công nghệ sinh học đại cương học viện nông nghiệp các kỹ thuật nền của công nghệ sinh học hiện đại

CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI CƢƠNG
(SH3014)
Giảng viên hướng dẫn: …….
1
BM CNSH TV – Khoa CNSH
9/3/2011
CHƢƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI
(10 TIẾT)
 Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn
 Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng
gen
 Các phương pháp lai phân tử
 Phương pháp PCR, ứng dụng
 Kỹ thuật xác định trình tự DNA
 Kỹ thuật tạo thư viện genome và cDNA
9/3/2011
2
BM CNSH TV – Khoa CNSH
 Sự bắt cặp lai (Hybridization) theo cơ chế
bổ sung (Complementarity)
 Các dạng phức hợp lai bổ sung:
– DNA - DNA
– DNA - RNA
– Protein – Protein (thƣờng ở dạng phức hợp
kháng nguyên – kháng thể)
CƠ SỞ KHOA HỌC
Lai giữa các nucleic acid
9/3/2011 3
Lai phân tử là quá trình kết hợp lại
của hai mạch đơn DNA hoặc DNA-
RNA.

Cơ sở của việc lai phân tử là các
mối liên kết hydro giữa các base
trên hai mạch. Giữa một base A và
một base T (hoặc U) hình thành
hai liên kết hydro còn giữa G và C
hình thành ba liên kết.
LAI GIỮA CÁC NUCLEIC ACID
(DNA – DNA hoặc DNA – RNA)
Lai giữa các nucleic acid
T A
C G
U
A
9/3/2011 4
LAI GIỮA CÁC NUCLEIC ACID
(DNA – DNA hoặc DNA – RNA)
9/3/2011 5
• LAI SOUTHERN (DNA – DNA)
• LAI NORTHERN (DNA – RNA)
• LAI WESTERN (PROTEIN – PROTEIN)
MỘT SỐ KỸ THUẬT LAI PHÂN TỬ
9/3/2011 6
So sánh sự phân tích gene X sử dụng các kỹ thuật lai
Southern, Northern và Western
9/3/2011 7
• Lịch sử
– Do Edwin Southern đề xuất
năm 1975 và sau đó được tiếp
tục hoàn thiện.
– Với sự phát triển của kỹ thuật

này, Southern đã nhận được
giải thưởng Lancaster trong
lĩnh vực Y học vào năm 2005.
LAI SOUTHERN
Edwin Southern
9/3/2011 8
LAI SOUTHERN
• Nguyên lý
– Dựa trên sự bắt cặp bổ sung giữa 2 phân tử DNA mạch đơn
(DNA-DNA)
– Cho phép xác định được sự có mặt của những trình tự
nucleotide trên một đoạn DNA nào đó trong một hỗn hợp các
đoạn DNA khác nhau dựa trên sự bắt cặp của mẫu dò đã được
đánh dấu với đoạn DNA chứa trình tự bổ sung với mẫu dò đó.
• Kỹ thuật lai Southern cho biết
– Sự có mặt của đoạn ADN (gen)
– Số lượng đoạn ADN có mặt (tương ứng với số gen)
– Độ lớn của đoạn AND
– Trình tự tương tự giữ đoạn ADN mục tiêu và mẫu dò
9/3/2011 9
Các bƣớc tiến hành
Bước1: Chuẩn bị DNA mẫu.
Bước 2: Chuyển ssDNA lên màng lai
(giai đoạn này gồm nhiều bước)
Bước 3: Lai ssDNA với mẫu dò
Bước 4: Kết thúc phản ứng lai, thu kết quả lai.
9/3/2011 10
1 2 3
Mẫu nghiên cứu
3

Marker
1
Đối chứng
2
Bước 1: Chuẩn bị DNA mẫu
9/3/2011 11
Membrane
DNA
Gel
Buffer
Gel
Membrane
Giấy thấm
Bước 2: Chuyển DNA mạch đơn lên màng lai
9/3/2011 12
Màng lai có mang
các DNA mạch
đơn
Bổ sung chất
“khóa” màng lai
Phần màng lai
không mang DNA
được phủ bằng
chất “khóa” màng
lai
Mẫu dò được phủ
trên toàn bộ
màng lai nhưng
chỉ liên kết với
các DNA bổ sung

