báo cáo quy trình phân tích kháng sinh trong tôm

Bộ Giáo Dục và Đào Tạo

Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM
Bộ Môn Công Nghệ Hóa Học
BÁO CÁO
QUY TRÌNH PHÂN TÍCH
KHÁNG SINH TRONG TÔM
Giáo viên hướng dẫn Nhóm thực hiện:
Phùng Võ Cẩm Hồng Bùi Nguyễn Hương Duyên
Nguyễn Thanh Duy
Đặng Quốc Thái
Phạm Anh Thư
Trần Nhật Trường
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 02/2012
Muc lục
A. ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay ngành chăn nuôi thủy sản nước ta phát triển rất mạnh nhất là lĩnh vực
nuôi tôm sú ở các tỉnh ven biển, tôm càng xanh ở các tỉnh dồng bằng sông cửu long.
Tuy nhiên hiện trạng đang xảy ra là dư lượng thuốc kháng sinh được các nhà máy
thức ăn bổ sung vào thức ăn công nghiệp quá nhiều, hậu quả chắc ai cũng biết.
Sử dụng thuốc và hóa chất trong nghề nuôi tôm ngày càng tăng do chuyển đổi
nhanh chóng từ nuôi quảng canh sang thâm canh. Kết quả điều tra 60 hộ nuôi tôm và
người phân phối thuốc và hóa chất ở tỉnh Bạc Liêu và Sóc Trăng thấy có 74 loại thuốc
và hóa chất trong đó có 19 loại đang đựơc sử dụng trong nghề nuôi tôm.
Một vấn đề lớn còn lại cần phải giải quyết là các nhà sản xuất và người bán lẻ
các sản phẩm kháng sinh thường không chú ý tới việc cung cấp cho người nuôi tôm
những thông tin chính xác về những sản phẩm của họ. Họ cần phải được bắt buộc
cung cấp cho người nuôi những thông tin tốt hơn về hàm lượng, độ an toàn và hiệu
quả sử dụng sản phẩm.

B. KHÁNG SINH
I. ĐỊNH NGHĨA
Kháng sinh còn được gọi là trụ sinh là những chất có khả năng tiêu diệt vi
khuẩn hay kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn một cách đặc hiệu. Nó có tác dụng lên
vi khuẩn ở cấp độ phân tử, thường là một vị trí quan trọng của vi khuẩn hay một phản
ứng trong quá trình phát triển của vi khuẩn.
Bảng: Một số loại thuốc kháng sinh thường sử dụng trong nuôi tôm
Tên kháng sinh Tên thương mại
Enrofloxacin (10) Enroxin và Enrofloxacin
Norfloxacin (7) Noracin, Anti – white, Anti – WW và N300
Oxolinic acid (8) Oxolin
Sulphamethoxazole + Trimethoprim (4) Dai-Trim và Vi- trim
Sulfamid + Trimethoprim (4) Cotrim-Fort, Trimesul và Sulfa-Prim 01
Enrofloxacin + Metronidazole + Colistin (3) Enro DC
Enrofloxacin + Gentamycin + Colistin (2) Genrodexacol và EGC-mycine
Norfloxacin + Sulfamid + Trimethoprim (2) Anti –V
Norfloxacin + Colistin + Gentamycin (2) Norlp-Septryl
Sorbitol (2) Sorbitol
Ampicillin + Furaltadone + Sulfachlorpuridazin (2) Bioxide for shrimp
Sơ đồ cơ chế tác động của chất kháng sinh
II. DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH?
Dư lượng kháng sinh trong thực phẩm hiện là vấn đề quan ngại của hầu hết các
cơ quan
kiểm
soát thực phẩm trên thế giới. Một số loại kháng sinh bản thân nó
(chloramphenicol, malachite green
)
có thể gây ra tác động có hại cho sức khoẻ
người tiêu dùng, một số loại khác như các kháng sinh
nhóm

