Ngô chuyển gen kháng sâu từ BACILLUS THURINGIENSIS

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC



ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH KHOA CNSH
NGÔ CHUYỂN GEN KHÁNG SÂU TỪ
BACILLUS THURINGIENSIS








GVHD : CÔ LÊ THỊ THỦY TIÊN
SVTH : VŨ NHƢ HƢỜNG
MSSV : 60701044






Tp. HCM, tháng 6 năm 2011.
i

LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình làm đồ án, em đã gặp rất nhiều khó khăn và bỡ ngỡ. Nếu

không có sự giúp đỡ và động viên của thầy cô bạn bè thì em khó có thể hoàn thành
tốt đồ án này.
Đặc biệt em xin cảm ơn cô Lê Thị Thủy Tiên, người trực tiếp hướng dẫn em
thực hiện đồ án này. Qua khoảng thời gian được cô hướng dẫn, em đã học hỏi được
rất nhiều từ cô. Cô dạy cho em tính cẩn thận và sự khoan dung. Cám ơn cô rất nhiều
và mong em còn được tiếp tục làm luận văn dưới sự hướng dẫn của cô.
Em cũng xin cảm ơn các thầy cô của trường Đại học Bách Khoa Tp. Hồ Chí
Minh đã cho em một nền tảng kiến thức vững chắc, giúp em có thể bước tiếp trên
con đường học vấn đầy cam go và thử thách này.
Và sau cùng, con xin cảm ơn cha mẹ, những người đã sinh thành và nuôi
dưỡng con nên người. Suốt đời này con luôn nhớ ơn cha mẹ.


TpHCM, tháng 6 năm 2011.


ii

MỤC LỤC

Chƣơng 1 :TỔNG QUAN VỀ BACILLUS THURINGIENSIS 2
I. Giới thiệu chung về Bacillus thuringiensis : 2
1.Tóm tắt về lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của Bacillus thuringiensis. 2
2. Sự phân bố của B.thuringiensis. 2
3. Đặc điểm sinh thái của B.thuringiensis. 3
4. Đặc điểm sinh hoá của B.thuringiensis. 3
5. Phân loại B.thuringiensis. 4
II. Sinh trưởng và phát triển của Bacillus thuringiensis. 8
III. Các loại độc tố của Bacillus thuringiensis. 11
1.Bản chất hóa học của tinh thể : 11

2. Phân loại tinh thể độc: 11
3.Cấu trúc của tinh thể protein. 12
4.Cơ chế tác động của tinh thể độc. 13
IV. Hoạt lực diệt sâu của Bacillus thuringiensis. 14
V. Phân lập chủng Bacillus thuringiensis kurstaki. 15
1. Thu thập mẫu để phân lập các chủng B. thuringiensis. 15
2. Phân lập các chủng B. thuringiensis. 15
3. Thử sinh học hoạt tính diệt sâu. 15
4. Xác định tính chất 10 chủng B. thuringiensis kurstaki phân lập. 16
5. Phát hiện gen cry1Ab, cry1C bằng kỹ thuật PCR. 16
Chƣơng 2 : CÔNG NGHỆ CHUYỂN GEN VÀO THỰC VẬT 17
I. Khái niệm về thực vật chuyển gen 17
II. Tóm tắt lịch sử phát triển của công nghệ chuyển gen thực vật. 17
III. Một số nguyên tắc cơ bản của việc chuyển gen 18
1. Một số nguyên tắc sinh học 18
2. Phản ứng của tế bào với quá trình chuyển gen 19
3. Các bước cơ bản của chuyển gen 19
IV. Các hướng nghiên cứu và một số thành tựu trong lĩnh vực tạo thực vật
chuyển gen 21
1. Cây trồng chuyển gen kháng các nấm gây bệnh 21
2. Cây trồng chuyển gen kháng các vi khuẩn gây bệnh 22
3. Cây trồng chuyển gen kháng virus gây bệnh 22
4. Cây trồng chuyển gen kháng côn trùng phá hoại 22
5. Cây trồng chuyển gen cải tiến các protein hạt 23
iii

6. Cây trồng chuyển gen sản xuất những loại protein mới 23
7. Cây trồng chuyển gen mang tính bất dục đực 24
8. Thực vật biến đổi gen để sản xuất các acid béo thiết yếu 24
9. Phát triển hệ thống marker chọn lọc 24

10. Làm sạch đất ô nhiễm 25
11. Làm thức ăn chăn nuôi 26
Chƣơng 3 : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHA
́
P SỬ DỤNG TRONG CÔNG TÁC
CHUYỂN GEN. 27
I. Vector sử dụng trong công nghệ chuyển gen ở thực vật. 27
1. Vector là gì: 27
2. Các đặc tính của vector: 27
3. Các bước trong tạo dòng phân tử: 27
II. Các vector sử dụng để chuyển gen vào thực vật. 28
1. Các vector biến nạp vào tế bào thực vật sử dụng
Agrobacterium tumefaciens. 28
2. Ti – plasmid. 30
2.1. Cấu tạo Ti-plasmid. 30
2.2. Cơ chế chuyển gen của Ti-plasmid. 31
3. Vector Ti-plasmid cải tiến. 34
3.1. Hệ thống vector đồng liên hợp 34
3.2.Hệ thống vector kép 35
III. Các phương pháp chuyển gen thường sử dụng ở thực vật. 35
1. Chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen. 35
2. Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium. 38
3. Kỹ thuật biến nạp qua protoplast. 40
4. Chuyển gen trực tiếp bằng phương pháp điện di. 41
5. Kỹ thuật chuyển gen qua ống phấn (polen tuber). 42
IV. Các phương pháp xác định sự hiện diện và biểu hiện của gen ngoại lai. 43
1. Southern blot 43
2. Northern blot 44
3. Western blot 45
4. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 46

