau khi
giải mã bộ gen của Rhesus D (Zhong và cộng sự, 2000; Lo YMD và cộng sự, 1993), những
rối loạn gen đơn (Chiu và cộng sự, 2008)và chẩn đoán giới tính của bào thai (Costa và cộng
sự, 2001; Edwards và cộng sự, 1966; Grosset L và cộng sự, 1974;). Ƣu điểm nữa là việc
định lƣợng DNA phôi thai, nhờ đó cho phép nghiên cứu DNA thai nhi trong các điều kiện
bệnh lý và lâm sàng khác nhau trong quá trình mang thai (Costa và cộng sự, 2001; Lo và
cộng sự, 1998) và sự tăng hàm lƣợng DNA phôi thai cũng đƣợc tìm thấy khi thai nhi có

biểu hiện bất thƣờng, chậm phát triển thai nhi, sinh sớm, bệnh Down, tiền sản giật vv (Lo
và cộng sự, 1999; Sekizawa và cộng sự, 2000; Troeger và cộng sự., 1999)
Các nghiên cứu ADN phôi thai tự do trong huyết tƣơng mẹ (nguồn gốc, vận
chuyển từ mẹ sang bào thai, hàm lƣợng trong quá trình mang thai, sự biến mất hoàn toàn
sau sinh) đã đƣợc đề cập đến trong một số tài liệu. Tuy nhiên, nguồn gốc xuất hiện ADN
phôi thai tự do vẫn còn là một vấn đề chƣa rõ trong nhiều năm. Gần đây, nhiều công trình
đã xác định đƣợc chúng có nguồn gốc từ tế bào apoptosis của thai. Rất nhiều các loại mô
khác nhau nhƣ các tế bào biểu mô, tế bào gan của bào thai đã đƣợc giả định nhƣ nguồn
gốc sơ khai của ADN phôi thai tự do và việc phân huỷ các tế bào của`` thai nhi trong
huyết tƣơng mẹ có do đó giải phóng DNA bào thai. Việc truyền trực tiếp DNA thai nhi
qua màng ối hoặc các DNA thai nhi tự do trong huyết tƣơng cũng đƣợc đề cập đến
(Kolialexi và cộng sự 2004; Sekizawa và cộng sự, 2000; Illanes và cộng sự, 2005; Kondo
và cộng sự, 2002).
 Sàng lọc và chẩn đoán di truyền qua tế bào phôi thai trong máu ngoại vi của
mẹ
Tới nay, sau nhiều nghiên cứu đã khẳng định sự có mặt của tế bào phôi thai trong
máu ngoại vi của mẹ. Từ tuần thứ 8 của thai kì, đã phát hiện đƣợc các tế bào của thai
gồm: Trophoblast (tế bào lá nuôi phôi), bạch cầu lympho, hồng cầu nhân, tế bào gốc, song
số lƣợng các tế bào này rất thấp.
Các tế bào này mang vật chất di truyền của phôi thai do vậy rất có ý nghĩa trong
chẩn đoán dị tật sớm cho thai. Tuy nhiên, có sự khác biệt giữa các loại tế bào:Trophoblast
(lá nuôi phôi): xuất hiên sớm nhất, nhanh bị hủy, không xuất hiện trong máu ngoại vi của
mẹ ở tất cả các thai, không có kháng nguyên bề mặt đặc hiệu.Bạch cầu phôi thai: Lần đầu
tiên bạch cầu phôi thai đƣợc chứng minh có mặt trong máu ngoại vi của mẹ vào năm
1969 bởi Walknowska, đặc biệt với những thai nhi mang giới tính nam. Sự tồn tại của nó
đƣợc chứng minh bằng sự khác biệt trong biểu hiện kháng nguyên bạch cầu ngƣời (HLA).
Tuy vậy, việc nghiên cứu về loại tế bào này gặp phải những khó khăn nhất định: (1) các tế
bào này không có kháng nguyên bề mặt đặc hiệu; (2) tuổi thọ của các tế nào này tƣơng
đối dài có thể tồn tại nhiều năm sau khi sinh dẫn đến tăng khả năng chẩn đoán sai.Hồng
cầu nhân (hồng cầu thai nhi hay NRBCs): Luôn đƣợc coi là loại tế bào đầy hứa hẹn cho

kỹ thuật này với những ƣu điểm: xuất hiện sớm và tồn tại trong suốt trong thai kì, tuổi thọ
ngắn loại bỏ đƣợc khả năng của các tế bào xuất hiện từ lần mang thai trƣớc đó, có kháng
nguyên bề mặt đặc hiệu. Hơn nữa số lƣợng tế bào này còn tăng lên ở những phôi thai
mang các dị tật bẩm sinh. Do vậy, các nghiên cứu trên thế giới đang tập trung vào phân
tách hồng cầu có nhân của thai nhi.

Hình 1.6: Hình minh họa các thành phần trong máu ngoại vi của
mẹ( />_.pdf )
Các đặc trƣng chính của hồng cầu nhân: Xuất hiện sớm trong máu ngoại vi, mang
bộ gen hoàn chỉnh của phôi thai, mang kháng nguyên bề mặt đặc hiệu, thời gian tồn tại ở
máu ngoại vi có giới hạn.
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
 VẬT LIỆU
 Đối tƣợng nghiên cứu
Mẫu máu ngoại vi của những phụ nữ mang thai từ 6 tuần tuổi đến 22 tuần tuổi thai
số lƣợng mẫu 279 mẫu và 5 mẫu máu ngoại vi của những phụ nữ mang thai mắc các hội
chứngtrisomy 13, 18, 21, Klinefelter (XXY tại Bệnh Viện Từ Dũ, và 34 mẫu máu ngoại vi
của các phụ nữ có nguy cơ sinh con dị tật đƣợc chọc ối và chẩn đoán tại Trung tâm nghiên
cứu Sinh Y Dƣợc học – HVQY. Thể tích mẫu máu ngoại vi cần lấy từ 5 ml từ các phụ nữ
mang thai tuần 14-22 tuần.
Mẫu chứng: Các phụ nữ chƣa mang thai và chƣa quan hệ tình dục bao giờ lấy 02
mẫu máu ngoại vi. Mẫu máu ngoại vi của phụ nữ mang thai có nguy cơ sinh con bị
TSTTBS là 11 mẫu, Teo cơ Duchenne là 10 mẫu máu ngoại và 13 mẫu máu ngoại vi của
những phụ nữ có nhóm máu Rh(-) đang mang thai để chẩn đoán nhóm máu Rh củacon.
 Hoá chất và thiết bị máy móc
 Hoá chất tách chiết ADN
 Hoá chất cho PCR
 Hoá chất dùng cho điện di
Agarose, Đệm TBE 1, buffer GA 1X, Polymer POP4, HiDi formamid, Gene Scan
GS500.

