Nghiên cứu khả năng hạ đường huyết và xác định cấu trúc hợp chất của cao chiết lá chè đắng ilex kaushe S.Y.UH hu

Khóa luận tốt nghiệp
MỞ ĐẦU
Đái tháo đường (ĐTĐ) bệnh rối loạn trao đổi chất với biểu hiện chung
nhất là chứng tăng đường huyết. Hiện nay ĐTĐ là 1 trong 4 bệnh mãn tính
đang có tốc độ phát triển nhanh trên toàn thế giới đó là: ĐTĐ, bệnh tim mạch,
bệnh phổi và bệnh ung thư chiếm 50% tỷ lệ tử vong trên toàn cầu. ĐTĐ
không chỉ mang tính chất của một bệnh mãn tính mà còn kèm theo những
biến chứng đa dạng và nguy hiểm như: chủ yếu là ở các mạch máu lớn gây
bệnh mạch vành, tai biến mạch máu não, bệnh mạch máu ngoại biên, ở các mạch
máu nhỏ là bệnh võng mạc, bệnh thận và bệnh biến chứng về thần kinh [4].
WHO cho thấy hiện nay trên thế giới có khoảng 221 triệu người mắc
bệnh ĐTĐ và số này tiếp tục tăng lên. Năm 2025 sẽ lên tới 330 triệu người
(gần 6% dân số toàn cầu). Tỷ lệ bệnh tăng lên ở các nước phát triển là 42%,
nhưng ở các nước đang phát triển (như Việt Nam) sẽ là 170%. Hiện nay, y
học hiện đại cũng đã có nhiều loại thuốc chữa bệnh ĐTĐ có hiệu quả: insulin,
sulfonylure, biguanides, thyazolidinediones…Tuy nhiên các loại thuốc này
đều gây ra các tác dụng phụ và chi phí để chữa trị rất tốn kém đặc biệt là ở những
nước đang phát triển. Như vậy đòi hỏi một hướng đi mới trong việc nghiên cứu và
điều trị bệnh với nguồn nguyên liệu phong phú, giá cả lại hợp lý [8].
Trước khi có các loại thuốc hữu hiệu như ngày nay, ông cha đã biết
dùng các loại cây cỏ để điều trị ĐTĐ mà hiện nay dân gian vẫn hay dùng: cây
khổ qua, lá vối, nhưng chỉ trong số ít được đánh giá về mặt khoa học và y
học. Chính vì vậy nghiên cứu các loại loại cây cỏ có tác dụng chữa bệnh càng
phải được quan tâm và chú trọng nhiều hơn.
Từ những thực tế trên, nhằm góp phần tìm kiếm và nghiên cứu thuốc
điều trị ĐTĐ, chúng tôi tiến hành đề tài mang tên: “Nghiên cứu khả năng hạ
đường huyết và xác định cấu trúc hợp chất của cao chiết lá chè đắng-
Ilex kaushe S.Y.Hu”.
1
Hoàng Thị Chang- K52B Công nghệ Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG
1.1.1. Vài nét về bệnh đái tháo đường
Đái tháo đường là tình trạng rối loạn chuyển hóa glucid gây tăng
glucose huyết mãn tính… Đây là hậu quả của thiếu hụt bài tiết insulin hoặc
hoạt động kém hiệu quả của insulin hoặc phối hợp cả hai. Kèm theo rối loạn
chuyển hóa protid và lipid.
Tình hình đái tháo đường trên thế giới và Việt Nam:
- Tại Việt Nam, trong 4 thành phố lớn Hà Nội, Huế, Thành phố Hồ Chí
Minh, Hải Phòng, tỷ lệ bệnh ĐTĐ là 4%, riêng quận Hoàn Kiếm (Hà Nội) lên
tới 7%. Phần lớn người bệnh phát hiện và điều trị muộn, hệ thống dự phòng,
phát hiện bệnh sớm nhưng chưa hoàn thiện. Vì vậy, mỗi năm có trên 70%
bệnh nhân không được phát hiện và điều trị. Tỷ lệ mang bệnh ĐTĐ ở lứa tuổi
30-64 là 2,7%, vùng đồng bằng, ven biển.
Nguyên nhân chính khiến bệnh ĐTĐ gia tăng ở Việt Nam là do nhận
thức cộng đồng về phòng bệnh thấp, tỷ lệ bệnh không được phát hiện cao, cán
bộ và cơ sở vật chất để theo dõi và điều trị còn rất hạn chế.
- Hiện trên thế giới ước lượng có hơn 190 triệu người mắc bệnh tiểu
đường và số này tiếp tục tăng lên. Ước tính năm 2010, trên thế giới có 221
triệu người mắc bệnh tiểu đường.
Bệnh ĐTĐ có di truyền nhưng với tần suất tương đối nhỏ. Ví dụ: con
của những người ĐTĐ typ 1 có khả năng mắc bệnh là 5-6%. ĐTĐ týp 2 có
tính chất gia đình. Khả năng mắc bệnh của cặp sinh đôi cùng trứng là 60-
100%. Nguy cơ bị mắc ĐTĐ của bố mẹ bệnh nhân đã được chẩn đoán ĐTĐ
typ 2 là 40%, tuy vậy để ngăn chặn bệnh phát triển cần tránh bị béo phì và lối
sống tĩnh tại. Hai yếu tố này ta có thể điều chỉnh được [4].
2
Hoàng Thị Chang- K52B Công nghệ Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp
1.1.2. Triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng

a. Triệu chứng lâm sàng
Triệu chứng lâm sàng của bệnh đái tháo đường điển hình bao gồm: đái
nhiều, uống nhiều, sút cân, mờ mắt, đôi khi ăn nhiều chóng đói thường gặp ở
bệnh nhân mắc đái tháo đường trẻ tuổi ( týp 1).
Triệu chứng lâm sàng xuất hiện khi glucose huyết tăng cao vì vậy vấn
đề chuẩn đoán không khó khăn và thường quá muộn với nhiều biến chứng.
Nhiều trường hợp phát hiện đái tháo đường do tình cờ khám sức khỏe
định kỳ hoặc vào viện vì lý do khác: tai biến mạch máu não, nhồi máu cơ tim,
tăng huyết áp, chấn thương, đục thủy tinh thể…
Nhiều trường hợp đến muộn, các triệu chứng lâm sàng không điển hình
trong khi đó nổi bật các triệu chứng của các biến chứng nặng nề: biến chứng
tim mạch, bệnh lý thần kinh ngoại vi, nhiễm trùng, biến chứng chuyển hóa…
Ngày nay nhờ tiêu chuẩn chuẩn đoán đái tháo đường đã hạ thấp mức
glucose huyết xuống còn 126mg/dl vì vậy triệu chứng lâm sàng của bệnh ít
được quan tâm khai thác [10].
b. Xét nghiệm cận lâm sàng
- Glucose huyết: glucose huyết >126mg/dl lúc đói đã nhịn ăn 8-10 giờ
và làm 2 lần liên tiếp được chuẩn đoán là đái tháo đường. Glucose niệu: ít có
giá trị chẩn đoán.
- HbA1c (trong hồng cầu ở máu có chất vận chuyển oxy gọi là
hemoglobin (Hb), chất này có đặc tính kết hợp tự nhiên với đường glucose
một cách bền vững, khi đó gọi là HbA1c): bình thường < 6,4%.
- Mỡ máu: cholesterol, triglycerid, HDL (high density lipoprotein-
cholesterol có tỷ trọng cao), LDL (low density lipoprotein- cholesterol có tỷ
trọng thấp) thường tăng.
- Định lượng insulin: bình thường hoặc tăng trong đái tháo đường typ
2. Giảm trong đái tháo đường týp 1.
3
Hoàng Thị Chang- K52B Công nghệ Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp

- ICA (Islet Cell Antibodies), GAD (Glutamic Acid Decarboxylase) (+)
trong đái tháo đường týp 1.
Xét nghiệm khác:
- Soi đáy mắt phát hiện tổn thương võng mạc do đái tháo đường.
- Điện cơ: phát hiện tổn thương thần kinh ngoại vi do đái tháo đường.
- Chụp XQ phổi: phát hiện sớm lao phổi không triệu chứng.
- Siêu âm Doppler màu động mạch cảnh, chi dưới mạch lớn…phát hiện
mảng xơ vữa.
- Điện tim, nghiệm pháp gắng sức: phát hiện sớm suy vành.
- Siêu âm tụy: phát hiện sỏi – xơ tụy.
- Tổng phân tích nước tiểu: tìm thể ceton, protein niệu, tế bào niệu
- Microoalbumin niệu: bình thường < 20µg/ phút [9].
1.1.3. Chẩn đoán
Tiêu chuẩn chẩn đoán: WHO 2001
- Chẩn đoán xác định ĐTĐ ( bệnh nhân nhịn đói ít nhất 8 giờ) khi có
một trong các tiêu chuẩn sau:
+ Đường máu huyết tương >126 mg/dl (>7mmol) hoặc đường máu bất
kỳ >200 mg/ml (>11.1mmol.l).
- Chẩn đoán rối loạn dung nạp glucose:
(Uống 75 gr đường trong 250 ml nước trong vòng 5 phút) [13].
Bảng 1. Tiêu chí chẩn đoán rối loạn dung nạp glucose
1.1.4. Phân loại đái tháo đường
Đái tháo đường thường được phân ra làm 2 loại chủ yếu:
4
Hoàng Thị Chang- K52B Công nghệ Sinh học
Thời điểm Đường máu mao mạch Đường máu huyết
tương
Lúc đói < 6,1 mmol/l > 7,8 mmol/l
Sau 2h < 7 mmol/l > 7,8 mmol/l
Khóa luận tốt nghiệp

- Đái tháo đường týp 1 hay còn gọi là đái tháo đường gầy, thường xảy
ra ở người trẻ. Ở loại này, sự bài tiết insulin bị tiêu hủy do sự phá hủy tự miễn
tế bào β của đảo tụy Langerhans, nơi tiết insulin.
- Đái tháo đường týp 2 hay còn gọi là đái tháo đường béo, thường gặp ở
người nhiều tuổi hơn. Ở loại này, insulin được bài tiết bình thường, lưu thông
trong máu nhưng không có tác dụng do có quan hệ chặt chẽ với tính kháng
insulin ở cơ quan đích.
Ngoài ra còn có những dạng ít gặp hơn:
- Đái tháo đường do thái nghén: đái tháo đường khởi phát trong khi
mang thai.
- Đái tháo đường thứ phát ở một số bệnh (bệnh lý tụy ngoại tiết hoặc
phụ thuộc những hormon khác với insulin), những đái tháo đường gây ra do
điều trị, đái tháo đường liên quan đến dinh dưỡng.
- Cũng có những trường hợp dung nạp không hoàn toàn glucose, tình
trạng trên có thể được coi là tình trạng tiền đái tháo đường [10].
a. Đái tháo đường typ 1.
Ở ĐTĐ týp 1, tuyến tụy của bệnh nhân hầu như hoặc không có khả
năng sản sinh ra insulin- một loại hormon nhằm giúp chuyển hóa đường trong
máu thành năng lượng trong các tế bào. Nguyên nhân là do hệ miễn dịch tự
hủy hoại các tế bào β trong tuyến tụy có nhiệm vụ sản sinh ra insulin. Tác
nhân kích thích để cho hệ miễn dịch tấn công tế bào β vẫn chưa biết rõ. Bởi
vậy, trước đây còn gọi ĐTĐ týp 1 là bệnh tự miễn. Bệnh chiếm khoảng 10-
20% các trường hợp ĐTĐ.
Bệnh nhân mắc bệnh ĐTĐ týp 1 buộc phải tiêm insulin hằng ngày. Để
hạ đường máu, ngoài tiêm insulin người bệnh còn phải điều chỉnh và phối hợp
thuốc theo chế độ ăn và hoạt động thể lực. Hạ glucose huyết là nguy cơ tiềm
ẩn, đe dọa tính mạng của người bệnh ĐTĐ týp 1. Do đó, chiến lược dự phòng
nhằm tác động vào các giai đoạn sớm nhằm ngăn chặn sự diễn tiến của bệnh
được xem như là phương thức tốt nhất giúp hạn chế những tổn thương nặng
nề về tinh thần và vật chất cho mỗi cá nhân và cho toàn xã hội [6].

