MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN, XÉT NGHIỆM, PHÂN LOẠI VI KHUẨN LAO -PHƯƠNG PHÁP SPOLIGOTYPING

Khoá luận tốt nghiệp
Nguyễn Văn Quyết
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh lao là một căn bệnh mà sự tồn tại của nó đã gắn liền với sự phát
triển của xã hội loài người từ ngàn năm nay. Trên thế giới chưa có một quốc
gia nào, một dân tộc nào mà không có người bị mắc bệnh lao và chết do lao.
Việc tìm ra các thuốc hóa học chống lao giúp cho việc chữa trị lao trở nên
đơn giản và hiệu quả hơn, đồng thời trong giới y học cũng xuất hiện tư
tưởng chủ quan nên đã làm lãng quên đi căn bệnh nguy hiểm này. Ngày nay,
bệnh lao trở lại cùng với đại dịch HIV/AIDS, nó trở thành một trong những
căn nguyên gây bệnh và gây tử vong lớn nhất ở người, đặc biệt ở những
nước đang phát triển [2].
Theo TCYTTG, hiện nay trên thế giới có khoảng 2,2 tỉ người bị
nhiễm lao, chiếm 1/3 dân số thế giới, ước tính trong năm 2003 có thêm
khoảng 9 triệu người mắc lao mới và khoảng 2 triệu người chết do lao.
Trong đó có khoảng 75% bệnh nhân lao đều đang ở lứa tuổi lao động.
Việt Nam đứng thứ 13 trong 22 nước có số bệnh nhân lao trên toàn
cầu. Trong khu vực Tây-Thái Bình Dương, Việt Nam đứng thứ 3 sau Trung
Quốc và Philippin về số lượng bệnh lao lưu hành cũng như bệnh nhân lao
mới xuất hiện hàng năm [2]. Theo chương trình Chống lao Quốc gia mỗi
ngày nước ta có thêm khoảng 400 người mắc bệnh, tỷ lệ tử vong do lao là
26/100.000 dân. Chỉ số nguy cơ nhiễm lao ước tính chung cả nước là 1,7%,
trong đó miền nam là 2,2%. Tổng số nhiễm lao ước tính khoảng 44% dân
số[2].
Những nguyên nhân gắn liền với diễn biến xấu của bệnh lao trên thế
giới là sự kết hợp các yếu tố như bùng nổ dân số, tăng cường di cư, sự lan
Khoa Công nghệ sinh học
1
Khoá luận tốt nghiệp
Nguyễn Văn Quyết
rộng của virut HIV kéo theo bùng nổ dịch tễ hội chứng thiểu năng miễn dịch

AIDS và sự lan truyền của chủng lao kháng thuốc [2].
Trước tình hình đó, việc nghiên cứu sâu về bệnh lao cũng như tác
nhân gây bệnh lao, đặc biệt là ở mức độ phân tử của chủng vi khuẩn sẽ giúp
tìm hiểu được các vấn đề quan trọng như nguồn lây, tình trạng lan truyền,
phân bố các type phân tử của vi khuẩn lao [25]. Với mục đích trên, luận văn
này đề cập đến một số tính chất sinh học phân tử của chủng M.tuberculosis
phân lập được từ bệnh nhân lao tỉnh Hưng yên được phân tích bằng kỹ thuật
spoligotyping.
Khoa Công nghệ sinh học
2
Khoá luận tốt nghiệp
Nguyễn Văn Quyết
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 TỔNG QUAN VỀ TÌNH HÌNH BỆNH LAO
1.1.1 Tình hình bệnh lao trên thế giới
Bệnh lao gắn liền với sự phát triển xã hội loài người từ hàng ngàn
năm nay, trên thế giới chưa bao giờ và không có một quốc gia nào, một khu
vực nào, một dân tộc nào không có người mắc bệnh lao và chết do lao. Ngày
nay, bệnh lao đang xuất hiện trở lại và cùng với đại dịch HIV/AIDS trở
thành một trong những căn nguyên gây mắc bệnh và tử vong chủ yếu, đặc
biệt tại các nước đang phát triển.
Năm 1993, Tổ chức Y tế thế giới (TCYTTG) đã tuyên bố tình trạng
khẩn cấp toàn cầu của bệnh lao và mối hiểm hoạ của nó trong tương lai là
bệnh lao kháng thuốc.
Hiện nay, trên thế giới có khoảng 2,2 tỷ người đã nhiễm lao (chiếm
1/3 dân số thế giới). Khoảng 95% số bệnh nhân lao và 98% số người chết do
lao ở các nước có thu nhập vừa và thấp, 75% số bệnh nhân lao cả nam và nữ
ở độ tuổi lao động. Trong đó, có khoảng 80% số bệnh nhân lao toàn cầu
thuộc 22 nước có gánh nặng bệnh lao cao [2].
Hiện nay, tỷ lệ điều trị thành công trên toàn cầu đạt 82%, nhưng tỷ lệ

phát hiện chỉ đạt 37% số bệnh nhân ước tính. Như vậy, còn rất nhiều bệnh
nhân lao không được chữa trị đang tiếp tục lây bệnh cho cộng đồng, và theo
ước tính của TCYTTG, mỗi năm có thêm 1% dân số thế giới bị nhiễm lao
(65 triệu người). Trong đó hơn 33% số bệnh nhân lao toàn cầu tại khu vực
Khoa Công nghệ sinh học
3
Khoá luận tốt nghiệp
Nguyễn Văn Quyết
Đông-Nam Châu Á.
Bảng 1. Ước tính tỷ lệ mắc và tử vong do lao ở các khu vực (TCYTTG, 2004) [2]
Khu vực
Số bệnh nhân lao
(nghìn)
Tỷ lệ/100 000
Số tử vong do lao
(bao gồm cả nhiễm HIV)
Các thể AFB (+) Các thể AFB (+) # (nghìn) /100.000
Châu Phi
(26%)
2.354 1.000 350 149 556 83
Châu Mỹ
(4%)
370 165 43 19 53 6
Trung Đông
(7%)
622 279 124 55 143 28
Châu Âu
(5%)
472 211 54 24 73 8
Đông nam Châu