5. Phương pháp PCR 47
5.1. Thành phần : 47
5.2. Mồi: 48
5.3. Qui trình : 48
iv

6. Hệ thống gen chỉ thị và chọn lọc : 50
V. Phương pháp tái sinh cây . 52
Chƣơng 4 : NGÔ CHUYỂN GEN KHÁNG SÂU ĐỤC THÂN TỪ B.
THURINGIENSIS KURSTAKI. 55
I. Giới thiệu về ngô. 55
1. Đặc điểm chung. 55
2. Phân loại. 55
II. Giới thiệu về ngô chuyển gen. 56
1. Ngô chuyển gen là gì? 56
2. Tại sao phải chuyển gen kháng sâu vào ngô? 56
3. Các bước tạo giống ngô chuyển gen trong phòng thí nghiệm. 57
3.1. Xác định, phân lập và xử lý gen cần chuyển. 57
3.2. Thiết kế plasmid mang gen Bt 60
3.3. Gắn gen cần chuyển vào vector tạo DNA tái tổ hợp. 61
3.4. Nhân dòng DNA tái tổ hợp. 62
3.5. Biến nạp vào tế bào thực vật. 62
3.6. Chọn lọc và tái sinh cây chuyển gen. 63
3.7. Phân tích xác nhận cây chuyển gen và đánh giá mức độ biểu hiện
của gen. 68
3.8. Mô hình trồng trọt, khảo nghiệm và đảm bảo tính an toàn
sinh học. 70
4. Thực trạng sử dụng ngô chuyển gen kháng sâu trên thế giới và trong nước. 71
5. Tính hữu hiệu của cây trồng chuyển gen Bt 72

KẾT LUẬN ……………………………………………………………………….74

TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………………… 75


v

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Phân loại Bt theo gen mã hóa protein tinh thể độc 6
Bảng 1.2. Phân loại Bt theo độc tố diệt sâu 6
Bảng 2.1. Tóm tắt những phát triển quan trọng trong công nghệ
chuyển gen thực vật. 17
Bảng 2.2. Một số loại cây trồng chuyển gen quan trọng hiện nay 26
Bảng 4.1. Sự biểu hiện một số gen độc tố diệt sâu B. thuringiensis
ở cây chuyển gen. 60
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của nồng độ AgNO
3
đến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây của
ngô dòng HR8 64
Bảng 4.3. Ảnh hưởng của thành phần môi trường và AgNO
3
lên khả năng tạo mô sẹo
và tái sinh cây. 66
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của tuổi phôi ( kích thước phôi) lên sự tạo mô sẹo và tái sinh cây
dòng HR8. 67
Bảng 4.5. Trình tự của mồi sử dụng trong phản ứng PCR 69
Bảng 4.6. Các quốc gia đã đưa bông và/hoặc ngô Bt vào canh tác đại trà,
từ 1996 đến 2004. 71

vi

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Một số chế phẩm trừ sâu có mặt trên thị trường từ Trung Quốc, Mỹ,
Việt Nam. 2
Hình 1.2. Hình thái của B.thuringiensis 3
Hình 1.3.Hình dạng và kích thước Bt. 3
Hình 1.4. Chu trình sống của B. thuringiensis . 8
Hình 1.5 : Các giai đoạn của quá trình tạo bào tử. 9
Hình 1.6. Các giai đoạn của quá trình tạo bào tử và tinh thể của
Bacillus thuringiensis. 10
Hình 1.7. Động học quá trình phát triển, tạo bào tử và tinh thể độc. 11
Hình 1.8: Cấu trúc không gian của tinh thể Cry3. 12
Hình 1.9. Minh họa biểu hiện của sâu bệnh dưới tác dụng của tinh thể độc Bacillus
thuringiensis. 13
Hình 1.10. Cơ chế thẩm thấu ion K
+
trên màng biểu mô ruột. 14
Hình 3.1. Bệnh khối u hình chóp ở cây mâm xôi do A.tumefaciens gây ra ………….28
Hình 3.2. Khối u hình chóp ở cành táo 28
Hình 3.3. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. 28
Hình 3.4. Phản ứng tạo nopalin và octopine. 29
Hình 3.5. Sơ đồ cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 30
Hình 3.6. Cấu tạo của Ti-plasmid. 31
Hình 3.7. Quá trình tạo phức hợp T-DNA- protein. 32
Hình 3.8. Minh họa cơ chế hoạt động của Ti-plasmid. 33
Hình 3.10. Minh họa phương pháp dùng súng bắn gen. 36
Hình 3.11. Sơ đồ chuyển gen bằng súng bằng gen. 37

Hình 3.12. Sơ đồ chuyển gen bằng Agrobacterium tumefaciens. 39
Hình 3.13. Quy trình chuyển gen vào thực vật bằng kỹ thuật đĩa lá nhờ vi khuẩn
A.tumefaciens . 40
Hình 3.14. Cách tiến hành phương pháp Southern blot. 43
Hình 3.15. Phóng xạ tự ghi kết quả lai Southern Blot. 44
Hình 3.16. Cách tiến hành phương pháp Northern Blot. 45
Hình 3.17. Lai và phát hiện. 46
Hình 3.18. Phương pháp PCR 48
Hình 3.19. Xác nhận thay đổi gen ở ngô biến đổi gen. 49
Hình 3.20. Công thức cấu tạo của Kanamycin 50
Hình 3.21. Xác nhận sự biểu hiện gen chỉ thị. 52
Hình 3.22. Bước tái sinh cây hoàn chỉnh 53
vii

Hình 4.1. Vector nhân dòng đồng cài nhập mang gen độc tố diệt sâu B.
thuringiensis. 61
Hình 4.2. Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của nồng độ AgNO
3
đến khả năng tạo mô sẹo
và tái sinh cây của ngô dòng HR8. 65
Hình 4.3. Hình dạng của phôi và mô sẹo của ngô trong quá trình nuôi cấy. 68
Hình 4.4 : Xác nhận thay đổi gen ở ngô biến đổi gen. 69
Ngô chuyển gen kháng sâu từ Bacillus thuringiensis.