nitrofurans qua quá
trình trao đổi chất trong cơ thể động vật có thể sinh ra những hợp chất có độc
tính
cao đối với cơ thể sống. Chính vì vậy những kháng sinh này đã bị cấm sử dụng
hoàn toàn trong
nuôi
trồng và bảo quản thực phẩm
Tồn dư kháng sinh trong
thực phẩm ảnh hưởng xấu đến sức khoẻ cộng đồng và môi trường, là một
trong những nguyên nhân gây những bệnh hiểm nghèo như ung thư, đột
biến gen, quái thai, dị ứng và tăng nguy cơ xuất hiện nguồn gen kháng thuốc ở các
chủng vi sinh vật, đặc biệt vi sinh vật gây bệnh
Enrofloxacin là chất kháng sinh kháng vi khuẩn ảnh hưởng đến mắt dễ gây khiếm thị.
Khi vi khuẩn có được sức đề kháng, người ta khó có khả năng tống khứ được chúng
đi bằng thuốc kháng sinh. Hơn nữa, một số thuốc kháng sinh có thể làm cho vi khuẩn
tăng sức đề kháng không chỉ với loại kháng sinh đó mà còn với nhiều loại kháng sinh
khác nhau. Thêm vào đó, các nguyên tố mã hoá có sức đề kháng có thể di chuyển từ
một loài vi khuẩn này sang các loài vi khuẩn khác. Vi khuẩn này có thể gián tiếp trở
nên kháng lại một loại kháng sinh mà không cần phải đưa trực tiếp kháng sinh đó vào
nó.
Một vấn đề quan trọng khác đó là nhiều loại kháng sinh là có hại cho sức khoẻ nghề
nghiệp. Hiện nay khi người lao động và nhiều người khác khi xử lý nhiều loại kháng
sinh thì phần da để lộ ra ngoài và bụi hít vào từ thuốc bột kháng sinh có thể dẫn đến
các vấn đề về sức khoẻ đối với họ.
Nhiều loại kháng sinh được sử dụng trong các trại nuôi tôm là có sức sức bền khá cao
trong môi trường và có thể lan ra các vùng nước xung quanh qua đường thoát nước,
nước thải. Trong môi trường xung quanh chúng có thể thay đổi hệ sinh thái bằng cách
thay đổi cấu trúc thông thường của vi khuẩn, và cũng có những ảnh hưởng độc tính
rất lớn đối với động vật và thực vật dưới nước. Chúng cũng có thể được các sinh vật
hấp thụ, ví dụ như những con vẹm loài thủy sản được nhiều địa phương khai thác và

ăn. Ðiều đó có nghĩa là, dư lượng kháng sinh trong thực phẩm không chỉ là một mối
đe doạ đối với người tiêu dùng tôm ở những nước nhập khẩu mà còn là một mối đe
dọa đối với những người sống trong những vùng nuôi tôm.
C. GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH KHÁNG SINH
TRONG TÔM
Các phương pháp phân tích sử dụng sắc ký có ghép khối phổ như GC-
MS, GC-MS/MS,
LC-
MS, LC-MS/MS đều đáp ứng được yêu cầu và được các
cơ quan thẩm quyền của các nước nhập
khẩu
chấp nhận. Tuy nhiên những
phương pháp này đòi hỏi đầu tư chi phí cao về thiết bị, chi phí vận
hành,
kỹ năng
và trình độ của kiểm nghiệm viên. Do vậy nó không phù hợp cho các phòng
kiểm nghiệm
qui
nhỏ hay những phòng kiểm nghiệm của địa phương. Vài năm
gân đây, cách tiếp cận mới về
phương
pháp phân tích dựa trên phản ứng giữa
kháng nguyên-kháng thể (Enzyme-Linked
Immunosorbent
Assay (ELISA)) đã
trở thành một công cụ khá hữu hiệu và được cơ quan thẩm quyền chấp thuận
cho
phép sử dụng với mục đích thử nghiệm sàng lọc (Screening method). Liên
minh châu Âu (Chỉ
thị