Á (33%)
2.890 1.294 182 81 625 39
Tây Thái Bình
Dương (24%)
2.090 939 122 55 373 22
Toàn cầu
(100%)
8.797 3.887 141 63 1.823 29
Mức độ nặng nề của bệnh lao đã ảnh hưởng tới thu nhập quốc dân và
chỉ số phát triển con người của các quốc gia. Các nghiên cứu về kinh tế y tế
Khoa Công nghệ sinh học
4
Khoá luận tốt nghiệp
Nguyễn Văn Quyết
cho thấy mỗi bệnh nhân lao sẽ mất trung bình 3-4 tháng lao động, làm giảm
20-30% thu nhập bình quân của gia đình. Những gia đình có người chết sớm
vì bệnh lao có thể sẽ mất tới 15 năm thu nhập [2]. Bệnh lao đã tác động
mạnh tới 70% đối tượng lao động chính của xã hội, làm lực lượng sản xuất
bị giảm sút, năng suất lao động giảm. Bệnh lao là nguyên nhân chủ yếu gây
nghèo đói dai dẳng và là trở ngại đối với sự phát triển kinh tế xã hội. Như
vậy, bệnh lao là kết quả của nghèo đói và nghèo đói lại là nguyên nhân làm
cho bệnh lao phát triển.
1.1.1.1 Bệnh lao và HIV/AIDS
Theo TCYTTG đến cuối năm 2002, trên thế giới có 42 triệu người
nhiễm HIV, trong đó 50% đồng nhiễm lao và HIV [2].
HIV là yếu tố nguy cơ làm cho người nhiễm lao phát triển thành bệnh
lao, nguy cơ đó cao gấp 30 lần so với người không bị nhiễm HIV. Đại dịch
HIV/AIDS đã làm tăng ít nhất 30% số bệnh nhân lao trên loàn cầu và bệnh
lao là nguyên nhân gây tử vong cho 1/3 số đối tượng nhiễm HIV trên toàn
cầu. Như vậy, đại dịch HIV đang làm tăng thêm gánh nặng đồng thời làm

giảm hiệu quả của Chương trình chống lao.
TCYTTG và nhiều đối tác đang kêu gọi tăng cường sự hợp tác và liên
kết giữa Chương trình chống lao quốc gia và Chương trình HIV/AIDS, đặc
biệt là ở Cam-pu-chia, Trung Quốc, Pa-pua-Niu-Ghi-nê và Việt Nam, là
những nơi có số người đồng nhiễm Lao/HIV đang gia tăng. Nghiên cứu về
tỷ lệ HIV trong số bệnh nhân lao tại Cam-pu-chia năm 2003 cho thấy lại thủ
đô Phnom Penh, tỷ lệ bệnh nhân lao nhiễm HIV tăng gần gấp 3 lần so với
năm 1995 (từ 11% năm 1995 lên 31% năm 2003) [2].
Khoa Công nghệ sinh học
5
Khoá luận tốt nghiệp
Nguyễn Văn Quyết
1.1.1.2 Tình hình bệnh lao kháng thuốc
Theo TCYTTG, hiện nay bệnh lao kháng thuốc là một vấn đề toàn
cầu, đặc biệt nghiêm trọng là tình hình kháng đa thuốc. Bệnh lao kháng
thuốc xuất hiện khi có vi khuẩn lao kháng với một hoặc nhiều loại thuốc
chống lao, nguyên nhân là do bệnh nhân không hợp tác, không luân thủ đúng
nguyên tắc điều trị được quy định của CTCL, một nguyên nhân khác hay
gặp là do thầy thuốc kê đơn không đúng do không phối hợp đầy đủ các
thuốc chống lao, liều lượng thuốc không đủ, hướng dẫn bệnh nhân không
đúng cách, điều trị không đủ thời gian,
Kết quả điều trị với bệnh nhân kháng thuốc thường không cao, nhất là
đối với bệnh nhân kháng đa thuốc. Chi phí điều trị bệnh nhân lao kháng đa
thuốc tăng lên 100 lần so với bệnh nhân lao không kháng thuốc và thậm chí
không điều trị được ở một số trường hợp [2].
1.1.2 Tình hình bệnh lao ở Việt Nam
Năm 1995, trước những biến động xấu đi của tình hình dịch tễ bệnh
lao toàn cầu, công tác chống lao thực sự bắt đầu phải đối mặt với những
thách thức mới là bệnh lao kháng thuốc và Lao/HIV, Nhà nước và Bộ Y tế
Việt nam đã quyết định đưa Chương trình chống lao thành một trong những