GVHD : Cô Lê Thị Thủy Tiên. 1

MỞ ĐẦU
Trong tất cả các lớp vi sinh vật, côn trùng có số lượng loài nhiều nhất. Côn
trùng ảnh hưởng xấu đến con người theo nhiều cách khác nhau : phá hoại mùa màng
và là vector truyền bệnh cho người và động vật. Vào những năm 1940, nhiều loại

thuốc trừ sâu hóa học được phát triển nhằm kiểm soát sự tăng sinh của quần thể côn
trùng có hại. Nhưng sau đó, các nhà khoa học đã nhận thấy những tác động tiêu cực
của thuốc trừ sâu hóa học như : ảnh hưởng lâu dài đến động vật, hệ sinh thái và con
người. Thuốc trừ sâu hóa học như DDT bền vững trong môi trường hơn 20 năm và
tích tụ với hàm lượng ngày càng tăng qua chuỗi thức ăn gây hậu quả lâu dài và nặng
nề cho con người và động thực vật. Thêm vào đó, quần thể sâu hại ngày càng kháng
nhiều thuốc trừ sâu hóa học. Thuốc trừ sâu hóa học thiếu tính đặc hiệu và tiêu diệt
cả thiên địch của các loài sâu hại dẫn đến kết quả là xử lý sâu bệnh càng làm số
lượng côn trùng tăng lên. Sau khi xem xét mọi ảnh hưởng tiêu cực của thuốc trừ sâu
hóa học, thuốc trừ sâu vi sinh có hoạt tính trừ sâu của vi khuẩn Bacillus
thuringiensis được chọn là phương án thay thế vì nó không tồn tại bền vững trong
môi trường và an toàn đối với vật nuôi và con người. Nhưng nhược điểm của thuốc
trừ sâu vi sinh là công hiệu thấp, giá thành cao làm hạn chế việc sử dụng. Vả lại,
một số sâu gây hại lại ăn các mô ở trong cây do đó tránh được ảnh hưởng của chế
phẩm B. thuringiensis phun bên ngoài cây. Để khắc phục vấn đề này, các gen độc tố
Bacillus thuringiensis có thể được biểu hiện trong cây bằng phương pháp chuyển
gen độc tố từ B. thuringiensis vào thực vật thông qua plasmid Ti của vi khuẩn A.
tumefaciens hoặc dùng súng bắn gen . Với các cây chuyển gen này, không cần phun
độc tố diệt sâu. Điều này hạn chế sự phát tán độc tố vào môi trường, giảm chi phí sử
dụng thuốc trừ sâu… Ngô hay bắp ( Zea mays.) là một trong những cây trồng quan
trọng trên thế giới và cả Việt Nam, được dùng làm lương thực hay ứng dụng rất
nhiều trong công nghiệp để làm bánh kẹo, syrup đường nghịch đảo, tinh bột biến
hình… Chính vì điều đó cho nên năng suất thu hoạch ngô là điều cần cải thiện. Một
trong những biện pháp đó là tăng khả năng chống chịu sâu bệnh của cây ngô nhằm
tăng năng suất thu hoạch. Điều đó không những giúp tiết kiệm được chi phí sử dụng
thuốc trừ sâu mà còn góp phần hạn chế những tác động xấu đến môi trường xung
quanh.

Ngô chuyển gen kháng sâu từ Bacillus thuringiensis.

GVHD : Cô Lê Thị Thủy Tiên. 2

Chƣơng 1 :TỔNG QUAN VỀ BACILLUS THURINGIENSIS
I. Giới thiệu chung về Bacillus thuringiensis :
1.Tóm tắt về lịch sử nghiên cứu và ứng dụng của Bacillus thuringiensis.
Lần đầu tiên vào năm 1870, nhà bác học Pasteur người Pháp đã phát hiện
một loài vi khuẩn gây bệnh cho con tằm và đặt tên là Bacillus bombycis.
Sau đó vào năm 1911, nhà côn trùng học người Đức là Berline đã phát hiện
loài vi khuẩn này trên loài sâu xám ở Thuringia vùng Địa Trung Hải và đặt tên là
Bacillus thuringiensis (viết tắt là Bt.).
Sau đó đến khoảng giữa thế kỷ 20, người ta đã phát hiện nhiều chủng Bt. ký
sinh trên nhiều loài sâu khác nhau như sâu xanh, sâu keo, sâu róm thông.
Từ đó vi khuẩn Bt. đã được chế tạo thành thuốc trừ sâu sử dụng trong nông
nghiệp ở nhiều nước, mở đầu cho công nghệ thuốc trừ sâu sinh học. Chế phẩm Bt.
đã được nghiên cứu từ năm 1971 và hiện đang được ứng dụng rộng rãi ở nhiều nước
thay thế một phần thuốc trừ sâu hóa học để diệt côn trùng.
Với những thành tựu của di truyền học và công nghệ sinh học, người ta đã
phát hiện nhiều chủng Bt. có khả năng ký sinh mạnh, sản xuất ra những chế phẩm
có hàm lượng độc tố và tính ổn định cao để tăng hiệu lực diệt sâu và mở rộng phổ
tác dụng trên nhiều loài sâu hại thuộc nhiều bộ côn trùng ở nhiều vùng khí hậu khác
nhau. Đã xác định có tới trên 150 loài sâu hại bị nhiễm các chủng Bt., trong đó bao
gồm hầu như toàn bộ các loài sâu hại có ở Việt Nam.
Hiện nay thuốc trừ sâu từ vi khuẩn Bt. đã chiếm phần lớn thị trường thuốc trừ
sâu sinh học trên thế giới cũng như ở nước ta. Ngoài việc dùng làm thuốc trừ sâu,
hiện nay người ta đã tách một số gen từ vi khuẩn Bt. ghép vào hệ thống gen của cây
để tạo ra các giống cây kháng sâu như giống bông kháng sâu xanh, giống lúa kháng
sâu đục thân, sâu cuốn lá, giống ngô kháng sâu…
Gần đây, một nhóm các nhà khoa học tại Viện Pasteur TPHCM vừa nghiên cứu
thành công chế phẩm vi sinh từ chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis subsp.
israelensis serotype H14 diệt lăng quăng.

Hình 1.1. Một số chế phẩm trừ sâu có mặt trên thị trường từ Trung Quốc, Mỹ, Việt
Nam.
2. Sự phân bố của B.thuringiensis.
Ngô chuyển gen kháng sâu từ Bacillus thuringiensis.