657/EC/2002) cho phép sử dụng phương pháp ELISA trong phân tích dư luợng
các hóa chất
kháng
sinh cấm, tuy nhiên có những yêu cầu rất khắt khe về giới
hạn phát hiện và độ không đảm bảo đo
và
các tỷ lệ dương tính giả và âm tính giả
của xét
nghiệm.
Từ năm 2002 đến nay, phương pháp ELISA đã được sử dụng trong phân tích
sàng lọc tại
phòng
kiểm nghiệm của các Trung tâm Kiểm tra Chất lượng và Thú
y Thuỷ sản vùng đối với các chỉ
tiêu
CAP, AOZ và AMOZ. Tất cả các mẫu
phát hiện dương tính trên ELISA được kiểm tra khẳng định
trên LC-MS/MS.
2.2.1. Tóm tắt qui trình thử nghiệm Elisa sử dụng trong thực
nghiệm
a. Kít thử Elisa: Kit thử của các hãng R-Biopharm và
TAPB.
b. Qui trình chuẩn bị mẫu: Dư lượng CAP trong 3g mẫu đuợc ly trích
bằng 6ml ethyl
acetate.
Dịch chiết đuợc cô đến khô ở 50
o
C dưới dòng nitơ. Cặn
khô được hoà tan trong 1ml đệm và làm
sạch

bằng 1ml hexan. Hàm luợng CAP
trong dịch chiết đuợc phân tích với kit thử
ELISA.
c. Qui trình thử nghiệm với ELISA: qui trình xác định hàm lượng CAP
trong dịch chiết
trên
Elisa tuân thủ theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất.
Mỗi loạt thử nghiệm đều có kèm theo
mẫu
chứng âm và chứng dương để
kiểm soát chất lượng kết quả thử
nghiệm.
d. Giới hạn phát hiện:
0,1ppb
2.2.2. Tóm tắt qui trình thử nghiệm LC-MS/MS sử dụng trong thực
nghiệm
Các mẫu phát hiện dương tính trên ELISA (phần 2.2.1) được phân tích
khẳng định trên
LC-
MS/MS theo qui trình tóm tắt như
sau:
a. Thiết
bị:
Hệ thống LC-MS/MS: Waters Quattro-micro API (tripple quadrupole,
ESI(-)
b. Qui trình chuẩn bị
m
ẫ
u:
Dư lượng CAP trong 3g mẫu đuợc ly trích bằng 6ml ethyl acetate. Dịch chiết

đuợc cô đến
khô
ở 50
o
C dưới dòng nitơ. Cặn khô được hoà tan trong 1ml NaCl 4%, làm sạch
sơ bộ bằng 1ml hexan
và
sau đó được làm tinh sạch bằng cột C18. Hàm luợng
CAP trong dịch giải hấp đuợc phân tích trên
LC-
MS/MS
c. Phân tích trên
LC-MS/MS:
Các thông số
chính:
LC: Pha động: ACN:
H20
(80:20)
Tốc độ
dòng:
0,3ml
Thể tích
tiêm:10ul
MS/MS: ESI
(-)
MRM :
321->152
321->194
321->256
326->157

Mỗi loạt thử nghiệm đều có kèm theo mẫu chứng âm và chứng dương
để kiểm soát chất
lượng
kết quả thử nghiệm. Nội chuẩn CAP-d5 được sử dụng
6
để hạn chế tối đa ảnh hưởng của nền
mẫu
(biological maxtrices) đối với kết
quả phân tích. Ngoài ra, hàng năm phòng kiểm nghiệm đều tham
gia
các
chương trình thử nghiệm thành thạo do FAPAS tổ chức (thuộc Phòng Thí
nghiệm Trung tâm
của
Vương quốc Anh - Central Science Laboratory, UK) và
đạt kết quả tốt (Z score <
2).
Tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi đầu tư chi phí cao về thiết bị, chi phí vận
hành,
kỹ năng và trình độ của kiểm nghiệm viên. Do vậy nó không phù hợp
cho các phòng kiểm nghiệm
qui
nhỏ hay những phòng kiểm nghiệm của địa
phương. Vài năm gân đây, cách tiếp cận mới về
phương
pháp phân tích dựa
trên phản ứng giữa kháng nguyên-kháng thể (Enzyme-Linked
Immunosorbent
Assay (ELISA)) đã trở thành một công cụ khá hữu hiệu và
được cơ quan thẩm quyền chấp thuận

