Thu nhận enzyme cellulase thô từ chủng Bacillus spp. trong tự nhiên

Thu nhận enzyme cellulase thô từ chủng
Bacillus spp. trong tự nhiên
Mạch Trần Phương Thảo
1. Đặt vấn đề
Vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulose có vai trò
quan trọng trong đời sống tự nhiên. Và hiện nay nhu cầu sử dụng enzyme
này rất phổ biến trong đời sống hiện đại.
Cellulase thường được sinh tổng hợp từ nấm, vi khuẩn, thực vật và
động vật nhưng trong ứng dụng thường sử dụng nguồn gốc từ vi sinh. Hệ
enzyme từ nấm gồm có endoglucanese (hoặc CMCase), exoglucanases
(cellobiohydrolase) và β-glucosidases (hoặc cellobiases) đóng vai trò trong
việc thủy phân hoàn toàn cellulose. Loài nấm được ứng dụng để sinh
cellulase như Trichoderma viride, Aspergillus spp Đối với hệ enzyme trong
vi khuẩn thường thấy ở vi khuẩn hiếu khí như Pseudomonas và
Actinomyces, kị khí thường thấy ở Bacillus và Cellulomonas, đặc biệt là loài
Clostridium.Hầu hết các chủng đều sinh endoglucanases.
Cellulase được sử dụng nhiều trong công nghệ thực phẩm như chế
biến cà phê. Nó sẽ thủy phân cellulose trong quá trình tách vỏ cà phê. Ngoài
ra, cellulase còn được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp vải sợi, sản xuất
giấy hay ứng dụng trong dược phẩm. Hiện nay, nó còn được quan tâm rộng
rãi hơn trong lên men sản xuất nhiên liệu sạch thay thế cho xăng dầu hiện
nay.
2. Phương pháp và nguyên liệu
Chuẩn bị môi trường
Môi trường nuôi vi khuẩn Bacillus spp.:
NA 2g
Nước 100ml
pH=6,8
Môi trường sinh tổng hợp enzyme cellulase
Pepton 1g
CMC 1g

Nước 100ml
pH=6,8
2.1 Chuẩn bị mẫu
Vi khuẩn được chọn lọc từ nguồn tự nhiên trong cơm nấu để qua 24h
ở nhiệt độ phòng. Trước khi đi cấy chọn vi khuẩn, mẫu được đun cách thủy
ở nhiệt độ 100
o
C trong 15 phút nhằm tiêu diệt các loại vi khuẩn sinh dưỡng.
Baccilus spp. là chủng vi khuẩn có khả năng sinh bào tử và chịu được nhiệt
độ cao nên với phương pháp trên sẽ hạn chế bớt các vi khuẩn không mong
muốn.
2.2 Phân lập vi khuẩn
Chuẩn bị môi trường thạch dinh dưỡng NA (Nutritional agar) để cấy
khuẩn. Các đĩa peptri, ống nghiệm được sấy khử trùng ở nhiệt độ 160
o
C
trong 2 giờ. Môi trường được hòa tan theo định mức 2g NA pha với 100ml
nước cất và hấp khử trùng ở nhiệt độ 121
o
C trong 15 phút. Vi khuẩn được
cấy ria nhằm phân lập khuẩn lạc theo đúng phương pháp nhằm tránh để bị
nhiễm.
Các đĩa peptri cấy khuẩn được ủ trong 37
o
C với thời gian 24h để
khuẩn lạc phát triển.
Vi khuẩn được phân lập sẽ đem đi kiểm tra hình thái nhằm xác định
có phải là chủng Baccilus spp. hay không. Thí nghiệm sử dụng phương pháp
nhuộm gram sau đó soi kính hiển vi điện tử.
2.3 Giữ chủng

Sử dụng môi trường thạch dinh dưỡng NA (Nutritional agar) pha với
tỉ lệ 2g NA trong 100ml nước cất. Môi trường được hấp khử trùng trong
121
o
C trong 30 phút sau đó cho vào từng ống nghiệm 5ml thạch. Ống
nghiệm được đặt nghiêng 30
o
và để nguội. Sau đó cấy chuyền vi khuẩn vào
ống nghiệm và bảo quản ở nhiệt độ 4
o
rồi cách 1 tháng cấy chuyền tiếp tục
một lần nhằm giữ giống.
2.4 Nuôi tăng sinh
Chuẩn bị môi trường để cấy vi khuẩn sinh enzyme như trên. Đối với
CMC cần hòa tan trong nước nóng 70
o
C trước khi hòa chung các chất khác.
Hấp môi trường ở nhiệt độ 121
o
C trong 30 phút. Sau đó cho ống nghiệm
chứa vi khuẩn vào và tiếp tục nuôi cấy trên máy lắc trong thời gian 2ngày.
Để thu nhận enzyme cellulase thô thì đưa dịch đi ly tâm lạnh với tốc
độ 3500 vòng/phút trong thời gian 10 phút ở nhiệt độ 4
o
C, gạn kết tủa thu
dịch lọc đem đi xác định hoạt độ.
2.5 Đo hiệu quả thủy phân của enzyme
Thí nghiệm được tiến hành trên đĩa thạch peptri với phương pháp đục
lỗ thạch và chấm điểm khuẩn trên bề mặt. Sau đó tiến hành đo vòng phân
giải và so sánh, lựa chọn chủng vi khuẩn sinh enzyme cellulase tốt nhất.

3 Kết quả và đề xuất
Hình Vi khuẩn Bacillus spp.
Hình Cấy ria vi khuẩn trên đĩa peptri
Hình Giữ chủng trên thạch nghiêng
Hình Tuyển chọn chủng thu nhận enzyme cellulase
Hình Tuyển chọn chủng theo phương pháp đục lỗ thạch
Kết quả quá trình định lượng đường khử so với mẫu chứng không bổ sung
enzyme là 0,4ml KMnO
4
, mẫu thử là 2,4ml, chênh lệch là 2ml. Tra bảng quy
đổi đường khử đạt 1,8mg Glucose cho thấy dấu hiệu khả quan khi sinh tổng
hợp enzyme cellulase từ Bacillus spp.
Qua quá trình thử nghiệm thì có thể thấy kết quả khả quan khi vi sinh
vật sinh enzyme cellulase. Tuy nhiên thí nghiệm khảo sát còn hạn chế về
thời gian nên đề xuất thêm các phương pháp tối ưu để sinh enzyme có hoạt
tính cao hơn.
-Sử dụng nhiều nguồn thu nhận Bacillus spp. để lựa chọn được chủng
nào sinh enzyme mạnh hơn.
-Tối ưu hóa môi trường sinh enzyme, bổ sung các chất khoáng vi
lượng, đa thành phần. Có thể lựa chọn môi trường lỏng hoặc môi trường bán
rắn để thử nghiệm.
-Kiểm tra hoạt tính enzyme cellulase trên đĩa thạch bằng phương pháp
đổ dung dịch Lugon trên bề mặt nhằm so sánh vòng tròn thủy phân cơ chất.
-Sử dụng phương pháp Miller đo lượng đường khử để suy ra hoạt độ
enzyme nhằm đưa kết quả chính xác hơn phương pháp Bertran.
-Thực hiện các thí nghiệm khảo sát các tính chất của enzyme như yếu
tố nhiệt độ tối ưu,tính bền nhiệt, pH tối ưu, ion kìm hãm, chất hoạt hóa…