GVHD : Cô Lê Thị Thủy Tiên. 3

Phổ biến trong tự nhiên, cư trú trong đất, trên bề mặt cây và trên xác sâu.Tần
suất B. thuringiensis phân bố cao nhất từ nguồn đất là 35%, trên mùn thóc là 30%
và thấp nhất ở trên lá cây là 16%.
3. Đặc điểm sinh thái của B.thuringiensis.
Từ Bacillus nhằm miêu tả hình dáng của một nhóm vi khuẩn khi được quan
sát dưới kính hiển vi. Nó xuất phát từ tiếng Latin có nghĩa là hình que. Do đó, một
số nơi gọi là khuẩn que hoặc trực khuẩn.

Hình 1.2. Hình thái của B.thuringiensis Hình 1.3.Hình dạng và kích thước Bt
1. Tinh thể độc.

Qua kính hiển vi Bacillus thuringiensis đơn lẻ có hình dạng giống những
chiếc que, kích thước 1-1,2 x 3-5 µm , phủ tiêm mao, di chuyển được. Bào tử hình
oval có khuynh hướng phình ra ở một đầu. Thường thì người ta quan sát thấy tập
đoàn của giống sinh vật này rất rộng lớn, có hình dạng bất định và phát triển lan
rộng.

4. Đặc điểm sinh hoá của B. thuringiensis.
Bacillus là vi khuẩn gam dương.
Catalase dương tính.
Sử dụng khí oxy làm chất nhận electron khi trao đổi khí trong quá trình trao đổi
chất. Hiếu khí tùy tiện.

Sinh bào tử, kích thước 1,6 – 2 µm
Tế bào đứng riêng hoặc xếp chuỗi
Nhiệt độ sinh trưởng 15º-45ºC
Tạo ra tinh thể protein trong giai đoạn tạo bào tử, kích thước 0,6 – 2 µm .Tinh thể
có kích thước 0,6 x 2 µm. Bản chất là protein.
Bào tử: hình trứng dài, kích thước 1,6 x 2 µm. Bào tử có màng mỏng và khó nhuộm
màu.
1
Ngô chuyển gen kháng sâu từ Bacillus thuringiensis.

GVHD : Cô Lê Thị Thủy Tiên. 4

Có một cách dễ dàng để cô lập một loại trực khuẩn nào đó là cho đất tốt vào trong
ống nghiệm cùng với nước, lắc đều, cho vào môi trường muối manitol đã tan, và giữ
ở nhiệt độ trong phòng ít nhất một ngày.
5. Phân loại B. thuringiensis.
Giới: Procaryotae
Ngành: Firmicutes
Họ: Bacillacaeae
Chi: Bacillus
Loài: thuringiensis
Loài phụ…
(Khoá phân loại của Bergey (1984)) [9].
5.1. Phân loại theo typ huyết thanh kháng tiêm mao :
Nguyên lí: Kháng nguyên tiêm mao H kết hợp với kháng thể sẽ xảy ra phản
ứng ngưng kết → tạo cặn lắng trắng dưới đáy ống nghiệm.
Quan sát dưới kính hiển vi thấy tế bào không di chuyển được.
Các bước phân loại :
Chuẩn bị dịch kháng tiêm mao H  tiêm vào thỏ sau đó thu huyết thanh miễn
dịchthử phản ứng ngưng kết.

 Chuẩn bị dịch kháng tiêm mao H
Nuôi cấy VK B. thuringiensis trên môi trường bán lỏng NA: cao thịt 5g, agar
2g, nước cất 1000ml, điều chỉnh tới pH = 7,2. Thời gian nuôi 16 – 18 giờ.
Chuyển sang môi trường NB: nuôi ở chế độ lắc cho tới khi OD
650nm
= 0,8 – 1,0.
Bổ sung 0,5 ml formaldehyde.

 Thu nhận dịch kháng nguyên tiêm mao H
Thu nhận huyết thanh miễn dịch
Tiêm dịch kháng nguyên tiêm mao H:
- Mũi đầu tiên dưới da.
- Các mũi tiếp theo tiêm ven, mỗi tuần 2 lần, liều lượng mỗi lần tăng dần (1ml,
2ml, 3ml), thời gian tiêm 3 tuần
Kiểm tra sự hình thành kháng thể:
- Sau 8 ngày của lần tiêm cuối: lấy 2ml máu từ ven tai thỏ để xác định hiệu giá.
Nếu HG lớn hơn hoặc bằng 25 000 là đạt yêu cầu.
Nếu HG nhỏ hơn 25 000 thì tiếp tục tiêm thêm 2 – 3 lần nữa để nhận hiệu giá
cao hơn.
Ngô chuyển gen kháng sâu từ Bacillus thuringiensis.

GVHD : Cô Lê Thị Thủy Tiên. 5

- Dùng 02 con thỏ cho một kháng nguyên để tránh rủi ro.
- Huyết thanh được tách trong đièu kiện vô trùng và bảo quản ở 4oC hoặc đông
khô.

 Thử phản ứng ngưng kết.
Cho 1,8ml NaCl 1,15M và 200ml dịch huyết thanh miễn dịch tiêm mao vào ống
nghiệm 5ml.

Pha loãng với các nồng độ giảm dần theo hệ số 2: 1:10; 1:20; 1:40;…; 1:2560.
Chuyển 100ml dịch ở mỗi nồng độ pha loãng này vào ống nghiệm có chứa
900ml dịch vi khuẩn B. thuringiensis, như vậy độ pha loãng lúc này là 1:100;
1:200; 1:400; … ; 1:25600. Mẫu đối chứng được thay thế 100ml dịch huyết
thanh bằng 100ml dịch NaCl 1,15M.
Ủ các ống nghiệm ở 37
o
C trong 2 giờ và quan sát sự ngưng kết.
 Hiệu giá thu được là nồng độ pha loãng cao nhất xảy ra hiện tương ngưng
kết

 Nhược điểm của phân loại theo type huyết thanh
Mối liên hệ giữa type huyết thanh với phổ diệt côn trùng không nhất quán:
Có các loài cùng type huyết thanh có độc tính với côn trùng như nhau: loài phụ
Kustaki và loài phụ alesti đều biểu hiện độc với côn trùng bộ cánh vẩy.
Có các loài có type huyết thanh giống nhau nhưng độc tính với côn trùng khác
nhau: loài phụ morisoni (type huyết thanh H8ab) có độc tính với côn trùng bộ
hai cánh và loài phụ sandiego (type huyết thanh H8ab) có độc tính với côn
trùng bộ cánh cứng.
Không thể thông qua type huyết thanh của một loài phụ để xác định hoạt tính
diệt sâu của chúng

5.2.Theo gen mã hóa protein tinh thể độc
 Protein cry hay còn gọi δ-endotoxin (tinh thể độc) (Ge, A. Z., N. I.
Shivarova, and D. H. Dean, 1989) [19].
- Tinh thể độc tồn tại dưới dạng tiền độc tố, cần được hoạt hoá để có tác
dụng.
- Tinh thể độc tồn tại dưới nhiều hình dạng: kim tự tháp đôi, thoi phẳng,
khối hộp, hỗn hợp của các loại trên.
- Tinh thể độc có kích thước khoảng 230KDa với phần nhân độc 65KDa.