5
Hoàng Thị Chang- K52B Công nghệ Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp
b. Đái tháo đường týp 2
Cơ chế bệnh sinh của đái tháo đường týp 2 chủ yếu là kháng insulin
và rối loạn bài tiết insulin, cả hai quá trình này tương trợ nhau suy kiệt tế
bào β:
- Rối loạn bài tiết insulin: rối loạn sản xuất insulin cả về chất lượng và
số lượng.
+ Mất pha sớm: rối loạn nhịp tiết.
+ Bất thường về số lượng insulin: ban đầu là đa tiết insulin suy
kiệt giảm tiết.
+ Bất thường về chất lượng insulin: tăng Proinsulin trong máu.
- Kháng insulin:
+ Kháng insulin ở cơ: không tổng hợp được glycogen ở cơ, chuyển hóa
glucose ở cơ kém. Rối loạn quá trình oxy hóa glucose trong tế bào cơ
+ Giảm chuyển GLUT4 từ trong tế bào tương ra màng tế bào để vận
chuyển glucose dưới tác dụng của insulin.
+ Giảm Phosphoryl hóa để chuyển glucose thành G
6
P ở cơ.
- Kháng insulin ở gan:
+ Tăng glucagon dẫn đến tăng tạo glucose từ glycogen
+ Tăng hoạt tính enzyme phosphoethanol- pyruvat- carboxykinase dẫn
đến tăng tạo glucose mới ở gan.
+ Giảm số lượng receptor ở các tổ chức phụ thuộc insulin [11].
1.1.5. Biến chứng bệnh đái tháo đường
Bệnh ĐTĐ có nhiều biến chứng ở tất cả các cơ quan trong cơ thể; chủ
yếu là biến chứng thần kinh. Biến chứng thần kinh trong bệnh đái tháo đường
được chia thành các nhóm tổn thương sau:

- Biến chứng thần kinh ngoại vi: Thường xuất hiện sớm cùng với tình
trạng tiến triển của bệnh. Tổn thương chủ yếu ở chi trên và chi dưới, bao gồm
các triệu chứng: đau cơ, cảm giác tê bì, kiến bò, kim châm; nóng bỏng hay tê
lạnh, thậm chí rát bỏng ở đầu ngón tay, ngón chân. Đau hay tê tự phát xảy ra
vào ban đêm, không có chu kỳ, không khu trú ở một chỗ. Điều đặc biệt là đau
cả lúc nghỉ ngơi, nhưng lại giảm đi khi vận động. Đây là dấu hiệu phân biệt
với tổn thương các mạch máu ở chi dưới trong bệnh đái tháo đường.
- Khi tổn thương thần kinh ngoại vi nặng do đái tháo đường, bệnh nhân
có thể bị teo cơ, liệt nhẹ. Do cảm giác ở bàn chân giảm, mức độ sừng hoá ở
6
Hoàng Thị Chang- K52B Công nghệ Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp
da tăng lên, có thể xuất hiện các ổ loét da giữa các vùng sừng hoá mà người
bệnh không biết.
- Biến chứng thần kinh vận động: Thường ít gặp hơn và có khả năng
hồi phục tốt nếu được điều trị tích cực bệnh đái tháo đường. Trong biến
chứng này, các dây thần kinh bị viêm với các biểu hiện: sụp mi mắt (do tổn
thương dây thần kinh số 3), lác ngoài (dây thần kinh số 4), liệt mặt (dây thần
kinh số 7), mất vận động nhìn ngoài (dây số 6), điếc (dây số 8).

Hình 1. Hoại tử ở chân Hình2. Vị trí xuất huyết ở mắt
- Biến chứng thần kinh thực vật (nội tạng): Các biến chứng này thường
kết hợp với các biến chứng thần kinh ngoại vi, nên được coi là rối loạn thần
kinh nội tạng. Có thể gặp: nhịp tim nhanh khi nghỉ, giảm sự tiết mồ hôi, giảm
sự co giãn của đồng tử (ảnh hưởng đến việc điều tiết của mắt), giảm trương
lực cơ hệ tiêu hoá (gây buồn nôn, nôn hay đầy bụng sau khi ăn, có thể bị táo
bón hay tiêu chảy về đêm), giảm co bóp cơ bàng quang (gây ứ đọng nước
tiểu), liệt dương hay xuất tinh sớm ở nam giới.
Các biến chứng thần kinh nói trên cũng có thể gặp ở một số bệnh lý
khác. Nhưng nếu đã bị bệnh đái tháo đường thì bạn nên quan tâm đến việc

theo dõi các biến chứng và kiểm soát chặt chẽ lượng đường huyết dưới sự
hướng dẫn của bác sĩ chuyên khoa [13].
1.1.6. Bệnh béo phì
a. Vài nét về bệnh béo phì
Tổ chức Y tế thế giới định nghĩa béo phì là: tình trạng tích lũy mỡ
quá mức và không bình thường tại một vùng cơ thể hay toàn thân đến mức
7
Hoàng Thị Chang- K52B Công nghệ Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp
ảnh hưởng tới sức khỏe. Béo phì là tình trạng sức khỏe có nguyên nhân dinh
dưỡng. Thường thường một người trưởng thành khỏe mạnh, dinh dưỡng hợp
lý, cân nặng của họ dao động trong giới hạn nhất định. "Cân nặng nên có" của
mỗi người thường ở vào độ tuổi 25-30. Hiện nay, Tổ chức y tế thế giới
thường dùng chỉ số khối cơ thể (Body Mass Index - BMI) để nhận định tình
trạng gầy béo.
Người bị béo phì ngoài thân hình phì nộn, nặng nề, khó coi còn có
nguy cơ mắc nhiều bệnh như rối loạn lipit máu, tăng huyết áp, sỏi mật, đái
tháo đường, xương khớp và ung thư.
Một số hình ảnh béo phì:

Hình 3. Người bị bệnh béo phì
Để có chỉ số khối cơ thể (BMI), người ta dùng công thức sau đây:

W = Cân nặng (kg)H = Chiều cao (m). Chỉ số BMI bình thường nên có ở giới
hạn 20-25, trên 25 là thừa cân và trên 30 là béo phì. Đó là chỉ số dành cho
người châu Âu và châu Mỹ.
Đối với người châu Á, BMI bình thường có giới hạn từ 18.5-23.
Một điều cần chú ý nữa là vùng chất mỡ tập trung. Mỡ tập trung nhiều
quanh vùng eo lưng tạo nên dáng người "quả táo tàu" thường được gọi là béo
kiểu "trung tâm", kiểu phần trên hay béo kiểu dáng đàn ông và mỡ tập trung ở

