luận văn công nghệ sinh học Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt chất sinh học của lá trầu miền Bắc

LỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới thầy giáo Ths. Phạm Thế Chớnh đó
tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình
thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Hóa học trường ĐHKH
đã trực tiếp truyền thụ cho chúng em những kiến thức nền tảng hết sức quan
trọng trong thời gian học tập tại trường, và đã tạo cho em những điều kiện thuận
lợi để chúng em có điều kiện nghiên cứu những mảng kiến thức bổ ích và quý
báu.
Em xin cảm ơn những người bạn, những anh chị đã cho những ý kiến
đóng góp quan trọng trong quá trình tìm hiểu vấn đề.
Mặc dự đó cố gắng nhưng trong bài không tránh khỏi những sai sót và
khiếm khuyết, em rất mong được sự đóng góp của thầy cô.
Em xin chân thành cảm ơn!

Thỏi Nguyờn, ngày 18 tháng 4 năm 2011.
Sinh viên
Hoàng Thị Thanh

MỤC LỤC
2.4 ĐIỀU CHẾ CÁC CẶN CHIẾT TỪ LÁ TRẦU (PIPER BETLE L.) 19

2

MỞ ĐẦU
Trầu không là cây vườn quen thuộc gắn liền với văn hóa Việt Nam từ
ngàn xưa, đã đi vào nhiều câu chuyện và dân ca khắp mọi miền của đất nước.
Người ta sử dụng lá trầu không để ăn và làm thuốc trong y học dân tộc. Tập tục
ăn trầu là một nét văn hóa đặc trưng của lễ tết Việt Nam cũng như nhiều dân tộc
phương đông khác như Srilanka, Ấn Độ, Malaysia _ lá trầu được xem là biểu
tượng của lòng tôn kính, sự may mắn và hòa hợp. Trong y học dân gian, người ta

dựng lỏ trầu không giã nhỏ, cho thêm nước sôi vào dùng để rửa những vết loét,
mẩn ngứa. Nước pha lá trầu không chữa bệnh viêm kết mạc…
Việc nghiên cứu thành phần hóa học của trầu không đã được nghiên cứu
tại một số quốc gia trên thế thế giới, và đã phân lập được một số hợp chất quý,
có vai trò sinh học quan trọng. Theo “Nghiờn cứu thành phần hóa học và hoạt
chất sinh học của lá trầu miền Bắc” của ThS. Phạm Thế Chớnh đó phân lập
được egeunol là thành phần chính trong tinh dầu miền Bắc. Thành phần hóa học
chủ yếu của trầu không philippine là chavibetol và chavibetol axetat. Trầu không
Ấn Độ thì eugenol và hydroxychavicol là thành phần chính.
Ở Việt Nam chưa có nhiều số liệu công bố về các thành phần hóa học của
trầu không, hơn nữa những bài thuốc trong dân gian sử dụng lá trầu không để
chữa bệnh chưa có tiêu chuẩn kiểm nghiệm về thành phần hóa học nào tạo nên
hoạt tính đó, vì vậy cần phải nghiên cứu kỹ thành phần hóa học của lá trầu. Đó là
lý do chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học dịch chiết kém
phân cực của lá trầu khụng”.

3

Chương 1
TỔNG QUAN
1.1 KHÁI QUÁT VỀ THỰC VẬT HỌ HỒ TIÊU (PIPERACEAE)
Piperaceae được biết đến là họ hồ tiêu, hiện được xếp là một họ rộng của
các thực vật có hoa. Nhóm này bao gồm khoảng 3610 loài thuộc 5 chi chính:
Piper, Piperomia, Zippellia, Manekia, Verhuellia. Phần lớn những cây hồ tiêu có
thể tìm thấy trong 2 chi chính là: Piper (2000 loài) và Peperomia (1600 loài).
Các thành viên của Piperaceae là những cây nhỏ, những bụi cây, hoặc các loại
thảo mộc [21]. Thân: cỏ hay dây leo nhờ dễ bám; Lá: đơn, nguyên, mọc cỏch, cú
hay không có lá kèm. Phiến lá hình tim hay hình trứng, gân lá hình chân vịt hay
lông chim; Cụm hoa: giộ không phân nhánh mọc ở nách lá hay đối diện với lá.
Mỗi hoa mọc ở nách một lá bắc, xếp theo đường xoắn ốc và thường áp sát vào