Chương trình y tế Quốc gia trọng điểm. Cùng với sự đầu tư phát triển các
Chương trình y tế quốc gia nói chung, Bộ Y tế và Chính phủ đã ưu tiên đầu
tư đồng bộ lượng rất lớn cán bộ, kinh phí và trang thiết bị cho Chương trình
chống lao. Ban chỉ đạo chương trình chống lao và Chính quyền địa phương
các cấp đã tham gia tích cực triển khai công tác này, cùng với sự hợp tác và
giúp đỡ có hiệu quả về tài chính và kỹ thuật của các tổ chức Quốc tế.
Năm 1996, Chương trình chống lao quốc gia với sự hỗ trợ về kỹ thuật
Khoa Công nghệ sinh học
6
Khoá luận tốt nghiệp
Nguyễn Văn Quyết
và tài chính của Chính phủ Hà Lan, Hiệp hội chống lao Hoàng gia Hà Lan,
Uỷ ban hợp tác y tế Hà Lan - Việt nam, chương trình chống lao quốc gia
(CTCLQG) đã hình thành và xây dựng kế hoạch phòng chống lao giai đoạn
1996-2000. Đến năm 1999, chiến lược DOTS (điều trị bằng hoá trị liệu ngắn
ngày có kiểm soát trực tiếp) đã bao phủ 100% số huyện trên cả nước [2].
Trong giai đoạn 1997-2002, CTCLQG đã phát hiện được 532.703
bệnh nhân lao các thể, tỷ lệ phát hiện đạt 82% số bệnh nhân ước tính (so với
mục tiêu của TCYTTG là 70%), CTCLQG đã điều trị 260.698 bệnh nhân
lao phổi AFB(+) với tỷ lệ khỏi là 92%.
Năm 2002, khu vực Tây-Thái Bình Dương phát hiện 806.460 bệnh
nhân lao các thể, 372.220 bệnh nhân lao phổi AFB(+) mới. Trong đó, số
bệnh nhân do CTCLQG Việt nam phát hiện chiếm 12% bệnh nhân các thể
và 15% số bệnh nhân lao phổi AFB(+) mới [2].
Với những kết quả đạt được trong chỉ tiêu phát hiện và điều trị bệnh
nhân, năm 1996, Việt nam là nước đầu tiên ở Châu Á đã đạt được mục tiêu
của TCYTTG. Kiểu hình hoạt động chống lao ở Việt nam được xem là kiểu
hình để học viên các nước học tập.
Nhân ngày Thế giới Chống lao, 24/3/2004, tại Diễn đàn các Đối tác
chống lao lần thứ 2 do TCYTTG tổ chức tại New Dehli, CTCLQG Việt

Nam là một trong 6 nước trên thế giới (bao gồm: Việt Nam, Pêru, Madives,
Cuba, Tunisia và Morocco) và là nước duy nhất trong 22 nước có gánh nặng
bệnh lao cao được nhận giải thưởng của TCYTTG về thành tích đã đạt được
mục tiêu của TCYTTG và kết quả có tính bền vững trên 4 năm.
Hiện nay nguy cơ nhiễm lao hàng năm ở nước ta ước tính là 1,5% (ở
các tỉnh phía Nam là 2%, ở các tỉnh phía Bắc là 1%). Ước tính với dân số
70-80 triệu, hàng năm ở nước ta có[2]:
Khoa Công nghệ sinh học
7
Khoá luận tốt nghiệp
Nguyễn Văn Quyết
- Tổng số mới mắc lao (các thể): 130.000
- Số lao phổi BK dương tính mới: 60.000
- Tổng số trường hợp lao: 260.000
- Tổng số lao phổi BK dương tính: 120.000
Trên thực tế, chỉ số nguy cơ nhiễm lao hàng năm có thể cao hơn 1,5%,
như vậy các con số nêu trên có thể còn lớn hơn. Điều đó sẽ tăng thêm sự khó
khăn đối với công tác chống lao không những trong những năm tới mà có
thể còn trong thời gian khá dài, ngay cả khi đã bước sang thiên niên kỷ mới.
Tình hình Lao/HIV ở Việt Nam
Qua theo dõi một số địa phương cho thấy xu hướng tăng số lượng
bệnh nhân Lao/HIV hàng năm. Số lượng bệnh nhân Lao/HIV tăng sẽ làm
tăng gánh nặng và giảm hiệu quả của CTCLQG vì việc chẩn đoán bệnh lao ở
người nhiễm HIV khó khăn hơn, tỷ lệ tử vong trong số bệnh nhân Lao/HIV
cao hơn sẽ làm giảm kết quả điều trị khỏi bệnh của Chương trình.
Theo số liệu giám sát trọng điểm của Chương trình HIV/AIDS cho
thấy tỷ lệ HIV(+) trong số bệnh nhân lao năm 2002 trên cả nước khoảng
3,2%, trong đó có 10 tỉnh > 3% (Hồ Chí Minh 9,4% và An Giang 4,8%)[2].
Khoa Công nghệ sinh học
8

Khoá luận tốt nghiệp
Nguyễn Văn Quyết
1.2 VI KHUẨN GÂY BỆNH LAO M. tuberculosis
1.2.1 Đặc điểm và phân loại vi khuẩn lao Mycobacterium
tuberculosis
Trực khuẩn lao M.tuberculosis được tìm thấy vào ngày 24 tháng 3
năm 1882 bởi Robert Koch.Với thành công này, ông đã nhận được giải
thưởng của Nobel về vi sinh vật học và y học năm 1905 [6]. Mycobacterium
là giống vi khuẩn thuộc họ Mycobacteriaceae, bộ Actinomycetes, là trực
khuẩn hiếu khí bắt buộc, tế bào vi khuẩn lao dài từ 2-4µm, rộng 0,3-0,5µm,
không có lông, hai đầu tròn. Với phương pháp nhuộm Ziehl-Neelsen, vi
khuẩn không bị cồn hay axít làm mất màu đỏ Fucsin. Khuẩn lạc có màu kem
hoặc vàng đỏ do sinh sắc tố porphyrin, carotenoid, và có dạng xù xì hình
suplơ [1].
Bảng 2. Tính chất của các vi khuẩn thuộc nhóm trực khuẩn lao [6]
Vi khuẩn Hình thái khuẩn
lạc
Nhiệt độ phát
triển thích
hợp
Thời gian
mọc khuẩn
lạc
Khả năng
gây
bệnh
M.tuberculoi
s
M.bovis
M.avium

