PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN TỪ CÁC SẢN PHẨM THỦY SẢN LÊN MEN

1


TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ
KHOA SINH HỌC ỨNG DỤNG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH: NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
MÃ SỐ: 304




PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN
VI KHUẨN LACTIC
CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN
TỪ CÁC SẢN PHẨM THỦY SẢN LÊN MEN





Sinh viên thực hiện

ĐẶNG THỊ THU THẢO
MSSV: 0753040084
LỚP: ĐH NTTS K2



Cần Thơ, 2011

2


TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ
KHOA SINH HỌC ỨNG DỤNG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH: NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
MÃ SỐ: 304





PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN
VI KHUẨN LACTIC
CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN
TỪ CÁC SẢN PHẨM THỦY SẢN LÊN MEN






Cán bộ hướng dẫn Sinh viên thực hiện

PGs.Ts. NGUYỄN VĂN BÁ ĐẶNG THỊ THU THẢO
ThS. NGUYỄN THÀNH TÂM

2011

3

XÁC NHẬN CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN
TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Luận văn kèm theo đây với tựa đề: “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có
khả năng kháng khuẩn từ các sản phẩm thủy sản lên men”.
Do sinh viên Đặng Thị Thu Thảo thực hiện và báo cáo đã được Hội đồng chấm
luận văn thông qua.
Phản biện Ủy viên



Cần Thơ, ngày 13 tháng 07 năm 2011
Chủ tịch hội đồng











4

LỜI CẢM TẠ
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Tây Đô đã tạo điều
kiện tốt cho tôi học tập và sinh hoạt. Cảm ơn quý Thầy Cô Khoa Sinh Học Ứng
Dụng đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu về
cơ sở ngành cũng như chuyên ngành từ những ngày đầu bước chân vào trường
đến nay.
Đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng kháng khuẩn từ
các sản phẩm thủy sản lên men” được kết thúc thành công. Tôi xin chân thành
cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ của Thầy Nguyễn Văn Bá đã hỗ trợ môi trường
nuôi cấy và các dụng cụ đặc trưng cho thí nghiệm, Thầy Nguyễn Thành Tâm
luôn theo sát hướng dẫn đề tài và cung cấp một số tài liệu liên quan. Cảm ơn Cô
Trần Ngọc Huyền – cán bộ phòng thí nghiệm đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để
đề tài kết thúc đúng thời hạn và xin cảm ơn anh
Lê Văn Toàn (lớp ĐH NTTS K2) cùng hai em Nguyễn Thị Thùy Trang và
Dương Thị Bé Ba (lớp ĐH NTTS K3) đã đồng hành và giúp đỡ tôi trong suốt
quá trình thực hiện.
Cảm ơn Thầy cố vấn học tập Tạ Văn Phương , Thầy Nguyễn Lê Hoài Phương
(Khoa cơ bản) và các thành viên lớp ĐH NTTS K2 đã sát cánh cùng tôi trong
suốt quá trình học tập tại trường.
Chân thành cảm ơn!



Đặng Thị Thu Thảo

5

TÓM TẮT
Vi khuẩn lactic có ý nghĩa rất quan trọng trong các quá trình lên men thực
phẩm. Chúng sinh ra nhiều chất để bảo vệ thực phẩm như: axít lactic, H
2
O
2
và
chất kháng khuẩn. Do đó, việc tìm ra những chất kháng khuẩn sinh ra từ vi
khuẩn lactic nhằm bổ sung cho những nghiên cứu về chất kháng khuẩn và ứng
dụng chất kháng khuẩn vào trong nuôi trồng thủy sản. Nghiên cứu sử dụng môi
trường MRS để phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic, sử dụng phương pháp
trực tiếp để kiểm tra sự kháng lại vi khuẩn Pediococcus pentosakeus. Kết quả
cho thấy có tổng số 83 dòng vi khuẩn lactic được phân lập từ 37 mẫu mắm và
nước mắm (thu ngẫu nhiên ở những chợ thuộc vùng nước ngọt và nước lợ mặn)
và có 19 dòng cho vòng kháng khuẩn đối với dòng chỉ thị. Độ dày vòng kháng
khuẩn từ 0,1 – 0,85 cm, trong đó có 9 dòng vi khuẩn lactic cho bề dày vòng
kháng khuẩn lớn nhất (hơn 0,6 cm), 1 dòng cho bề dày vòng kháng khuẩn
0,1 cm là nhỏ nhất. Như vậy, có thể sử dụng vi khuẩn lactic từ các sản phẩm lên
men thủy sản để kháng lại vi khuẩn Pediococcus pentosakeus.
Từ khóa: Vi khuẩn lactic, Chất kháng khuẩn, Phương pháp trực tiếp,
Pediococcus pentosakeus.