trục hoa; Hoa: trần, lưỡng tính, cũng có thể là đơn tính, mẫu 3 với 2 vòng nhị;
Bộ nhị: 6 nhị đớnh trờn 2 vòng, nhưng số nhị thường giảm do trong vòng có thể
mất đi hoàn toàn hoặc một phần; Bộ nhụy: thông thường là 3 noãn, nhưng cũng
có thể là 4 hoặc 5 noãn, hợp thành một bầu ô; Qủa: mọng, chứa một hạt, hạt có
nội nhũ và ngoại nhũ [4].
Cỏc cây tiêu biểu trong họ:
+ Rau càng cua: Piperomia Pellucida dùng làm rau ăn.
+ Trầu: Piper Betel L. thõn, lá, quả chữa nhức mỏi, đau dạ dày, ăn không
tiêu.
+ Lá lốt: Piper lolot C.DC toàn cây chữa phong hàn, rối loạn tiêu hóa.
+ Tiêu dài: Piper Longum L. quả trị đau bụng, tiêu chảy, nước rễ sắc chữa
bệnh viêm phế quản, ho, cảm lạnh.
+ Tiêu: Piper Nigrum L. dùng làm gia vị. [4]

4

1.2 KHÁI QUÁT VỀ CHI HỒ TIÊU
Chi hồ tiêu (piper) là một chi lớn, gồm khoảng 1200 loài, phân bố chủ yếu
ở các khu vực có khí hậu nhiệt đới điển hình. Trong vùng Đông Nam Á có
khoảng 400 loài. Ở nước ta, theo Phạm Hoàng Hộ (1991) chi hồ tiêu có khoảng
40 loài, thường là những cõy thõn bụi, thân thảo và cây dây leo. Lá mọc so le,
nguyên hay chẻ ba. Cụm hoa bụng tỏn, hoa lưỡng tính hoặc đơn tính, không có
bao hoa, xếp thành bông dày đặc và dài, hoa có hai nhị đớnh trờn trục hoặc ở gốc
bầu. Quả mọng dời không có cuống hoặc có cuống, chỉ có một hạt có phôi nhũ to
[2].
1.3 KHÁI QUÁT VỀ CÂY TRẦU KHÔNG
Trầu không có tên khoa học là Piper betle L. thuộc họ hồ tiêu
(pipieraceae). Ngoài ra ở những vùng khác nhau lại có tên khác nhau như: trầu
lẹt (Huế), trầu cay, trầu lương, hruố eehang (Buụn Mờ Thuột), mụ-lu
(Campuchia), piper betle, vine piper (Anh), bétel (Pháp)…

1.3.1 Đặc điểm thực vật
Trầu không là loại cây lâu năm, là loại dây leo bám, cành hình trụ nhẵn có
khía dọc, bén rễ ở những mấu, lá mọc so le, hình tim tròn, gốc đôi khi hơi lệch,
đầu nhọn dài khoảng 10 đến 13cm, rộng 4,5 đến 9cm, hai mặt nhẵn, mặt trên
sẫm búng, gõn nổi rất rõ ở mặt dưới. Cuống lá có bẹ kéo dài, cụm hoa mọc
buông thõng ở kẽ lá thành bông ngắn. Lá bắc tròn hoặc hình trái xoan, hoa đực
dài có cuống, có lông, hoa cái dài khoảng 5cm, cuống phủ lông dày, bầu có lông
ở đỉnh, quả mọng và tròn. Toàn thân có tinh dầu thơm, cay [1,6].

