Vi nhân giống hoa hướng dương (Helianthus annuus)

Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
VI NHÂN GIỐNG HOA HƯỚNG DƯOÍNG
(Helianthus annuus)
CÁN Bộ HƯỚNG DẪN
NGUYÊN THỊ PHA
SINH VIÊN THựC HIỆN
TRƯƠNG THỊ MỸ LẸ
MSSV:3072514
LỚP:CNSH K33
Cần Thơ, Tháng 5/1011
PHẦN KÝ DUYỆT
Trương Thị Mỹ Lệ
DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO YỆ LUẬN VĂN
Cần Thơ, ngày tháng năm 2011
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(ký tên")
Để hoàn thành tốt bài luận văn này ngoài sự cố gắng của bản thân tôi còn
nhận được sự giúp đỡ, hướng dẫn, động viên của nhiều người và sau đây tôi xin
gởi lời cảm om chân thành nhất đến:
Cha mẹ và gia đình, nơi đã sinh thành, nuôi nấng, bảo vệ, động viên và hỗ
trợ tôi trong suốt quá trình học tập, thực hiện và hoàn thành bài luận văn này.
Ban Giám Hiệu trường Đại Học cần Thơ, Ban Giám Đốc Viện NGhiên
Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học - Trường Đại Học cần Thơ.
CÁN Bộ HƯỚNG DẪN
(ký tên)
SINH VIÊN THỰC HIỆN

(ký tên)
Nguyễn Thị Pha
Cô Nguyễn Thị Pha đã hết long hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ,
đóng góp ý kiến và tạo điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình tôi thực hiện và
hoàn thảnh luận văn tốt nghiệp.
Cô Nguyễn Thị Liên - cố vấn học tập lớp Công Nghệ Sinh Học, khóa 33 -
trường Đại Học cần Thơ đã tận tình giúp đõ, truyền đạt kiến thức trong suốt quá
trình làm việc trong phòng thí nghiệm.
Cô Tràn Thị Xuân Mai đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực
hiện tốt luận văn.
Cuối cùng tôi xin gởi lời cảm ơn đến Thày Tràn Nguyên Tuấn đã động
viên, và cho tôi những lời khuyên tốt nhất trong những lúc khó khăn để tôi có thể
tiếp tục và hoàn thành chương trình học. Cảm ơn tất cả các bạn của tập thể lớp
Công Nghệ Sinh Học, khóa 33 đã luôn bên cạnh tôi trong suốt quá trình học tập và
hoàn thảnh bài luận văn này.
Xin kính chúc Thầy Cô vạn điều tốt đẹp, dồi dào sức khỏe và luôn thành
công rong công việc, tiếp tục cống hiến cho sự nghiệp cao cả “ Trăm năm trồng
người”, góp phần phát triển nền giáo dục Việt Nam.
Đe tài “ Vi nhân giống hoa Hướng Dương (Helianthus annuus) ” nhằm mục đích
khảo sát hiệu quả của các chất điều hòa sinh trưởng như: BAP, IAA, NAA,
2,4D lên quá trình phát triển của mô sẹo và sự tái sinh chồi từ sẹo của hoa
Hướng Dương, qua đỏ góp phần xây dựng quy trình vỉ nhăn giống loài cây
này.
Kết quả thỉ nghiệm cho thấy:
Thỉ nghiệm 1: hạt Hướng Dương được khử trùng bằng phương pháp hợp lí nên
không bị nhiễm( nấm hoặc vi khuẩn). Tỉ lệ nẩy mầm rất cao (97%) chứng tỏ môi
trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp.
Thí nghiệm 2: Mầu từ thân cho khả năng tạo sẹo tốt hơn mẫu lá. Môi trường
MS0,5 cho hiệu quả tạo sẹo tốt nhất sau 4 tuần, Môi trường MS2 cho hiệu quả tạo
sẹo nhiều nhất sau 6 tuần.

Thí nghiệm 3: khả năng tạo sẹo của thân và lá cây mầm hoa Hướng dương phụ
thuộc nhiều vào môi trường nuôi cấy, môi trường MS 0,5 cho hiệu quả tạo sẹo cao
nhất sau 4 tuần, môi trường MS2 cho hiệu quả tạo sẹo cao nhất sau 6 tuần.
Thí nghiệm 4: Sau 8 tuần quan sát chồi vẫn chưa xuất hiện.
Thí nghiệm 5: Sẹo phát triển tắt nhất và chồ xuất hiện sớm nhất trên
môi trường MS205IAA.
MỤC LỤC
Trang
PHẦN KÍ DUYỆT
LỜI CẢM TẠ
3.1Phương tiện nghiên cứu
3.1.1
3.1.2
4.2Kết quả thí nghiệm 2: Khảo sát vị trí của cây mầm (đoạn thân, lá) và
3.1.3 nồng độ
2,4D lên khả năng tạo sẹo của Hoa Hướng dương
4.3Kết quả thí nghiệm 3: Khảo sát tuối cây mầm và nồng độ 2,4D lên khả
3.1.4 năng
tạo sẹo của hoa Hướng dương
4.4Kết quả thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường đến khả năng
3.1.5 tạo chồi từ
sẹo của hoa Hướng dương
4.5Kết qảu thí nghiệm 5: Khảo sát khả năng tạo sẹo và tái sinh chồi trực tiếp
3.1.6 của
Hoa Dướng Dương từ phôi mầm
3.1.7 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
3.1.8 TÀI LIỆU THAM KHẢO
3.1.9 PHU LUC
• •
DANH SÁCH BẢNG