6

MỤC LỤC

Trang
LỜI CẢM TẠ i
TÓM TẮT ii
MỤC LỤC iii
DANH SÁCH BẢNG v
DANH SÁCH HÌNH vi
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vii
CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1
1.1 Giới thiệu 1
1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2
1.3 Nội dung nghiên cứu 2
CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
2.1 Một số quy trình lên men thủy sản 3
2.2 Vi khuẩn lactic 7
2.2.1 Đặc điểm của vi khuẩn lên men axit lactic 7
2.2.2 Cơ chế của quá trinh lên men axit lactic 8
2.3 Mối quan hệ giữ axit lactic với cá và các sản phẩm từ cá 8
2.4 Chất kháng khuẩn 9
2.5 Dòng chỉ thị Pediococcus pentosakeus 12
2.6 Những nghiên cứu trong và ngoài nước 13
2.6.1 Những nghiên cứu trong nước 13
2.6.2 Những nghiên cứu ngoài nước 14
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15
3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 15
3.1.1 Địa điểm 15
3.1.2 Thời gian thực hiện 15
3.2 Vật liệu nghiên cứu 15
3.3 Phương pháp nghiên cứu 17
3.3.1 Phương pháp thu và bảo quản mẫu 17
3.3.2 Phương pháp phân lập VKL từ mẫu mắm 18

3.4 Phân tích và xử lý số liệu 20
3.4.1 Phân tích VKL 20
3.4.2 Phân tích khả năng kháng khuẩn 20
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 21
4.1 Phân lập một số dòng VKL từ các sản phẩm thủy sản lên men 21
4.1.1 Thu mẫu 21
4.1.2 Tăng sinh mẫu lần 1 21
4.1.3 C
ấy ria trên đĩa pêtri 23
7

4.1.4 Thử catalase và nhuộm Gram 25
4.1.5 Tăng sinh mẫu lần 2 26
4.1.6 Lưu trữ mẫu 26
4.2 Kiểm tra khả năng sinh CKK từ các dòng VKL thu được 26
4.2.1 Tối ưu hóa quy trình 26
4.2.2 Thử khả năng sinh CKK từ các dòng VKL thu được 27
CHƯƠNG 5: KẾT QUẢ ĐỀ XUẤT 31
5.1 Kết quả 31
5.2 Đề xuất 31
TÀI LIỆU THAM KHẢO 32
PHỤ LỤC A A
PHỤ LỤC B B
PHỤ LỤC C C
PHỤ LỤC D D1
PHỤ LỤC E E
PHỤ LỤC F F1
PHỤ LỤC G G

8

DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 2.1: Các đặc tính CKK của VKL 10
Bảng 3.1: Tên và địa điểm thu mẫu 17
Bảng 4.1: Địa điểm và số lượng mẫu thu 21
Bảng 4.2: Kết quả tăng sinh lần 1 22
Bảng 4.3: Kết quả cấy ria VKL trên đĩa thạch 23
Bảng 4.4: Kết quả thử khả năng sinh chất kháng khuẩn 28

Bảng 4.5: Kết quả thử với Pediococcus pentosakeus 30
Bảng A1: Thành phần môi trường MRS_broth A
Bảng A2: Thành phần môi trường MRS_agar A
Bảng D1: Bảng mã mẫu D1
Bảng D2: Kết quả thử khả năng sinh CKK của VKL phân lập được D3
Bảng F1: Quan sát khuẩn lạc F1



















9

DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 2.1: Quy trình sản xuất mắm cá 3

Hình 2.2: Quy trình sản xuất mắm tép 4
Hình 2.3: Quy trình sản xuất mắm tôm 5
Hình 2.4: Quy trình sản xuất mắm ruốc 5
Hình 2.5: Quy trình sản xuất nước mắm 6
Hình 2.6: Pediococcus 12
Hình 3.1: Quy trình phân lập mẫu mắm 19
Hình 3.2: Tối ưu hóa quy trình 19
Hình 3.3: Phương pháp trực tiếp 20
Hình 4.1: Cách xác định sự phát triển của VKL 21
Hình 4.2: Khuẩn lạc có khả năng phân giải CaCO
3
25
Hình 4.3: Vi khuẩn Gram dương (vật kính 100X) và mẫu thử catalase âm tính . 25
Hình 4.4: Vòng kháng khuẩn của mẫu 27
Hình 4.5: Vòng kháng khuẩn sinh ra từ VKL 30

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
VKL: Vi khuẩn lactic
CKK: Chất kháng khuẩn

10

CHƯƠNG 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1 Giới thiệu
Ở nước ta, nuôi trồng thủy sản ngày càng chiếm vị trí quan trọng trong nền kinh
tế. Trong những năm gần đây, nhằm nâng cao năng suất thủy sản phục vụ nhu
cầu xuất khẩu nên mức độ nuôi thâm canh hóa ngày càng cao. Bệnh trên tôm, cá
và các loài thủy đặc sản khác cũng xuất hiện ngày càng nhiều. Bệnh đã gây
nhiều tổn thất cho nghề nuôi thủy sản. Sản phẩm làm ra không được tiêu thụ
hoặc chất lượng sản phẩm giảm, không đảm bảo cho tiêu dùng và xuất khẩu.
Do đó, công tác phòng trị bệnh trong nuôi trồng thủy sản đang đòi hỏi cấp bách.
(Bùi Quang Tề, 2008). Tuy nhiên, nhiều sản phẩm thuốc thủy sản hiện nay đã
dần mất tác dụng với các loại mầm bệnh quen thuộc do việc sử dụng thuốc quá
mức và không đảm bảo liều lượng theo yêu cầu dẫn đến tình trạng kháng thuốc
của các loại mầm bệnh ngày một gia tăng. Việc sử dụng các dòng vi khuẩn có
lợi để ức chế hay tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh hiện đang được chú trọng, đặc biệt
là nhóm vi khuẩn lactic (VKL).
VKL là tên gọi của nhóm vi khuẩn sinh ra axit lactic như là sản phẩm chính
trong quá trình chuyển hoá chất bột đường và chúng được xếp vào họ
Lactobacteriaceae (Lê Văn Nhương và csv., 2009). VKL có ứng dụng rộng rãi