cho
phép sử dụng với mục đích thử
nghiệm sàng lọc (Screening method). Liên minh châu Âu (Chỉ
thị
657/EC/2002) cho phép sử dụng phương pháp ELISA trong phân tích dư
luợng các hóa chất
kháng
sinh cấm, tuy nhiên có những yêu cầu rất khắt khe
về giới hạn phát hiện và độ không đảm bảo đo
và
các tỷ lệ dương tính giả và
âm tính giả của xét
nghiệm.
D. PHƯƠNG PHÁP ELISA
I . GIỚI THIỆU CHUNG
ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay_ Xét nghiệm hấp thu miễn dịch
liên kết với enzyme) dựa trên sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu,
phản ứng tạo sản phẩm có màu hay phát sáng. Trong đó tính chất họat hóa của
enzyme và độ đặc hiệu của kháng thể là không đổi.
Kit thử của các hãng R-Biopharm và TAPB
II. NGUYÊN TẮC
Sử dụng KT đơn dòng (Mabs) phủ bề mặt những đĩa giếng. Nếu có sự hiện diện
của KN trong mẫu,KN sẽ tạo phức hợp với KT cố định trên giếng và KT tự do
có gắn enzyme tạo thành một phức hợp kép(sandwich).Khi bổ sung cơ chất đặc
hiệu của enzyme vào giếng,enzyme xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất để tạo
ra các sản phẩm có màu hay phát sáng.
7
III. ỨNG DỤNG
Trong thực phẩm
►Phương pháp Elisa có thể phát hiện và định lượng vi sinh trong thực phẩm

trong thời gian vài giờ sau khi tăng sinh.
►Phát hiện độc tố trong tảo.
►Phát hiện vi khuẩn E.coli, Salmonella, Staphylococcus aureus,sán lá gan…
trong thực phẩm.
►Phát hiện chất chloramphenicol (chất không được phép có trong tôm, cá và
các sản phẩm thuỷ sản khác)
►Kiểm tra dư lượng kháng sinh trong thực phẩm,tàn dư thuốc diệt cỏ,thuốc trừ
sâu…
Trong y học
►Là một trong các kĩ thuật xét nghiệm HIV nhằm phát hiện kháng nguyên p24.
►Chuẩn đóan và điều trị bệnh viêm gan siêu vi B và C,bệnh ung thư.
►Ứng dụng để phát hiện bệnh A. cantonensis (bệnh viêm màng não) do loại
giun kí sinh ở phổi chuột gây ra.
►Xác định tỉ lệ nhiễm kí sinh trùng sốt rét ở miền Trung-Tây Nguyên.
IV. ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ELISA ĐỂ PHÂN TÍCH TỒN DƯ KHÁNG SINH
TRONG TÔM
Nhóm QUINOLONE trong tôm tại một số tỉnh ven biển khu vực phía Bắc
Dung dịch kháng sinh chuẩn: tất cả 5 kháng sinh thuộc nhóm quinolones được
sử dụng trong nghiên cứu này gồm enrofloxacin, flumequin, norfloxacin,
8
Ciprofloxacin và sarafloxacin ở dạng bột và đều là sản phẩm của Sigma-
Aldrich (St Louis, MO, USA).
Dung dịch gốc 1 mg/ml: hoà tan trong methanol với sự có mặt của NH 4
OH 2M.
Dung dịch dùng củng cố mẫu được pha loãng từ dung dịch gốc (1 mg/ml)
bằng nước cất.
Hỗn hợp methanol/PBS (50/50) pH 7,4 (dung dịch PBS pH 7,4 là hỗn
hợp 9 gam NaCl, 7,78 gam Na
2
HPO