 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

 Phƣơng pháp tách ADN phôi thai tự do và phƣơng pháp nhân gen PCR và
realtime-PCR
 Quy trình tách và phân lập tế bào phôi thai tự do, phƣơng pháp nhuộm tế bào
bằng kỹ thuật FISH, phƣơng pháp QF-PCR chứng minh sự tồn tại của tế bào
phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ
 Kỹ thuật phân lập tế bào phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ
 Kỹ thuật cố định tế bào phôi thai và nhuộm tế bào phôi thai sau khi phân lập
 Tách chiết ADN từ phôi bào và khuếch đại bộ gen bằng bộ kit WGA REPLI-g
Single Cell Kit của Qiagene
 Kỹ thuật QF-PCR cho chẩn đoán bệnh nhiễm sắc thể bằng phương pháp
phân tích đoạn STRs
 Kỹ thuật điện di sản phẩm QF-PCR trên máy ABI 3130 XL
 Phương pháp phân tích kết quả sản phẩm định lượng huỳnh quang sau điện
di mao quản
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
 KẾT QUẢ QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT ADN PHÔI THAI TỰ DO TRONG MÁU
NGOẠI VI CỦA MẸ
 Kết quả tách chiết ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ
Mẫu huyết tƣơng này sẽ đƣợc tách ADN phôi thai tự do bằng nhiều phƣơng pháp,
phƣơng pháp ban đầu chúng tôi tách là dùng 200µl dung dịch huyết tƣơng sau đó biến tính
ở nhiệt độ 99
o
C trong 5 phút, dung dịch sau biến tính sẽ đƣợc ly tâm tốc độ cao 13.000
vòng/phút trong 2 phút và thu dung dịch trong phía trên vào ống 1,5ml mới khác. Phƣơng
pháp thứ 2 chúng tôi tách là sử dụng bộ kít của Qiagene có cải tiến với các bƣớc đƣợc nêu
chi tiết trong phần phƣơng pháp nghiên cứu. Sau khi tách xong và đo nồng độ của ADN
phôi thai tự do tách chiết đƣợc nhƣ sau:
Bảng 3.1. Bảng kết quả đo nồng độ ADN của phương pháp tách bằng nhiệt và

phương pháp tách bằng bộ Kít Qiagene (Chi tiết ở Phụ luc bảng 3.1)
ST
T
Mã
BN
Tuổi
thai
Tuổi
mẹ
Bằng nhiệt độ
Kít Qiagene
Nồng độ ADN
(ng/ul)
Độ tinh
sạch
Nồng độ
ADN
(ng/ul)
Độ tinh
sạch
1
811
8.2
32
1,12
1,00
3,00
1,82
2
812

8
31
0,81
1,20
3,20
1,78
…
…
…
…
…
…
…
…
29
839
9
32
0,86
0,67
3,99
1,78
30
840
8
35
0,93
1,34
3,78
1,80

TB



0,81
0,97
3,95
1,81
SD



0,18
0,20
0,53
0,31
Từ bảng số liệu tách chiết ADN phôi thai tự do bằng hai phƣơng pháp trên chúng
tôi nhận thấy nồng độ ADN tách chiết đƣợc bằng cách sử dụng nhiệt thấp hơn rất nhiều so
với phƣơng pháp tách chiết bằng bộ kít qiagene có cải tiến. Mặt khác độ tinh sạch của
ADN tách chiết đƣợc bằng bộ kít qiagene cao hơn và đạt đƣợc tiêu chuẩn cho phép về độ
tinh sạch của ADN nằm trong khoảng từ 1,80 đến 2,00.
Trong phƣơng pháp tách ADN tự do bằng kỹ thuật biến tính ở nhiệt độ 99
o
C trong
5 phút cho thấy nồng độ trung bình của phƣơng pháp này khá thấp 0,81±0,18 ng/µl và độ
tinh sạch 0,97±0,20. Kết quả tách chiết bằng bộ kít Qiagene nồng độ cao hơn 3,95±0,53
ng/µl và độ tinh sạch 1,81±0,31. Trong quá trình tách chiết ADN tự do bằng bộ kít Qiagene
chúng tôi có cải tiến sử dụng 400ul huyết tƣơng, việc tăng lƣợng mẫu để tách ADN phôi
thai tự do cũng đã đƣợc Lo và cộng sự đề cập tới năm 1998 khi ông sử dụng từ 400ul đến
700ul mẫu để tách ADN.

 Kết quả chạy PCR nhân gen SRY
Các mẫu ADN sau khi tách xong ở trên sẽ đƣợc nhân gen bằng kỹ thuật Nested
PCR (PCR lồng) cho gen SRY và nhân gen PCR thƣờng cho gen GAPDH.

Hình 3.1. Hình ảnh kết quả điện di của gen SRY với gen GAPDH của các mẫu nghiên
cứu từ 811 đến 825
M: Marker 100bp- Thang ADN với band nhỏ nhất là 100bp; Các giếng từ 811 đến 825 là
các mẫu nghiên cứu. Phía trên là các mẫu nhân gen SRY kích thước sản phẩm 198bp. Phía
dưới là các mẫu nhân gen GAPDH với kích thước sản phẩm PCR là 97bp.
Nhận xét: Các mẫu từ 811 đến mẫu số 825 chúng tôi thấy đều xuất hiện băng của
gen GAPDH (nửa điện di phía dƣới) điều này cho thấy các mẫu này chúng tôi đều tách
đƣợc ADN. Từ các hình trên cho chúng ta thấy các băng điện di xuất hiện khá rõ nét và
gọn, kích thƣớc sản phẩm PCR phù hợp với tính toán lý thuyết. Trong hình ảnh kết quả
điện di các mẫu nghiên cứu của gen SRY có một số mẫu không xuất hiện băng vạch của
198bp và các mẫu xuất hiện băng vạch 198bp. Các mẫu này đƣợc nhân gen GAPDH ở hình
trên cho chúng ta thấy tất cả các mẫu nghiên cứu này đều xuất hiện băng vạch của gen
GAPDH 97bp điều đó chứng tỏ các mẫu nghiên cứu này đều tách chiết đƣợc ADN. Từ kết
quả này chúng tôi chứng minh đƣợc rằng trong máu mẹ ngƣời mang thai có ADN phôi thai
tự do của con lƣu hành trong đó.
Kết quả này đƣợc kiểm chứng bằng kỹ thuật siêu âm ở tuần thứ 16 và sau sinh cho
kết quả hoàn toàn phù hợp. Dƣới đây là kết quả của 30 trƣờng hợp nghiên cứu ban đầu cho
Nghiên cứu quy trình tách chiết ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ và chứng
minh đƣợc sự tồn tại của ADN phôi thai tự do lƣu hành trong máu ngoại vi của mẹ. Theo
nghiên cứu của Zolotukhina T.V., (2005), tách chiết ADN phôi thai trong huyết tƣơng và
huyết thanh mẹ xác định giới tính bằng nested PCR qua mồi SRY trên nhiễm sắc thể Y.
Nghiên cứu của chúng tôi cũng cho thấy kết quả hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu của
các tác giả trên thế giới.
Với 30 mẫu máu ngoại vi của các phụ nữ mang thai với tuổi thai từ tuần thứ 7 đến
tuần thứ 9 của thai kỳ, kết quả chúng tôi thấy xuất hiện 16/30 trƣờng hợp dƣơng tính với
gen SRY và 14/30 trƣờng hợp âm tính với gen SRY, 30 mẫu nghiên cứu này đều dƣơng