trong thực tiễn với axit lactic là nguyên liệu rất cần thiết của nhiều ngành công
nghiệp. Đặc biệt, trong công nghiệp chế biến và bảo quản thực phẩm như sữa
chua, các loại dưa từ rau củ, các loại sản phẩm thủy sản lên men
(Lương Đức Phẩm, 2004). Trong quá trình lên men, VKL sinh ra các axit hữu
cơ, chúng tạo ra môi trường không thích hợp cho sự phát triển của những vi sinh
vật gây bệnh hay gây hư hỏng sản phẩm, tác động lên màng tế bào chất của vi
khuẩn, ảnh hưởng đến chức năng bảo vệ và chức năng dinh dưỡng của màng tế
bào, ức chế quá trình vận chuyển chủ động của màng tế bào. Axit lactic dễ dàng
thấm qua màng tế bào, làm giảm pH nội bào hoặc tự oxi hoá, làm dừng quá
trình trao đổi chất, gây chết những tế bào nhạy cảm với nó (Lê Văn Nhương và
csv., 2009).
Nhằm làm tiền đề cho việc nghiên cứu dòng VKL có khả năng sinh chất kháng
khuẩn tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản hiện nay, đề tài
“Phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn lactic từ các sản phẩm thủy
sản lên men có khả năng kháng khuẩn ” được thực hiện.


11

1.2 Mục tiêu nghiên cứu
Nhằm tìm ra một số dòng VKL có khả năng sinh chất kháng khuẩn từ
các sản phẩm thủy sản lên men.
1.3 Nội dung nghiên cứu
• Phân lập một số dòng VKL trong các sản phẩm mắm và nước mắm.
• Kiểm tra khả năng sinh chất kháng khuẩn từ các nhóm VKL phân lập
được.

12

CHƯƠNG 2
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Một số quy trình lên men thủy sản
Mắm là sản phẩm đặc trưng của các tỉnh Nam Bộ, tùy vào điều kiện tự nhiên
đặc trưng của mỗi vùng mà các sản phẩm mắm cũng đa dạng không kém. Ở các
tỉnh đầu nguồn như An Giang, Đồng Tháp nổi tiếng với các sản phẩm mắm cá
nước ngọt như mắm cá Lóc, mắm cá Trèn, mắm cá Rô…. Có nhiều cơ sở mắm
đã đăng kí bảng quyền thương hiệu và được xuất khẩu như Mắm bà giáo Khỏe,
Mắm cô Tư Ấu. Về các tỉnh ven biển Bạc Liêu, Cà Mau cũng vang danh với các

loại mắm cá đặc trưng của vùng nước lợ mặn như: mắm cá Phi, mắm cá biển,
mắm Ba khía, mắm Tép…. Mắm prohoc một sản phẩm mắm quen thuộc của
người dân Khmer hay mắm Tôm chà đặc sản của vùng Gò Công, Tiền Giang.
Phần lớn các sản phẩm mắm đều sản xuất theo phương pháp lên men truyền
thống.
Quy trình sản xuất của một số sản phẩm mắm
Quy trình làm mắm cá có 4 công đoạn: làm cá, muối cá, thính cá, chao mắm.















Hình 2.1: Quy trình s
ản xuất mắm cá
(Nguồn: Nguyễn Văn Mười, 2009)

Cá làm sạch bỏ ruột, mang, vẩy
Vớt cá ra để ráo và rãi thính vào
lưng, vào bụng
Ướp muối vào bụng, vào lưng

(
1 kg mu
ối cho 5 kg cá
)

Chao mắm với cơm rượu trộn
chung với đường chảy nấu lỏng
Cho vào mái đầm đậy kín
(1 tháng)
Cho vào mái đầm đậy kín
(
2 tháng
)

Mắm thành phẩm
Cho vào mái đầm đậy kín
(
2 tháng
)

13

Quy trình làm mắm tép

Hình 2.2: Quy trình sản xuất mắm tép
(Nguồn: Nguyễn Văn Mười, 2009)









Tép sống làm sạch,
rửa nước muối
Trộn đều với rượu
(khoảng 30 phút)
Ướp gia vị: tỏi, riềng, ớt,
đường, nước mắn
Cho vào lọ thủy tinh, đậy lá
ổi,lá chùm ruột để lên trên
và gài chặc lại
Tép dậy nước là dùng được

Phơi nắng 2 ngày
14

Quy trình làm mắm tôm










Hình 2.3: Quy trình sản xuất mắm tôm
(Nguồn: Nguyễn Văn Mười, 2009)
Các công đoạn làm mắm ruốc









Hình 2.4: Quy trình sản xuất mắm ruốc
(Nguồn: Nguyễn Văn Mười, 2009)