M.mioroti
Xù xì,màu kem
Xù xì,mỏng,trong
Màu hồng
Màu trắng
37
o
C
37
o
C
37
o
C
37
o
C
30 ngày
30 ngày
10 ngày
Lao người
Lao bò
Lao chim,
Lao người,
Lao chuột
Khoa Công nghệ sinh học
9
Khoá luận tốt nghiệp
Nguyễn Văn Quyết
Trong điều kiện tự nhiên vi khuẩn lao có thể tồn tại 3-4 tháng, trong

phòng thí nghiệm có thể tồn tại trong nhiều năm. Dưới ánh sáng mặt trời vi
khuẩn lao chết trong 1,5 giờ. Nếu chiếu tia cực tím thì vi khuẩn chỉ tồn tại
trong 2-3 phút, ngừng phát triển từ 42
o
C, chết sau 10 phút tại 86
o
C, ở cồn 90
o
chết trong 3 phút, trong axít phenic 5% chết trong vòng 1 phút [1].
1.2.2 Đặc điểm bệnh sinh
Lao là một bệnh lây: Nguồn lây chủ yếu của vi khuẩn lao thông qua
con đường hô hấp, người hít phải những mẫu đờm của bệnh nhân lao phổi
khi ho, khạc, hắt hơi sẽ bị nhiễm lao. Ngày nay bệnh lao còn có thể lây qua
các con đường khác như tiêu hóa, da, niêm mạc…[ 1]
Triệu chứng đầu tiên của bệnh lao bao gồm: mệt mỏi, sút cân và ra mồ
hôi về đêm. Các triệu chứng của thể lao phổi bao gồm: ho kéo dài, có thể ho
ra máu và đau ngực. Tuy nhiên, ở trẻ em dấu hiệu của lao phổi chỉ là trẻ phát
triển chậm hoặc không tăng cân.
1.3 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN, XÉT NGHIỆM,
PHÂN LOẠI VI KHUẨN LAO
1.3.1 Các phương pháp không sử dụng yếu tố di truyền
1.3.1.1 Soi kính
Kĩ thuật soi kính trực tiếp sử dụng thuốc nhuộm Ziehl-Neelsen, huỳnh
quang để phát hiện trực khuẩn lao là kỹ thuật cơ bản được sử dụng rộng rãi
cho đến nay trong các phòng thí nghiệm tuyến huyện trở lên, cho kết quả
nhanh và giá thành thấp hơn so với tất cả các phương pháp khác. Giới hạn để
phát hiện được vi khuẩn lao bằng kỹ thuật này là 5000 – 10000 vi khuẩn trên
ml. Độ nhạy soi kính phụ thuộc vào loại bệnh phẩm và trình độ kĩ thuật viên.
Khoa Công nghệ sinh học
10

Khoá luận tốt nghiệp
Nguyễn Văn Quyết
Thông thường thì độ nhạy ở ngưỡng 46-78%, độ đặc hiệu là 100%. Độ nhạy
của kĩ thuật có thể được cải thiện nếu mẫu bệnh phẩm được li tâm thu cặn tế
bào trước khi tiến hành nhuộm soi. Kết quả nhuộm soi kính trực tiếp không
phân loại được các chủng vi khuẩn Mycobacteria [3].
Hình 1. Hình ảnh vi khuẩn lao khi nhuộm Ziehl-Neelsen và huỳnh
quang.
1.3.1.2 Phương pháp xác định acid tuberculostearic (TBSA)
Acid tuberculostearic (TBSA) là axít béo có trong thành phần vách
tế bào của vi khuẩn Mycobacteria và các vi khuẩn Actinomycetales khác
như là Nocardia và Actinomyces. TBSA được phát hiện nhờ kĩ thuật sắc
kí khí - khối phổ kết hợp với định lượng ion có chọn lọc. Khi cấu trúc
vách tế bào Mycobacteria được máy sắc kí nghiền nhỏ thành các đơn
chất, các chất này bị ion hóa và chuyển động trong điện trường của máy
đo khối lượng phân tử, thông qua số lượng các ion đo được có thể suy ra
khối lượng của TBSA có trong bệnh phẩm. Bệnh phẩm có thể là đờm,
dịch màng phổi, dịch não tủy, dịch dạ dày, dịch màng bụng. Độ nhạy và
độ đặc hiệu của kĩ thuật này khá cao, thời gian trả kết quả sau khoảng 3
giờ. Tuy nhiên TBSA lại không chỉ có ở vi khuẩn lao, vì thế phải lưu ý
đến những mẫu bệnh phẩm có thể chứa các vi khuẩn khác cũng có TBSA
[3].
Khoa Công nghệ sinh học
11
Khoá luận tốt nghiệp
Nguyễn Văn Quyết
1.3.1.3 Phương pháp xác định kháng nguyên
Người ta sử dụng kĩ thuật ELISA để xác định kháng nguyên
Mycobacteria trong bệnh phẩm. Kĩ thuật giảm độ đặc hiệu nếu sử dụng
kháng thể đa dòng. Nhiều nghiên cứu [15] đã dùng kháng thể đơn dòng