tính với gen GAPDH, do vậy chúng tôi nhận định rằng các mẫu nghiên cứu đều tách đƣợc
ADN phôi thai tự do, các mẫu âm tính với gen SRY là âm tính thật. Từ kết quả trên đây,
chúng tôi cũng đã chứng minh đƣợc sự tồn tại của ADN phôi thai tự do lƣu hành trong máu
mẹ. Và các nhận định rằng quy trình tách chiết ADN phôi thai tự do lƣu hành trong máu
ngoại vi của mẹ có cải tiến bằng bộ kít Qiagene đạt kết quả tốt. Kết quả này mở ra một
hƣớng mới trong chẩn đoán trƣớc sinh không.
 Kết quả định lƣợng số bản copy của ADN phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ
Từ bảng này chúng tôi cũng thấy rằng nồng độ trung bình của ADN phôi thai tự
do trong máu ngoại vi của mẹ ở các tuần từ tuần thứ 6 đến tuần thứ 12 này có độ lệch
chuẩn rất lớn, và lớn hơn cả giá trị trung bình điều này chứng tỏ nồng độ ADN phôi thai
này dao động ở một khoảng rất lớn nhƣ ở tuần 6 của thai kỳ nồng độ trung bình của ADN
phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ là 50,69 ± 83,56 bản copy/ml, hay ở tuần thứ 12
là 206,63 ± 742,55 copy/ml.

Bảng 3.6. Bảng kết quả số bản copy và nồng độ gen DYS14 và nồng độ gen GAPDH ở các tuần 6 đến 12 của thai kỳ (chi tiết
xem phần phụ lục bảng 3.6)


Tuần 6

Tuần 7

Tuần 8

Tuần 9

Tuần 10

Tuần 11

Tuần 12

S
T
T

Mã
bện
h
nhâ
n

Số
bản
cop
y
gen
DY
S14

Số
bản
copy
gen
GAP
DH

Tỷ lệ gen
DYS14/G
APDH

(%)

Số
bản
cop
y
gen
DY
S14

Số
bản
copy
gen
GAP
DH

Tỷ lệ gen
DYS14/G
APDH
(%)

Số
bản
cop
y
gen
DY
S14

Số
bản
copy
gen
GAP
DH

Tỷ lệ gen
DYS14/G
APDH
(%)

Số
bản
copy
gen
DYS
14

Số
bản
copy
gen
GAP
DH

Tỷ lệ gen
DYS14/G
APDH
(%)

Số
bản
copy
gen
DYS
14

Số
bản
copy
gen
GAP
DH

Tỷ lệ gen
DYS14/G
APDH
(%)

Số
bản
copy
gen
DYS
14

Số
bản
copy

gen
GAP
DH

Tỷ lệ gen
DYS14/G
APDH
(%)

Số
bản
cop
y
gen
DY
S14

Số
bản
copy
gen
GAP
DH

Tỷ lệ gen
DYS14/G
APDH
(%)

1

269

332

6942

4,78

129
1

9692

13,32

297
0

18900
0

1,57

2998

23965

12,51

3754

1799
0

20,87

3897

5157
4

7,56

378
9

1887
6

20,07

2

270



4613

0



463

0



81300

0



8791

0



5080

0



3620

0



5100

0

3

271



27482

0



2410

0



1380

0

1562

0



692

0



3620

0



3210
0

0

4

275

12411

0



1380

0



27400

0



22111

0



1890
0

0

4810

0



1510
0

0

5

276



2380

0



874

0

52800

0



25021

0



4330

0



1870

0



1600

0

6

277

13

7156

0,18

15

2470

0,61

24

3470

0,69

30

4123

0,73

45

756

5,95

59

1160

5,09

70

4300

1,63

7

280



1508

0



943

0

1880

0



2467

0



3471

0



1830

0



1980

0

8

295



16110

0



756

0



52100

0



41289

0

1380

0



4300

0



3217

0

9

296

3,5

13440

0,03

12

3190

0,38

50

508

9,84

37

988

3,74

36

978

3,68

46

986

4,67

27

610

4,43

…


….

…

…

…

…

…

…

…

…

…

…

…

…

…

…

…

…

…

…

…

…

…

59

622

125

15123

0,83

238

15100

1,58

350

28900

1,21

367

13901

2,64

380

2810
0

1,35

398

3090
0

1,29

412,
6

2290
0

1,80

60

623

68,8

22820

0,30

125

22800

0,55

260

21300

1,22

278,
3

15600

1,78

289

1089
2

2,65

312,
8

1130
0

2,77

345,
9

2190
0

1,58

61

Âm
nội
chứ
ng


13332

0,00



13303

0,00



13300

0,00



13303
2

0,00



1333
1

0,00



1333
0

0,00



1336
0

0,00

1

62

Âm
nội

chứ
ng
2



14094

0,00



14070

0,00



14043

0,00



14090

0,00

1409
3

0,00



1400
2

0,00



1389
0

0,00

T
B


50,6

13980
,2

0,52

85,7
7

10395

1,97

135,
1

17951
,1

1,68

151,
6

22583
,3

1,72

167,
2

9700
,5

2,26

182,
9

1054
2

2,83

206,
6

1117
2,2

3,70

S
D


83,5

18877
,2

1,05

295,
16

14412
3,4

3,60

632,
3

39348
,1

3,45

642,
9

8580

3,38

755,
1

9966
,2

5,36

761,

3

1344
2,5

6,52

742,
5

2040
4,4

4,57


Để xác định đƣợc tuổi thai thích hợp nhất, tuổi thai thấp nhất và có nồng độ cao
để có thể chẩn đoán chính xác nhất khi ứng dụng vào sàng lọc và chẩn đoán các bệnh di
truyền trƣớc sinh. Chúng tôi tiến hành nhân gen SRY bằng kỹ thuật Nested PCR, siêu âm
ở tuổi thai 16 tuần và kiểm tra lại sau sinh và so sánh với kỹ thuật Realtime PCR.
Bảng 3.7. Bảng kết quả so sánh của kỹ thuật Nested PCR, Realtime PCR với
siêu âm ở tuần thứ 16 và sau sinh (chi tiết kết quả bảng được thể hiện trong bảng 3.7 ở
phần Phụ lục bảng kết quả nghiên cứu)
ST
T
Mã bệnh
nhân
Tuầ
n 6
Tuần