phần háng tạo nên vóc người "hình quả lê" hay còn gọi là béo phần thấp hay
8
Hoàng Thị Chang- K52B Công nghệ Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp
kiểu dáng đàn bà. Vì vậy bên cạnh theo dõi chỉ số BMI nên theo dõi thêm tỷ
số vòng bụng/vòng mông, khi tỉ số này vượt quá 0,9 ở nam giới và 0,8 ở nữ
giới thì các nguy cơ tǎng huyết áp, bệnh tim mạch, bệnh đái đường đều tǎng
lên rõ rệt.
Béo phì không tốt đối với sức khoẻ. Trước hết, người béo phì dễ mắc
các bệnh tǎng huyết áp, bệnh tim mạch do mạch vành, đái đường hay bị các
rối loại dạ dày, ruột, sỏi mật [6,11].
b. Mối quan hệ giữa bệnh béo phì và đái tháo đường typ 2
Trong cơ thể người béo phì tồn tại một trạng thái bệnh lý đặc thù gọi
là chất đề kháng insulin. Sau khi ăn, một lượng đường khá lớn được hấp thụ
vào trong máu thông qua huyết dịch mà tuần hoàn đến mọi nơi trong cơ thể.
Nhờ có insulin đường mới đi vào tế bào được cơ thể sử dụng. Lượng đường
glucose trong máu được duy trì trong một phạm vi an toàn nhất định cũng nhờ
insulin. Sở dĩ insulin có đủ khả năng phát huy tác dụng đó là đầu tiên nó kết
hợp với insulin thụ thể ở trên màng tế bào sau đó dẫn dắt một loạt những chất
truyền tín hiệu khác trong tế bào, đem thông tin ”có đường” được truyền vào
các tầng lớp sâu trong tế bào. Sự trao đổi chất diễn ra trong bản thân tế bào để
chuyển hóa đường thành năng lượng. Cơ chế vận chuyển, chuyển hóa glucose
ở người béo phì có rất nhiều hạn chế do:
- Số lượng insulin thụ thể trên màng tế bào bị giảm sút.
- Chức năng của từng thụ thể đơn lẻ cũng bị suy giảm.
- Những thụ thể sau khi được insulin kích hoạt chức năng truyền tín
hiệu vào sâu bên trong tế bào lại bị tổn thương.
- Số lượng phân tử vận chuyển glucose giảm.
- Chức năng gan chuyển hóa glucose thành đường nguyên chất để tồn
trữ lại không bảo đảm.

Với những nguyên nhân trên, chất đề kháng insulin được sản sinh ra,
lượng glucose trong máu vì thế rất khó chuyển vào tế bào, đây chính là hiện
tượng đề kháng insulin.
9
Hoàng Thị Chang- K52B Công nghệ Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp
Với người béo phì, thời kỳ đầu mới phát béo, chức năng sản xuất
insulin còn bình thường nhưng dần dần do sự đề kháng insulin tăng lên làm
hiệu quả hoạt động của chất này giảm sút. Để khắc phục hiện tượng này,
tuyến tụy hoạt động quá sức dẫn đến chức năng sản sinh ra insulin ở tụy giảm
dần, lúc này insulin trong cơ thể sẽ không đủ để duy trì việc chuyển hóa
đường trong máu ở mức bình thường nữa. Do vậy đái tháo đường xuất hiện
[6].
Hình 4. Béo phì làm tăng mức độ axit béo có thể gây ra bệnh tiểu đường [14]
1.1.7. Điều trị
Mục tiêu điều trị: tùy từng người mắc bệnh cụ thể nhưng nhìn chung:
- Đưa đường máu về càng gần giá trị bình thường càng tốt.
- Phòng tránh và chữa trị những biến chứng có thể có.
Để đạt được mục tiêu này cần dựa vào:
- Chế độ ăn uống hợp lý.
- Tránh lối sống tĩnh tại bằng vận động cơ bắp thích hợp.
- Thuốc hạ đường huyết khi cần thiết.
a. Chế độ ăn cho người ĐTĐ
Mục tiêu dài hạn của chế độ ăn là giữ cân nặng ổn định ở mức lý tưởng.
10
Hoàng Thị Chang- K52B Công nghệ Sinh học
Gan
Gan tăng giải
phóng glucose và
triglyxerid

Hệ cơ xương
Kháng insulin
Tăng glucose, rối loạn
chuyển hóa mỡ
Phá hủy tế bào β
Tế bào β của
tuyến tụy
Sản xuất insulin giảm
Tăng axit béo trong máu
Mô mỡ nội tạng
Khóa luận tốt nghiệp
Chế độ ăn cho người ĐTĐ bao gồm:
- Các bữa ăn hỗn hợp có đủ chất đạm + béo + chất bột + xơ (xơ: có
nguồn gốc từ rau quả, cám gạo…).
- Nhiều bữa một ngày: 3 bữa chính gồm sáng, trưa và tối và 2 đến 3
bữa phụ xen kẽ nếu cần thiết ( khi bữa chính chưa ăn đủ).
- Ăn đều đặn về khối lượng tùy theo vận động thể lực, cố gắng ăn đúng
giờ từ ngày này qua ngày khác, từ tuần này qua tuần khác. Khi thay đổi khối
lượng và thành phần thức ăn sẽ dẫn đến thay đổi đường máu và dẫn đến thay
đổi chế độ thuốc tương ứng [4].
b. Thuốc điều trị
1. Insulin (dùng cho dạng typ1)
Căn cứ vào tác dụng, giới chuyên môn chia ra 03 nhóm:
- Insulin tác dụng nhanh: gồm Insulin hydrochlorid, nhũ dịch Insulin-kẽm
+ Insulin tác dụng trung bình: Isophan Insulin, Lente Insulin
+ Insulin tác dụng chậm: Insulin Protamin kẽm, Insulin kẽm tác dụng chậm.
Insulin được chỉ định dùng cho bệnh nhân đái tháo đường thuộc typ 1,
nó chỉ dùng cho bệnh nhân đái tháo đường typ 2 khi đã thay đổi chế độ ăn,
luyện tập và dùng các thuốc điều trị ĐTĐ tổng hợp mà không hiệu quả.
Phản ứng phụ của Insulin: Dị ứng (sau khi tiêm lần đầu hoặc nhiều lần