3.1.10
3.1.11
3.1.12 Bảng 7: Thành phần môi trường tạo sẹo và tái sinh chồi của Dướng
Dương.33 Bảng 8: Các chỉ tiêu theo dõi sự phát triển của cây mầm 8,11,14
ngày.
3.1.13 Bảng 8.1. Ảnh hưởng của vị trí mẫu cấy và môi trường đến khả năng
hình thành mô sẹo sau 4 tuần cấy.
3.1.14 Bảng 8.2. Ảnh hưởng của vị trí mẫu cấy và môi trường đến khả năng
hình thành mô sẹo sau 6 tuần cấy.
3.1.15 Bảng 8.3. Hiệu quả tương tác của hai vị trí mẫu cấy vói môi trường
nuôi cấy đến phần trăm mẫu tạo mô sẹo sau 6 tuần cấy.
3.1.16 Bảng 8.4. Ảnh hưởng của vị trí mẫu cấy và môi trường đến khả năng
hình thành mô sẹo sau 8 tuần cấy.
3.1.17 Bảng 9.1. Ảnh hưởng của tuổi mẫu cấy thân và môi trường đến khả
năng hình thành mô sẹo sau 4 tuần cấy.
3.1.18 Bảng 9.2. Hiệu quả tương tác của tuổi mẫu cấy thân vối môi trường
nuôi cấy đến phần trăm mẫu tạo mô sẹo sau 4 tuần cấy.
3.1.19 Bảng 9.3. Ảnh hưởng của tuổi mẫu cấy thân và môi trường đến khả
năng hình thành mô sẹo sau 6 tuần cấy.
3.1.20 Bảng 9.4. Ảnh hưởng của tuổi mẫu cấy thân và môi trường đến khả
năng hình thành mô sẹo sau 8 tuần cấy.
3.1.21 Bảng 9.5. Ảnh hưởng của tuổi mẫu cấy lá và môi trường đến khả năng
hình thành mô sẹo sau 4 tuần cấy.
3.1.22 Bảng 9.6. Ảnh hưởng của tuổi mẫu cấy lá và môi trường đến khả năng
hình thành mô sẹo sau 6 tuần cấy.
3.1.23 Bảng 9.7. Hiệu quả tương tác của tuổi mẫu cấy lá với môi trường nuôi
cấy đến phần trăm mẫu tạo mô sẹo sau 6 tuần cấy.
3.1.24 Bảng 9.8. Ảnh hưởng của tuổi mẫu cấy lá và môi trường đến khả năng
hình thành mô sẹo sau 8 tuần cấy.
3.1.25 Bảng 10: Phần trăm mẫu tạo sẹo và hình thành chồi trên 5 loại môi

trường khác nhau.
3.1.26 DANH SÁCH HÌNH
3.1.27 Hình 1: Cây hướng dương sau 8,11,14 ngày cấy
3.1.28 Hình 2: mẫu sau 2 tuần cấy trên môi trường MS0,5
3.1.29 Hình 3: mẫu trên môi trường tạo sẹo MS0,5 sau 4 tuần cấy
3.1.30 Hình 4: mẫu lá trên môi trường tạo sẹo MS0,5 sau 6 tuần cấy
3.1.31 Hình 6: mẫu trên môi trường tạo sẹo MS0,5 sau 8 tuần cấy
3.1.32 Hình 7: mẫu trên môi trường tạo sẹo MS2 sau 8 tuần cấy
3.1.33 Hình 8: Sự hình thành và phát triển của mô sẹo thân trên môi
trường MS0,
3.1.34 Hình 9: Sự hình thành mô sẹo từ lá trên môi trường MS0,5
3.1.35 Hình 10: Mô sẹo sau 14 ngày cấy trên môi trường MS205IAA và
MS2Ỏ5NAA
3.1.36 Hình 11: Chồi hình thành trên môi trường MS205IAA
3.1.37 CÁC TỪ VIẾT TẮT
3.1.38 IAA : Indol acetic acid
3.1.39 NAA : 1- Napthalene acetic acid
3.1.40 BAP : 6 - Benzylaminopurine. MS : Murashige & Skoog
3.1.41 CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
1.1. Giới thiêu:
3.1.42 •
3.1.43 Xã hội ngày càng phát triển, cuộc sống vãn minh và hiện đại luôn đòi
hỏi những nhu cầu tối ưu nhất cho đời sống con người kéo theo sự phát triển mạnh
mẽ của công nghiệp, nông nghiệp, dịch vụ Trong đó, vấn đề luôn được quan tâm
hàng đầu là cải thiện, nâng cao sản xuất nông nghiệp theo hướng hiện đại trên cơ
sở áp dụng những thành tựu khoa học lã thuật nhằm nâng cao chất lượng, sản
lượng nông sản, đồng thời góp phần bảo vệ môi trường sống. Hiện nay, trên thế
giới cũng như ở Việt Nam đang chú trọng trồng và sử dụng một số loài cây không
những đẹp mà còn có giá trị kinh tế và dược liệu.
3.1.44 Hoa hướng dương (Helianthus annuus) là loài cây quen thuộc mang