7
Tuầ
n 8
Tuần
9
Tuần
10
Tuần
11
Tuần
12
Siêu
âm
Sau
sin
h
1
269
+/+
+/+
+/+
+/+
+/+
+/+
+/+
+
+
…
…
…

…
…
…
…
…
…
…
…
60
623
+/+
+/+
+/+
+/+
+/+
+/+
+/+
+
+
61
Âm nội
chứng 1
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
-

-
62
Âm nội
chứng 2
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
-/-
-
-
Ghi chú: -/-; +/+: Kết quả chẩn đoán của kỹ thuật Nested PCR và kỹ thuật
Realtime –PCR đều giống nhau cùng âm tính và hoặc dương tính.
-/+: : Kết quả chẩn đoán của kỹ thuật Nested PCR và kỹ thuật Realtime –PCR
khác nhau. Nested âm tính còn Realtime dương tính.
Từ các kết quả trên, chúng tôi nhận thấy rằng để ứng dụng ADN phôi thai vào
sàng lọc và chẩn đoán các bệnh di truyền trƣớc sinh ở thời điểm thích hợp nhất đối với
phƣơng pháp Reatime PCR là tuần thứ 7 trở đi và với kỹ thuật Nested PCR thì phải tuần
thứ 8 trở đi.
 Kết quả biến thiên nồng độ ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ
Để kiểm tra xem nồng độ ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ biến
đổi theo tuần thai của thai nhi chúng tôi tiến hành định lƣợng các mẫu nghiên cứu này ở
các tuần từ 6 tuần đến 22 tuần tuổi. Kết quả cho thấy nồng độ biến thiên nồng độ ADN
phôi thai tự do trong 1 ml huyết tƣơng có sự thay đổi giữa các tuần và nồng độ này có xu
hƣớng tăng lên theo tuổi thai, mặc dù trong từng trƣờng hợp nồng độ này có lúc giảm
nhƣng sau đó xu hƣớng tăng trở lại ở các tuần sau. (xem đầy đủ các biểu đồ ở phần phụ
lục Hình ảnh các biểu đồ số 1 đến biểu đồ số 15)

Hình 3.10. Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự do của trƣờng hợp 269
Trục tung biểu diễn nồng độ ADN phôi thai (tính bằng số bản copy/ml), trục hoành biểu
diễn tuổi thai ở các tuần từ 6 đến 22 tuần.
Trong trƣờng hợp 269 này đƣờng cong biểu diễn nồng độ ADN phôi thai trong
máu ngoại vi của mẹ tăng lên rất nhanh từ tuần thai thứ 6 đến tuần thai 14, nhƣng đến
tuần thứ 16 nồng độ này giảm một cách đáng kể xuống gần bằng nồng độ ADN phôi thai
ở 8 tuần tuổi thai, sau đó ở các tuổi thai sau nồng độ ADN phôi thai lại tăng dần trở
lại.Kết quả chạy nhân gen SRY trên 189 bệnh nhân nghiên cứu
Sau khi hoàn thành quy trình tách chiết ADN phôi thai tự do và nhân gen bằng
kỹ thuật Nested PCR chúng tôi tiến hành đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của phƣơng
pháp này. Chúng tôi nghiên cứu trên 189 trƣờng hợp cho kết quả ở bảng dƣới đây, kết
quả này đƣợc kiểm chứng sau sinh cho kết quả hoàn toàn phù hợp. Chúng tôi nhận thấy
rằng độ nhạy của phƣơng pháp này là 100% và độ đặc hiệu là 100%. Kết quả này cũng
tƣơng tự kết quả của tác giả Sekizawa và cộng sự (2007) 302 trƣờng hợp từ 7 tuần đến 16
tuần tuổi thai thấy 298 trên 302 trƣờng hợp xác định chính xác khi nhân gen SRY, với độ
nhạy 97,2% và độ đặc hiệu là 100%.
Bảng 3.8. Bảng kết quả nhân gen SRY và kiểm chứng sau sinh của 189 mẫu
nghiên cứu (Chi tiết xem phần Phụ lục bảng 3.8)
STT
Mã BN
Kết quả trƣớc sinh
Kết quả sau sinh
Tuổi
Tuổi thai
1
841
(-)
(-)
31
8

…
…
….
….
…
…
189
1029
(-)
(-)
29
8.2
Từ bảng trên chúng tôi nhận thấy trong 189 mẫu nghiên cứu này thấy xuất hiện
84 mẫu dƣơng tính với gen SRY và 105 mẫu âm tính với gen SRY. Các kết quả trƣớc
sinh và sau sinh là hoàn toàn phù hợp với nhau.
 Kết quả biến thiên nồng độ ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ
sau khi sinh
Để đánh giá đƣợc nồng độ ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ sau
khi sinh chúng tôi thu thập các mẫu nghiên cứu và định lƣợng nồng độ ADN phôi thai tự
do trƣớc sinh ở tuần thai 36 của thai kỳ và mẫu máu mẹ sau sinh ở 3 thời điểm 1 giờ, 2
giờ, 3 giờ sau khi sinh.
Bảng 3.9. Bảng kết quả nồng độ ADN biến thiên sau sinh
STT
Mã bệnh
nhân
Số bản copy gen DYS14

Trƣớc sinh 1 tháng
(Tuần thai 36 tuần)
1 giờ sau sinh

2 giờ sau sinh
3 giờ sau sinh
1
SS01
587
42
0
0
2
SS02
329
25
0
0
3
SS03
890
45
4
0
4
SS04
532
60
0
0
5
SS05
716
34