Ruốc tươi đem xào sơ với một

ít muối hạt
Phơi nắng
Để vài giờ cho ngấm muối
Cho vào cối quết thật nhuyễn
với muối trắng mịn theo công
thức 3 ruốc: 1 muối
Khoảng 1 giờ
Mắm lên men chua, chuyển
sang màu đỏ tươi và dậy mùi
thơm là dùng được
Tép tươi sống đem say
hoặc chà nát
Cho vào dụng cụ chứa, phơi nắng,
khuấy đều
Trộn muối vừa đủ sao cho enzyme
trong ruột tép hoạt động được
Mắm tôm có màu và hương vị đặc
trưng
6 – 12 tháng
15

Trong các sản phẩm lên men thủy sản, nước mắm là loại sản phẩm được nhắc
đến nhiều nhất. Nước mắm được sản xuất hầu hết các nước Châu Á tuy nhiên
mỗi quốc gia có phương pháp lên men truyền thống khác nhau, tạo sản phẩm có
giá trị dinh dưỡng và giá trị cảm quan khác nhau. Về cơ bản, nước mắm là dung
dịch đạm (chủ yếu là các axit amin) được tạo thành do quá trình thủy phân
protein nhờ các hệ enzyme protase có trong cá.
Quy trình sản xuất nước mắm truyền thống

Hình 2.5: Quy trình sản xuất nước mắm
(Nguồn: Nguyễn Văn Mười, 2009)


Cá
Lựa chọn
Xử lý
Trộn muối
Lên men
Làm nguội
Chiết rút
Nước mắm
thành phẩm
Bã
Phụ gia

16

2.2 Vi khuẩn lactic
Lên men lactic là quá trình thu nhận năng lượng nhờ VKL, bao gồm sự biến đổi
một phân tử đường thành 2 phân tử axit lactic và năng lượng tách ra
(Lương Đức Phẩm và csv, 2009):
C
6
H
12
O
6
= 2CH
3
CHONCOOH + 0,075x10
6
J .
VKL được xếp chung vào họ Lactobacteriaceae. Các sản phẩm lên men axit
lactic truyền thống đã được sử dụng lâu đời như lên men rau hoa quả, lên men
thịt, lên men cá. Nhưng mãi đến năm 1878, Lister mới phân lập được VKL, ông
gọi vi khuẩn này là Bacterium lactic (hiện nay gọi là Trestococcus lactic).
Từ đó đến nay, nhiều loại VKL được phát hiện và ứng dụng có ích của chúng
ngày càng đựợc mở rộng ra nhiều lĩnh vực, đặc biệt là thực phẩm và thực phẩm
chức năng. Công nghiệp lên men để sản xuất axit lactic có thể nói được hình
thành từ năm 1881 (Nguyễn Lân Dũng và csv, 1997).
Những loài vi khuẩn lactic khác nhau có sự thích nghi để phát triển rộng rãi
trong điều kiện môi trường khác nhau, và chúng được phổ biến rộng rãi trong tự
nhiên. Vi khuẩn lactic thường được tìm thấy ở đường tiêu hóa (dạ dày và ruột
non) của các loài động vật khác nhau (chuột, lợn, gia cầm và con người)
(Tannock, 1988 được trích dẫn bởi Einar Ringø et al., 1997). Trong sữa và các

sản phẩm từ sữa (Sharp, 1981 được trích dẫn bởi Einar Ringø et al., 1997), các
sản phẩm thủy sản (Mauguin và Novel, 1994 được trích dẫn bởi Einar Ringo et
al., 1997), và trên một số bề mặt hệ thực vật (Keddie, 1959 được trích dẫn bởi
Einar Ringø et al., 1997). Chúng thường được dùng trong sản xuất và bảo tồn
các sản phẩm thực phẩm như pho mát, thịt, sữa chua (McKay và Baldwin, 1990
được trích dẫn bởi Einar Ringo et al., 1997). Một vài VKL được tìm thấy trong
các sản phẩm thủy sản lên men của Hàn Quốc (Lee, 1993 được trích dẫn bởi
Gyu Sung Cho và Hyung Ki Do, 2006). Ngoài đặc tính lên men axit lactic, VKL
còn giúp chuyển hoá thức ăn trong cơ thể, hạn chế sự phát triển của vi sinh vật
gây bệnh (tạo ra axit formic, axit bezoic, H
2
O
2
, chất kháng khuẩn ), giúp phòng
một số bệnh (cao huyết áp) (Lê Văn Nhương và csv, 2009).
2.2.1 Đặc điểm của vi khuẩn lên men lactic
Vi khuẩn lên men axit lactic có hai dạng hình chính là hình cầu và hình que.
Tuy nhiên, khi nuôi cấy trong điều kiện môi trường hay các điều kiện ngoại
cảnh khác nhau thì có hình dạng khác nhau nhưng chúng đều có một số đặc
điểm sau: chúng là những vi khuẩn Gram dương, không có khả năng sinh bào
tử, catalase âm tính, oxydase âm tính, khử natri âm tính và hầu hết đều không
chuyển động, chúng không có khả năng tổng hợp nhân hem của các
polyphyrine, chúng không có chứa xitocrom. Chúng có thể sinh trưởng được khi
17

có mặt oxy, là loại cơ thể duy nhất có khả năng lên men hiếu khí cũng như yếm
khí (Lê Văn Nhương và csv , 2009).
Theo hình dáng tế bào và cách sắp xếp tế bào trong môi trường người ta thường
chia VKL thành 4 giống (4 chi): Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus và
Leuconotoc. Các chủng thuộc 4 chi này có thể lên men đồng hình hay dị hình.