tiêm), hạ glucose máu (thường gặp khi tiêm quá liều), phản ứng tại chỗ tiêm
(ngứa, đau, cứng vùng tiêm). Do gây rối loạn chuyển hóa mỡ tại vùng tiêm,
tăng sinh mỡ dễ gây u mỡ, giảm sẽ gây xơ cứng (khó tiêm, đau).
2. Thuốc dùng cho dạng ĐTĐ typ2
Các dẫn xuất của Sulfonyl ure, chia làm 02 nhóm:
- Nhóm 1: có tác dụng yếu, gồm - Tolbutamid, Acetohexamid,
Tolazamid, Clopropamid.
- Nhóm 2: có tác dụng mạnh hơn, gồm - Glibenclamid, Glipizid,
Gliclazid [9].
11
Hoàng Thị Chang- K52B Công nghệ Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp
c. Thuốc điều trị có nguồn gốc từ thực vật
Thảo dược điều trị cho bệnh ĐTĐ không phải là mới. Từ thời cổ đại,
thực vật và chất chiết xuất từ thực vật được sử dụng để chống lại bệnh ĐTĐ.
Dưới đây là các loại thảo mộc đã được khẳng định bởi nhiều công trình điều
tra khoa học có chất lượng, thảo dược tương đối không độc và có kết quả khả
quan trọng điều trị bệnh tiểu đường.
1. Sâm châu Á- Panax ginseng C. A. Mey : thường được sử dụng trong
y học cổ truyền Trung Quốc để điều trị bệnh tiểu đường. Nó đã được chứng
minh để tăng cường giải phóng insulin từ tuyến tụy và để tăng số lượng các
thụ thể insulin. Nó cũng có tác động trực tiếp hạ đường huyết .
2. Tỏi- Alliumsativum L: Tỏi không những có tác dụng giảm
cholesterol mà còn giúp giảm đuờng máu. Uống 3-4gr nước ép tỏi tươi với
nước mỗi ngày giúp giảm đường trong máu hiệu quả.
3. Cỏ cari- Trigonela foenum graecum thuộc họ đậu: Là loại thảo mộc
giúp điều chỉnh lượng đường máu, có thể dùng dưới dạng bột hoặc gia vị cho
vào thức ăn khi đun nấu.
4. Nghệ- Curcuma longa L: Nghệ có tác dụng tăng cường hoạt dộng
của các tế bào thuộc tuyến tụy giúp sản sinh ra nhiều insulin hơn. Nên uống

bột nghệ với nước ấm.
5. Quế- Cinnamomum Blume: Quế có tác dụng hỗ trợ trong việc giảm
lượng đường máu, nên cho quế vào thức ăn hàng ngày sẽ rất tốt cho những
người bị bệnh ĐTĐ.
6. Hành tây- Allium cepa L: Hành tây có tác dụng dự phòng sự tăng
đường máu bởi một số chất vẫn thường gây ÐTÐ trên động vật thí nghiệm.
Trên lâm sàng, cho bệnh nhân ÐTÐ uống dịch ép hành tây đã có tác dụng làm giảm
đường máu. Hành tây sống cho vào thức ăn hàng ngày của bệnh nhân ÐTÐ typ 2 đã
có tác dụng hỗ trợ và làm giảm liều thuốc cần thiết để điều trị bệnh.
7. Mướp đắng- Momordica charantia: Quả mướp đắng còn xanh có
tác dụng hạ đường máu trên động vật đã được gây ÐTÐ thực nghiệm. Khi
12
Hoàng Thị Chang- K52B Công nghệ Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp
cho động vật uống hàng ngày trong thời gian dài, nó làm chậm sự phát triển
bệnh võng mạc và đục thủy tinh thể của mắt.
Mướp đắng có tác dụng chống oxy hóa, loại bỏ những gốc tự do - là
một trong những nguyên nhân gây ÐTÐ. Quả mướp đắng có tác dụng làm
tăng khả năng dung nạp glucose của bệnh nhân ÐTÐ. Hoạt chất chính trong
mướp đắng có tác dụng hạ đường máu là charantin, glycosid steroid.
8. Chuối hột- Musra barjoo sieb: Vị thuốc chữa bệnh đái tháo đường.
Theo kinh nghiệm dân gian, chuối hột trị được nhiều bệnh khá hiệu
quả, mà lại không tốn tiền, không độc hại. Quả chuối hột tròn dài, lúc chín sắc
vàng, ăn ngọt, có nhiều hột đen. Lá và vỏ quả chuối hột khô sắc uống làm
thuốc lợi tiểu và chữa được chứng phù thũng sưng chân (cước khí). Rễ sắc
uống chữa cảm mạo, bệnh dạ dày, đau bụng, chữa cả chứng tiêu khát và bệnh
lâm lậu nhưng hay dùng nhất là để điều trị các bệnh đái tháo đường [21].
1.2. CÂY CHÈ ĐẮNG - Ilex kaushue S.Y.Hu
1.2.1. Đặc điểm hình thái, phân bố
Mô tả: Cây thân gỗ cao 6-20m, có thể tới 35m, đường kính thân 20-

60cm, có cây đạt tới 120cm, cành thô, mầu nâu xám, không có lông, nhánh
non hình trụ tròn có nhiều gờ nhỏ. Lá đơn, mọc so le, dai như da, mỏng, hình
thuôn dài hoặc hình ngọn giáo ngược, có kích thước thay đổi. Ở cây trưởng
thành lá thường dài 11-17cm, rộng 4-6cm, ở cây non lá thường lớn hơn, ở
những cành chồi sau khi bị đốn, lá có cỡ lớn hơn tới 21-37 x 9-13cm, đầu lá
có mũi nhọn ngắn hoặc tù, gốc hẹp dần, mép lá có răng dạng răng cưa nhỏ
gần đều nhau, đầu răng màu đen trên mặt mầu lục xẫm, mặt dưới nhạt màu
hơn, không lông, gân bên 10-14 đôi, xếp chéo với gân giữa, tạo thành một góc
lớn hơn 45 độ, cuống lá dài 1,5-2cm.
Hoa khác gốc, cụm hoa đực có trục dài cỡ 1cm, thường có 20-30 hoa,
cuống mảnh dài 4-5cm, đài hoa có đường kính dài 3mm, 4 lá đài hình trứng
13
Hoàng Thị Chang- K52B Công nghệ Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp
hoặc hình tròn dạng tam giác, 4 cánh hoa hình trứng ngược, dài 3,5-4mm, 4
nhị ngắn hơn hay dài bằng cánh hoa. Cụm hoa cái dạng chùm giả, gồm 3-9
hoa, có cuống thô, dài 4-6mm.

Hình 5. Cây chè đắng và lá chè đắng
Quả hạch gần hình cầu, đường kính cỡ 1cm, cuống ngắn 2-3mm, khi
chín màu đỏ, chứa 2-3 hạch, hạt hình thuôn, dài 7mm, rộng 4mm, mặt bên
và mặt lưng có vân và rãnh dạng mạng lưới.
Sinh thái và phân bố: Chè đắng mọc rải rác trong rừng xanh vùng núi
đá vôi,ở ven suối hoặc rừng thưa bên sườn núi, ở độ cao 600-900m, ra hoa
vào tháng 2-4, có quả vào tháng 6-10. Chè đắng phân bố ở bắc Việt Nam,
Nam và Đông Nam Trung Quốc. Ở nước ta gặp nhiều ở Cao Bằng, Lào Cai,
Hòa Bình, Ninh Bình [1].
1.2.2. Tính vị và tác dụng
Bộ phận dùng: Lá, búp.
Tính vị tác dụng: vị đắng, ngọt, tán phong nhiệt, thanh đầu mục, trừ