0
0
6
SS06
413
27
0
0
7
SS07
344
27
0
0

Trung bình
544,43
37,14
0,57
0

SD
206,02
12,72
1,51
0
Trên bảng trên là kết quả nồng độ ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của
mẹ trƣớc và sau kkhi sinh, chúng tôi nhận thấy rằng nồng độ bản copy gen DYS14/1ml
huyết tƣơng rất cao trung bình là 554,43 ± 206,02 copy/ml. Và sau 1 giờ nồng độ gen
DYS14 trong 1ml là 37,14 ± 12,72 copy/ml, sau 2 giờ sau sinh giá trị trung bình số bản

copy của gen DYS14 là 0,57± 1,51 bản copy/ml, và hoàn toàn không còn ADN tự do của
con sau khi sinh ở giờ thứ 3 sau khi sinh. Trong 7 trƣờng hợp này có 6 trƣờng hợp ADN
phôi thai tự do không đƣợc tìm thấy sau 2 giờ sau khi sinh, chỉ còn một trƣờng hợp là sau
2 giờ sau khi sinh ADN phôi thai vẫn còn tồn tại trong máu ngoại vi của mẹ. Ba giờ sau
khi sinh thì nồng độ ADN phôi thai không còn tìm thấy trong máu ngoại vi của mẹ.

Lo YM, Zhang J, Leung TN, Lau TK, Chang và cộng sự (1999), nghiên cứu trên
10 phụ nữ mang thai nam. Tác giả đã lấy mẫu ở các thời điểm 6 tuần, 4 tuần, 1 tuần, 1
ngày sau khi sinh tác giả thấy ở tất cả các thời điểm này không phát hiện đƣợc ADN phôi
thai tự do nữa. Lần thứ 2 tác giả nghiên cứu trên 12 phụ nữ mang thai khác, tác giả đã lấy
mẫu ở các thời điểm 5 phút, 15 phút, 30 phút, 45, 60 và 120 phút, kết quả cho thấy ADN
phôi thai tự do trong máu mẹ có thời gian bán thải vào khoảng 16,3 giờ Error!
Reference source not found


Hình 3.14. Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN phôi thai tự do sau khi sinh
Từ kết quả này chúng tôi cũng đã lựa chọn thời điểm lấy mẫu là khoảng 1 giờ, 2
giờ và 3 giờ sau khi sinh. Kết quả của chúng tôi cho thấy ADN phôi thai tự do sau khi
sinh bị mất hoàn toàn ở giờ thứ 3 sau khi sinh là hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu của
Lo và cộng sự năm 1999. Từ kết quả này chúng tôi nhận định rằng ADN phôi thai lƣu
hành trong máu ngoại vi của mẹ chỉ tồn tại một thời gian rất ngắn sau khi sinh con. Ở
nghiên cứu này chúng tôi nhận thấy chỉ sau 3 giờ sau khi sinh ADN phôi thai đã không
thấy xuất hiện trong máu ngoại vi của mẹ.
 So sánh nồng độ ADN phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ với kết quả QF-
PCR
Dƣới đây là hình ảnh các mẫu chạy chẩn đoán bất thƣờng nhiễm sắc thể bằng bộ
Kít Aneufast Kit đƣợc điện di mao quản:

Hình 3.15. Hình ảnh mẫu QF64 (tƣơng ứng mẫu nghiên cứu BT05) bình thƣờng có
bộ NST 46, XY

Hình ảnh trên cho chúng tôi thấy các locus 13, 18, 21 và XY đều cho các peak
với tỷ lệ 1:1. Đối với nhiễm sắc thể giới tính có các locus Amel; X22; DXYS28;
DXYS267 nằm trên cả nhiễm sắc thể X và nhiễm sắc thể Y xuất hiện 2 peak với tỷ lệ 1:1.
Riêng locus SRY chỉ nằm trên NST Y ở mẫu nghiên cứu này xuất hiện 1 peak chứng tỏ
mẫu này là thai nam mang bộ nhiễm sắc thể bình thƣờng 46, XY.
Chúng tôi đối chiếu so sánh mẫu nghiên cứu này khi định lƣợng nồng độ ADN
phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ thấy rằng nồng độ ADN phôi thai tự do trong máu
ngoại vi của mẹ của mẫu này là 9,69%. Chúng tôi cũng nhận thấy rằng các mẫu đƣợc
chẩn đoán có bộ NST bình thƣờng 46, XY đối chiếu so sánh với nồng độ ADN phôi thai
tự do trong máu ngoại vi của mẹ thấy nồng độ ADN phôi thai của các mẫu có bộ nhiễm
sắc thể 46, XY trung bình khoảng 10,01 ± 2,67%.

Hình 3.16. Hình ảnh điện di mao quan của mẫu QF 61 (tƣơng ứng với mẫu DT 02)
có bộ NST 47XY, +21
Từ hình ảnh trên cho chúng ta thấy các locus trên NST số 13, 18, XY xuất hiện
các peak với tỷ lệ 1:1 dị hợp tử và một peak đồng hợp tử. Ở mẫu này các locus trên NST
số 21: D21S1442, D21S1411 xuất hiện peak với tỷ lệ 1:1:1. Locus D21S1435, D21S1446
xuất hiện các peak với tỷ lệ 2:1. Từ kết quả này chúng tôi kết luận rằng mẫu nghiên cứu
này bị là thai nam bị hội chứng Down (Trisomy 21)
Bảng 3.10: Bảng nồng độ ADN phôi thai tự do trong huyết tương mẹ của các
bệnh nhân mang thai có bộ NST 46, XY (Chi tiết xem phần phụ lục bảng 3.10)
STT
Mã bệnh
nhân
Tuổi
mẹ
Tuổi
thai
Số bản
copy

gen
DYS14
Số bản
copy gen
GAPDH
Tỷ lệ gen
DYS14/GAPDH
(%)
QF-
PCR
1
BT01
41
16
3312,0
27506,0
12,04
46,XY
…
…
…
…
…
…
…
…
29
BT29
39
17,5

579,3
4318,0
13,42
46XY
TB

33,55
18,36
848,7
7923,4
10,01

SD

6,10
2,46
1141,3
10036,0
2,67

Bảng 3.11: Bảng nồng độ ADN phôi thai tự do trong huyết tương mẹ của các
bệnh nhân mang thai có bộ NST bất thường
STT
Mã
bệnh
nhân
Tuổi
mẹ
Tuổi
thai

Hội
chứng
Số bản
copy
gen
DYS14
Số bản
copy gen
GAPDH
Tỷ lệ gen
DYS14/GAP
DH (%)
QF-PCR
1
DT01
40
20
47,+21
4561,4
11380,0
40,08
47,XY,+21
2
DT02
36
16
47,+21
890,7
1044,0
85,32