Các chủng lên men đồng hình thường được sử dụng để bảo quản thực phẩm,
ướp chua cá thịt, trong sản xuất axit lactic (Lương Đức Phẩm, 2004).
2.2.2 Cơ chế của quá trình lên men lactic
Trong quá trình lên men axit lactic, cơ chất đầu tiên tham gia vào quá trình lên
men là đường glucose hoặc fructose. Khi sử dụng nguồn nguyên liệu là các
đường đôi hay các chất chứa gốc đường thì trước khi tham gia vào quá trình lên
men chúng phải được thủy phân thành glucose hay fructose nhờ các enzyme
tương ứng. Lên men axit lactic là quá trình chuyển hoá yếm khí đường thành
axit lactic (Lê Văn Nhương và csv, 2009).
Có 2 kiểu len men lactic. Trong lên men lactic đồng hình thực tế chỉ xuất hiện
axit lactic, còn trong lên men dị hình các sản phẩm cuối cùng khá đa dạng: axit
lactic, etanol, axit acetic và CO
2
. Chỉ có lên men lactic đồng hình là có ý nghĩa
về mặc công nghiệp (Nguyễn Lân Dũng và csv, 1997).
2.3 Mối quan hệ giữa axit lactic với cá và các sản phẩm từ cá
VKL không được coi là thuộc về môi trường thủy sản, nhưng có một số loài vi
khuẩn như: Carnobacterium, Vagococcus, Lactobacillus, Enterococcus,
Lactococcus đã được tìm thấy trong các loài cá nước ngọt và môi trường nước
nuôi (Austin, 1992 được trích dẫn bởi Ringø et al., 2000). Carnobacteria,
Carnobacteria piscicola chiếm phần lớn và thấp nhất là Carnobacteria
divergens, đã có những ghi nhận về các giống vi khuẩn này như một phần của
hệ vi sinh đường ruột của nhiều loài cá. Mặt khác, Carnobacteria piscicola
(Baya et al., 1991 được trích dẫn bởi Einar Ringø et al., 1997) và
Lactobacillus sp. có mối quan hệ với cá bệnh (Cone, 1982 được trích dẫn bởi
Einar Ringø et al., 1997). Tuy nhiên, sự quan trọng của Carnobacteria như là
một tác nhân gây bệnh cá nhưng không thể đánh giá chính xác (Schillinger và
Holzapfel, 1995 được trích dẫn bởi Ulrike Lyhs, 2002).
Một vài nghiên cứu liên quan đến sản phẩm cá được đóng gói và hút chân đã
được thực hiện tập trung vào ảnh hưởng của chế biến và trên các vi sinh vật chất

lượng. Sau khi kết thúc quá trình giữ lạnh ở nhiệt độ khác nhau, VKL qua quá
trình kiểm tra có từ 10
6
– 10
8
CFU/g (Schulze, 1985 được trích dẫn bởi Zorn
et al., 1993). Trong nghiên cứu của Zorn et al. (1993) mật số vi khuẩn
18

Carnobacteria vượt trội trong sản phẩm cá Hồi đóng gói hút chân không được
bảo quản ở nhiệt độ 8
o
C và 20
o
C. Một số nghiên cứu trước kia trên sản phẩm
cá được hút chân không giữ lạnh. Sau khi kết thúc giai đoạn giữ lạnh sự biến đổi
của hệ sinh vật tỷ lệ với vi khuẩn lactic, Enterobacteriaceae và một số vi khuẩn
khác đã được quan sát thấy trong sản phẩm được lưu trữ ở nhiệt độ ướp lạnh.
Mật số VKL từ 10
6
– 10
8
CFU/g (Joffraud et al., 2001 được trích dẫn bởi Ulrike
Lyhs, 2002). Trong một vài trường hợp, số lượng vi khuẩn lactic 10
6
– 10
7