lại giá trị mỹ quan khi được trồng làm kiểng, có giá trị kinh tế khi được trồng để
lấy hạt, tinh dầu làm thực phẩm, làm thuốc chữa bệnh. Hơn thế nữa tinh dầu còn
được sử dụng làm nhiên liệu sinh học- một trong những nguồn nhiên liệu đang
được nghiên cứu và phát triển mạnh mẽ nhằm thay thế nhiên liệu có giới hạn và
góp phần bảo vệ môi trường.
3.1.45 Hiện nay, diện tích hoa hướng dương trên thế giới chiếm 20 triệu ha
và sản xuất khoảng 30 triệu tấn hoa hướng dương. Các nước trồng nhiều hướng
dương: Nga (5.410.000 ha), Ukraine (3.690.000 ha), Ấn Độ (2,16 triệu ha),
Argentina (1.890.000 ha) Mỹ (1.060.000 ha), Trung Quốc (1,05 triệu ha) (
7p=363 )
3.1.46 Trong khi đó, ở Việt Nam có điều kiện khí hậu thuận lợi, ánh sáng
mặt trời chiếu quanh năm rất thuận lợi cho Hoa hướng dương phát triển nhưng diện
tích trồng hướng dương ở nước ta còn rất ít, theo hướng công nghiệp chưa nhiều,
hoa chủ yếu chỉ trồng làm cảnh cũng chính vì thế mà các tài liệu nghiên cứu về loài
cây này trong nước còn rất hạn chế. Đặc biệt là các nghiên cứu về vi nhân giống.
Với những lợi ích mà hoa hướng dương mang lại đề tài “Vi nhân giống hoa hướng
dương (Helỉanthus annuus) ” được thực hiện nhằm khảo sát một số yếu tố ảnh
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 33 năm 2011 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học 11 Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học
hưởng đến quá trình phát triển của mô sẹo và sự phát sinh chồi trong điều kiện in
vitro và bước đầu xây dựng quy trình vi nhân giống loài cây này. Kết quả của đề tài
sẽ cung cấp một số kiến thức hữu ích về hoa hướng dương phục vụ cho các nghiên
cứu tiếp theo cũng như trong công tác nhân giống loài cây này trên quy mô công
nghiệp.
1.2. Muc tiêu của đề tài:
3.1.47 •
3.1.48 Mục tiêu chính của đề tài là khảo sát hiệu quả của các chất
điều hòa sinh trưởng như: BAP, IAA, NAA, 2,4 D lên quá trình phát
triển của mô sẹo và sự tái sinh chồi từ sẹo của hoa hướng dương.
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 33 năm 2011 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học 12 Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học
3.1.49 CHƯƠNG 2: Lược KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Nguồn gốc, phân loại, đặc tính, công dụng của hoa hướng
dĩrơngựỉelùmthus annuus.)
2.1.1. Nguồn gốc:
3.1.50 Hướng dương là loài cây có từ châu Mỹ, bắt đầu từ đất nước Mexico,
và đã được con người nuôi trồng vào khoảng năm 1000 TCN. Sau đó được mang về
châu Âu từ trước thế kỷ 16. Từ Heỉỉanthus để chỉ hoa hướng dương có nguồn gốc từ
tiếng Hy Lạp. Hoa hướng dương thuộc lớp thực vật hai lá mầm.
3.1.51 Từ hướng dương cũng được sử dụng để nói về tất cả các loài thực vật
thuộc chi Helianthus, rất nhiều trong số đó là thực vật sống lâu năm.
3.1.52 ( />%C6%B0%C6
3.1.53 %Alng#L.El.BB.8Bch_s.El.BB.AD)
2.1.2. Phân loại khoa học:
3.1.54 Tên khoa học: Helỉanthus annuus.
- Giới: Plantae
- Bộ: Asterales
- Họ: Asteraceae
- Chi: Helianthus
- Loài: H. Annuus (Theo
Hoàng Thị Sản, 2002)
2.1.3. Đặc tính:
a. Tên gọi: Hoa hướng dương còn có tên gọi khác là: hoa Mặt Trời, hướng
dương quỳ tử, thiên quỳ tử, quỳ tử, quỳ hoa tử. Được gọi là Hoa hướng dương
vì những bông hoa đang ở giai đoạn nụ, chưa trưởng thành thì biểu lộ tập tính
hướng dương (hướng theo Mặt Trời) của loài cây này. Khi mặt trời mọc vào
buổi sáng, phàn lớn hoa hướng về phía đông. Theo hành trình của một ngày,
vào những ngày nhiều nắng, các nụ hoa theo hành trình của Mặt Trời di
chuyển từ đông sang tây, thời gian buổi đêm nó lại trở về hướng đông. Sự vận
động thực hiện bằng những tế bào vận động trong thân, một đoạn mềm dẻo

của cuống ở vị trí thấp hơn nụ hoa. Khi giai đoạn chồi kết thúc thì cuống hoa
bị cứng lại, và khi hoa nở thì nó không còn tính hướng dương nữa, cho dù
nhiều bông hoa quay về hướng đông.
3.1.55 ( />%C6%B0%C6%A1n
3.1.56 g#H.C3.ACnh_d.El.BA.Alng)
b. Phân bố: Cây có nguồn gốc từ Mexico, hiện tại được trồng ở nhiều nơi trên
thế giới và một số tỉnh ở nước ta.
c. Mô tả:
- Hoa hướng dương thuộc lớp thực vật 2 lá mầm.
- Hướng dương là loài cây thảo sống 1 năm.
- Thân to thẳng có lông cứng, thường có đốm, cao l-3m.
- Lá to, thường mọc so le, có cuống dài, phiến lá hình trứng đầu nhọn, phía
dưới hình tim, mép có răng cưa, hai mặt đều có lông trắng.
- Cụm hoa đầu lớn, đường kính 7-20cm, bao chung hình trứng; bông hoa này
trên thực tế là một cụm hoa dạng đàu, bao gồm những bông hoa con (chiếc
hoa) tập họp cùng nhau. Ở vòng ngoài, những bông hoa con gọi là chiếc hoa
tỏa tia. Chúng có thể có màu vàng, nâu sẫm, da cam hoặc các màu khác.
Những bông hoa con này không có khả năng sinh sản. Các bông hoa con nối
thành một vòng tròn ở bên trong các chiếc hoa toả tia được gọi là chiếc hoa
dạng đĩa. Những bông hoa dạng đĩa khi trưởng thành phát triển thành những
cái mà người ta gọi là "hạt hướng dương.
- Hạt: Thực sự là một loại quả (quả bế) của loài cây này.
- Cây ra hoa vào mùa đông, mùa xuân, có quả vào tháng 1-2
2.1.4. Thành phần hóa học.
3.1.57 Theo hiện đại dưỡng sinh bảo kiện trung dược từ điển:
3.1.58 Hàm lượng dầu béo trong hạt hướng dương khoảng 50%, trong đó
linolenic acid chiếm tới 70%. Còn chứa các phospholipid như lecithin,
phosphatidylinositol, phosphatidylethanolamine.
3.1.59 Hàm lượng protein khoảng 20-26%, trong đó các acid amin thiết yếu
isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylamine, tryptophan, threonile, valine có