5


Hình 1: Hình ảnh cây trầu không Piper betle L.
1.3.2 Nguồn gốc và phân bố
Trầu không có nguồn gốc ở miền Trung và Đông Malaysia, được trồng từ
2500 năm trước, sau đó lan sang Madagasca và Đông Phi. Ở Trung Quốc, trầu
không cũng được ghi chép từ đời nhà Tần 618-907 sau công nguyên. Đầu thế kỷ
XV cây bắt đầu được đưa sang Châu Âu. Ngày nay trầu không được trồng phổ
biến ở khắp các nước nhiệt đới vùng Nam Á và Đông Nam Á như Ấn Độ,
Srilanka, Malaysia, Thái Lan, Indonesia, philippine, Việt Nam, Trung Quốc…
Ở Việt Nam, trầu không cũng được nhắc đến trong truyện cổ tích “Trầu-
Cau” từ thời vua Hùng, cách đây 2000 năm. Hiện nay trầu không được trồng
khắp nơi (trừ vùng cao núi lạnh, trên 1500 m). Việc trồng trầu không ở Việt Nam
cũng như các nước Châu Á thường gắn liền với tục ăn trầu của người dân [1].
1.3.3 Thành phần hóa học của trầu không
Thành phần các chất chứa trong lá trầu tươi [25]:

6

Bảng 1: Thành phần các chất chứa trong lá trầu tươi

Thành phần Hàm lượng Thành phần Hàm lượng
Nước 85-90% Riboflavin 1,9-30μg/100g
Protein 3-3,5% Tannin 0,1-1,3%
Chất béo 0,4-1% Nitrogen 2-7%
Chất khoáng 2,3-3,3% Photphorus 0,005-0.6%
Chất xơ 2,3% Kali 1,1-4,6%
Chlorophyll 0,01-0,25% Canxi 0,2-0,5%
Cacbohydrate 0,5-6,1% Sắt 0,005-0,007%
Axit nicotinic 0,63-0,89 mg/100g Iot 3,4 μg/100g
Vitamin C 0,005-0,01% Tinh dầu 0,08-0,2%
Vitamin A 1,9-2,9mg/100g Năng lượng 44 kcal/100g
Thiamine 10-70 μg/100g
Từ những bài báo và tạp chí trong nước cũng như trên thế giới, thành phần
hóa học của trầu không được phân ra như sau:
1.3.3.1 Các hợp chất tecpenoit
Tecpen là những hợp chất hữu cơ chứa C, H, O và tồn tại trong thiên
nhiên mà có bộ khung cacbon gồm nhiều mắt xích giống với khung cacbon của
isopren, tức là biểu diễn bởi công thức (iso-C
5
)
n
với n ≥ 2.
Theo nhiều kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước cho thấy, trong thành
phần hóa học của trầu không có chứa một số hợp chất tecpenoit.
Qua khảo sát thành phần hóa học tinh dầu trầu ở 3 vùng miền của Việt
Nam cho thấy thành phần thay đổi theo cỏc vựng miền địa lý: tinh dầu trầu miền
Bắc có hàm lượng các hợp chất tecpen thấp, còn tinh dầu trầu miền Nam trong
thành phần chính chỉ có một xiclic monotecpenoit là (R)-(-)-p-ment-1-en-4-ol
(terpinen-4-ol), với hàm lượng 19,28%. Trong khi đó tinh dầu trầu miền Trung
hàm lượng secquitecpenoit chiếm tới 25,6% bao gồm: δ-cadinen (1) , γ-cadinen

(2), α-cadinol (3) và monotecpenoit là terpinen-4-ol (4) [8, 9] .