CFU/g cùng với mật số vi khuẩn Gram âm từ 10

5
– 10
7
CFU/g (Paludan-Müller
et al., 1998 được trích dẫn bởi Ulrike Lyhs, 2002).
Theo Leroi et al., (2001) (được trích dẫn bởi Ulrike Lyhs, 2002) phân biệt tại
thời điểm hỏng cho cùng một loại sản phẩm cá có ba loại vi khuẩn khác nhau:
lactobacilli, một hỗn hợp của lactobacilli và Enterobacteriaceae hoặc một hỗn
hợp của VKL và Brochothrix thermospacta. VKL trong sản phẩm giữ lạnh hút
chân không bị hư hỏng được tìm thấy các giống vi khuẩn Lactobacillus,
Leuconostoc, Lactococcus và Carnobacterium. Theo Magnusson và
Traustadottir (1982) cho rằng chỉ có vi khuẩn Lactobacilli homofermentative
trong chân không đóng gói lạnh cá trích hun khói (được trích dẫn bởi Ulrike
Lyhs, 2002).
2.4 Chất kháng khuẩn (CKK)
Trong các sản phẩm chuyển hoá có khả năng ức chế vi sinh vật của VKL thì
chất kháng khuẩn được các nhà khoa học và nhà công nghiệp thực phẩm đặc
biệt chú ý. CKK của VKL bắt đầu được nghiên cứu từ những năm 1940. Từ đó
đến nay đã có rất nhiều CKK khác nhau được phát hiện (Lê Văn Nhương và
csv, 2009). Nisin là CKK được nghiên cứu và ứng dụng nhiều nhất, được sử
dụng trên 40 nước khác nhau (Delves – Brought,J,1990 được trích dẫn bởi
Adisorn Swetwiwathora et al., 2009). Theo tài liệu gần đây nhất thì CKK được
định nghĩa như sau: “CKK là các polypeptit có tính kháng khuẩn, được sản sinh
trên các riboxom hoặc các protein có khả năng kháng khuẩn chống lại một phổ
hẹp các loài vi khuẩn họ hàng gần gũi” (Lê Văn Nhương và csv, 2009). Người
ta đã chứng minh chắc chắn rằng nhiều loại VKL sản sinh ra CKK (Cleveland
et al., 2001; O
’
Sullivan et al., 2002 được trích dẫn bởi Pongtep Wilaipun et al.,
2002)

19

Hiện nay, CKK được chia thành 4 nhóm
Nhóm I: là nhóm lantibiotic, là loại polypeptit có khối lượng phân tử nhỏ
(< 5 KDa), chứa amino acid lanthionine, β – methyllanthionine.
Nhóm II: gồm các CKK không phải là lantibiotic, khối lượng phân tử nhỏ
(< 10 KDa). Cấu trúc gấp nếp β, bền nhiệt, có thể chịu được nhiệt độ khoảng
100 – 121
o
C.
Nhóm III: các CKK có khối lượng phân tử lớn (>30 KDa), khả năng bền nhiệt
cao.
Nhóm IV: Đây là nhóm CKK phức tạp. Trong cấu trúc phân tử ngoài protein,
chúng còn chứa các thành phần khác là lipid, carbohydrat. Tiêu biểu của nhóm
này là: plataricin S, leconocin S, lactocin 27 và pediocin SJ – 1.
Trong đó, nhóm I và II được nghiên cứu nhiều nhất và chúng cũng đa dạng
nhất.
Bảng 2.1: Các đặc tính CKK của VKL
Chất kháng
khuẩn
Tên
vi khuẩn
sản xuất
Phổ ức chế pH
hoạt
động

Khối
lượng
phân
tử
(Da)
Enzyme
bất hoạt
1. Lantibiotic
Nisin A Lactococcus
lactic subsp lactic
ATCC 11454
Vi khuẩn
Gram (+)
2 – 7 3353 α
chymotr
ypsin,
nisinase
Nisin Z Lactococcus
lactic subsp lactic
NIZO 22186
Vi khuẩn
Gram (+)

Lacticin 481 Lactococcus
lactic subsp lactic
CNRZ 481
LAB,Clostridiu
m
tyrobutyricum
2 – 8

2901 α
chymotr
ypsin,
ficin,
proteina
se K
Lactocein S Lactobacillus
sake 145
Staphycoccus
carnosus
Carnobacteria,
lactobacilli
Pediococcus,
lactococci
<5,5 3778 Trysin,
protease
loại XIV


20

2. Nhóm II
Lactococcin
A
Lactococcus lactic
subsp cremoris
LMG 2130
Lactococci 5778 Trypsin,
endo –

proteina
se, glu –
C
Lactacin Lactobacillus
acidophilus N2
lactobacilli 5 6500 Proteina
se K
Lactacin F Lactobacillus
acidophilus 11088
Lactobacilli,
Enterococeus,
Faecalis
6300 Trypsin,
ficin,
proteina
se K
Diplococci Lactococcus lactic
subsp cremoris 346
Lactococci 5 – 11 5300 proteina
se K,
α
chymotr
ypsin,
trypsin
Sakacin A Lactobacillus sake
LD 706
Lactobacilli,
Carnobacteria,
Enterococci
2 – 9 6000 Trypsin,

pepsin,
proteina
se K,
α
chymotr
ypsin
Curvacin A Lactobacillus
curvatus LTH
1174
Lactobacilli,
Carnobacteria
5000 proteina
se K,
trypsin
3.Nhóm III
Helveticin J Lactobacillus
Helveticus 481
Lactobacilli 37511 Trypsin,
pepsin,
pronase,
proteina
se K
Caseicin 80 Lactobacillus 109 Lactobacillusca
sei 109
3 – 9 4000 α
chymotr
ypsin,
trypsin,
pepsin,
proteinas

e

(Nguồn: De Vuyst và Vandamme, 1993)