phiến khát.
Công dụng: Lá cây được dung nấu nước uống làm thuốc trị đau đầu,
đau răng, mắt đỏ, tai ù, tai giữa chảy mủ, sốt nóng, khát nước, lỵ, đau họng
14
Hoàng Thị Chang- K52B Công nghệ Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp
và bỏng lửa, có thể dùng lá sấy khô hãm như nước trà có tác dụng thanh
nhiệt, giải độc, điều hòa huyết áp, chè uống này còn làm đầu óc minh mẫn, lợi
tiểu, tiêu độc, giúp tiêu hóa, dùng lâu sẽ tăng sức khoẻ và kéo dài tuổi thọ.
Theo y học hiện đại: những kết quả nghiên cứu mới đây công bố, chè
đắng có tác dụng giảm cholestorol, giảm mỡ máu, giảm chứng cao huyết áp,
tăng cường lưu thông máu, ngăn chặn suy thoái chức năng tim và não, giãn
khí quản, điều hòa mô mỡ, giảm tích tụ mỡ, làm cho cơ thể cân đối (chống
béo phì). Dịch chiết nước chè đắng có tác dụng kháng khuẩn cao.
Hiện nay, ở nước ta cũng đã có vài chế phẩm của chè đắng dạng búp
sấy khô và dạng chè túi lọc. Chè đắng là cây bản địa của vùng núi đá vôi, có
thể trở thành cây kinh tế ở vùng núi đá cao, nên nhân giống để tạo nguồn
nguyên liệu làm chè uống như chè Paraguay ở Nam Mỹ, phục vụ trong nước
và xuất khẩu [1,10].

Hình 6. Các sản phẩm từ chè đắng
1.2.3. Thành phần hóa học
Thành phần hóa học của chè đắng: ngoài một số hoạt chất chính khác
với chè xanh, còn đại bộ phận các thành phần khác cũng tương tự như chè
xanh, chỉ khác nhau về hàm lượng. Ví dụ trong chè đắng Cao Bằng có hàm
lượng flavonoid (chất có tác dụng chống lão hóa, chống ung thư) lại cao gấp 7
lần chè xanh.
Chè đắng có 5 nhóm chất là saponin, tritecpen, flavonoid, axit hữu cơ,
polysaccharid và carotenoid, trong đó các nhóm saponin và flavonoid có hàm
lượng đáng kể. Mặt khác các thử nghiệm đều không tìm thấy alkaloid và

glucosid” [14].
15
Hoàng Thị Chang- K52B Công nghệ Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG
- Lá chè đắng- Ilex kaushue S.Y.Hu được thu hái ở Cao Bằng.
- Chuột nhắt chủng Swiss trọng lượng 14-17g, được mua tại Viện Vệ
sinh Dịch tễ Trung ương.
- Hóa chất STZ (Streptozotocin), các loại dung môi hữu cơ như: hexan,
ethylaxetat, choloroform, butanol.
16
Hoàng Thị Chang- K52B Công nghệ Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp
- Các thiết bị : máy cô quay thu hồi dung môi, bể ổn nhiệt, máy lắc, tủ
sấy, cột sắc ký thuỷ tinh, đường kính trong 22mm, dài 300mm, có khoá nút
mài thuỷ tinh hoặc teflon và bình đựng dung môi phía trên, dung lượng
250ml, bình nón 250ml, 500ml , máy đo pH, máy đo đường huyết của
Onetouch Ultra 2, cột sắc ký, thuyền tán, máy đo khối phổ, máy đo cộng
hưởng từ hạt nhân…Các thiết bị đều đảm bảo chính xác và độ an toàn.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng ( TLC)
Sắc kí lớp mỏng (thin layer chromatography - TLC) là một kĩ thuật sắc
kí được dùng để tách các chất trong hỗn hợp.
Sắc kí lớp mỏng được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực:
- Xét nghiệm độ tinh khiết của các hóa chất phóng xạ trong dược
khoa.
- Xác định các sắc tố trong tế bào thực vật.
- Phát hiện thuốc trừ sâu, thuốc diệt côn trùng trong thức ăn, hoặc.

- Nhận biết những hóa chất trong một chất cho sẵn
- Giám sát các phản ứng hữu cơ
Phương pháp sắc kí lớp mỏng bao gồm pha tĩnh là một lớp mỏng các
chất hấp phụ, thường là silica gel, aluminium oxide, hoặc cellulose được phủ
trên một mặt phẳng chất trơ. Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được
hòa tan trong một dung môi thích hợp và được hút lên bản sắc kí bởi mao dẫn,
tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trong
dung dịch [7].
Sau khi chạy sắc ký xong phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử
ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 368 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch
H
2
SO
4
10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện
từ từ đến khi hiện màu.
2.2.2 Xử lý mẫu
17
Hoàng Thị Chang- K52B Công nghệ Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp
Lá sau khi hái về được rửa sạch, phơi khô đem sấy ở 60
0
C sau đó đem
nghiền mịn thành bột bằng thuyền tán. Bột được cho vào túi nilon kín để bảo
quản để nơi khô ráo, thoáng mát tránh ẩm mốc.
2.2.3. Phương pháp tách chiết bằng dung môi
a. Chiết thu cao tổng số
Chiết cao nước nóng: Cân 2kg mẫu đã nghiền thành bột hòa với nước
theo tỉ lệ 1: 10 (khối lượng mẫu : thể tích nước) đun trong thời gian là 1h rồi
tiến hành lọc nóng thu được dịch lọc lần 1. Phần bã còn lại tiếp tục hòa với

nước theo tỉ lệ 1: 7 (tính theo khối lượng mẫu khô ban đầu) cũng đun trong
thời gian 1h thu được dịch lọc lần 2. Lần 3 tiến hành tương tự nhưng với tỉ lệ
mẫu / nước là 1: 5 thu được dịch lọc lần 3. Dịch lọc cả 3 lần gộp lại cô quay
chân không thu được cao chiết bằng nước nóng.
Chiết cao cồn: Cân 350g bột mẫu thực vật khô được chiết 3 lần với cồn
60
0
. Cụ thể: Sau khi cho dung môi chiết vào mẫu với tỉ lệ mẫu : dung môi =
1:10, khuấy đều và tiếp tục ngâm trong vòng 1 tuần có lắc liên tục. Sau đó
tiến hành lọc qua giấy lọc thu được dịch chiết lần 1, phần bã tiếp tục cho dung
môi chiết vào theo tỉ lệ mẫu: dung môi = 1:7 rồi tiến hành như chiết lần 1.
Chiết lần 3 cho dung môi vào phần bã còn lại của chiết lần 2 với tỉ lệ mẫu:
dung môi = 1:5. Dịch chiết của 3 lần được gom lại đem cô trên máy cô quay
chân không ta thu được cao cồn.
18
Hoàng Thị Chang- K52B Công nghệ Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp
b. Chiết thu cao phân đoạn
Từ cao thô tổng số thu được ta tiến hành chiết lần lượt qua ba dung môi
có tính phân cực tăng dần: n-hexan, choloroform, ethylaxetat với mỗi dung
môi ta thu được dịch chiết tương ứng. Dịch chiết đem lọc rồi cô quay chân
không thu được cao chiết phân đoạn. Ta có sơ đồ tách chiết dưới đây:
Bổ sung n-hexan
Lọc và cô quay
Bổ sung choloroform
Lọc và cô quay
Bổ sung ethylaxetat
Lọc và cô quay