47,XY,+21
3
DT03
27
19
47,XXY
465,9
1541,0
30,23
47,XXY
4
DT04
32
23
47,+21
306,7
648,0
47,33
47,XY,+21
5
DT05
37
17
47,+21
819,0
1606,9
50,97
47,XY,+21
6
DT06

36
16
47,+21
935,4
2831,6
33,03
47,XY,+21
7
DT07
40
18
47,+21
1419,3
2188,0
64,87
47,XY,+21
8
DT08
36
19
47,+18
1209,0
3787,2
31,9
47,XY,+18
9
DT09
30
19
47,XXY

279,5
935,4
29,9
47,XXY
10
DT10
34
20
45, XO
0,0
1389,6
0,0
45, XO
TB

34,89
18,56

1209,7
2884,7
46,0

SD

4,40
2,19

1315,4
3337,3
18,8

So sánh nồng độ AND phôi thai ở bảng 3.10 và 3.11 thấy nồng độ ADN phôi
thai trong huyết tƣơng của mẹ ở trƣờng hợp bình thƣờng 10,01 ± 2,67% và trƣờng hợp
bất thƣờng là 46,0 ± 18,8%, điều này cho thấy nồng độ ADN phôi thai tự do của những
trƣờng hợp bị dị tật cao hơn trƣờng hợp bình thƣờng khoảng 4,5 lần, sự khác nhau này có
ý nghĩa thống kê với p=0,00043 (< 0,05), mặc dù tuổi thai và tuổi mẹ trung bình của hai
nhóm này không khác nhau nhiều, sự khác nhau về tuổi mẹ của 2 nhóm này không có ý
nghĩa thống kê với p=0,48 (> 0,05).
Chungwen Wei và cs. (2001), nghiên cứu sàng lọc ADN phôi thai tự do trong
máu mẹ qua gen xác định giới tính nam giới SRY và gen - lactin. Trong số 30 đối tƣợng
thai phụ, 19 trƣờng hợp thai nam đã đƣợc xác định chính xác qua phân tích ADN phôi
thai trong máu mẹ với độ chính xác 100% khi đối chiếu với kết quả phân tích bộ nhiễm
sắc thể qua tế bào dịch ối. Nồng độ ADN tách chiết đƣợc tăng cao trong trƣờng hợp thai
nhi bị Down, nồng độ ADN phôi thai trƣờng hợp bất thƣờng tăng cao hơn trƣờng hợp
bình thƣờng khoảng 2,9 lầnError! Reference source not found Kết quả của chúng tôi
cũng khá phù hợp với kết quả của tác giả Chungwen năm 2001.
 KẾT QUẢ QUY TRÌNH PHÂN LẬP TẾ BÀO PHÔI THAI TRONG MÁU
NGOẠI VI CỦA MẸ
 Kết quả phân lập tế bào phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ
Để phân lập đƣợc tế bào phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ chúng tôi tiến hành
phân lập dựa vào phức hợp kháng nguyên kháng thể với kháng thể chúng tôi lựa chọn là
kháng thể CD71+. Để phân lập tốt giữa tế bào phôi thai và tế bào máu ngoại vi của mẹ
chúng tôi còn dựa vào nguyên tắc của hạt từ tính. Các hạt từ tính này chúng tôi bọc bề
mặt ngoài của hạt từ là Streptavidin, còn kháng thể chúng tôi gắn Biotin. Mối liên kết
giữa Streptavidin với Biotin là một liên kết rất bền chặt về mặt hóa học.
Sau khi thu đƣợc hồng cầu có nhân bằng phƣơng pháp này chúng tôi nhuộm
hồng cầu có nhân bằng thuốc nhuộm huỳnh quang để chứng minh sự tồn tại của tế bào
phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ. Sau khi thực hiện chúng tôi thu đƣợc một số
kết quả sau:

Hình 3.21. Hình ảnh tế bào phôi thai của
mẫu số 831
Hình 3.22. Hình ảnh tế bào phôi thai của
mẫu số 837
Từ hình ảnh kết quả trên chúng tôi nhận thấy rằng các tế bào phôi chúng tôi tách
đƣợc có xuất hiện tín hiệu màu vàng của NST Y, điều này chứng minh rằng quy trình
tách tế bào phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ đạt kết quả tốt. Theo tác giả
Babochkinavà cộng sự năm 2005 đã nghiên cứu nhuộm tế bàophôi thai tự do trong máu
ngoại vi của mẹ trên 19 trƣờng hợp mang thai từ tuần thứ 12 đến 37 tuần với độ nhạy của
phản ứng lai huỳnh quang NST Y là 91% và độ đặc hiệu là 75% và tác giả đã chứng
minh rằng có tế bào phôi thai của con lƣu hành tự do trong máu mẹ.
 Kết quả nhân gen SRY sau khi phân lập tế bào phôi thai trong máu ngoại vi
của mẹ
Sau khi phân lập tế bào phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ chúng tôi tiến hành
khuếch đại cả bộ gen của các tế bào phân lập đƣợc đó, sau đấy chúng tôi tiến hành chạy
nhân gen SRY để chứng minh sự tồn tại của tê bào phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ.
Quy trình khuếch đại bộ gen từ các tế bào bằng bộ kít Repli-G của Qiagene đƣợc
miêu tả chi tiết trong phần phƣơng pháp nghiên cứu và quy trình nhân gen của các locus
trên NST X và NST Y đƣợc thực hiện bằng bộ kít Aneufast cho kết quả dƣới đây:

Hình 3.23. Hình kết quả nhân gen các locus trên NST
giới tính X và Y của mẫu nghiên cứu 964
Từ hình ảnh kết quả trên cho chúng tôi thấy sau khi nhân gen các locus trên NST
giới tính X và Y các alen xuất hiện với tín hiệu là các Peak cao và rõ nét. Trong kết quả
này có xuất hiện Alen của NST Y ở locus Amel, locus SRY và locus DXYS156 điều này
chứng minh đƣợc rằng mẫu tế bào phôi này chúng tôi tách đƣợc là của tế bào phôi thai tự
do, đây là tế bào phôi thai mang nhiễm sắc thể giới tính Y. Các locus khác trên NST giới
tính X và Y này xuất hiện với các tín hiệu tỷ lệ bình thƣờng.
 Kết quả ứng dụng ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ để sàng

lọc và chẩn đoán di truyền trƣớc sinh
 Kết quả sàng lọc bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh
Chúng tôi tiến hành sàng lọc các bệnh nhân này qua ADN phôi thai tự do trong
máu ngoại vi của mẹ. Bằng việc sử dụng nhân gen SRY và gen GAPDH với quy trình và
chu trình phản ứng nhƣ đã nêu ở trên. Chúng tôi thu đƣợc kết quả điện di sản phẩm PCR
nhƣ sau:

Hình 3.24. Hình ảnh điện di gen SRY của mẫu sàng lọc bệnh CAH
M: Marker 100 Âm: chứng âm nước cất Dương: chứng dương
CAH1, CAH2, CAH3, CAH4, CAH5, CAH6, CAH7, CAH8, CAH9,
CAH10,CAH11 là các mẫu bệnh nhân nghiên cứu
Từ kết quả điện di chúng tôi nhận thấy rằng có 5/11 trƣờng hợp dƣơng tính với
gen SRY và 6/11 trƣờng hợp âm tính với gen SRY. Tất cả 11 trƣờng hợp này đều cho kết
quả dƣơng tính với gen nội chứng GAPDH. Trong 11 trƣờng hợp nghiên cứu này có 6
trƣờng hợp cần chọc ối và làm xét nghiệm chẩn đoán bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm
sinh.
Bảng 3.12: Bảng kết quả sàng lọc bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh
STT
Mã bệnh
nhân
Tuổi
thai
Chẩn
đoán gen
SRY
Kết quả
kiểm tra
sau sinh
KẾT QUẢ GEN
CYP21A2 chọc ối và

sau sinh
1
CAH1
8
(-)
(-)
Bình thƣờng
2
CAH2
8
(-)
(-)
Đột biến , hủy thai
3
CAH3
8
(+)
(+)
Đột biến
4
CAH4
8
(+)
(+)
Bình thƣờng
5
CAH5
8
(+)
(+)

Dị hợp xóa đoạn exon
1- 3
6
CAH6
8
(-)
(-)
Bình thƣờng
7
CAH7
8
(-)
(-)
Dị hợp tử R356W
8
CAH8
8
(+)
(+)
Bình thƣờng
9
CAH9
8
(-)
(-)
đột biến , hủy thai
10
CAH10
8
(-)

(-)
Bình thƣờng
11
CAH11
8
(+)
(+)
Bình thƣờng
Trên bảng kết quả này chúng tôi nhận thấy có 5/11 trƣờng hợp dƣơng tính với
gen SRY và không phải dùng thuốc. Trong 5 trƣờng hợp này có 2 trƣờng hợp kiểm tra
gen CYP21A2 sau sinh có mang đột biến. Còn 6/11 trƣờng hợp âm tính với gen SRY tiếp
tục phải dùng thuốc đến tuần thứ 16 của thai kỳ và trong 6 trƣờng hợp này có 3 trƣờng
hợp bị bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh trong đó có 2 trƣờng hợp hủy thai và 3
trƣờng hợp âm tính với gen SRY và không bị bệnh.
Theo tác giả Du và cộng sự năm 2009 đã sàng lọc và chẩn đoán thành công các
trƣờng hợp mang thai bị bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh thông qua ADN phôi thai tự
do trong máu ngoại vi của mẹ. Kết quả của chúng tôi cũng đã sàng lọc đƣợc bệnh tăng
sản thƣợng thận bẩm sinh.
 Kết quả sàng lọc bệnh Teo cơ Duchenne
Các gia đình, dòng họ có tiền sử sinh con bị Teo cơ Duchenne sẽ đƣợc sàng lọc
bệnh này trƣớc khi sinh bằng ADN phôi thai tự do trong máu ngoại vi của mẹ ở tuần thứ
8 của thai kỳ.
Bảng 3.13: Bảng kết quả sàng lọc bệnh Teo cơ Duchenne
STT
Mã bệnh
nhân
Tuổi thai
Chẩn đoán
gen SRY
Chẩn đoán siêu

âm 16 T
Chọc ối chẩn
đoán DMD
1
DMD01
8
(+)
(+)
(+)
2
DMD02
8
(+)
(+)
(-)
3
DMD03
8
(+)
(+)
(+)
4
DMD04
8
(+)
(+)
(-)
5
DMD05
8

(-)
(-)

6
DMD06
8
(+)
(+)
(-)
7
DMD07
8
(-)
(-)

8
DMD08
8
(-)
(-)

9
DMD09
8
(-)
(-)

10
DMD10
8

(+)
(+)
(+)
Qua bảng số liệu trên chúng tôi nhận thấy rằng trong 10 trƣờng hợp này có 6
trƣờng hợp dƣơng tính với gen SRY và 4 trƣờng hợp âm tính với gen SRY. Bốn trƣờng
hợp âm tính với gen SRY này sẽ không cần chọc ối để chẩn đoán bệnh Teo cơ Duchenne
này nữa. Còn 6 trƣờng hợp dƣơng tính với gen SRY sẽ đƣợc chọc ối để tiến hành xét
nghiệm bệnh Teo cơ Duchenne này tại Đại học Y Hà Nội và cho kết quả 3/6 trƣờng hợp
mang bệnh Teo cơ Duchenne, 3 trƣờng hợp không mang gen bệnh thai nhi sinh ra bình
thƣờng.
 Kết quả chẩn đoán sự bất đồng nhóm máu Rh giữa mẹ và thai nhi
Bảng 3.15: Bảng kết quả chẩn đoán nhóm máu Rh của thai nhi ở tuần thứ 8
STT
Mã bệnh nhân
Tuổi
mẹ
Tuổi
thai
Chẩn đoán
Rh của
Thai
RH của
mẹ
Chẩn đoán Rh
con sau sinh
1
RH01
34
8
(+)

(-)
(+)
2
Rh02
26
8
(+)
(-)
(+)
3
RH03
30
8
(+)
(-)
(+)
4
RH04
29
9
(-)
(-)
(-)
5
RH05
35
8
(+)
(-)
(+)

6
RH06
29
8
(+)
(-)
(+)
7
RH07
36
8
(+)
(-)
(+)
8
RH08
32
8
(+)
(-)
(+)
9
RH09
28
8
(+)
(-)
(+)
10
RH10

35
8
(+)
(-)
(+)
11
RH11
26
8
(-)
(-)
(-)
12
RH12
32
9
(-)
(-)
(-)
13
RH13
26
8
(+)
(-)
(+)
Từ kết quả bảng trên cho chúng ta thấy: trong 13 bệnh nhân nghiên cứu này có 3
bệnh nhân mang thai mang nhóm máu Rh(-) , cho thấy không có sự bất đồng nhóm máu
giữa mẹ và con (mẫu Rh4, Rh 11 và Rh 12). Có 10 trong tổng số 13 mẫu nghiên cứu có
thai nhi mang nhóm máu Rh(+), 10 mẫu này có sự bất đồng nhóm máu giữa mẹ và con.