- Tinh thể độc tan trong điều kiện pH cao (pH >9,5).
- Tính độc: gây độc ở nồng độ picomol (10-12M)
Ngô chuyển gen kháng sâu từ Bacillus thuringiensis.

GVHD : Cô Lê Thị Thủy Tiên. 6

 Gen cry
- Các gen mã hoá cho tiền độc tố thường nằm trên các plasmid.
- Mỗi tiền độc tố là sản phẩm của một gen.
- Một số loài phụ có khả năng tổng hợp được nhiều hơn 1 tiền độc tố.
- 250 gen mã hoá tổng hợp protein cry đã được đọc trình tự và được xếp
vào 40 họ dựa vào sự tương đồng về trình tự sắp xếp các nucleotit.
Bảng 1.1.Phân loại Bt. theo gen mã hóa protein tinh thể độc (Hoft và Whiteley,
1989) [28].
Gen
Hình dạng
tinh thể
Kích thước
protein
(kDa)
Đối tượng diệt sâu
CryI ( Aa,
Ab, Ac,B,
C, D, E,
F, G, H, I,
J, K, L)
Lưỡng tháp
130-140
Ấu trùng bộ cánh vẩy
CryII(A,

B, C)
Hình lập
phương
69-71
Bộ cánh vẩy và bộ hai cánh.
CryIII(A,
B, C, D)
Phẳng/không
đều
73-74
Bộ cánh cứng
CryIV
(A,B,C,D)
Lưỡng tháp
73-134
Bộ hai cánh
CryV-
cryIX
Đa dạng
35-129
Đa dạng
Cyt

25-28
Tế bào động vật xương sống
và không xương sống

Bảng 1.2.Phân loại Bt. theo độc tố diệt sâu
Ngô chuyển gen kháng sâu từ Bacillus thuringiensis.

GVHD : Cô Lê Thị Thủy Tiên. 7

















5.3. Các cách phân loại khác
 Phân loại theo loại hình enzyme lipase
Căn cứ vào số lượng các vạch enzyme lipase.
Tương đối thống nhất với loại hình huyết thanh kháng nguyên H, sử
dụng để phân biệt các loài phụ của cùng một type huyết thanh.

 Phân loại theo type huyết thanh kháng protein tinh thể
Các tinh thể có cấu trúc khác nhau, thành phần kháng nguyên của các
Ngô chuyển gen kháng sâu từ Bacillus thuringiensis.

GVHD : Cô Lê Thị Thủy Tiên. 8

tinh thể khác nhau.
Thông qua phản ứng huyết thanh nhận biết type huyết thanh tinh thể.
Quan hệ mật thiết với phổ diệt sâu

 Phân loại theo type huyết thanh kháng nguyên O
Kháng nguyên O là một kháng nguyên bền nhiệt của Bt., thu được khi xử
lý nhiệt để loại bỏ tiêm mao.
Được sử dụng để xác định vị trí phân loại Bt. không có tiêm mao.

 Phân loại theo loại bệnh gây cho côn trùng
Căn cứ vào độ nhạy khác nhau của côn trùng: Dạng A (nhạy cảm với bộ
cánh vẩy). Dạng B (nhạy cảm với bộ hai cánh). Dạng C (nhạy cảm với
bộ cánh cứng). Dạng D (nhạy cảm với bộ hai cánh và bộ cánh vẩy).
II. Sinh trưởng và phát triển của Bacillus thuringiensis.
1. Chu trình sống của Bacillus thuringiensis


Hình 1.4. Chu trình sống của B. thuringiensis .

Bacillus thuringiesis trải qua 2 chu trình sống : pha phát triển sinh dưỡng và
pha tạo bào tử. Nội bào tử không hình thành trong suốt quá trình sinh trưởng và
phân chia tế bào. Chúng thường được hình thành khi tế bào đã vượt qua pha log
trong sinh trưởng hoặc là khi môi trường đã cạn kiệt nguồn dinh dưỡng.
Thường thì một tế bào sinh dưỡng chỉ hình thành một nội bào tử. Khi bào tử trưởng
thành tế bào dinh dưỡng tự phân giải, bào tử được giải phóng ra khỏi tế bào mẹ.
Bào tử trưởng thành không có quá trình trao đổi chất chúng tồn tại ở trang thái gọi
là crytobiotic. Chúng có sức chống chịu cao với những điệu kiện khắc nghiệt của
Ngô chuyển gen kháng sâu từ Bacillus thuringiensis.