7


HO
OH
(1) (2) (3) (4)
Theo kết quả nghiên cứu của Saeed S.A, Farnar S và các cộng sự khỏc đó
phõn lập được tritecpene từ trầu không, ứng dụng khả năng chống tiểu cầu hình
dĩa và khả năng kháng viêm của nó [28].
1.3.3.2 Các hợp chất phenolic (polyphenol)
Phenylpropenoit (C
6
-C
3
) là những hợp chất có một nhân benzen liên kết
với gốc allyl, và nhân benzen liên kết với ít nhất một nhóm hydroxy ở dạng tự do
hoặc liên kết với một nhóm chức khác như ete, este
Trong nhiều tài liệu nghiên cứu về thành phần hóa học của trầu không
piper betle cho thấy thành phần chính là eugenol và các dẫn xuất của nó. Như
trong công trình nghiên cứu của Lê Thanh, Nguyễn Xuân Dũng và Piet A.
Leclercq đã nghiên cứu và xác định được thành phần chính của tinh dầu trầu
trồng ở Huế là eugenol (10) [9]. Phạm Thế Chính cũng đã phân lập được eugenol
là thành phần chính lớn nhất trong tinh dầu trầu miền Bắc [3]. Như vậy tinh dầu
trầu không còn là nguồn nguyên liệu để sản xuất eugenol, một đơn hương quớ, là
nguyên liệu đầu cho tổng hợp các đơn hương và định hương khác phục vụ cho
công nghiệp hương liệu.
Ngoài ra, theo kết quả nghiên cứu thành phần hóa học của trầu không
Philippine do AgnesM.Rimando và các cộng sự nghiên cứu đã phân lập được các

thành phần chính trong tinh dầu trầu và các chất hòa tan trong ete. Thành phần
chính của tinh dầu trầu là: chavibetol (5) , metyl chavibetol (6), allylpyrocatechol
(7), safrole (8), chavibetol acetate (9), eugenol (10), allylpyrocatechol điaxetat
(11) và một số chất khác với hàm lượng nhỏ. Thành phần chính của các chất hòa
tan trong ete là allylpyrocatechol (2.38%). Như vậy thành phần chính của tinh

8

dầu trầu là các hợp chất phenol và tecpen, tỷ lệ của chúng khác nhau tùy thuộc
vào nguồn gốc của lá trầu. Chavibetol được coi là thành phần đặc trưng của trầu
Philippine, tuy nhiên tinh dầu trầu Ấn Độ thì eugenol lại là thành phần chính
(30-90%) [11].
Nghiên cứu của Pitchaon Maisuthisakul, Ph.D về hoạt tính chống oxy hóa
của các hợp chất phenolic từ lá trầu cho thấy thành phần các chất chứa trong lá
trầu có tác dụng này là chavicol, chavibetol, chavibetol axetat và eugenol [27].


OCH
3
OH
OCH
3
OCH
3
OH
OH

O
O

(5) (6) (7) (8)
OCH
3
OCOCH
3
OCH
3
OH
OCOCH
3
OCOCH
3
(9) (10) (11)
Theo nghiên cứu của M.Nagabhushan và các cộng sự cũng đã nghiờn cứu
và phân lập được eugenol - thành phần chính của tinh dầu trầu [23].
Cũng theo nghiên cứu khác của S. Bhattacharya cựng các cộng sự đã phân
lập được allylpyrocatechol từ dịch chiết etanol của lá trầu không tại Ấn Độ và
ứng dụng nó để chống lại bệnh viêm loét dạ dày, bằng cách thử nghiệm trên
chuột [29].
Tại Ấn Độ, K.Ghosh và T.K.Bhattacharya cũng đã nghiên cứu thành phần
hóa học của trầu không Piper betel Linn, phân lập được một số hợp chất chính

9

trong đó có hợp chất phenolic là 4-allyl resorcinol (12). Hợp chất này thu được
từ cặn chiết etylaxetat của rễ cây trầu [17].
Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất
phenolic trong trầu không, Amonkar cựng cỏc cộng sự đã phân lập được
chavicol (13) là thành phần chính trong tinh dầu trầu. Nú cũn được coi như là
một chất chống đột biến [12].