để xác định kháng nguyên M. tuberculosis, cho độ đặc hiệu cao hơn so
với các loại kháng thể đa dòng khác. Phương pháp cho kết quả nhanh, kĩ
thuật và phương tiện không đòi hỏi cao. Độ nhạy và đặc hiệu khá cao đối
với bệnh nhân lao phổi, còn với lao ngoài phổi thì vẫn còn hạn chế do
lượng vi khuẩn lao có trong bệnh phẩm phần lớn ít hoặc không phát hiện
được. Tuy nhiên phương pháp này chưa đạt được độ nhạy cao hơn so với
phương pháp soi kính phát hiện trực khuẩn kháng axit (AFB) trực tiếp
trong mẫu bệnh phẩm, nên tính ứng dụng còn hạn chế.
1.3.1.4 Phương pháp xác định kháng thể đặc hiệu với M.tuberculosis
Xác định kháng thể kháng M.tuberculosis trong huyết thanh là
phương pháp được sử dụng cho chẩn đoán sàng lọc lao, đặc biệt có ích trong
chẩn đoán cộng điểm lao trẻ em, chẩn đoán sàng lọc lao ngoài phổi, là
những thể lao ít vi khuẩn, khó xác định bằng các phương pháp phát hiện tác
nhân gây bệnh trực tiếp như soi kính và nuôi cấy. Kháng nguyên của vi
khuẩn lao được chiết xuất từ tế bào vi khuẩn bằng phương pháp siêu nghiền
tế bào (kháng nguyên siêu nghiền) hoặc tách thành các thành phần riêng
biệt, tùy theo bản chất hoặc trọng lượng phân tử khác nhau, phụ thuộc mục
đích nghiên cứu hay chiết xuất từ môi trường nuôi cấy (kháng nguyên hoà
tan). Kháng nguyên có thể là protein, peptidoglican, polysaccharide. Các
kháng thể đích phát hiện là IgG, IgA, IgM đặc hiệu. Trong đó chỉ số IgG đặc
Khoa Công nghệ sinh học
12
Khoá luận tốt nghiệp
Nguyễn Văn Quyết
hiệu thường được sử dụng do có hiệu giá cao hơn, thời gian tồn tại trong
huyết thanh dài hơn, có vai trò đặc trưng cho tình trạng nhiễm lao của cơ thể
[4].
1.3.1.5 Phương pháp nuôi cấy
Nuôi cấy phân lập vi khuẩn lao là phương pháp “tiêu chuẩn vàng” để
chẩn đoán bệnh lao. Bệnh phẩm được cấy trên môi trường đặc Loweinstein-

Jensen, Ogawa, Kudoh, môi trường thạch Middlebrook, canh thang Kirchner
và ủ ấm ở 37ºC. Khuẩn lạc có màu kem hoặc vàng đỏ và có dạng xù xì hình
suplơ. Sau 1 -2 tháng hoặc có khi lâu hơn mới xác định được kết quả chính
xác. Phương pháp này có độ nhạy và đặc hiệu cao hơn so với phương pháp
soi kính, đồng thời phân loại được vi khuẩn lao. Nhưng phương pháp đòi hỏi
thời gian nuôi cấy dài, giá thành cao nên chỉ sử dụng cho các trường hợp
không đáp ứng với thuốc điều trị, cần nuôi cấy để làm kháng sinh đồ nhằm
xác định tính nhạy cảm của chủng vi khuẩn, phục vụ công tác điều trị [3,6].
1.3.1.6 Thử nghiệm trong da (Phản ứng Mantoux)
Nguyên tắc chung của phản ứng là đưa một lượng kháng nguyên đặc
hiệu thích hợp vào da, nếu cơ thể đã nhiễm vi khuẩn sẽ xảy ra sự tương tác
giữa kháng nguyên và tế bào lympho mẫn cảm, đại thực bào, gây nên phản
ứng viêm. Phản ứng xảy ra mạnh nhất sau khoảng 70 giờ sau tiêm. Kháng
nguyên hay sử dụng là kháng nguyên protein chiết xuất từ dịch nuôi cấy trực
khuẩn lao (PPD). Đây là phương pháp thực hiện đơn giản, cho kết quả
nhanh (sau 72 giờ), giá thành thấp, tuy nhiên đòi hỏi kỹ năng tiêm trong da
chính xác. Độ đặc hiệu của phương pháp không cao do ảnh hưởng của việc
tiêm BCG. Hiện nay người ta dự tính sử dụng dạng kháng nguyên khác của
Khoa Công nghệ sinh học
13
Khoá luận tốt nghiệp
Nguyễn Văn Quyết
M.tuberculosis có trọng lượng phân tử là 38 kDa, là kháng nguyên có tính
đặc hiệu do vậy có triển vọng hơn, khắc phục được hạn chế của kháng
nguyên PPD [3,15]. Tuy nhiên cho đến nay, phương pháp tiêm trong da sử
dụng PPD vẫn đang được sử dụng trên thế giới do kháng nguyên mới vẫn
đang trong quá trình nghiên cứu.
1.3.1.7 Phương pháp sử dụng thực khuẩn thể (phage)
Đây là một trong những phương pháp được sử dụng khá phổ biến
trong phân loại vi khuẩn lao. Đặc biệt phương pháp hữu ích đối với việc

phân loại một số chủng vi khuẩn lao từ các khu vực bùng phát dịch bệnh và
kiểm tra khả năng nhiễm chéo phòng thí nghiệm [10]. Tuy nhiên, phương
pháp này có độ nhạy thấp do hạn chế về số lượng các loại phage
Mycobacterium.
1.3.2 Các phương pháp sử dụng yếu tố di truyền
1.3.2.1 Phương pháp đa dạng độ dài cắt đoạn giới hạn (Restriction
Fragment Length Polymorphism –RFLP)
Phương pháp này đánh giá sự khác nhau về cấu trúc di truyền DNA
của vi khuẩn lao. Nhiễm sắc thể của vi khuẩn lao được cắt bởi enzyme giới
hạn để tạo ra các đoạn DNA ngắn hơn. Các mảnh DNA sau khi cắt sẽ được
chạy trên gel agarose và tạo ra các vạch riêng biệt.
Tính đa dạng trong di truyền của vi khuẩn lao có thể được làm sáng tỏ
thông qua việc lai ghép các đoạn DNA sau khi chạy điện di với một đoạn
DNA mồi được đánh dấu, có trình tự bổ trợ với một trình tự đặc trưng nào
đó của vi khuẩn. Từ đó có thể phát hiện được số lượng và vị trí của trình tự
cần xác định trên nhiễm sắc thể. Bất cứ đoạn axít nucleic nào của vi khuẩn
Khoa Công nghệ sinh học
14
Khoá luận tốt nghiệp
Nguyễn Văn Quyết
đều có thể dùng được để sản xuất mồi. Tuy nhiên, để gia tăng khả năng
phân loại người ta thường chọn đoạn DNA có tần suất lặp lại cao trên nhiễm
sắc thể của vi khuẩn. Sau khi lai với đoạn mồi, tất cả các đoạn cắt có mang
trình tự bổ trợ với đoạn mồi sẽ được hiển thị, tạo nên các dấu ấn
(fingerprinting) đặc trưng cho từng chủng. Dựa vào hình ảnh phân bổ các
vạch đặc hiệu, người ta có thể phân loại dịch tễ học các chủng vi khuẩn lao
phân lập từ bệnh phẩm của bệnh nhân lao.
Đoạn xen IS6110 là trình tự phổ biến nhất được sử dụng trong kỹ
thuật RFLP. Đây là đoạn xen thuộc gia đình IS3 của họ Enterbacteriaceae
[18]. Phụ thuộc vào đối tượng mang đoạn xen IS mà có tên gọi là IS6110