GVHD : Cô Lê Thị Thủy Tiên. 9

môi trường như nhiệt độ cao, sự bức xạ, axit mạnh, chất tẩy…Khi gặp điều kiện
thuận lợi chúng nảy mầm thành các té bào sinh dưỡng.
Bào tử được hình thành từ tế bào sinh dưỡng để đáp ứng lại các điệu kiện
khắc nghiệt của môi trường và chúng sẽ nảy mầm thành các tế bào sinh dưỡng khi
điều kiện bớt khắc nghiệt. Bào tử của vi khuẩn không phải là một hình thức sinh sản
mà chúng chỉ là một hình thức thích nghi để giúp vi khuẩn vượt qua những điều
kiện sống bất lợi.
2. Các giai đoạn của quá trình tạo bào tử


Hình 1.5 : Các giai đoạn của quá trình tạo bào tử.
Bước 1 : Nhiễm sắc thể của Vi khuẩn phân chia nhân lên làm đôi.
Bước 2 : Hình thành màng tế bào phân cắt NST vi khuẩn làm 2 phần không
đều nhau.
Bước 3 : Phần nhỏ hơn phát triển hình thành nhân bào tử. Sau đó phần lớn
hơn bao lấy phần nhỏ. Kết quả 2 tế bào chất hợp nhất làm một. Chính điều này mà
một số người cho rằng quá trình hình thành bào tử cũng là quá trình sinh sản do sự
hình thành bào tử là một hình thức đổi mới tế bào do sự kết hợp của các phần
nguyên sinh chất trong quá trình hình thành bào tử mà tế bào được đổi mới.
Bước 4: Vỏ bào tử được tổng hợp.
Bước 5 : Áo bào tử được tổng hợp.
Bước 6 : Màng tế bào và NST dần tiêu biến.
Bước 7 : Bào tử được hình thành hoàn chỉnh.
Tế bào bình thường
Bước 1
Bước 2
Bước 3
Bước 4
Bước 5

Bước 6
Bước 7
Ngô chuyển gen kháng sâu từ Bacillus thuringiensis.

GVHD : Cô Lê Thị Thủy Tiên. 10

Tinh
thể độc
3. Các giai đoạn của quá trình tạo bào tử và tinh thể của Bt.


Hình 1.6. Các giai đoạn của quá trình tạo bào tử và tinh thể của Bacillus
thuringiensis.
Trong quá trình hình thành bào tử thì tinh thể độc cũng được tổng hợp đồng
thời và không nằm trong bào tử. Tinh thể độc sẽ được phóng thích ra môi trường
khi màng tế bào bị tiêu biến.
4. Động học quá trình phát triển, tạo bào tử và tinh thể độc.
Tế bào sinh dưỡng (vegetative cells) phát triển nhanh chóng từ 2-8h đầu
trong chu kỳ sinh trưởng và giảm dần rồi dừng hẳn sau 10h sinh trường.
Tiếp theo đó là sự hình thành các tinh thể độc tố trong khoảng thời gian 10-
14h. Trong khoảng giờ thứ 12 bào tử bắt đầu hình thành và được tổng hợp hoàn
chỉnh tại thời điểm 20h.

Bào tử
Ngô chuyển gen kháng sâu từ Bacillus thuringiensis.

GVHD : Cô Lê Thị Thủy Tiên. 11


Hình 1.7. Động học quá trình phát triển, tạo bào tử và tinh thể độc.

5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và hình thành bào tử của vi khuẩn
Bacillus thuringiensis.
Nhiệt độ
pH
Oxy
Ánh sáng và tia xạ
Chất kháng sinh và hóa học.
III. Các loại độc tố của Bacillus thuringiensis.
1.Bản chất hóa học của tinh thể :
Trong tinh thể độc có trên 180 loại axit amin, trong đó có hai loại chiếm tỷ lệ
cao nhất là axit glutamic và axit asparaginic. Trong tinh thể có chứa lượng khá lớn 5
nguyên tố như C, N, H, O, S. Ngoài ra còn chứa lượng nhỏ 19 nguyên tố khác
nhưng không có P. Các phân tử có khối lượng lớn (>800.000Da) có độc tính còn lại
loại có khối lượng nhỏ (<10.000) thì không có độc tính.
Tinh thể độc được coi là một tiền độc tố (Protoxin), được hoạt hóa trong ruột
côn trùng hình thành nên các phân tử độc tố với khối lượng 50.000Da.
Tinh thể bền vững với nhiệt độ cao so với độc tố dạng hòa tan.
2. Phân loại tinh thể độc:
α-exotoxin: là phospholipase C, 45-50 kDa, không bền nhiệt. Chỉ có ở một
số chủng Bt Enzyme liên quan tới sự phân huỷ mang tính cảm ứng của
phospholipid trong mô của côn trùng.Đầu tiên enzyme liên kết với tế bào ruột của
côn trùng, sau đó tách ra và được hoạt hoá bởi một chất không bền nhiệt.
Ngô chuyển gen kháng sâu từ Bacillus thuringiensis.

GVHD : Cô Lê Thị Thủy Tiên. 12

β-exotoxin: là nucleotide tạo thành trong giai đoạn phát triển sinh trưởng
trước khi hình thành bào tử. Khối lượng phân tử thấp, tan trong nước. Có tác dụng
ức chế tổng hợp ARN.
Tác dụng cộng hưởng với d-endotoxin: d-endotoxin làm dập vỡ, phá huỷ

vùng biểu mô ruột giữa côn trùng. b-exotoxin xâm nhập vào huyết tương và máu
gây ra biến đổi sinh lý của ấu trùng.Độc với cơ thể sống kể cả người, phổ diệt sâu
rộng. Do đó cần loại bỏ các chủng sinh độc tố này.
δ-endotoxin: ICPs (insecticidal crystal proteins) hay protein Cry hay thể vùi
được tạo thành trong giai đoạn tạo bào tử. Tác dụng độc đặc hiệu với các loài côn
trùng. Lượng tinh thể độc cũng như phổ tác dụng thay đổi theo chủng.
Protein kết tinh gồm 640 – 1200 a/a. Chủ yếu là a. glutamic, a. asparaginic chiếm
20% tổng số a/a. Điểm đẳng điện thấp (pI = 4,4).
Tỷ lệ axit amin systein thấp (<2%) gây ra tính không tan của tinh thể.
Ngoài ra chứa: hydratcacbon 5,6%; các nguyên tố C, N, H, O, S và 19 nguyên tố
Ca, Mg, Si, Fe…
Hình dạng: đa dạng
Vips (Vegetative insecticidal proteins)
3.Cấu trúc của tinh thể protein.
Bao gồm 3 vùng:
Vùng 1: 1 chuỗi xoắn α kỵ nước bao quanh là 6 chuỗi xoắn α lưỡng tính khác. Chứa
290 axít amin và chứa đầu N. Chịu trách nhiệm tạo lỗ rò trên ruột sâu.
Vùng 2: từ a.a 291 đến a.a 500. Chứa 7 tấm β và một chuỗi xoắn α ngắn. Chịu trách
nhiệm gắn với thụ thể.