Các kết quả này đã đƣợc xác định lại bằng test nhanh nhóm máu Rh của con sau sinh.
 Kết quả thử nghiệm ứng dụng tế bào phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ để
chẩn đoán bất thƣờng số lƣợng nhiễm sắc thể bằng bộ kít Vysis MultiVysion
PGT Multicolor probes
Mẫu DT02 chúng tôi phân lập tế bào khi thai ở 16 tuần tuổi, trƣờng hợp này vừa
đƣợc chẩn đoán bằng kỹ thuật FISH vừa đƣợc chẩn đoán bằng kỹ thuật QF-PCR sau khi
chọc ối.

Hình 3.29. Hình ảnh tế bào phôi thai của mẫu số DT01
Nhận xét: Hình ảnh kết quả nhuộm FISH cho mẫu DT ở trên cho thấy các tín
hiệu huỳnh quang bắt màu tốt không bị mất tín hiệu. Với NST số 21 xuất hiện 3 tín hiệu
màu xanh lá cây, các NST thƣờng khác nhƣ NST số 13 và 18 đều xuất hiện 2 tín hiệu
chứng tỏ NST này bình thƣờng. Hai NST giới tính xuất hiện 1 tín hiệu màu vàng của
NST giới tính Y và một tín hiệu màu xanh rêu của NST X. Do vậy, đây là một tế bào
mang bộ nhiễm sắc thể 47, XY, +21. Kết quả này đƣợc kiểm chứng bằng phƣơng pháp
chẩn đoán QF-PCR qua mẫu ối của
KẾT LUẬN
 Chúng tôi đã chứng minh đƣợc sự tồn tại của ADN phôi thai và tế bào phôi tự
do lƣu hành trong máu ngoại vi của ngƣời mẹ.
 Đã xây dựng đƣợc quy trình tách chiết ADN tự do ứng dụng trong sàng lọc
bệnh tăng sản thƣợng thận bẩm sinh và đã sang lọc đƣợc 11 trƣờng hợp trong
đó có 5/11 trƣờng hợp dƣơng tính với gen SRY và chúng tôi cũng đã sang lọc
đƣợc 10 bà mẹ mang thai có nguy cơ sinh con bị Teo cơ Duchenne, ngoài ra
còn chẩn đoán đƣợc 10/13 trƣờng hợp bà mẹ mang nhóm máu Rh(-) mang
thai có nhóm nhóm máu Rh(+).
 Nghiên cứu của chúng tôi đã khảo sát đƣợc nồng độ ADN phôi thai tự do ở
cac tuần tuổi thai từ 6 đến 22 tuần và lựa chon đƣợc thời điểm thích hợp nhất
cho sang lọc và chẩn đoán bệnh di truyền trƣớc sinh là vào tuổi thai 8 tuần
tuổi.
 Nghiên cứu của chúng tôi cũng đã chỉ ra đƣợc rằng ADN phôi thai tự do chỉ

tồn tại một thời gian rất ngắn trong máu ngoại vi của mẹ sau khi sinh vào
khoảng 3h sau khi sinh.
 Chúng tôi đã khảo sát và so sánh đƣợc nồng độ AND phôi thai tự do ở các
trƣờng hợp mang thai bị dị tật cao gấp 4,5 lần so với trƣờng hợp mang thai
không bị dị tật.
KIẾN NGHỊ
 Cần nghiên cứu ứng dụng kết quả sang lọc và chẩn đoán trên nhiều mặt bệnh
khác nữa.
 Mở rộng nghiên cứu với số lƣợng mẫu nhiều hơn trên tế bào phôi thai lƣu
hành trong máu ngoại vi của mẹ để tiến tới có thể chẩn đoán đƣợc các bệnh di
truyền qua máu ngoại vi.
DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC
CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

[1]. Triệu Tiến Sang, Nguyễn Duy Bắc, Trần Ngọc Anh, Đặng Tiến Trƣờng (2010),
“Nghiên cứu áp dụng kỹ thuật QF-PCR trong chẩn đoán một số hội chứng bất thƣờng
nhiễm sắc thể”, Tạp chí y dược học quân sự, vol 35, số 7/2010, tr.41-44.
[2]. Nguyen Duy Bac, Trieu Tien Sang, Tran Van Khoa (2010), “QF-PCR in the prenatal
and postnatal detection of common chromosome aneuploidies”, Revue mesdiccale 2010,
tr.22-28.
[3]. Triệu Tiến Sang, Trần Văn Khoa (2012), “Nghiên cứu quy trình chiết tế bào phôi thai
trong máu ngoại vi của mẹ, Ứng dụng chẩn đoán trƣớc sinh bệnh di truyền”, Tạp chí y
dược học quân sự, vol 37, số 7 tháng 9/2012, tr.35-39.
[4]. Triệu Tiến Sang, Trần Văn Khoa, Đinh Đoàn Long (2013), “Phát hiện ADN tự do
của thai nhi trong huyết tƣơng phụ nữ mang thai bằng kỹ thuật PCR, Ứng dụng chẩn
đoán bệnh di truyền trƣớc sinh”, Tạp chí y học Việt Nam, Tập 411, số đặc biệt/2013,
tr.212-218.
[5]. Triệu Tiến Sang, Trần Văn Khoa, Đinh Đoàn Long (2014), “Phát hiện và định lƣợng
AND phôi thai tự do trong huyết tƣơng ngƣời mẹ bằng phƣơng pháp Realtime-PCR”,
Tạp chí y dược học quân sự, vol 39, số 5 tháng 6/2014, tr.45-51.

[6]. Triệu Tiến Sang, Trần Văn Khoa, Đinh Đoàn Long (2014), “Tách và phân lập tế bào
phôi thai trong máu ngoại vi của mẹ ứng dụng chẩn đoán không can thiệp”, Tạp chí y
dược học quân sự, vol 39, số 6 tháng 8/2014, tr.49-55.
[7]. Triệu Tiến Sang, Trần Văn Khoa, Đinh Đoàn Long, Nguyễn Duy Bắc (2014), “Ứng
dụng phân tích DNA phôi thai tự do để sàng lọc di truyền trƣớc sinh”, Tạp chí y học Việt
Nam, tập 424, số đặc biệt/2014, tr.130-137.
[8]. Triệu Tiến Sang, Trần Văn Khoa, Đinh Đoàn Long (11/2014), “Khảo sát và định
lƣợng ADN phôi thai tự do trong huyết tƣơng của mẹ ở các tuần tuổi thai từ 6 tuần đến
22 tuần bằng phƣơng pháp Realtime-PCR”, Tạp chí y học Việt Nam, tập 424, số đặc
biệt/2014, tr.138-146.