OH
OH

HO

(12) (13)
Lignanoit và Neolignanoit
Zing H.W. cựng cỏc cộng sự đã phân lập được piperol A (14), piperol B
(15), piperbetol (16), metylpiperbetol (17) từ lá trầu không Piper betle L. có khả
năng ức chế sự quần tụ huyết tố hình dĩa của thỏ, được gây kích thích bằng nhân
tố hoạt hóa huyết tố hình dĩa (PAF) trong sự phụ thuộc vào nồng độ. Hơn nữa,
piperbetol, metylpiperbetol, piperolA, và piperol B không làm ảnh hưởng đến
thành phần cAMP trong các thành phần còn lại của huyết tố hình dĩa [34].

H
3
CO
H
3
CO
HO
OCH
3
O
H
H
3
C

H
3
CO
H
3
CO
HO
OCH
3
O
H
H
H
3
CO
HO
AcO
OCH
3
O
H
H
3
C
H
3
CO
H
3
CO

AcO
OCH
3
O
H
H
3
C
piperol A piperol B
piperbetol
metylpiperbetol
(
14
) (
15
)
(
16
)
(
17
)

10

1.3.3.3 Các hợp chất ankaloit
Ankaloit là một nhóm hợp chất thiên nhiên mà hầu hết là các dị vòng chứa
nitơ, có tính bazơ, có trong một số sinh vật nhất định. Nhiều nghiên cứu trong và
ngoài nước đã phân lập và xác định được một số ankaloit từ cây trầu không.
K.Ghosh và T.K.Bhattacharya nghiên cứu về thành phần hóa học của rễ

cây trầu không piper betle Linn và phân lập được Aristololactam (18) từ phân
đoạn benzen _ ete dầu [17].
Ngoài ra, năm 2009, C.M.Lim, G.C.L.Ee cựng cỏc cộng sự khỏc đó phân
lập được 6 alkaloit từ trầu không ở Malaysia: Pellitorine (19), (E)-1-[3’,4’-
(methylenedioxy) cinnamoyl]-piperidine (20), Cepharadione A (21), 2,4-
tetradecadienoic acid isobutyl amide (22), Piperine (23), piperolactam D (24)
[16].

O
HO
MeO
NH
1
3
4
5
7
8
9
2
6
10
(18)
O
NH
1
2
3
4
5

6
7
8
9
10
1
'
2
'
3
'
4
'
O
O
N
O
1
2
3
1
'
2
'
3
'
4
'
5
'

6
'
2
''
3
''
4
''
5
''
6
''
(19) (20)


NH
MeO
H
OH O
MeO
NH
O
6

(21) (22)

11


O

O
N
O
O
O
NCH
3
O
O
H
H
H
H
H
H
(23) (24)
1.3.3.4 Steroit và axit béo từ trầu không
Theo nghiên cứu về thành phần hóa học của của thân cây trầu piper betle
do Yan Yin, Xiang Zhong Huang và các cộng sự nghiên cứu, sử dụng các kỹ
thuật sắc ký đã phân lập và tinh chế được 9 hợp chất. Cấu trúc của các hợp chất
này được xác định dựa trên cơ sở phân tích quang phổ. Kết quả đã phân lập được
9 hợp chất từ các phân đoạn ete dầu hỏa và phân đoạn etylaxetat của dịch chiết
axeton 70%. Trong 9 hợp chất đú cú cỏc hợp chất steroit là: 6β-
hydroxystigmast-4-en-3-on (25), β-sitosterol (26), stigmasterol (27). Đây là lần
đầu tiên phân lập được steroit từ cây xanh [33].
Bên cạnh đó, theo nghiên cứu của K.Ghosh và T.K.Bhattacharya về thành
phần hóa học của rễ cây trầu không Ấn Độ, đã phân lập được hợp chất steroit là
stigmas-4-en-3,6-đion (28) [17].