tỷ lệ phần hăm gần giống tỷ lệ lý tưởng do WHO kiến nghị, do đó có giá trị dinh
dưỡng tương đối cao.
3.1.60 Ngoài ra còn có các acid hữu cơ như citric acid, tartaric acid,
chlorogenic acid, quinic acid, caffeic acid; beta caroten, nhiều loại vitamin và
nguyên tố vi lượng. Đặc biệt, vitamin E có hàm lượng rất cao trong hạt hướng dương
(trong 15g có tới 31mg); Hàm lượng Ka-li (K) trong hạt hướng dương còn cao hơn
trong chuối tiêu và quít.
3.1.61 ( />%C6%B0%C6%A1n
3.1.62 g#H.C3.ACnh_d.El.BA.Alng)
2.1.5. Công dụng:
a. Giá trị kinh tế:
3.1.63 Hoa hướng dương được trồng phổ biến để lấy hạt, hạt hướng dương
được sử dụng để làm thức ăn nhanh cho con người, làm thức ăn cho chim. Dầu
hướng dương được chiếc xuất từ hạt hướng dương có nhiều loại khác nhau với tỷ lệ
acid béo không no khác nhau. Chính thành phần các acid béo không no cao này
trong dầu hướng dương khiến dầu hướng dương trở thành một trong những loại dầu
và mỡ thực vật tốt nhất cho sức khỏe, đặc biệt là đối với những người có nguy cơ
mắc bệnh tim mạch.
3.1.64 Đặc biệt trong điều kiện kinh tế xã hội đang phát triển một cách mạnh
mẽ như hiện nay thì vấn đề cấp thiết đang được quan tâm hàng đầu là tìm ra nguồn
năng lượng mới thay thế những nguồn năng lượng đang dần cạn kiệt đồng thời giảm
sự ô nhiễm môi trường. Và dầu hướng dương được nghiên cứu để tạo nhiên liệu sinh
học- nguồn năng lượng đang được tập trung nghiên cứu và phát triển.
3.1.65 Gần đây, theo ông Mark Van Hom, Giám đốc Trung tâm Trang trại
sinh viên của Trường ĐH California (Mỹ). Hoa hướng dương được trồng không phải
để trang trí mà là phần chính yếu của một chiến lược kiểm soát sâu bệnh của trang
trại rau sạch. Vì loài hoa này được trồng để làm nơi trú ngụ của bọ rùa và ong vò vẽ
ký sinh. Đây chính là 2 loài côn trùng chuyên tiêu diệt côn trùng gây hại cho việc
trồng trọt.
3.1.66 Theo tin mới nhất từ Cơ quan Nghiên cứu và Phát triển Hàng không vũ

trụ Nhật Bản (JAXA). Thì cây hướng dương sẽ được trồng để khử đất nhiễm phóng
xạ tại các nhà máy điện hạt nhân sau thảm họa động đất và sống thần năm 2011.
Trước đây vào năm 1986 loài cây này cũng đã giúp Ukraina khử lượng phóng xạ
trong đất trong thảm họa Chernobyl (Ưgl/khoa- hoc/2011/04/khu-
dat-nhiem-phong-xa-bang-cay-hoa-huong-duong/)
b. Tác dụng theo Đông Y và kinh nghiệm nhân gian:
3.1.67 Toàn bộ các bộ phận của cây hướng dương đều được dùng làm thuốc.
Theo Đông y: Hạt hướng dương có vị ngọt, tính bình, không độc. Tác dụng ninh tâm
an thần, chỉ lỵ, thấu chẩn. Dùng chữa tinh thần uất ức, thần kinh suy nhược, chán ăn,
đau đầu do suy nhược, đi lỵ ra máu, sởi không mọc được.
3.1.68 Công dụng của các bộ phận khác (theo Trung dược đại từ điển):
- Vỏ hạt có có thể dùng để chữa tai ù.
- Hoa hướng dương có tác dụng trừ phong, sáng mắt. Dùng chữa đầu choáng
váng, mặt sưng phù, còn dùng để thúc sinh cho phụ nữ.
- Khay hạt hướng dương (còn gọi là quỳ phòng, hướng nhật quỳ hoa thác,
hướng nhật quỳ hoa bàn) có tác dụng chữa đầu đau, mắt hoa, răng đau, đau dạ
dày và bụng, phụ nữ thống kinh, sưng đau lở loét.
- Lá có tác dụng tăng cường tiêu hóa và chữa cao huyết áp.
- Lõi thân cành (còn gọi là hướng nhật quỳ ngạnh tâm, hướng nhật quỳ kinh
tâm, hướng nhật quỳ nhương) có tác dụng chữa tiểu tiện xuất huyết, tiểu
dưỡng chấp, sỏi đường tiết niệu, tiểu tiện khó khăn.
- Rễ cây hướng dương có tác dụng chữa ngực, sườn và vùng thượng vị đau
nhức, thông đại tiểu tiện, chữa đòn ngã chấn thương, mụn nhọt lở loét chảy
nước vàng.
- Ngoài ra hoa hướng dương còn đem lại cho con người giá trị về mặt thẩm mỹ
khi được trồng làm kiểng và không những thế nó còn có ý nghĩa về mặt tinh
thần: Người dân Inca có sự sùng bái hoa hướng dương giống như hình ảnh
thần Mặt Trời của họ. Hoa hướng dương thể hiện niềm tin và hy vọng trong
tình yêu, luôn hương về điều tươi sáng nhất.
3.1.69 2.2. Một số phương pháp nhân giống:

2.2.1. Phương pháp nhân giống thông thường:
3.1.70 Hoa hướng dương được trồng chủ yếu bằng hạt.
2.2.2. Phương pháp nhân giong in vitro:
a. Khái niệm và mục đích của vi nhân giống:
3.1.71 Vi nhân giống là một trong những ứng dụng của kĩ thuật nuôi cấy mô
tế bào thực vật.
3.1.72 Nuôi cấy mô tế bào thực vật là sự nuôi cấy vô trùng các cơ quan, mô,
tế bào thực vật trên môi trường nuôi cấy được xác định rõ; việc nuôi cấy mô được
duy trì dưới các điều kiện được kiểm soát. Kỹ thuật nuôi cấy mô mang tính thương
mại chủ yếu trên cơ sở vi nhân giống.
3.1.73 Vi nhân giống là việc nhân đúng kiểu cây (true-to-type) của một kiểu
gen được tuyển chọn bằng cách sử dụng kỹ thuật in vitro (Nguyễn Bảo Toàn, 2004).
Vi nhân giống thông thường là phương pháp nhân nhanh và giúp giảm giá thành sản
phẩm.
3.1.74 Các giai đoạn của vi nhân giống:
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 33 năm 2011 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học 1 Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học
3.1.75 Vi nhân giống đã được Debergh và Zimmerman (1991) chia thành bốn
giai đoạn khác nhau:
• Giai đoạn đầu tiên: Chuẩn bị của cây mẹ
• Giai đoạn 1: Bắt đầu tiệt trùng
• Giai đoạn 2: Nhân chồi
• Giai đoạn 3a: Kéo dài
• Giai đoạn 3b: Tạo rễ và tiền thuần dưỡng
• Giai đoạn 4: Thuần dưỡng
3.1.76 Mỗi giai đoạn đều có một chức năng riêng. Kết quả của việc vi nhân
giống phụ thuộc vào cả bốn giai đoạn.
3.1.77 ♦♦♦ Giai đoạn đầu tiên: Chuẩn bị cây mẹ
3.1.78 Giai đoạn này là giai đoạn điều kiện vệ sinh cây mẹ được cải thiện.
Tình trạng sinh lý của cây mẹ cũng như nguồn làm mẫu cấy có thể được cải thiện bởi

một số kỹ thuật như tưới nhỏ giọt, ghép nhiều tầng (Nguyễn Bảo Toàn, 2004). Ngoài
ra các thủ tục phát hiện để làm giảm hay loại trừ một số mầm bệnh về vi khuẩn, virus
là điều càn thiết (George, 1993). Chọn nguyên liệu ban đàu rất quan trọng, nó không
chỉ quyết định thành công ban đầu mà cả các quá trình tiếp theo.
3.1.79 ♦♦♦ Giai đoạn 1: Tiệt trùng mẫu cấy
3.1.80 Đây là một sự kết họp giữa một phương pháp tiệt trùng đầy đủ và một
tỉ lệ sống cao với mẫu cấy và không bị nhiễm. Thông thường khó đạt thành công
100% trong kỹ thuật vô trùng mẫu. Để nâng cao tỉ lệ tiệt trùng, cần chú ý đến nồng
độ hóa chất và thời gian khử trùng. Nồng độ và thời gian khử trùng tùy theo loài và
kích thước của mẫu cấy.
3.1.81 * Các hóa chất khử trùng bề mặt:
3.1.82 > Dung dich hypochloride
3.1.83 lon hypochloride có trong sodium hypochloride NaOCl hoặc calcium
hypochloride Ca(OCl)
2
, nồng độ sử dụng là từ 5 - 10% để ngâm mẫu khoảng 20 phút
(Nguyễn Bảo Toàn, 2004). Sodium hypochloride hòa tan trong nước ở dạng lỏng.
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 33 năm 2011 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học 18 Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học
Dung dịch này có trong các sản phẩm tẩy rửa như nước Javel, Clorox.
3.1.84 Tác dụng diệt khuẩn của dung dịch hypochloride là cả HOC1 và ion ocn.
Người ta cho rằng HOC1 hiệu quả hơn OC1. Dung dịch hypochoride nên được sử
dụng ở pH 6-7.
3.1.85 Nước Javel thương mại có chứa khoảng 5% NaOCl, có khả năng diệt vi sinh
vật tốt và không hoặc có mức độ độc thấp đối với mẫu cấy. Để tăng tính linh động
của hóa chất diệt khuẩn, người ta thường sử dụng thêm các chất làm giảm sức căng
bề mặt như Tween 20, Tween 80, Teepol hoặc có thể xử lý phối họp với cồn 70%
(Vũ Vãn Vụ, 1999).
> Cồn
3.1.86 Có tác dụng diệt khuẩn đồng thời lấy đi các chất sáp từ mô mẫu cấy.