hoặc là IS986 trong M.tuberculois hay là IS987 ở M.bovis – BCG[24].
IS6110 là một trình tự gồm 1361 cặp bazơ được phát hiện trong genom vi
khuẩn thuộc nhóm M.tuberculosis. Khi so sánh trình tự đoạn xen của các
chủng khác nhau thì thấy chúng chỉ khác nhau ở một vài nucleotid. Số lượng
bản sao đoạn xen xuất hiện trên nhiễm sắc thể của M.tuberculosis mang tính
đặc trưng theo loài và khác nhau ở các chủng vi khuẩn. Phần lớn các chủng
vi khuẩn thuộc nhóm M.tuberculosis có từ 8-15 bản sao đoạn xen nằm rải
rác tại các vị trí khác nhau trên nhiễm sắc thể [12,24,25].
Do tính chất đặc hiệu cao về số lượng và vị trí phân bố của IS6110, kỹ
thuật RFLP cho đến nay vẫn được coi là kỹ thuật sinh học phân tử "tiêu
chuẩn vàng" và được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu dịch tễ học
phân tử chủng gây bệnh lao. Quy trình kỹ thuật RFLP đã được chuẩn hóa
trên toàn cầu, do vậy kết quả thu được giữa các phòng thí nghiệm khác nhau
có thể so sánh được với nhau, cho phép nghiên cứu sự lan truyền bệnh trong
Khoa Công nghệ sinh học
15
Khoá luận tốt nghiệp
Nguyễn Văn Quyết
phạm vi quốc gia và trên thế giới [16,22]. Nhược điểm của phương pháp này
là phải nuôi cấy vi khuẩn, phải tách chiết một khối lượng DNA lớn, nguyên
vẹn và tinh khiết. Qui trình thực hiện do đó đòi hỏi khoảng 5 ngày, kỹ thuật
viên phải được đào tạo kỹ lưỡng và điều kiện phòng thí nghiệm đạt mức độ
hiện đại. Mặt khác phương pháp hạn chế đối với khả năng phân loại các
chủng vi khuẩn (chủ yếu là chủng M.bovis ) có ít các bản sao IS6110 [26].
Phương pháp này chỉ hữu ích đối với chủng có số lượng bản sao IS6110 cao
hơn (thông thường có 5 đoạn xen trở lên).
Bên cạnh đó, có một số chủng lao không có đoạn xen IS6110 trên
nhiễm sắc thể, và một vài Mycobacteria không gây bệnh lao cũng chứa các
trình tự phức tạp, có khả năng lai ghép với đoạn mồi IS6110, tạo kết quả
tương tự, gây giảm độ đặc hiệu của phương pháp [19].

1.3.2.2 Phương pháp điện di xung trường (Pulsed Field Gel
Electrophoresis-PFGE)
Phương pháp điện di xung trường (PFGE) được nghiên cứu phát triển
nhằm ứng dụng để khắc phục các nhược điểm của phương pháp RFLP.
Phương pháp này sử dụng enzyme giới hạn có tần suất cắt thấp trên nhiễm
sắc thể của vi khuẩn lao. Sau đó, chạy điện di các mảnh cắt trên gel agarose
trong điều kiện đặc biệt của dòng điện. Hạn chế chính của kỹ thuật này là
cho kết quả tạo các dấu ấn đơn giản đối với các chủng lao khác nhau nên có
khả năng phân loại chủng thấp [27].
Khoa Công nghệ sinh học
16
Khoá luận tốt nghiệp
Nguyễn Văn Quyết
1.3.2.3 Phương pháp đa dạng trình tự lặp lại giàu GC (Polimorphic GC-
rich repetitive sequence – PGRS)
Yếu tố lặp lại nhiều nhất trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn lao là các
trình tự lặp lại giàu guanin (G) và cytosin (C). Kỹ thuật đa dạng trình tự lặp
lại giàu GC (PGRS) giúp xác định tính đa dạng của các trình tự có số lượng
lớn các bản sao có chiều dài 96 cặp GC lặp lại liên tiếp cùng chiều. Trình tự
này xuất hiện tại 26 vị trí khác nhau trên nhiễm sắc thể của M.tuberculosis
và cũng được phát hiện ở một số ít vi khuẩn Mycobacteria không thuộc
nhóm M.tuberculosis [20]. Tính đa dạng các trình tự giàu GC trong PGRS
đã được khai thác để phân loại M.tuberculosis.
1.3.2.4 Phương pháp sử dụng trình tự mã hóa RNAr 16S và RNAr 23S
Các đoạn DNA nằm giữa gen mã hóa RNAr 16S và RNAr 23S được
khuyếch đại nhờ phản ứng PCR. Sản phẩm tạo ra được cắt bởi enzyme giới
hạn, sau đó được chạy điện di tạo ra các vạch khác nhau trên gel agarose,
nhờ đó có thể được phân biệt các chủng khác nhau [7].
1.3.2.5 Phương pháp sử dụng trình tự lặp lại trực tiếp DR (Direct repeat
cluster - DR cluster)