OH

O
3
4
6
HO
(25) (26)

12



HO

O
O

(27) (28)
Trong trầu không cũng tìm thấy một số axit béo. Theo nghiên cứu về
thành phần hóa học của thân cây trầu không của Yan Yin, Xiang Zhong Huang
và các cộng sự đã phân lập và xác định được axit 23-hydroxyursan-12-en-28-oic
(29) [33].
Ngoài ra, axit stearic (30) cũng được tìm thấy trong trầu không.

COOH

COOH

(29) (30)
1.4 GIÁ TRỊ TRUYỀN THỐNG VĂN HÓA, CÔNG DỤNG TRONG Y HỌC
VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA TRẦU KHÔNG PIPER BETLE L.

1.4.1 Tục nhai trầu- một nét đẹp văn hóa
Ngày xưa người Việt thường có thói quen ăn trầu và đã trở thành phong
tục. Tục ăn trầu tương truyền có từ thời vua Hùng và gắn liền với chuyện cổ tích
“trầu cau”. Miếng trầu gồm có 4 nguyên liệu: cau có vị ngọt, lá trầu không có vị
cay, rễ chay có vị đắng, và vôi tôi có vị nồng, đôi khi người ta cho thêm cả sợi
thuốc lá. Ăn trầu thể hiện nếp sinh hoạt mang đậm tính dân tộc độc đáo của
người Việt Nam, ăn trầu làm thơm miệng, chắc răng, hạ khí, tiêu cơm.
“Miếng trầu là đầu câu chuyện”- là thay cho lời mở đầu nồng nàn để mọi
câu chuyện trở lên gần gũi và thân thiết hơn.

13

Tục ăn trầu đã trở thành nét văn hóa không phai nhòa trong tâm hồn người
Việt. Trong lễ cưới hỏi, mâm thờ cúng tổ tiên không thể thiếu trầu cau, trong dịp
lễ tết và một số lễ hội khác cũng vậy.
Không chỉ ở Việt Nam mà các quốc gia khác như Trung Quốc, Ấn Độ,
Malaysia, Philippine, Sri Lanka,… lá trầu cũng chiếm vị trí quan trọng trong đời
sống văn hóa và trong các dịp cưới hỏi, hôn nhân.
1.4.2 Công dụng của trầu không trong y học cổ truyền
Trầu không có vị cay nồng, mùi thơm hắc, tính ấm, vào các kinh : phế tỳ,
vị, có tác dụng trừ phong thṍp, chụ́ng lạnh, hạ khí, tiêu đờm, tiờu viờm, sát
trùng.
Y học dân gian nhiều nước có kinh nghiệm dùng nước sắc lá trầu để rửa
vết thương và những chỗ lở loét ngoài da. Y học Ayurveda sử dụng lá trầu làm
thuốc kích dục. Tại Malaysia, lá trầu được dùng chữa đau đầu, viêm khớp. Ở
Thái Lan, trầu chữa đau răng. Ở Indonesia, dõn gian dùng trầu làm thuốc kháng
sinh, kháng khuẩn, diệt nấm. Lá trầu có thể được dùng để xông hơi, hít qua mũi
để trị nhức đầu, làm thông mũi hoặc sát trùng đường hô hấp. Ngoài ra, tinh dầu
trầu cũng được dùng trong công nghệ sản xuất dược phẩm, nước hoa, làm sạch
miệng hoặc chất tẩy mùi [6].

