đánh giá các tính chất Lý-Hóa của cellulase từ chung vi sinh vật phân lập từ suối nước nóng

Ti liu chia s ti: wWw.SinhHc.edu.vn
đại học tháI nguyên
khoa khoa học tự nhiên và xã hội
Đề tài sinh viên nghiên cứu khoa học

đánh giá các tính chất lý hóa của cellulase từ
chủng vi sinh vật phân lập từ suối nớc nóng
Chuyên ngành : Hóa Sinh

Giáo viên hớng dẫn : ThS. Trịnh Đình Khá
Sinh viên thực hiện : Đinh Thị Hồng
Trang
Lớp : Công nghệ Sinh
B2K3

(Đề tài thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh học khoa
KHTN&XH)
Ti liu chia s ti: wWw.SinhHc.edu.vn
Nội dung chính của báo cáo

1. Mở đầu
2. Mục tiêu nghiên cứu
3. Tổng quan tài liệu
4. Vật liệu và phơng pháp nghiên cứu
5. Kết quả nghiên cứu và thảo luận
6. Kết luận và đề nghị
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHc.edu.vn
Më ®Çu
Lý do chän ®Ò tµi
• Cellulase là một trong những loại enzyme có vai trò rất quan
trọng trong nhiều lĩnh vực đời sống, sản xuất của con người.

• Việc nghiên cứu để tìm ra các enzyme chịu nhiệt và bền nhiệt
có vai trò quan trọng, quyết định khả năng ứng dụng của
chúng.
• Đã có nhiều công trình nghiên cứu về enzyme bền nhiệt nói
chung và cellulase chịu nhiệt nói riêng từ các nguồn vi sinh
vật khác nhau.
• Các vi sinh vật suối nước nóng là nguồn khai thác tiềm năng
để sản xuất enzyme này.
• Hiện nay các nghiên cứu về vi sinh vật suối nước nóng của
Việt Nam còn chưa được quan tâm đúng mức và còn hạn chế.
• Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi chọn đề tài:
“Đánh giá các tính chất lý hóa của cellulase từ chủng vi sinh
vật phân lập từ suối nước nóng”.
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHc.edu.vn


Môc tiªu nghiªn cøu
1. Phân lập các chủng vi sinh vật từ các suối
nước nóng
2. Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng
sinh tổng hợp cellulase cao
3. Đánh giá các tính chất lý hóa của cellulase.


Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHc.edu.vn
Tæng quan tµi liÖu
1.1. Khái niệm Cellulase

Hình 1.1. Sơ đồ thủy phân mối liên kết
β-1,4-O-glycoside của cellulase
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHc.edu.vn

1.2. Cơ chất của Cellulase











Hình 1.2. Cấu trúc cellulose và mạng lưới liên kết hydro
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHc.edu.vn

Hình 1.3. Cấu trúc cellulose
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHc.edu.vn

1.3. Cơ chế thủy phân của cellulase
Enzyme C
1

Cellulose kết tinh
Cellulose vô định hình
Enzyme C
x

Oligome
r
Enzyme C
x

Enzyme C
1

Cellobiose
Cellobiase
Glucose
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHc.edu.vn

1.4. Khả năng ứng dụng của cellulase
1.4.1. Trong công nghiệp

 Trong công nghiệp thực phẩm
 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc
 Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ
 Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy
 Trong công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa
 Trong công nghiệp dệt
1.4.2. Trong nông nghiệp
1.4.3. Trong bảo vệ môi trường
1.4.4. Trong công nghệ sinh học
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHc.edu.vn
vËt liÖu vµ ph¬ng ph¸p
2.1. VËt liÖu
Bảng 2.1. Mẫu nước suối nước nóng dùng phân lập các chủng vi sinh vật

Stt Tên mẫu Địa điểm suối nước nóng Ngày lấy mẫu Nhiệt độ
1 CP1 Cẩm Thạch - Cẩm Phả
Quảng Ninh
Ngày 5 tháng 7
năm 2007
40
0
C
2 CP2 Quang Hanh - Cẩm Phả
Quảng Ninh
Ngày 28 tháng 7
năm 2007
45
0
C
3 CP3 Quang Hanh - Cẩm Phả

Quảng Ninh
Ngày 8 tháng 10
năm 2007
45
0
C
4 PT La Phù - Thanh Thủy
Phú Thọ
Ngày 12 tháng 8
năm 2007
46
0
C
Ti liu chia s ti: wWw.SinhHc.edu.vn
2.2. Phơng pháp nghiên
cứu
2.2.1. Phơng pháp phân lập vi sinh vật
2.2.2. Phơng pháp nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận
enzyme
2.2.3. Phơng pháp xác định hoạt tính cellulase
2.2.4. Phơng pháp xác định hoạt độ cellulase
2.2.5. Phơng pháp xác định tính chất lý hoá của
cellulase
* Xỏc nh thi gian phn ng ti u
* Xỏc nh nhit phn ng ti u
* Xỏc nh nng c cht phn ng ti u
* Xỏc nh pH phn ng ti u
* nh hng ca ion kim loi n hot tớnh cellulase
2.2.6. Phơng pháp xử lý số liệu theo thống kê sinh
học trên Excel