Hình 1.8: Cấu trúc không gian của tinh thể Cry3.
Ngô chuyển gen kháng sâu từ Bacillus thuringiensis.

GVHD : Cô Lê Thị Thủy Tiên. 13

Vùng 3: Từ a.a 501 đến a.a 644. Chứa 12 tấm β. chứa đầu C. Chịu trách nhiệm nhận
biết điểm gắn kết.

4.Cơ chế tác động của tinh thể độc.

Hình 1.9. Minh họa biểu hiện của sâu bệnh dưới tác dụng của tinh thể độc Bacillus
thuringiensis.
Tác động của tinh thể độc lên côn trùng là rất phức tạp. Tác động điển hình
là làm liệt đường ruột và xoang miệng. Sau ăn từ 1-7 giờ sâu bị liệt toàn thân. Các
tế bào thượng bì biến đổi. Sau ăn 1 phút, tinh thể độc đã xuất hiện tại thượng bì ruột
giữa. Một số tế bào ruột bị tách rời, biến dạng, các chất bên trong chảy ra ngoài
màng, K
+
thoát ra ngoài. K
+
trong máu và bạch huyết tăng là nguyên nhân gây tê
liệt đường ruột và toàn thân sâu bọ, côn trùng.
Sự thay đổi tác động của tinh thể lên côn trùng phụ thuộc nhiều yếu tố.
Chẳng hạn bình thường khi vào ruột trước và ruột giữa, nếu pH không cao (>7) và
cơ thể không có cơ chế giải độc, tinh thể sẽ vỡ làm nhiễm độc máu. Tuy vậy trong
nhiều trường hợp khi tinh thể độc vỡ ra một số loài sâu có cơ chế tự giải độc, ngừng
ăn, pH đường ruột giảm xuống, sau một thời gian nhất định đường tiêu hóa được
hồi phục.
Trong khi đó nhiều loài côn trùng sản sinh ra men chuyển protoxin của tinh
thể độc thành độc tố. Tinh thể độc ( Protoxin) ở dạng tiền hoạt động. Sau khi được
sâu hại nuốt vào dưới tác dụng của môi trường pH thấp và men tiêu hóa trong ruột
sâu phân cắt tinh thể độc tố dạng tiền hoạt động thành dạng hoạt động . Độc tố Bt
chèn vào biểu mô ruột của sâu làm rối loạn trao đổi chất dẫn tới mất nước.
Ngô chuyển gen kháng sâu từ Bacillus thuringiensis.

GVHD : Cô Lê Thị Thủy Tiên. 14



Hình 1.10. Cơ chế thẩm thấu ion K

+
trên màng biểu mô ruột.
Biểu hiện của sâu bị bệnh :ngừng ăn nôn mửa, lờ đờ, mất điều khiển có thể
chết ngay sau khi nhiễm bệnh, hoặc cũng có thể bệnh kéo dài 1giờ đến vài ngày.
Nếu sống sót thì tuổi thọ, khả năng sinh sản, trọng lượng của sâu cũng giảm.
IV. Hoạt lực diệt sâu của Bacillus thuringiensis.
Hoạt lực diệt sâu của Bacillus thuringiensis được quyết định bởi:
- Số lượng gen cry có mặt.
- Sự khác nhau về trình tự axít amin của các ICPs.
- Sự khác nhau của mức độ biểu hiện các gen.
- Thuộc tính của các ICPs, vd: khả năng giữ được độ ổn định và hoạt độ
trong quá trình lên men.
Các yếu tố quyết định phổ tác dụng của Bt.
- Chủng Bacillus thuringiensis.
- Khả năng hòa tan của độc tố trong ruột sâu .
- Khả năng tiếp cận của sâu với độc tố.
- Khả năng tồn lưu của Bacillus thuringiensis trong môi trường.
Ưu điểm của thuốc trừ sâu Bt.
- Không ảnh hưởng xấu đến môi trường, người sản xuất, người tiêu dùng.
- Không ảnh hưởng đến chất lượng nông sản.
- Công nghệ sản xuất và thiết bị đơn giản, nguồn nguyên liệu sản xuất là phụ
Ngô chuyển gen kháng sâu từ Bacillus thuringiensis.

GVHD : Cô Lê Thị Thủy Tiên. 15

phẩm công nghiệp.
- Tỷ lệ phát triển tìm ra chủng giống mới cao. Có thể cải tạo giống theo ý
muốn bằng phương pháp di truyền và công nghệ gen.
- Đăng ký sản phẩm mới đơn giản, nhanh và rẻ tiền.
Nhược điểm của thuốc trừ sâu BT.

- Gặp khó khăn khi cây trồng bị tấn công bởi nhiều loài sâu hại khác nhau.
- Thời gian có hiệu lực quá ngắn do các độc tố bị phân hủy nhanh chóng do
tia UV.
- Lắng đọng nhanh trong nước → mất hoạt tính.
- Mất hoạt tính trong đất do bị phân hủy bởi các VSV trong đất.
- Khó tiếp cận được với các loài sâu ở rễ hay trong thân cây.
- Một số độc tố có thể gây bệnh ở người → ít khả năng.
- Không có khả năng tự nhân lên và kém bền vững dưới các tác động vật lý
và hóa học.
- Hiện tượng kháng Bt của sâu bệnh.
Biện pháp chuyển gen sinh tổng hợp độc tố vào thực vật có thể giải quyết
được những nhược điểm kể trên.