Lọc và cô quay

Hình 7. Sơ đồ tách chiết cao phân đoạn
2.2.4. Sắc ký cột
Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel pha thường có
cỡ hạt là 0,040- 0,063mm. Nguyên tắc của sắc ký là dựa trên sự phân bố các
chất giữa 2 pha: một cố định và một di động. Trong đó, pha tĩnh được nhồi
vào một cột thủy tinh, pha lỏng là dung môi dung để chiết cho chảy qua cột.
Mẫu được tách được đưa vào một đầu của cột. Các phần khác nhau của mẫu
19
Hoàng Thị Chang- K52B Công nghệ Sinh học
Cao tổng
Cao n-hexan
Lớp nước còn lại
Cao cloroform
Lớp nước còn lại
Cao ethylaxetat Lớp nước còn lại
Cao nước cuối
Khóa luận tốt nghiệp
sẽ đi qua cột với tốc độ khác nhau, được phát hiện và thu lại ở đầu kia. Trong
quá trình chạy sắc ký cần chú ý đến tốc độ chảy, thường với tốc độ chảy chậm
việc tách chất thường rõ nét hơn [7].
Dưới đây là hình minh họa sắc ký cột:
Hình 8. Sự di chuyển các chất trong sắc ký cột
2.2.5. Phương pháp định lượng glucose huyết
Máu sử dụng để định lượng đường huyết là máu toàn phần lấy từ đuôi
chuột. Định lượng đường huyết bằng máy đo đường huyết tự động và que thử
tương ứng- (One Touch Ultra, Johnson & Johnson, USA). Nguyên tắc của
phương pháp dựa trên phản ứng đặc hiệu của glucose oxidase (GOD) có trong
que thử với glucose có trong máu tạo thành axit gluconic và H
2
O

2
. H
2
O
2
tạo
thành được peroxydase phân hủy giải phóng oxy, oxy hóa O- Diansidin tạo
phức màu vàng nâu.
Các phản ứng xảy ra:
GOD
Glucose + H
2
O + O
2
axit gluconic + H
2
O
2
H
2
O
2
+ O- Diansidin Phức chất màu vàng nâu + O
2
Cường độ màu được xác định theo phương pháp đo quang tương ứng với định
lượng glucose trong máu cần định lượng.
20
Hoàng Thị Chang- K52B Công nghệ Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp
2.2.6. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất

Cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ được xác định dựa vào các
phương pháp phổ kết hợp. Tùy thuộc vào cấu trúc hóa học của từng hợp chất
mà người ta sử dụng những phương pháp phổ cụ thể. Cấu trúc càng phức tạp
thì yêu cầu phối hợp các phương pháp phổ càng cao. Trong một số trường
hợp để xác định chính xác cấu trúc hóa học của các hợp chất người ta còn
phải dựa vào các phương pháp bổ sung khác như chuyển hóa hóa học, kết
hợp với các phương pháp sắc ký so sánh.
a. Điểm nóng chảy (MP)
Điểm nóng chảy được đo trên máy Kofler micro- hotstage của Viện
Hóa học các hợp chất thiên nhiên.
b. Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu
hiệu nhất hiện nay được dùng để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất
hữu cơ nói chung và hợp chất thiên nhiên nói riêng. Với việc sử dụng kết hợp
các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác
định chính xác cấu trúc của các hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử.
Nguyên lý chung của các phương pháp NMR (phổ proton và cacbon) là sự
cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (
1
H và
13
C) dưới tác dụng của từ
trường ngoài. Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ dịch
chuyển hóa học (chemical shift). Ngoài ra, đặc trưng của các phân tử còn
được xác định dựa vào tương tác spin các hạt nhân từ với nhau (spin
coupling).
- Phổ
1
H- NMR
Trong phổ

1
H- NMR, độ dịch chuyển hóa học (δ) của các proton được
xác định trong thang từ 0-14 ppm tùy thuộc vào mức độ lai hóa của nguyên tử
cũng như đặc trưng riêng của từng phân tử. Mỗi loại proton cộng hưởng ở
một trường khác nhau và vì vậy chúng được biểu diễn bằng một độ dịch
chuyển hóa học cũng như tương tác cặp đôi spin mà người ta có thể xác định
được cấu trúc hóa học của các hợp chất.
21
Hoàng Thị Chang- K52B Công nghệ Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp
- Phổ
13
C- NMR
Phổ này cho tín hiệu vạch phổ của cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ
cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho một tín hiệu phổ khác nhau.
Thang đo cho phổ
13
C- NMR cũng được tính bằng ppm với dải thang đo rộng
hơn so với phổ proton (từ 0- 240 nm).
- Phổ DEPT (Distortionless Enhancemant by Polarisation Transfer)
Phổ này cho tín hiệu phổ phân loại các loại cacbon khác nhau. Trên phổ
DEPT, tín hiệu của cacbon bậc 4 biến mất. Tín hiệu phổ của CH và CH
3
nằm
về một phía và của CH
2
về một phía trên phổ DEPT 135
0
. Còn trên phổ DEPT
90

0
thì chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của các CH.
- Phổ 2D- NMR
Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các tương tác của
các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều. Một số kỹ thuật chủ
yếu thường được sử dụng như sau:
+ Phổ HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence): các
tương tác trực tiếp H-C được xác định nhờ vào các tương tác trên phổ này.
Trên phổ, một trục là phổ
1
H- NMR còn trục kia là
13
C- NMR. Các tương tác
HMQC nằm trên đỉnh các ô vuông trên phổ.
+ Phổ
1
H-
1
H COSY (HOMOCOSY)
1
H-
1
H Chemical Shift Correlation
Spectroscopy: phổ này biểu diễn các tương tác H-H, chủ yếu của các proton
đính với cacbon liền kề nhau. Chính nhờ phổ này mà các phần của phân tử
được nối ghép lại với nhau.
+ Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): Đây là phổ
biểu diễn các tương tác xa của H và C trong phân tử. Nhờ vào các tương tác
trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác
định về cấu trúc.