21

Cơ chế tác dụng của CKK của VKL
CKK của VKL dù thuộc nhóm này hay nhóm khác nhưng chúng đều có một cơ
chế tác dụng chung. Đó là chúng tấn công màng tế bào nhạy cảm, gây tổn
thương màng không thể khắc phục được, tế này sẽ chết do nội chất thoát ra
ngoài. Sỡ dĩ CKK có thể tấn công vì chúng có dạng hoà tan, dễ dàng xâm nhập
vào tế bào, làm mất lực đẩy proton (PMF), làm giảm thế năng của màng nguyên
sinh chất và thay đổi pH nội bào, từ đó tế bào không thể tổng hợp được màng tế
bào và tế bào bị chết (Lê Văn Nhương và csv , 2009).
2.5 Dòng chỉ thị Pediococcus pentosakeus
Phân loại Pediococcus (Claussen 1903)
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Lactobacillales
Họ: Lactobacillaceae
Giống: Pediococcus
Loài: Pediococcus pentosakeus
Nhóm Pediococcus dạng hình cầu, có thể đứng riêng lẻ, kết đôi hay kết chuỗi
hoặc tạo đám tỷ cầu hay bát cầu khuẩn. Hình dạng, kích thước và sự sắp xếp của
tế bào cũng có thể thay đổi phụ thuộc vào thành phần của môi trường, điều kiện
ngoại cảnh khi nuôi cấy tế bào (Lê Văn Nhương và csv, 2009).

Hình 2.6: Pediococcus
Pediococcus có hoạt tính thủy phân protein rất yếu, Gram dương, quá trình trao
đổi chất của nó là quá trình lên men đồng hình. Chúng là những vi khuẩn yếm
khí tùy tiện, có thể phát triển trên môi trường rắn với sự có mặt của không khí.
Chủng này yêu cầu rất cao về thành phần dinh dưỡng từ môi trường. Vì chúng
22

không có khả năng sinh tổng hợp các chất cần thiết cho sự phát triển của cơ thể.
Các loài Pediococcus khác nhau về tính chịu nhiệt, chịu axit và chịu NaCl.
2.6 Những nghiên cứu trong và ngoài nước
2.6.1 Những nghiên cứu trong nước
Hiện nay, ở nước ta việc nghiên cứu về CKK do VKL sinh tổng hợp nên đã và
đang được nhiều nhà khoa học quan tâm. Tuy nhiên, các nghiên cứu về ứng
dụng của CKK còn ít và chưa thu được những kết quả khả quan. Một số nghiên
cứu tiêu biểu về VKL và CKK
• Tuyển chọn định hướng VKL sinh CKK từ một số thực phẩm giàu
protein lên men lactic ở Việt Nam (Mai Thị Hằng và csv, 2000).
• Phân lập và tuyển chọn một số chủng VKL sinh chất diệt khuẩn sinh học
CKK (Nguyễn Thị Hương Trà và csv, 2001).
• Tối ưu hoá quá trình lên men Entecocin của chủng vi khuẩn enterococus
sp. Tn43 phân lập từ nem chua. Phần I-Nghiên cứu ảnh hưởng của một
số yếu tố tới khả năng sinh bacteriocin của chủng VKL Enterococus sp.
Tn43. 34 (Lê Thanh Mai và csv, 2001).
• Nghiên cứu công nghệ sản xuất CKK từ chủng VKL ST20 (Nguyễn Thị
Hương Trà và csv, 2002).
• Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp CKK của loài Lactobacillus
plantarum L24. (Nguyễn Thị Hoài Hà và csv, 2005). Trung tâm Công

nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội.
• Một số đặc tính của CKK sản xuất bởi vi khuẩn Lactobacillus
acidophilus. Lê Thị Hồng Tuyết và Hoàng Quốc Khánh. Viện Sinh học
Nhiệt Ðới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Ngoài ra còn rất nhiều các nghiên cứu ứng dụng của VKL vào các sản phẩm
thực phẩm làm cho thực phẩm có tính ổn định và về mặt cảm quan, có nhiều ưu
việt hơn là sản phẩm thực phẩm lên men lactic tự nhiên. Có được ưu điểm này
là do ngoài những tính chất ưu việt VKL còn có khả năng sinh tổng hợp CKK,
một chất bảo quản thực phẩm.




23

2.6.2 Những nghiên cứu ngoài nước
Hiện nay việc nghiên cứu, ứng dụng CKK do VKL sinh tổng hợp nên đang là
một hướng nghiên cứu được nhiều nhà khoa học quan tâm. Cũng đã có những
công trình nghiên cứu và ứng dụng thành công, góp phần vào việc nâng cao chất
lượng cuộc sống của nhân loại. CKK là một chất có khả năng ức chế một số vi
khuẩn gây bệnh, nhờ khả năng này mà việc ứng dụng của VKL được đa dạng và
phong phú hơn. CKK đã được các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu từ rất
lâu và đạt nhiều thành tựu.
• Theo Kekessy et al., (1970) đã nghiên cứu một phương pháp mới trong
việc phát hiện CKK. Chủng vi sinh vật đối kháng được nuôi ủ trên đĩa
môi trường thạch dinh dưỡng, sau đó tạo giếng có đường kính 0.5 mm
bằng cách đục bỏ agar trên đĩa. Cho một lượng vi khuẩn có khả năng
sinh tổng hợp CKK vào giếng, sau thời gian nuôi ủ vòng kháng khuẩn sẽ
xuất hiện, thể hiển bởi một vòng sáng rõ quanh giếng.
• Năm 1976 tại Minnesota, Tagg et al., đã nghiên cứu về những loại CKK

