BÁO CÁO THỰC HÀNH PHƯƠNG PHÁP NHUỘM MÀU VI SINH VẬT

THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG
BÁO CÁO THỰC HÀNH
BÀI 4:

PHƯƠNG PHÁP NHUÔM MÀU
VI SINH VẬT
I. NGUYÊN TẮC
Nhuộm màu là quá trình làm cho tế bào hoặc các thành phần của tế bào vi sinh vật
có màu dưới tác dụng của các loại thuốc nhuộm.
1. MỤC ĐÍCH
• Giúp việc quan sát hình dạng tế bào, các thành phần cấu trúc tế bào của vi
sinh vật được dễ dàng.
• Giúp phân biệt các chủng vi sinh vật với nhau do việc ăn màu khác nhau đối
với các loại thuốc nhuộm tạo điều kiện cho việc phân loại, định dạng vi sinh
vật ( nhuộm màu Gram ).
2. PHÂN LOẠI
Trần Thanh Tùng | MSSV:
10243221
Nhuộm màu vi
sinh vật
Nhuộm không cố địnhNhuộm cố định
Nhuộm đơn Nhuộm kép
Nhuộm tiên mao
Nhuộm bào tử
Nhuộm Ziehl -
Neelsen
Nhuộm Gram
THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG
Ở bài này sẽ tìm hiểu quá trình nhuộm không cố định và phương pháp
nhuộm Gram thuộc phương pháp nhuộm cố định.
II. DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG VÀ HÓA CHẤT

Các dung dịch nhuộm:
• Dung dịch xanh methylen
• Dung dịch tím kết tinh ( Crystal violet )
• Dung dịch lugol
• Dung dịch tẩy màu
• Dung dịch nhuộm bổ sung ( Safranin O hoặc Fuchsin )
III. TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM
1. NHUỘM MÀU VI SINH VẬT KHÔNG CỐ ĐỊNH
• Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh methylen 0.001% lên phiến kính.
• Nhỏ 1 giọt canh trường vi sinh vật hoặc hòa một ít sinh khối vi sinh vật vào
giọt thuốc nhuộm.
• Đậy lá kính lên giọt kính
• Quan sát tiêu bản ở vật kính (x10) rồi (x40).
2. NHUỘM MÀU VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH ( sử dụng phương pháp NHUỘM
GRAM ).

• Quy trình nhuộm Gram:
Trần Thanh Tùng | MSSV:
10243221
Vết đồ
THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG
• Kết Quả:
Trần Thanh Tùng | MSSV:
10243221
15s
Đã nhuộm
Rửa nước
Phủ safranin hoặc
Fuchsin
Rửa nước

Tẩy cồn
Rửa nước
Phủ lugol
Rửa nước
Phủ tím kết tinh
( Crystal violet )
1phút
1phút
15s
15s
15s
1phút
15s
THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG
Thứ tự Thuốc thử Gram ( + ) Gram ( - )
1
Crystal Violet 1’
Tím Tím
Rửa nước 15’’
2
Lugol 1’
Tím Tím
Rửa nước 15’’
3
Tẩy màu 5 - 15’’
Tím Không màu
Rửa nước 15’’
4
Saranin 1’
Tím Hồng

Rửa nước 15’’
Kết quả
Tím Hồng
• Xem tiêu bản ở vật kính x100
IV. BÁO CÁO THỰC TẬP
Sau khi nhuộm, vi khuẩn Gram dương có màu xanh đen hay tím, Gram âm có
màu đỏ vàng hay đỏ tía. Giải thích nguyên nhân?
Quá trình nhuộm trải qua các loại thuốc nhuộm sau:
• Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh để vi khuẩn bắt màu tím.
• Nhuộm tiếp bằng dung dịch lugol để màu tím của dung dịch tím kết tinh gắm
chặt hơn trên vi khuẩn.
• Khi phủ lên dung môi hữu cơ Etanol, Axetol thì vi khuẩn Gram âm bị tẩy, lipit
của lớp màng ngoài bị tan làm tăng tính thấm của màng dẫn đến sự rửa trôi
phức chất tím tinh thể - Iot và làm cho vi khuẩn mất màu. Khi nhuộm bổ
sung chúng sẽ bắt màu với thuốc nhuộm (màu đỏ vàng với Safranin, đỏ tía
với Fuchsin). Đối với nhóm gram dương, dung môi hữu cơ Etanol, Axetol làm
cho các lỗ trong Peptidoglican co lại do đó phức chất tím tinh thể - Iot bị giữ
lại trong tế bào.
Nếu không nhuộm bổ sung thuốc nhuộm Safranin hoặc Fuchsin, vi khuẩn
Gram âm có màu gì? Tại sao?
Nếu không nhuộm bổ sung thuốc nhuộm Safranin hoặc Fuchsin, vi khuẩn Gram âm
sẽ không có màu, đối với vi khuẩn Gram âm, hỗn hợp khử màu đóng vai trò là chất
làm tan màng ngoài của thành tế bào, có bản chất là lipide. Lớp peptidoglycan
mỏng không thể giữ lại phức hợp tím tinh thể-iot và tế bào Gram âm bị khử màu.
Trần Thanh Tùng | MSSV:
10243221
THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG
Vẽ hình thị trường kính hiển vi có vi sinh vật trong trường hợp nhuộm vi
sinh vật không cố định và nhuộm vi sinh vật cố định.
Nhuộm vi sinh vật cố định Nhuộm vi sinh vật không cố định

( Nhuộm Gram – Gram âm)
Nêu ít nhất 5 nguyên nhân khi nhuộm vi khuẩn Gram ( + ) cho kết quả vi
khuẩn Gram ( - ) và ngược lại.
5 nguyên nhân khi nhuộm vi khuẩn Gram dương cho kết quả vi khuẩn Gram âm ( vi
khuẩn Gram dương có màu hồng ):
• Thời gian tẩy màu quá lâu làm cho phức chất tím kết tinh – iot bị rửa trôi.
• Lứa cấy quá già, vì tế bào già thường mất khả năng giữ màu thuốc nhuộm
tím kết tinh khi tẩy bằng ethanol.
• Dung dịch lugol bị hỏng nên không tạo được phức với dung dịch tím kết tinh,
kết quả sẽ bị tẩy màu khi dùng dung dịch tẩy mảu.
• Thời gian bắt màu thuốc nhuộm tím kết tinh chưa đủ lâu.
• Thời gian để dung dịch lugol tạo phức với dung dịch tím kết tinh chưa đủ.
5 nguyên nhân khi nhuộm vi khuẩn Gram âm cho kết quả vi khuẩn Gram dương ( vi
khuẩn Gram âm có màu tím ):
• Cố định tiêu bản khi còn ướt , các hợp chất protein có trong môi trường hoặc
trong mẫu thử làm tiêu bản khó tẩy màu.
• Thời gian tẩy màu quá nhanh khiến màu tím của dung dịch tím kết tinh
chưa thoát ra hết.
Trần Thanh Tùng | MSSV:
10243221
THỰC HÀNH VI SINH ĐẠI CƯƠNG
• Thời gian bắt màu thuốc nhuộm tím kết tinh quá lâu.
• Thời gian để dung dịch lugol tao phức với dung dịch tím kết tinh quá lâu.
• Quá trình cố định mẫu chưa đủ thời gian cộng với quá trình rửa bằng nước
quá lâu hoặc rửa trực tiếp vào mẫu khiến cho vi khuẫn gram âm bị rửa trôi.
Trần Thanh Tùng | MSSV:
10243221