cồn khử trùng thường được sử dụng là ethanol, nồng độ từ 70 - 95%.
> lon kim loai năng
3.1.87 Chất khử trùng thông dụng nhất là HgCl
2
. Tuy nhiên việc sử dụng hóa
chất này phải hết sức cẩn thận vì độc cho thực vật lẫn động vật cũng như chất thải
sau khi khử trùng có ảnh hưởng đến môi trường.
> Chất khử nấm
3.1.88 Benomyl, Carbendazin, Fenbendazol, .là các chất khử nấm của thuốc
bảo vệ thực vật được sử dụng trong khử trùng bề mặt. Nồng độ và liều lượng thay
đổi theo từng loại mẫu thực vật. Người ta cũng cho các chất này vào trong môi
trường nuôi cấy.
> Chất kháng sinh
3.1.89 Một số chất kháng sinh cũng được sử dụng cho khử trùng bề mặt để
loại trực tiếp các vi khuẩn trong mẫu cấy như streptomycin, penicillin, alcide,
3.1.90 Nồng độ hóa chất và thời gian khử trùng cực kỳ quan trọng. Nếu nồng độ quá
cao và thời gian khử trùng khá dài mẫu có thể bị tổn thương và chết. Còn nếu nồng
độ quá thấp và thời gian khử trùng quá ngắn thì không giết chết được vi sinh vật.
Nồng độ thấp và thời gian khử trùng dài cũng có hiệu quả như nồng độ cao và thời
gian khử trùng ngắn (Nguyễn Bảo Toàn, 2004).
3.1.91 ♦♦♦ Giai đoạn 2: Nhân chồi
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 33 năm 2011 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học 19 Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học
3.1.92 Mục tiêu của giai đoạn này là tăng nhanh số lượng cá thể bằng sự sinh
phôi soma, tăng số lượng chồi bên và tạo chồi bất định (Nguyễn Bảo Toàn, 2004). số
lượng chồi nhân lên phụ thuộc vào số lần cấy chuyền và nồng độ kích thích tố sử
dụng trong môi trường. Một mẫu cấy có mang chồi đơn và sẽ phát triển thành một
chồi hay một cụm chồi được tạo ra và chuyển sang giai đoạn 3 để cảm ứng ra rễ
(Nguyễn Đức Lượng et al, 2002).
3.1.93 ♦♦♦ Giai đoạn 3: Kéo dài, tạo rễ và tiền thuần dưỡng.

3.1.94 Giai đoạn kéo dài: Trong nhiều trường hợp sự kéo dài là một yêu càu
cho sự tạo rễ đầy đủ. Môi trường kéo dài thường không chứa cytokinin hoặc có ít
hơn lượng cytokinin được sử dụng trong giai đoạn 2. Có thể cần thiết thêm than hoạt
tính để trung hòa hiệu quả cytokinin còn lại trong giai đoạn 2. Tùy thuộc vào kiểu
cây, sự kéo dài có thể xảy ra trên các chồi đơn hoặc chồi cụm (Pierik, 1987).
3.1.95 Giai đoạn kích thích rễ và tiền thuần dưỡng: Auxin thường được sử
dụng để kích thích tạo rễ. Tạo rễ tốt nhất trên môi trường có hàm lượng khoáng thấp.
Các rễ phát triển trong in vitro thì luôn không thích nghi với điều kiện nhà lưới và
các rễ quá dài sẽ gặp điều kiện khó khăn khi trồng. Ngoài việc kích thích rễ, giai
đoạn này cũng thích hợp với tiền thuần dưỡng. Các cách làm tăng khả năng thuần
dưỡng là cung cấp cây con với carbonhydrate hoặc làm thấp ẩm độ tương đối trong
bình chứa, sử dụng nấm rễ, sử dụng chất trơ
3.1.96 ♦♦♦ Giai đoạn 4: Sự thuần dưỡng
3.1.97 Mục đích của giai đoạn này là làm giảm tối thiểu sự chết cây con khi
chuyển từ in vitro sang nhà lưới hoặc điều kiện ngoài đồng. Trong giai đoạn này các
yếu tố cần quan tâm là:
3.1.98 - Tình trạng cây con khi chuyển ra môi trường trồng.
3.1.99 - Các yếu tố về môi trường như: nhiệt độ, ẩm độ và ánh sáng (Nguyễn
Bảo Toàn, 2004).
3.1.100 Đặc tính giải phẫu và sinh lý của cây con cấy mô cho thấy, chúng cần
thời gian hoàn thiện cấu trúc và chức năng sinh lý để thích nghi với môi trường tự
nhiên. Các kỹ thuật thuần dưỡng có mục đích làm cho cây cấy mô dần dần hoàn
thiện cấu trúc. Các yếu tố môi trường cần đạt đến như làm thấp ẩm độ, tăng dần
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 33 năm 2011 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học 20 Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học
cường độ ánh sáng. Quá trình thuần dưỡng có thể bắt đầu ở giai đoạn cuối của các
cây cấy mô, còn trong bình nuôi cấy và giai đoạn sau khi chuyển cây con ra ngoài
môi trường tự nhiên (Nguyễn Bảo Toàn, 2004).
b. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô:
3.1.101 Mồi trường nuôi cấy:

3.1.102 Thực vật cũng như tất cả các sinh vật khác, muốn sinh trưởng và phát
triển phải hấp thu các chất dinh dưỡng từ môi trường. Nhu càu dinh dưỡng cho sinh
trưởng tối ưu của các loài không giống nhau, ngay giữa các bộ phận của cùng một cơ
thể cũng ít nhiều có sự khác nhau.
3.1.103 Các thành phần trong môi trường nuôi cấy như: Nước, khoáng đa
lượng, khoáng vi lượng, đường, vitamin, chất điều hòa sinh trưởng, agar, giá trị pH
đều ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô.
3.1.104 Cho đến nay nhiều loại môi trường dinh dưỡng được tìm ra, trong số
đó môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) giàu và cân bằng về chất dinh dưỡng
được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô, thích hợp cho nhiều loài cây, phù họp cho
những nghiên cứu ban đàu (Nguyễn Văn Uyển et al, 1993).
3.1.105 ♦♦♦ Nước
3.1.106 Phẩm chất nước là điều kiện quan trọng trong nuôi cấy mô. Nước sử
dụng trong nuôi cấy mô thường là nước cất một làn. Trong một số trường hợp cũng
sử dụng nước cất hai làn hoặc nước khử khoáng (Nguyễn Bảo Toàn, 2004).
3.1.107 ♦♦♦ Các nguyên tố khoáng
3.1.108 CÓ nhiều nguyên tố khoáng được sử dụng trong môi trường
nuôi cấy, mỗi nguyên tố có một vai trò riêng. Chúng được chia thành hai nhóm
riêng: Nguyên tố khoáng đa lượng là thành phần của các họp chất hữu cơ hoặc đóng
vai trò của chất gây thẩm thấu; nguyên tố khoáng vi lượng thường là thành phần của
các enzymes.
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 33 năm 2011 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học 21 Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học
3.1.109
3.1.110 Là thảnh phần cấu tạo của nhiều hợp chất hữu cơ chứa N như
protein, amoni acid, chlorophyll, Nitơ vô cơ thường được sử dụng trong môi trường
nuôi cấy mô ở hai dạng: N03 , NH4
+
. Lượng nitrat trong hàu hết tất cả các môi
trường nhiều hơn amon và thường dùng ở nồng độ 25 mM với 2-20 mM amon.

Nitrogen hữu cơ thường dùng là các amino acid và các polyamine. Sự có mặt của
nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ ở hàm lượng thích hợp sẽ thúc đẩy mẫu sinh trưởng
mạnh hơn và đảm bảo chống lại sự thiếu hụt nitơ (Vũ Văn Vụ, 1999).
3.1.111 • Phospho
3.1.112 Là thành phần cấu tạo của các thành phàn quan trọng trong cây
như acid nhân (DNA, RNA), màng tế bào (phospholipid), ATP, NADPH MÔ cấy
hấp thu lân ở các hình thức khác nhau: H
2
P0
4
”, HP0
4
2_
, P0
4
3
.Hai dạng phospho
thường dùng nhất là NaH
3
P0
4
.7H
2
0 và KH2PO4. Nồng độ trong môi trường biến
thiên từ 0.15—4 mM, trung bình khoảng 1 mM.
• Kali
3.1.113 Là thành phần xúc tác của nhiều enzyme. Vai trò của K liên quan
nhiều đến quá trình tổng họp carbohyderate. Mô hấp thu K ở dạng ion K
+
. Trong môi

3.1.1 Bảng 1: Các nguyên tố khoáng
3.1.2 Nguyên tố khoáng đa lượng 3.1.3 Nguyên tố khoáng vi lượng
3.1.4 Nitơ ( dạng amonium và nitrate) 3.1.5 Iod Ợ)
3.1.6 Phospho (P) 3.1.7 Bo (B)
3.1.8 Kali (K) 3.1.9 Mangan (Mn)
3.1.10 Magiê (Mg) 3.1.11 Kẽm (Zn)
3.1.12 Canxi (Ca) 3.1.13 Molybdenum (Mo)
3.1.14 Lưu huỳnh (S) 3.1.15 Đồng (Cu)
3.1.16 Clo (Cl) 3.1.17 Coban (Co)
3.1.18
3.1.19 Nhôm (Al)
3.1.20
3.1.21 Sắt (Fe)
3.1.22
3.1.23 Niken (Ni)
3.1.24 (Nguồn: Nguyễn Văn Uyển etal, 1993) • Nitơ
3.1.25
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 33 năm 2011 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học 22 Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học
trường nuôi cấy, thường dùng nhất là KNO3, KC1, KH2PO4. Nồng độ K
+
trong môi
trường biến thiên từ 2-25mM, trung bình khoảng lOmM.
• Magie
3.1.114 Thành phần của chlorophyll. Ngoài ra Mg còn là thành phần của nhiều
enzyme và cũng cần thiết cho quá trình biến dưỡng năng lượng trong sự tổng họp
ATP. Cây hấp thu Mg ở dạng Mg
2+
. Mg được cung cấp dưới dạng MgS0
4

.7H
2
0 với
nồng độ trong môi trường khoảng từ 0.5-3mM.
• Canxi
3.1.115 Là thành phần của vách tế bào, màng tế bào và hoạt tính của một số
các enzyme. Mô cấy hấp thu Ca ở dạng Ca
2+
. Ca được cung cấp dưới dạng
Ca(N0
3
)
2
.4H
2
0, CaCl
2
.2H
2
0 với nồng độ trong môi trường khoảng từ l-3.5mM, trung
bình là 2mM.
• Natri
3.1.116 lon Na
+
được cây hấp thu, tuy nhiên chức năng của Na đối với cây
trồng thực sự chưa rõ. Người ta cho rằng Na có chức năng ổn định thẩm thấu các cây
sống trong vùng mặn.
• Clo
3.1.117 Có vai trò trong quang hợp chủ yếu ở hệ thống quang II trong quá trình
quang phân li nước, Ngoài ra, ion cr còn điều hòa sự đóng mở khí khẩu. Mô cấy