V. Phân lập chủng Bacillus thuringiensis kurstaki.
1. Thu thập mẫu để phân lập các chủng B. thuringiensis.
Tiến hành thu thập 137 mẫu gồm có 55 mẫu đất nông nghiệp, 56 mẫu lá, 26
mẫu mùn thóc từ các nguồn khác nhau của một số tỉnh có sinh thái khác nhau ở
miền Bắc Việt nam.
2. Phân lập các chủng B. thuringiensis.
Cắt một phần của lá (2-3 cm
2
) nghiền với 0,5 ml dịch nước muối. Đối với
các mẫu đất và mùn thóc cân 0,5 gam trộn với 5 ml môi trường T
3
lỏng chứa 0,25
M đệm natri acetate (pH = 6,8) và lắc trong 4 giờ ở 150 vòng/phút, nhiệt độ 30
0
C.
Mẫu được xử lý nhiệt ở 80
0

C trong 3 phút. Lấy 0,2 ml dịch nổi trải trên đĩa petri có
môi trường T3 nuôi ở 30
0
C trong 3 ngày. Quan sát hình dạng tinh thể của các
chủng B. thuringiensis phân lập bằng kính hiển vi đối pha Olympus.
3. Thử sinh học hoạt tính diệt sâu.
Tiến hành theo phương pháp của S.H.Park [47]: Đối tượng sâu được thử là
sâu tơ (Plutella xylostella), sâu keo (Spodoptera exiqua) và sâu khoang (Spodoptera
litura): lá bắp cải tươi được cắt thành các khoanh tròn có đường kính 3cm vào hỗn
dịch bào tử tinh thể B. thuringiensis có nồng độ 5x107 bào tử/ml, sau đó đặt vào đĩa
petri và cho vào mỗi đĩa 10 con sâu; mỗi mẫu thử với 30 con sâu. Đối với sâu bông
Ngô chuyển gen kháng sâu từ Bacillus thuringiensis.

GVHD : Cô Lê Thị Thủy Tiên. 16

(Helicoverpa armigera) cũng được tiến hành tương tự trên lá bông. Hoạt tính diệt
sâu ngài gạo (Corrcyra cephalonia) được đánh giá như sau: bỏ 30 con sâu ngài gạo
vào bình thuỷ tinh 400g gạo đã được nhiễm bào tử và tinh thể của B. thuringiensis
với liều 5x10
7
bào tử/gam gạo, nuôi ở 30
0
C với độ ẩm 70-80%.
4. Xác định tính chất 10 chủng B. thuringiensis kurstaki phân lập.
Điện di protein (SDS-PAGE) bào tử và tinh thể của các chủng B.
thuringiensis. Chủng B. thuringiensis phát triển trên môi trường thạch T
3
đã được
tạo hỗn dịch trong 5 ml dịch 0,02% Triton X-100. Ly tâm trong 1 phút. Cặn được
hoà tan với 30 l đệm SDS (1x SDS gel- loading buffer). Các mẫu được đun sôi

trong 5 phút, ly tâm ở 8000vòng/phút trong 5 phút, lấy dịch nổi và chạy điện di trên
gel polyacryamide 10% ở 30 mA theo phương pháp của Sambrook và Maniatis.
5. Phát hiện gen cry1Ab, cry1C bằng kỹ thuật PCR.
Phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích 25l đựng trong ống
Eppendorf bao gồm các thành phần: nước khử ion 13,6l, dNTP 2,5l, buffer 2,5l,
primer 2l, enzyme Tag-polymeraza 0,4l, MgCl
2
: 2l, ADN 2l ( nồng độ
50ng/l).
Sử dụng cặp mồi
TY6(5’-GGTCGTGGCTATATCCTTCGTGTCACAGC-3’) và
TY14(5’-GAATTGCTTTCATAGGCTCCGTC-3’);
TYIC (5’-CAAC CT CTAT TT G GTGCAGGTTC-3’) và
TYIUNI (5’-ATCACTGAGTCGCTTCGCATGTTTGACTTT CTC-3’)
theo thứ tự, để nhân bản đoạn ADN đặc hiệu nằm trong gen cry1Ab và cry1C. Các
sản phẩm PCR được phân tích bằng điện di trên gel agaroza 1%.

Ngô chuyển gen kháng sâu từ Bacillus thuringiensis.

GVHD : Cô Lê Thị Thủy Tiên. 17

Chƣơng 2 : CÔNG NGHỆ CHUYỂN GEN VÀO THỰC VẬT

I. Khái niệm về thực vật chuyển gen
Quá trình đưa một DNA ngoại lai vào genome (hệ gen) của một sinh vật
được gọi là quá trình biến nạp (transformation). Những cây được biến nạp được gọi
là cây biến đổi gen (genetically modified plant-GMP).
II. Tóm tắt lịch sử phát triển của công nghệ chuyển gen thực vật.
Bảng 2.1. Tóm tắt những phát triển quan trọng trong công nghệ chuyển gen
thực vật.

Năm

Những phát triển quan trọng
1980

Lần đầu tiên chuyển DNA vi khuẩn vào thực vật thành công nhờ
Agrobacterium tumefaciens
1983

Phát triển các marker chọn lọc, Ti-plasmid được loại bỏ các gen không cần
thiết
1984

Thực hiện biến nạp gen vào tế bào trần
1985

Nghiên cứu chuyển gen thành công vào thực vật gen kháng thuốc trừ cỏ
1986

Nghiên cứu chuyển gen thành công vào thực vật gen kháng virus
Lần đầu tiên đưa cây biến đổi gen ra đồng ruộng.
1987
Nghiên cứu chuyển gen thành công vào thực vật gen kháng côn trùng
Thành công trong quá trình biến nạp phi sinh học như súng bắn gen.
1988
Điều khiển sự chín ở cà chua bằng cách chuyển gen chín chậm vào cà chua.
1989
Kháng thể ở thực vật bậc cao
1990

Biến nạp phi sinh học ở ngô
Tạo cây trồng chuyển gen mang tính bất dục đực.
1991
Thay đổi thành phần carbohydrate
Tạo alkaloid tốt hơn
1992
Thực vật biến đổi gen để sản xuất các axit béo thiết yếu.
Biến nạp phi sinh học ở lúa mỳ
Lần đầu tiên phân giải plastic nhờ cây biến đổi gen
Cà chua biến đổi gen FlavorSaver xuất hiện trên thị trường
1994
Lần đầu tiên hơn 10 gen được chuyển đồng thời vào thực vật.
1998

Trên thế giới có 48 trong đó Mỹ có 35 loại thực vật biến đổi gen
được thị trường hóa
Lúa biến đổi gen với giá trị dinh dưỡng tốt hơn
Cây biến đổi gen được trồng trên diện tích hơn 40 triệu ha
1999
Cho đến nay khoảng 9000 thí nghiệm về cây biến đổi gen được
đưa ra đồng ruộng (ở EU: 1360)