Phương pháp này sử dụng các trình tự ngắn gồm 36 cặp bazơ lặp lại
trực tiếp, với tần suất lặp lại không cố định nằm xen kẽ giữa các đoạn trung
gian có chiều dài từ 35-41 cặp bazơ có trình tự không lặp lại. Số lượng các
đoạn trung gian và trình tự lặp lại không trực tiếp trong cụm DR đều có 50
bản sao cho mỗi loại. Sự có mặt hay vắng mặt của một hay nhiều đoạn trung
gian mang tính đặc hiệu đối với từng chủng vi khuẩn (hình 2), giúp ích cho
việc phân loại vi khuẩn lao [22].
Khoa Công nghệ sinh học
17
Khoá luận tốt nghiệp
Nguyễn Văn Quyết
Hình 2. Cấu trúc của cụm DR trên nhiễm sắc thể M.tuberculosis H37Rv và
M.bovis BCG P3 (các ô hình chữ nhật màu xanh biểu thị các trình tự lặp lại
trực tiếp bao gồm 36 cặp bazơ -DR).
Một trong những phương pháp sử dụng rộng rãi nhất trong nghiên cứu
dịch tễ học phân tử là Spoligotyping. Đây là công cụ thích hợp nhất để khắc
phục các hạn chế của phương pháp IS6110-RFLP trong phân tích dịch tễ học
bệnh lao, mặc dù Spoligotyping có khả năng phân biệt thấp hơn so với
phương pháp IS6110-RFLP đối với các chủng lao có số lượng bảo sao
IS6110 lớn nhưng lại có ưu điểm vượt trội khi phân tích các chủng lao có số
lượng bản sao đoạn xen IS6110 thấp [8].
1.4 PHƯƠNG PHÁP SPOLIGOTYPING
1.4.1 Nguyên lý của phương pháp Spoligotyping
Spoligotyping được sử dụng để phân loại vi khuẩn lao trong nghiên
cứu dịch tễ học để kiểm soát tính lan truyền của bệnh, phân loại các chủng vi
khuẩn có số lượng đọan xen IS6110 thấp và để phát hiện sớm việc lan truyền
bệnh dịch nhất là dịch gây ra bởi chủng lao kháng đa thuốc. Đây là phương
pháp khá đơn giản trong thao tác, cho kết quả nhanh và giá thành không cao,
lại rất hiệu quả trong việc phân tích vi khuẩn lao nhất là các chủng có kiểu
Khoa Công nghệ sinh học

18
Khoá luận tốt nghiệp
Nguyễn Văn Quyết
gen khác thường như chủng Bắc Kinh (Beijing) hoặc để điều tra quá trình
tiến hóa về mặt di truyền của vi khuẩn lao khi kết hợp với các kỹ thuật khác
[8]. Ngoài ra, do kỹ thuật Spoligotyping có thể thực hiện trực tiếp với bệnh
phẩm soi kính dương tính nên còn cho phép phát hiện nhanh vi khuẩn lao từ
bệnh phẩm.
Spoligotyping là phương pháp phân tích tính đa dạng của vùng lặp lại
trực tiếp hay còn gọi là vùng DR. Khi so sánh cụm DR của nhiều chủng
M.tuberculosis khác nhau người ta thấy thứ tự sắp xếp của các đoạn trung
gian hầu như không thay đổi. Tuy nhiên sự có mặt hay mất đi của mỗi đoạn
trung gian lại có tính đặc hiệu cao trong vi khuẩn (Hình 3).
Hình 3. Sơ đồ mô phỏng sự đa hình trong vùng DR của các chủng thuộc
nhóm M.tuberculosis
Khoa Công nghệ sinh học
19
Khoá luận tốt nghiệp
Nguyễn Văn Quyết
Hình 4. Nguyên lý của quá trình khuyếch đại DNA in vitro bên trong vùng
DR của vi khuẩn M.tuberculosis. Sử dụng cặp mồi Dra và Drb cho phản
ứng PCR, với mồi Dra có gắn biotin ở đầu 5’.
Lợi dụng đặc điểm này người ta dùng kỹ thuật PCR với cặp mồi có
gắn biotin có trình tự bổ trợ cho trình tự DR để khuyếch đại về mặt số lượng
toàn bộ các đoạn trung gian có trong genom của mỗi vi khuẩn (Hình 4). Sản
phẩm PCR là các đoạn trung gian được lai với 43 oligonucleotid đã biết
trình tự được gắn sẵn trên màng nitrocelluler. Kết quả sau khi lai là mỗi
đoạn trung gian gắn với một oligonucleotid tương ứng trên màng. Do các
đoạn trung gian đã được đánh dấu bằng biotin, nên tác dụng với streptavinin
có trong cộng hợp và bộc lộ màu dưới tác dụng của cơ chất phù hợp, giúp