4
.2HO và 0,75 gam KH
2
PO
4
pha trong 1
lít nước cất).
Kít ELISA phân tích quinolone: 10 bộ kít thuộc 5 lô khác nhau do phòng thí
nghiệm Hormonologie - CER, Marloie, Vương quốc Bỉ cung cấp.
Cách lấy mẫu
Chín mươi mẫu tôm được lấy ngẫu nhiên 6 đợt độc lập vào 6 tháng khác
nhau trong năm (tháng 5, 6, 7, 10, 11 và 12 năm 2006) tại các chợ 4 địa
phương đại diện gồm Hà Nội, Quảng Ninh, Nam Định và Nghệ An. Mỗi địa
phương, mỗi đợt lấy 3 mẫu tại các quầy ở các chợ khác nhau. Riêng Hà
Nội, ngoài chợ mẫu còn được lấy ở ba siêu thị. Các mẫu đều có nguồn gốc từ
các đầm nuôi ở các địa phương đại diện, riêng mẫu được lấy tại Hà Nội
được xác định nguồn gốc từ Quảng Ninh, Hải Phòng và Nam Định. Mẫu sau
khi lấy được bảo quản lạnh chuyển về phòng thí nghiệm loại bỏ đầu và vỏ.
Sau khi nghiền đồng nhất bằng máy moulinex, mẫu được lưu giữ ở âm 80°C.
Tính ổn định của kít được đánh giá qua kết quả phân tích đường chuẩn của 10
bộ kít thuộc 5 lô vào các ngày khác nhau, mỗi nồng độ khi thử trên một bộ kít
được lặp lại 2 lần. Đường chuẩn được xây dựng trên cơ sở phân tích 6 dung dịch
chuẩn sarafloxacin có nồng độ tương ứng là 0; 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,5 và 1,0
ng/ml.
Để đánh giá khả năng phát hiện và khả năng ứng dụng của kít trong điều
kiện phòng thí nghiệm ở Việt Nam, các tham số liên quan đến khả năng phát hiện
của phương pháp được đánh giá theo tiêu chuẩn châu Âu. Mỗi kháng sinh
thử 20 mẫu trắng (được xem như mẫu thực sự âm tính) và 20 mẫu củng cố các
quinolone đại diện ở nồng độ bằng nồng độ giới hạn phát hiện (0,7 ppb). Các
tham số độ xác thực và độ mạnh của phương pháp được tính toán theo các công

thức sau:
9
Trong đó :
N là tổng số mẫu phân tích = N
+
+ N
-

N
+
là số mẫu thực sự dương tính (mẫu củng cố)
N
-
là số mẫu thực sự âm tính (mẫu trắng)
PA là số mẫu dương tính theo kết quả phân tích trong số N
+
mẫu
FN là số mẫu âm tính theo kết quả phân tích trong số N
+
mẫu
FP là số mẫu dương tính theo kết quả phân tích trong số N
-
mẫu
NA là số mẫu âm tính theo kết quả phân tích trong số N
-
mẫu
10
Độ đặc hiệu, tính chọn lọc và độ xác thực của phương pháp
11
Kết quả phân tích mẫu tôm trên thị trường một số địa phương phía Bắc