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHc.edu.vn
KÕt qu¶ vµ Th¶o luËn
3.1. KẾT QUẢ PHÂN LẬP
Bảng 3.1. Các chủng vi sinh vật phân lập được trên các môi
trường khác nhau và hoạt tính của chúng
Stt Tên chủng Môi trường phân lập Hoạt tính Loài
1 CP1.1 Gauze I ++ XK
2 CP1.2 Gauze I ++ XK
3 CP1.3 Gauze I - XK
4 CP1.4 Gauze I - XK
5 CP1.5 Czapek - Nấm
6 CP1.6 Gauze I - XK
7 CP1.7 Gauze I - XK
8 CP1.8 Gauze I - XK
9 CP1.9 Gauze I + XK
10 CP1.10 Gauze I - XK
11 CP1.11 Gauze I - XK
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHc.edu.vn
12 CP1 .12 LB - VK
13 CP1.13 Gauze I ++ XK
14 CP1.14 Gauze I ++ XK
15 CP1.15 Gauze I ++ XK
16 CP1.16 Gauze I ++ XK
17 CP1.17 Gauze I + XK

18 CP1.18 Gauze I ++- XK
19 CP1.19 Gauze I ++- XK
20 CP1.20 Gauze I + XK
21 CP1.21 Gauze I + XK
22 CP1.22 Gauze I + XK
23 CP1.23 Gauze I - XK
24 CP1.24 Gauze I - XK
25 CP1.25 Gauze I + XK
26 CP1.26 Gauze I ++ XK
27 CP1.27 Gauze I ++ XK
28 CP1.28 Gauze I ++ XK
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHc.edu.vn
29 CP1.29 Gauze I - XK
30 CP1.30 Gauze I - XK
31 CP1.31 LB ++- VK
32 CP1.32 LB - VK
33 CP1.33 LB - VK
34 CP2.1 LB - VK
35 CP2.6 LB - VK
36 CP2.7 LB - VK
37 CP2.8 LB - VK
38 PT.1 LB ++ VK
39 PT.2 LB ++- VK
40 PT.3 LB - VK
41 PT.4 LB - VK
42 PT.5 LB +++ VK
43 PT.6 LB ++- VK
44 PT.7 LB ++- VK
45 PT.8 LB ++- VK
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHc.edu.vn

46 PT.9 LB ++- VK
47 PT.10 LB ++ VK
48 PT.11 LB - VK
49 PT.12 LB - VK
50 PT.13 LB - VK
51 PT.14 LB ++- VK
52 PT.15 LB - VK
53 PT.16 LB - VK
54 CP3.1 LB ++- VK
55 CP3.2 LB +++ VK
56 CP3.3 LB ++- VK
57 CP3.4 LB +++ VK
58 CP3.5 LB ++- VK
59 CP3.6 LB ++- VK
60 CP3.7 LB ++- VK
61 CP3.8 LB +++ VK
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHc.edu.vn


3.2. TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT SINH TỔNG HỢP
CELLULASE BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH

Hình 3.1. Tỷ lệ (%) của các chủng vi sinh vật suối nước nóng
có hoạt tính cellulase khác nhau












6.6%
45.9%
9.9%
14.7%
22.9%
Mạnh
Tương đối mạnh
Trung bình
Yếu
Không có hoạt tính
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHc.edu.vn

Chủng CP3.4 có đường kính vòng phân giải lớn nhất

(HT = 33 mm) (Hình 3.2).













Hình 3.2. Hoạt tính cellulase của chủng CP3.4

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHc.edu.vn


3.3. TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT SINH TỔNG HỢP
CELLULASE BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG

Bảng 3.2. Hoạt tính cellulase Hình 3.3. Hoạt tính
của một số chủng vi sinh vật phân lập cellulase của các chủng vi sinh vật
từ suối nước nóng




STT Tên chủng Hoạt tính (IU/ml)
1 CP3.1 0,12 ± 0,001
2 CP3.2 0,25 ± 0,002
3 CP3.3 0,07 ± 0,005
4 CP3.4 0,64 ± 0,006
5 CP3.5 0,07 ± 0,003
6 CP3.6 0,10 ± 0,002
7 CP3.7 0,08 ± 0,001
8 CP3.8 0,13 ± 0,007
9 PT.5 0,11 ± 0,010
10 PT.6 0,16 ± 0,004
0
20
40
60
80
100
120
CP3.1 CP3.2 CP3.3 CP3.4 CP3.5 CP3.6 CP3.7 CP3.8 PT.5 PT.6
Tªn chñng

Ho¹ t tÝnh t- ¬ng ®èi (100%)
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHc.edu.vn
0
20
40
60
80
100
120
16 18 20 22 24 26 28
Thời gian (giờ)
Hoạt tính tương đối (%)
Hình 3.4. Khả năng sinh tổng hợp cellulase của chủng CP3.4 theo thời gian