Ngoài ra người ta còn sử dụng nhiều kỹ thuật phổ 2 chiều rất hiện đại
khác, ví dụ như kỹ thuật xóa tương tác trên các phổ nhất định, như trên phổ
proton, xóa tương tác của một proton nào đó có thể xác định được vị trí của
các proton bên cạnh…
22
Hoàng Thị Chang- K52B Công nghệ Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp
Ngoài việc sử dụng các loại phổ, người ta còn sử dụng kết hợp các
chuyển hóa hóa học cũng như các phương pháp phân tích so sánh kết hợp.
Đặc biệt đối với các phân tử nhiều mạch nhánh dài, tín hiệu phổ NMR bị
chồng lấp nhiều khó xác định chính xác được chiều dài các mạch, cũng như
đối với các phân tử có các gốc đường thì việc xác định chính xác loại đường
cũng như cấu hình đường thông thường phải sử dụng phương pháp thủy phân
rồi xác định bằng phương pháp LC- MS hoặc GC- MS với các đường chuẩn
dự kiến [18].
c. Phương pháp phổ khối lượng (Mass Spectroscopy)
Kỹ thuật phổ khối lượng được sử dụng khá phổ biến để xác định cấu
trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ. Nguyên tắc chủ yếu của phương pháp
phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion của phân tử chất dưới sự bắn phá của
chùm ion bên ngoài. Ngoài ion phân tử, phổ MS còn cho các píc ion mảnh
khác mà dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế phân mảnh và dựng
lại được cấu trúc hóa học các hợp chất. Hiện nay có rất nhiều loại kỹ thuật
phổ khối lượng. Những phương pháp chủ yếu sau:
- Kỹ thuật phổ EI- MS (Electron Impact Ionization Mas Spectroscopy)
dựa vào sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm tia bắn phá với năng
lượng khác nhau, phổ biến là 70 eV.
- Kỹ thuật phổ ESI- MS (Electron Spray Ionization Mas Spectroscopy)
gọi là phổ phun mù điện tử. Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá
thấp hơn nhiều so với phổ EI- MS. Do đó phổ thu được chủ yếu là píc ion
phẩn tử và các píc đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng

thấp, dễ bị phá vỡ.
- Kỹ thuật phổ FAB- MS (Fast Atom Bombardment Mas Spectroscopy)
là phổ bắn phá nguyên tử nhanh với sự bắn phá nguyên tử nhanh ở năng
lượng thấp, do đó phổ thu được cũng dễ thu được píc ion phân tử.
- Kỹ thuật phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution Mas
Spectroscopy), cho phép xác định píc ion phân tử hoặc ion mản với độ chính
xác cao. Kết quả phổ khối lượng phân giải cao cùng với kết quả phân tích
23
Hoàng Thị Chang- K52B Công nghệ Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp
nguyên tố sẽ cho phép khẳng định chính xác công thức cộng của hợp chất
hữu cơ.
- Ngoài ra hiện nay người ta có thể sử dụng GC-MS (sắc ký khí khối
phổ) cho các hợp chất dễ bay hơi như tinh dầu, hay LC-MS (sắc ký lỏng khối
phổ) cho các hợp chất khác.
Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS): là một trong những
phương pháp được sử dụng để xác định khối lượng phân tử của các chất
nghiên cứu dựa vào sự phát hiện ra ion phân tử M
+
từ đó sẽ dẫn tới xây dựng
công thức phân tử. Việc nghiên cứu của các quá trình phân mảnh sẽ giúp nhận
biết một số đơn vị cấu trúc của phân tử.
Trong phương pháp này, một lượng rất nhỏ chất nghiên cứu được hóa
hơi ở áp suất thấp (6- 10mmHg) và được bắn phá bởi một dòng electron có
năng lượng cao (40-80 eV) gây nên sự ion hóa phân tử. Các ion được bắn phá
như vậy sẽ tách khỏi nhau theo tỉ số khối lượng/ điện tích (m/z), được phát
hiện và ghi lại trong máy đo. Các phương pháp kết hợp này còn đặc biệt hữu
hiệu khi phân tích thành phần của hỗn hợp chất (nhất là phân tích thuốc trong
nghành dược) [18].
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. HIỆU SUẤT CHIẾT CAO
Lá chè đắng sau khi hái đem rửa sạch, phơi khô đem tán thành bột rồi
đem chiết ở các dung môi khác nhau. Dịch chiết thu được đem lọc rồi cô quay
ta thu được cao.
24
Hoàng Thị Chang- K52B Công nghệ Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp
3.1.1. Chiết xuất bằng nước nóng và cồn 60
0
Mẫu thực vật khô gồm 700g chia làm hai phần bằng nhau, 1 phần chiết
trong nước nóng, phần còn lại chiết trong cồn 60
0
, với mỗi dung môi chiết ta
thu được dịch chiết tương ứng đem cô quay thu được cao nước nóng và cao
cồn. Cao thu được đem cân khối lượng, từ đó ta so sánh được hiệu suất tách
chiết mẫu của hai dung môi được thể hiện ở bảng 2:
Bảng 2. Hiệu suất tách chiết mẫu bằng nước nóng và cồn 60
0
C
Mẫu
thực vật
Khối
lượng
khô (g)
Khối
lượng
CNN (g)
Phần
trăm
tách chiết

CNN (%)
Khối
lượng
CC (g)
Phần
trăm
tách chiết
CC (%)
Lá chè
đắng
350+350 110 31.4 44 12.6
Dựa vào phần trăm tách chiết cao thu được ở bảng trên ta thấy chiết
mẫu bằng nước nóng thu được khối lượng nhiều hơn là chiết mẫu bằng cồn.
Cụ thể nhiều hơn 18.8%. Nước là dung môi quan trọng bậc nhất được dùng
trong công nghệ chiết xuất.
3.1.2. Chiết xuất thu cao phân đoạn
Bột khô được bổ sung thêm nước nóng, tiến hành chiết 3 lần ta thu
được cao tổng. Từ cao tổng nước ta tiến hành chiết phân đoạn với các dung
môi n-hexan, choloroform, ethylaxetat. Quy trình tách chiết được thể hiện:
Bổ sung nước nóng
25
Hoàng Thị Chang- K52B Công nghệ Sinh học
Mẫu thí nghiệm bột khô ( 3kg)