hấp thu ở dạng cr.
3.1.118 ♦♦♦ Các nguyên tố khoáng vỉ lượng
3.1.119 Có rất ít các nguyên tố vi lượng được chứng minh là không thể thiếu
đối với sự phát triển của mô và tế bào thực vật. Tuy nhiên, để an toàn các nguyên tố
vi lượng cần thiết đối với cây trồng đều được cung cấp trong môi trường nuôi cấy.
• lot
3.1.120 Không được công nhận như một nguyên tố dinh dưỡng cho thực vật
bậc cao mặc dù nó có thể cần thiết cho một số tảo và một lượng nhỏ thực vật bậc
cao. Nếu cần, chỉ sử dụng một lượng nhỏ.
• Bo
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 33 năm 2011 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học 23 Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học
3.1.121 Cần thiết cho sự phát triển và chuyển hóa mô, gia tăng sự ổn định của
tế bào và sự sinh sản của cây. Các chức năng sinh hóa của B vẫn chưa được hiểu rõ.
Người ta thấy B có liên quan đến sự điều hòa hoạt động của enzyme phenolase, biến
dưỡng acid phenolic và sự tổng họp lignin.
• Mangan
3.1.122 Là nguyên tố vi lượng quan trọng trong môi trường nuôi cấy, là thành
phàn quan trọng trong quang phân ly nước và cũng là thành phần hoạt hóa cho nhiều
enzyme. Cây hấp thụ Mn ở dạng ion Mn2+.
3.1.123 •Kẽm
3.1.124 Liên quan đến các phản ứng tổng hợp Indol-3- acetic acid (IAA), cũng
là thành phàn hoạt hóa của một so enzyme. Mô thực vật hấp thụ Zn ở dạng ion Zn2+
• Molybden
3.1.125 Mo là thành phàn cơ bản của enzyme khử nitrate và nitrogenase. Mo
cần thiết cho quá trinh tổng hợp ascorbic acid. Mô thực vật hấp thụ Mo ở dạng ion
Mo042-
• Đồng
3.1.126 Tham gia vào sự hoạt hóa của các enzyme cytocrome oxydase trong hô
hấp, trong các chất vận chuyển điện tử như plastocyanin và cũng là thành phần của

ascorbic acid oxydase. Mô cây hấp thu Cu ở dạng Cu2+.
• Cobalt
3.1.127 Là thành phần kim loại của vitamin B13 liên quan đến sự tổng họp
acid nhân. Mô cây hấp thu Co ở dạng Co2+.
• Sắt
3.1.128 Là nguyên tố cần thiết bởi vì nó hình thành bộ phận của một vài
enzyme hay của nhiều protein vận chuyển điện tử trong quá trình quang họp và hô
hấp. Sự oxi hóa và sự khử luân phiên giữa Fe2+ và Fe3+ khi nó đóng vai trò như
chìa khóa của hệ thống enzyme. Hiện nay sắt thường được dùng dưới dạng kết họp
với Na 2-etylen diamintetra acetate (EDTA). Ở dạng này sắt không bị kết tủa và sẽ
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 33 năm 2011 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học 24 Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học
giải phóng ra dần dần theo nhu cầu của mô thực vật.
3.1.129 • Nhôm và niken
3.1.130 Là nguyên tố vi lượng được cho vào môi trường nuôi cấy, tuy nhiên
vai trò sinh lý của các nguyên tố này thì chưa thật sự được hiểu rõ. Người ta thấy Ni
là thành phần của enzyme urease biến đổi ure sang ammonium.
3.1.131 Nồng độ của khoáng đa lượng và vi lượng trong môi trường ra rễ
thường giảm xuống còn một nửa so với bình thường (Nguyễn Bảo Toàn, 2004).
3.1.132 ♦♦♦ Nguồn cacbonhydrat, Đường sucrose
3.1.133 Nguồn carbonhydrat thường dùng là đường sucrose, đây là nguồn
cacbon để tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ, giúp tế bào phân chia, tăng
sinh khối trong môi trường nuôi cấy nhân tạo. Đường càn thiết cho sự ra rễ ở nhiều
loài thực vật. Hai loại đường monosaccharide và disaccharide đã được thí nghiệm.
Đường sucrose thường được sử dụng trong khoảng 2-5%. Khi sử dụng đường
sucrose trong môi trường nuôi cấy, nó được thủy phân hoàn toàn hoặc thủy phân một
phàn thành monosaccharide: glucose và fructose. Đường còn ảnh hưởng đến áp suất
thẩm thấu của môi trường (Nguyễn Bảo Toàn, 2004).
3.1.134 Hàm lượng đường cao, mô nuôi cấy khó hút được nước. Hàm lượng
đường quá thấp là một trong những nguyên nhân gây ra hiện tượng mọng nước ở

mẫu nuôi cấy, đây là trở ngại chính cho việc chuyển cây từ ống nghiệm ra vườn ươm
(Vũ Văn Vụ, 1999).
3.1.135 ♦♦♦ Vitamin
3.1.136 CÓ vai trò xúc tác quá trình trao đổi chất diễn ra bên trong tế bào, kích
thích sinh trưởng rễ cây. Vitamin thường sử dụng nhiều nhất là Nicotinic acid,
Pyridoxin, Thiamine, Myo inositol
3.1.137 Việc xử lý phối hợp một số vitamin với các auxin, cytokinin và các
nguyên tố vi lượng thường đem lại kết quả mỹ mãn trong giâm cành và cấy mô (Vũ
Văn Vụ, 1999).
3.1.138 ♦♦♦ Chất tạo gel
• Agar:
3.1.139 Là sản phẩm tự nhiên được trích từ tảo. Là thành phần quyết định trạng
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 33 năm 2011 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học 25 Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học