3.4. KHẢ NĂNG SINH CELLULASE THEO THỜI GIAN
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới khả năng sinh tổng hợp
cellulase của chủng CP3.4
Thời gian (giờ) 18 20 22 24 26
Hoạt tính (IU/ml) 0,43 ± 0,008 0,74 ± 0,012 0,87 ± 0,009 0,67 ± 0,004 0,50 ± 0,007
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHc.edu.vn
Hình 3.5. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hoạt tính cellulase của chủng CP3.4
Thời gian (phút) Hoạt tính (IU/ml) Thời gian (phút) Hoạt tính (IU/ml)
5 3,29 ± 0,012 20 1,01 ± 0,006
10 1,89 ± 0,009 25 0,70 ± 0,003
15 0,42 ± 0,004 30 0,51 ± 0,007

3.5. TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA CELLULASE
3.5.1. Thời gian phản ứng tối ưu
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng tới hoạt tính cellulase của chủng CP3.4
0

20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20 25 30 35
Thời gian (phút)
Hoạt tính tương đối (%)
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHc.edu.vn

3.5.2. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính cellulase
Nồng độ CMC
(%)
Hoạt tính (IU/ml) Nồng độ CMC (%) Hoạt tính (IU/ml)
0,3 0,18 ± 0,007 1,5 0,22 ± 0,008
0,5 0,30 ± 0,005 2,0 0,50 ± 0,102
1,0 0,93 ± 0,014 2,5 0,20 ± 0,004
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính cellulase
0
20
40
60
80
100
120
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
Nồng độ CMC (%)
Hoạt tính tương đối (%)
Hình 3.6. Ảnh hưởng nồng độ cơ chất đến hoạt tính cellulase của chủng CP3.4

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHc.edu.vn
3.5.3. Nhiệt độ phản ứng tối ưu
Nhiệt độ (
0
C) Hoạt tính (IU/ml) Nhiệt độ (
0
C) Hoạt tính (IU/ml)
45 0,91 ± 0,01 60 1,40 ± 0,06
50 0,94 ± 0,02 65 1,79 ± 0,02
55 1,38 ± 0,04 70 1,64 ± 0,05

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính cellulase của chủng CP3.4
0
20
40
60
80
100
120
40 45 50 55 60 65 70 75
Nhiệt độ (
O
C)
Hoạt tính tương đối (%)
Hình 3.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của cellulase của chủng CP3.4
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHc.edu.vn
Đệm pH Hoạt tính (IU/ml)
Acetate
3,5 0,03 ± 0,001
4,0 0,11 ± 0,003

4,5 0,14 ± 0,004
5,0 0,97 ± 0,012
5,5 0,69 ± 0,101
Phosphate
6,5 0,34 ± 0,005
7,0 0,58 ± 0,008
7,5 1,40 ± 0,110
8,0 0,28 ± 0,002
3.5.4. pH phản ứng tối ưu
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của pH
đến hoạt tính cellulase của chủng CP3.4
0
20
40
60
80
100
120
3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5
P
H
Hoạt tính tương đối (%)
Hình 3.8. Ảnh hưởng của pH đến
hoạt tính cellulase của chủng CP3.4
Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHc.edu.vn
Kim loại Hoạt tính (IU/ml)
ĐC 0,84 ± 0,021
Mg
2+
0,50 ± 0,002

EDTA 0,29 ± 0,003
Pb
2+
0,47 ± 0,006
Mn
2+
0,18 ± 0,005
Cu
2+
0,55 ± 0,004
Fe
3+
0,37 ± 0,002
3.5.5. Ảnh hưởng của ion kim loại
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của
ion kim loại đến hoạt tính cellulase
của chủng CP3.4
0
20
40
60
80
100
120
ĐC Mg EDTA Pb Mn Cu Fe
Ion kim loại
Hoạt tính tương đối (%)
Hình 3.9. Ảnh hưởng của ion
kim loại đến hoạt tính cellulase của
chủng CP3.4

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHc.edu.vn
 KẾT LUẬN
1. Đã phân lập được 61 chủng vi sinh vật, trong đó có 32 chủng vi
khuẩn, 28 chủng xạ khuẩn, 1 chủng nấm. Trong số 61 chủng vi
sinh vật có 32 chủng có khả năng sinh tổng hợp cellulase.
2. Đã tuyển chọn được chủng vi khuẩn: CP3.2, CP3.4, CP3.8 và
PT.5 có hoạt tính cellulase mạnh. Chủng CP3.4 có hoạt tính
cellulase mạnh nhất được chọn để tiến hành các nghiên cứu tiếp
theo.
3. Chủng CP3.4 có khả năng tổng hợp cellulase mạnh nhất sau 22
giờ nuôi cấy.
4. Cellulase của chủng CP3.4 phản ứng tối ưu ở thời gian 5 phút,
nồng độ cơ chất 1,0% (w/v) CMC, nhiệt độ 65
0
C và pH = 7,5.
5. Các ion kim loại khảo sát đều ức chế hoạt tính cellulase của chủng
CP3.4 theo các mức độ khác nhau: ion Mn
2+
ức chế mạnh nhất,
ion Cu
2+
kìm hãm nhẹ nhất.