của vi khuẩn gram dương và cho ra nhiều kết quả có giá trị. Nghiên cứu
đã cho biết được tính đối kháng của CKK, cách đặt tên và phân loại
CKK, chiết tách và tinh sạch CKK, phân tích hoạt tính CKK, các loại
hoạt động của CKK và ứng dụng của CKK.
• Năm 1992 tại Laramie, Yang et al., đã nghiên cứu một phương pháp mới
để chiết tách một lượng lớn CKK từ VKL. Phương pháp này dùng môi
trường pediocin AcH, nisin, sakacin A, leuconocin Lcm1 làm tăng hiệu
quả chiết tách và thu được một lượng CKK nhiều hơn quá trình phân lập.
• Năm 1999 tại Bỉ, Raf Callewaert và Luc De Vuyst đã nghiên cứu việc
sinh tổng hợp CKK của Lactobacillus amylovorus DCE 471 và có ứng
dụng cải tiến và làm ổn định các sản phẩm lên men. Việc sinh tổng hợp
thu nhận CKK bị ức chế bởi nồng độ của nguồn nitrogen.
• Năm 1999 tại Pakistan, Khalid et al., đã nghiên cứu tìm ra một loại CKK
mới có tên lactocin LC-09. Lactocin LC-09 được phân lập từ chủng vi
khuẩn lactobacillus có trong một mẫu bệnh.
• Năm 2002 Soore và ctv đã nghiên cứu việc tạo ra một chất kháng đặc
biệt của VKL gọi là CKK. CKK được sử dụng như một chất bảo quản
thực phẩm tự nhiên có khả năng thay thế các loại hoá chất bảo quản
khác. CKK có bản chất là protein nên rất an toàn đối với sức khoẻ con
người.
24

• Năm 2002 tại Thái Lan, Pongtep Wilaipun et al. đã tìm thấy khă năng
sinh CKK của Enterococcus faecium được phân lập từ các sản phẩm thủy
sản lên men của Thái.
• Năm 2004, Todorov, S.D., Van Reenen, C.A. và Dicks K.M. (Nam Phi)
đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp CKK của chủng Lactobacillus
plantarum ST13BR , một chủng được phân lập từ bia Barley.
• Năm 2006, 50 chủng VKL được tìm thấy từ sản phẩm lên men truyền
thống suan-tsai của Đài Loan. Với các chủng sau khi phân lập tiếp tục

nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá và khả năng sinh
tổng hợp CKK.
• Năm 2006, Stefan Marcinowski cho biết kẹo cao su có chứa các chủng vi
khuẩn có lợi lactobacillus do công ty hoá chất BASF của Đức phát triển.
Đây là sản phẩm giúp người dùng loại trừ các bệnh về răng miệng.
• Tháng 3/2007, Todorov, S.D. và Leon M.T. Dicks K.M. (Nam Phi) đã
nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp CKK của chủng Lactobacillus
pentosus ST712BZ được phân lập từ boza.
• Các nhà nghiên cứu CSIRO để tìm ra một vài CKK và sử dụng chúng để
tiêu diệt những con vi khuẩn gây bệnh trên gà và lợn.
• Bộ gen cho phân tử CKK sẽ được chèn vào gen vi khuẩn không gây bệnh
hoặc vi rút mà có thể sinh sản và tiết ra CKK. Lợi ích chính của việc sử
dụng CKK là nó sẽ giảm mầm bệnh nguy hiểm của con người chống cự
lại thuốc kháng sinh.









25

CHƯƠNG 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện
3.1.1 Địa điểm
Phòng thí nghiệm – Khoa Sinh Học Ứng Dụng - Trường Đại Học Tây Đô.

3.1.2 Thời gian thực hiện
Từ tháng 3 năm 2011 đến tháng 5 năm 2011.
3.2 Vật liệu nghiên cứu
Dụng cụ thí nghiệm cố định
 Tủ cấy vi sinh CEMACO.
 Tủ ấm vi sinh Memmert.
 Tủ lạnh SanYo.
 Tủ sấy Memmert.
 Nồi Autolave STURDY – SA 300 VF.
 Máy khuấy từ Yellowline.
 Cân 2 số lẻ Sartorius.
 Tủ hút.
Dụng cụ thí nghiệm không cố định
 Máy Vortex.
 Ống nghiệm có nắp, giá để ống nghiệm.
 Đĩa petri, cốc 100 ml.
 Micropipet BIOHIT 20 – 200 µl , 100 – 1.000 µl , 1.000 – 5.000 µl;
 Đầu típ 200 µl, 1.000 µl, 5.000 µl.
 Đèn cồn, hột quẹt.
 Đũa tán thủy tinh đầu tam giác, que cấy đầu nhọn, que cấy đầu tròn.
 Cây nhíp, dao mổ nhỏ, kéo.
 Bao hấp, giấy bạc gói, thun, parafilm, bọc, băng keo giấy, bông gòn, giấy
thấm.
 Khay nhựa, hộp nhựa nhỏ, thao nhựa, bình tia.
 Ống falcon 2 ml, ống effendoft 1,5 ml.
 Chai thủy tinh nấu môi trường 500 ml, cá từ.
 Găng tay, khẩu trang.