Kít ELISA của hãng CER Vương quốc Bỉ có khả năng phát hiện tốt các
kháng sinh thuộc nhóm quinolone trong tôm ở nồng độ lớn hơn hoặc
bằng 0,7 ppb.
Khả năng phát hiện, hiệu lực của kít trong điều kiện phòng thí nghiêm ở
Việt Nam đáp ứng được yêu cầu của một phương pháp bán định lượng qui
định trong Quyết định số 2002/657/CE Uỷ ban Châu Âu (CE, 2002). Tuy
12
nhiên, muốn định danh loại kháng sinh quinolone và xác định nồng độ chính
xác cần phải khẳng định lại bằng các phương pháp khẳng định lý hoá khác.
Tất cả các địa phương nghiên cứu đều phát hiện mẫu bị nhiễm quinolone
với nồng độ dư lượng cao nhất là 145 ppb và thấp nhất là 0,4 ppb (tỷ lệ nhiễm
10%). Trong đó có 4 mẫu không đạt yêu cầu vệ sinh an toàn thực phẩm theo qui
định của Việt Nam và Uỷ ban Châu Âu.
E. KẾT LUẬN
Để có thể hạn chế được các chất kháng sinh thì ta phải áp dụng tối đa các biện
pháp phòng tránh các chất kháng sinh, mà đặc biệt nhất là cấm sử dụng dư chất
kháng sinh trong nuôi trồng gia súc, gia cẩm, thủy hải sản Ngoài ra, phải tăng
cường phổ biến thông tin, nâng cao năng lực của người nông dân trong vấn đề
chăn nuôi, cũng như ý thức của người nông dân và doanh nghiệp nhằm phòng
tránh trường hợp thực phẩm bị nhiễm quá nhiều thuốc kháng sinh, gây hại cho
người tiêu dùng.
Khi nào nên sử dụng kháng sinh ?
- Chỉ sử dụng kháng sinh để xử lý khi nhiễm vi khuẩn, không đýợc sử dụng cho bất
kỳ một nguyęn nhân nŕo khác.
- Kháng sinh không thể chữa trị các bệnh về virút như virút đốm trắng hay bệnh
đầu vàng. Cần biết rằng một số sản phẩm kháng sinh sẵn có cho người nuôi tôm ở
Thái Lan được bán trên thị trường là không có khả năng để điều trị các bệnh về
virut.
Các loại kháng sinh nên sử dụng:
- Sử dụng các loại kháng sinh sạch từ nguồn đáng tin cậy. Thông tin về các loại

thành phần tác dụng cần được ghi rõ trên nhãn.
- Phải bảo đảm kháng sinh đạt tiêu chuẩn về dược phẩm. Không được sử dụng hoá
chất, do chúng có chất lượng kém hơn.
- Tránh sử dụng các loại kháng sinh được sử dụng điều trị cho người.
- Không được sử dụng Chloramphenicol hay nitrofurans (ví dụ như furazolidone,
nitrofurazone, nitrofurantoin, nitroquine và nitfuratel). Chúng rất nguy hiểm và
không được phép có trong thức ăn động vật.
Cách sử dụng:
13
- Cần nắm được các thông tin chi tiết về tất cả các loại kháng sinh sử dụng.
- Sử dụng kháng sinh phòng bệnh cần tránh càng xa càng tốt. Sử dụng phòng bệnh
là nguyên nhân chính sau sự tăng sức đề kháng.
- Tránh sử dụng lặp lại cùng một loại kháng sinh, để tránh làm tăng độ kháng
thuốc.
- Không được sử dụng nhiều hơn một loại kháng sinh tại cùng một thời gian nếu nó
không được yêu cầu một cách cụ thể. Không được rải các loại thuốc khác nay hoá
chất vào tôm trong khi xử lý bằng kháng sinh.
- Dùng đúng liều và thời gian chữa trị. Không được dùng nhiều hơn hay ít hơn chỉ
dẫn.
- Sử dụng và cất trữ các sản phẩm kháng sinh một cách cẩn thận, xem xét các rủi ro
với con người. Sử dụng các công cụ và găng tay để tránh da tiếp xúc nếu các loại
kháng sinh được trộn với thức ăn.
- Các loại tôm không nên được điều trị bằng kháng sinh trong ít nhất hai tuần trước
khi thu hoạch, tốt nhất là lâu hơn để tránh các dư lượng kháng sinh để lại.
- Nếu tôm không ăn tốt do nhiễm bệnh, cũng không được sử dụng thuốc kháng
sinh cùng với thức ăn.
- Sử dụng kháng sinh tốt nhất nên được giám sát về mặt thú y.
14