Bổ sung mẫu dò
Màng lai sau khi
rửa
Mẫu dò chỉ còn có
mặt ở trạng thái liên
kết bổ sung với DNA
Bước 3: Lai phân tử
9/3/2011 13
Các đoạn bổ sung
với mẫu dò xuất
hiện như các vạch
băng
Màng mang phân
tử lai giữa mẫu dò
và DNA
Phim X-quang được
đặt trên màng lai
cho đến khi sự phát
xạ từ mẫu dò được
ghi lên phim
Bước 4: Thu kết quả
9/3/2011 14
Kết quả lai hiện lên phim nhờ phóng xạ tự ghi
Bước 4: Thu kết quả
9/3/2011 15
9/3/2011 16
• MOVIE_Southern Blot
9/3/2011 17
LAI NORTHERN
• Lịch sử

− Được phát triển vào năm 1977 bởi James Alwine
và George Stark tại Stanford University.
− Phát triển từ kỹ thuật lai Southern và được ứng
dụng cho phân tích RNA
9/3/2011 18
LAI NORTHERN
• Nguyên lý
– Dựa trên sự bắt cặp bổ sung giữa DNA và RNA
– Phương pháp lai Northern Blot là phương
pháp lai RNA của tế bào với mẫu dò DNA.
Các bước tiến hành cũng tương tự như
phương pháp Southern blot.
• Phƣơng pháp này cho biết
– Sự có mặt của mRNA trong mô
– Mức độ thể hiện của gen
– Độ lớn của mRNA
– Trình tự tương đồng giữa đoạn mục tiêu và mẫu dò
9/3/2011 19
(E)
Vị trí xảy ra lai
RNA-DNA
Phân tách RNA theo kích
thước nhờ chạy điện di
Mẫu RNA
Khay chứa
dung dịch đệm
Giá đỡ Tập giấy
thấm
Khoảng trống
Màng lai

Vật nặng
Giấy
thấm
Đặt màng lai lên trên gel, đặt giấy
thấm, vật nặng lên trên. RNA di
chuyển lên màng lai nhờ mao dẫn
Bổ sung mẫu
dò phóng xạ
mạch đơn
Túi lai
Ghi nhận kết quả
bằng phóng xạ tự ghi
Vị trí không lai
Bước1: chuẩn bị RNA mẫu.
Bước 2: Chuyển RNA lên màng lai
- Chạy điện di
- Chuyển RNA lên màng lai
Bước 3: Lai RNA với mẫu dò
Bước 4: Kết thúc phản ứng lai, thu kết quả lai.
Các bƣớc tiến hành
9/3/2011 20
LAI WESTERN
• Lịch sử
− Phương pháp này được thực hiện đầu tiên ở phòng
thí nghiệm của George Stark ở Stanford. Kỹ thuật
này đã được W. Neal Burnette đặt tên là Western
blot (1981), nối tiếp theo tên Southern blot.
9/3/2011 21
LAI WESTERN
• Nguyên lý

– Lai Western Blot được thực hiện giữa các protein
với nhau dựa trên nguyên tắc phản ứng miễn dịch
giữa kháng nguyên và kháng thể
• Phƣơng pháp này cho biết
– Sự thể hiện của gen thông qua sự có mặt của
protein trong mô
– Mức độ thể hiện của gen
– Độ lớn của protein
9/3/2011 22
1. Chuẩn bị mẫu protein
2. Chạy điện di SDS-PAGE
3. Chuyển protein lên màng
4. Cố định màng
5. Ủ với kháng thể và phát hiện
Các bƣớc tiến hành
9/3/2011 23
Chuẩn bị mẫu
1. Chuẩn bị mẫu protein
2. Chạy điện di SDS-PAGE
3. Chuyển protein lên màng
4. Cố định màng
5. Ủ với kháng thể và phát hiện
9/3/2011 24
Chuẩn bị mẫu
Tách chiết protein
Hòa tan và biến tính protein
Protein ở dạng cấu trúc 2' and 3' thường không
tích điện âm xử lý với SDS (sodium dodecyl
sulfate) để bọc protein với điện tích âm
9/3/2011 25