nhận biết được khi chụp phim âm bản (Hình 5). Kết quả lai ghép giữa các
đoạn trung gian trong mỗi vi khuẩn sẽ tạo nên kiểu hình vạch Spoligotype
đặc trưng cho chủng vi khuẩn đó (Hình 5).
Khoa Công nghệ sinh học
20
Khoá luận tốt nghiệp
Nguyễn Văn Quyết
Hình 5: Kết quả Spoligotyping sau khi lai trên màng lai đã gắn sẵn 43
oligonucleotid trung gian (mỗi cột chiều dọc tương ứng với 1 loại trình tự
trung gian, mỗi hàng ngang là kiểu hình spoligonucleotid của một vi khuẩn)
Khoa Công nghệ sinh học
21
Khoá luận tốt nghiệp
Nguyễn Văn Quyết
1.4.2 Cơ sở dữ liệu Spoligotyping quốc tế spolDB4
Cơ sở dữ liệu Spoligotyping quốc tế, spolDB4, mô tả 1939 kiểu hình
spoligotype của 39.295 chủng lao từ 122 nước trên thế giới, tạm thời chia
làm 62 nhánh (dòng) dựa trên tổng hợp các thông tin sinh học và các nghiên
cứu chuyên nghiệp về phân loại [11,14].
SpolDB4 cung cấp một bức tranh rõ nét về tính đa dạng di truyền hiện
nay của vi khuẩn lao M.tuberculosis mối liên quan về tính đa dạng di truyền
của vi khuẩn M.tuberculosis, mối liên quan về di truyền giữa các
spoligotype, một bức tranh phân loai dưới loài và về lịch sử tiến hóa dưới
loài. SpolDB4 còn cập nhật các thông tin dịch tễ về các spoligotype, cũng
như bản đồ dịch tễ một số nhánh M.tuberculosis phổ biến.
SpolDB4 là công cụ hữu hiệu trong việc xác định nhận dạng của một
chủng lao nào đó đồng thời phân tích giữa vị trí lưu hành hiện tại của chủng
với lịch sử tiến hóa trước đó.
Khoa Công nghệ sinh học
22

Khoá luận tốt nghiệp
Nguyễn Văn Quyết
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu
Chủng M.tuberculosis: bao gồm 65 chủng vi khuẩn lao phân lập từ bệnh
nhân lao thuộc tỉnh Hưng Yên (do Bệnh viện Lao & Bệnh phổi Hưng yên
cung cấp).
2.2 Thiết bị và nguyên vật liệu
Thiết bị:
• Máy lắc
• Tủ ấm
• Lò lai
• Miniblotter
• Máy hút chân không
• Pipetman loại 1000µl, 200µl và 20µl
• Khay rửa màng
• Máy chạy PCR
• Bộ điện di gel agarose
Dung dịch và sinh phẩm:
• Hỗn dịch phản ứng PCR
• Kít màng lai Spoligo (Iosgen Bioscience)
• Cộng hợp gắn Streptavidin (Roche)
• Phim ECL (Kodak)
• Kít ECL (Amesham)
• SDS (Sigma)
Vật liệu tiêu hao:
Khoa Công nghệ sinh học
23
Khoá luận tốt nghiệp

Nguyễn Văn Quyết
• Tube eppendorf loại 2ml, 0,5ml, 0,2ml
• Đầu côn 1000µl, 200µl, 20µl
• Giấy thấm whatman
2.3 Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu sử dụng phương pháp Spoligotyping để phân loại 65 chủng vi
khuẩn lao phân lập được từ bệnh nhân lao của tỉnh Hưng yên.
2.3.1 Quy trình thực hiện phương pháp Spoligotyping
Chuẩn bị mẫu vi khuẩn bất hoạt:
- Gặt khuẩn lạc vi khuẩn lao phát triển trên môi trường
Lowentein-Jensen vào ống nhựa eppendorf có dung lượng 2
ml chứa sẵn 150ml dung dịch TE (TrisHCl 10mM, EDTA
1mM).
- Ủ trong tủ ấm 100ºC trong 30 phút để giết chết vi khuẩn và phá
vỡ vỏ tế bào, bộc lộ DNA của vi khuẩn
- Bảo quản DNA tại -20ºC
Chuẩn bị hỗn dịch phản ứng PCR:
Dùng một ống eppendorf loại 2 ml để pha hỗn dịch phản ứng PCR.
Dựa trên số mẫu vi khuẩn cần làm để tính toán toàn bộ lượng hỗn dịch cần
phải pha. Mỗi chủng cần một ống phản ứng. Ngoài ra phải có 01 ống phản
ứng dùng để đựng mẫu chứng dương và một ống đựng mẫu chứng âm. Công
thức pha hỗn dịch để thực hiện xét nghiệm PCR cho 10 mẫu được nêu trong
bảng sau:
Thành phần phản ứng PCR Thể tích Nồng độ cuối
Khoa Công nghệ sinh học
24
Khoá luận tốt nghiệp
Nguyễn Văn Quyết
H
2

O
Dung dịch đệm 5X
MgCl2 50mM
Mồi Dra 5M
Mồi Drb 5M
dNTP 2,5mM
Tth polymerase 5U/µl
149 µl
100 µl
70 µl
40 µl
40 µl
80 µl
1 µl
1X
7mM
0,4 µl
0,4 µl
0,4 µl
0,5/ µl
Tổng thể tích 480 µl 48µl/ống
Trình tự các đoạn mồi được sử dụng để khuyếch đại DNA đặc hiệu của
các chủng lao M.tuberculosis bao gồm:
Dra: 5’ biotin GGT TTT GGG TCT GAC GAC 3’
Drb:5’ CCG AGA GGG GAC GGA AAC 3’
Mỗi ống phản ứng được chia 48 µl hỗn dịch phản ứng (dùng ống
eppendorf loại 0,5ml hoặc 0,2ml).
Hỗn dịch phản ứng sau khi được chia vào các ống chạy PCR cần được
bảo quản ở nhiệt độ lạnh (trong đá hoặc trong tủ lạnh ở 4ºC) cho đến khi
chạy phản ứng, tốt nhất là dùng luôn trong ngày.

Chạy PCR
Nhỏ vào mỗi ống phản ứng 02µl mẫu DNA của một chủng vi khuẩn lao.
Ống chứng âm được cho 02 µl dung dịch TE và ống chứng dương được cho
02 µl DNA của chủng M.tuberculosis H37Rv chuẩn thức, ống chứng dương
thứ hai cho 02 µl DNA của M.bovis chuẩn.
Khoa Công nghệ sinh học
25