Ở Ấn Độ, lá và tinh dầu trầu không được dùng điều trị các bợ̀nh xuṍt tiờ́t,
bệnh phổi và làm thuốc đắp, thuốc súc miệng hoặc thuốc ngửi trong bệnh bạch
hầu. Lá trầu không có trong thành phần chế phẩm thuốc cổ truyền Ấn Độ phối
hợp với một số dược liệu khác trị hen phế quản.
Ở Việt Nam trầu không được dùng chữa hàn thấp nhức mỏi, đau bụng đầy
hơi, vết thương nhiễm trùng có mủ sưng đau, hen suyễn khi thời tiết thay đổi,
đờm nhiều khó thở, cảm mạo, bỏng, mụn nhọt, hắc lào, mề đay, ghẻ ngứa, sõu
kiờ́n đụ́t, viờm quanh răng, viêm tai, viêm họng. Ngày dùng 8 – 16g, dưới dạng
thuốc sắc. Dùng ngoài, đắp lá tươi giã nát hoặc ngâm lá với nước để rửa.

14

Lá trầu không và gừng sống ép lấy nước chữa ho, kho thở, đầy bụng.
Nước ép lá trầu không nhỏ vào tai chữa đau tai. Súc miệng hàng ngày với nước
có dịch ép lá trầu không phòng được viêm họng, có tác dụng hổ trợ các thuốc
chữa bệnh bạch hầu. Lá trầu không và lá ráy, giã nhỏ, hơ nóng, đắp chữa sưng
tấy. Trầu không (3 – 5 lá), hạt cau (1 hạt) phơi khô, tán bột rắc làm thuốc cầm
máu. Lá trầu không (2 – 4 g), nhai nuốt nước chữa đau bụng lạnh dạ, tiêu chảy,
nôn mửa, không tiêu [6].
1.4.3 Hoạt tính sinh học của trầu không
Trong trầu không có nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh, có khả
năng kháng lại nhiều loại vi khuẩn. Như trong nghiên cứu của T.Nalina và
Z.H.A.Rahim đã thử hoạt tính sinh học của dịch chiết thô của lá trầu Malaysia
lên vi khuẩn gây sâu răng trong khoang miệng người là Streptococcus mutans
[31,32].
Cao lá và tinh dầu trầu không có hoạt tính ức chế in vitro các chủng vi
khuẩn: tụ cầu vàng, phờ́ cõ̀u, Staphylococcus albus, Bacillus subtilis, B.
anthracis, liờn cầu tan máu, Escherichia coli, Salmonella typa, phảy khuẩn tả,
Shigella flexneri, Sh. Shigae, Proteus vulgaris, Sarcina lutea và Erwinia
carotovona, các chủng nấm: Candida albicans, C. stellatoides, Aspergillus

niger, A. flavus, A. oryzae, Curvularia lunata, Fusarium oxysporum và Rhizopus
cans. Hoạt tính diệt nấm có thể so sánh với resorcinol. Nước cất lá có tác dụng
ức chế sự phát triển của trực khuẩn lao in vitro trong thử nghiệm pha loãng với
nồng độ ức chế thấp nhất 1:5000 [25].
Trầu không có tác dụng kháng Entamoeba histolytica phân lập từ bệnh
phẩm. Tinh dầu diệt động vật nguyên sinh Paramaecium caudatum với độ pha
loãng đến 1:10.000. Trầu không có tác dụng diệt nấm mạnh đối với 24 chủng
Trichophyton rubrum, 3 chủng T. mentagrophytes, 3 chủng T. tosurans, 1 chủng
T. verrucosum, 4 chủng Microsporum canis, 2 chủng M. gypseum và 2 chủng
Epidermophyton floccosum [1].

15

Trầu không có tác dụng chống co thắt trờn mụ cơ trơn, ức chế sự tăng quá
mức của nhu đụ̣ng ruụ̣t, gõy trung tiện, có tác dụng ức chế hệ thần kinh trung
ương ở động vật có vú. Liều chết có tác dụng gây mê sâu và gây chết sau vài giờ.
Trầu không đã được đánh giá về tác dụng làm giảm trạng thái căng thẳng về thần
kinh ở người và có tác dụng tốt trên bệnh nhân hen phế quản. Piperbetol,
methylpiperbetol, piperol A và piperol B, phân lập từ trầu không, ức chế đặc hiệu
sự kết tập tiểu cầu thỏ gây bởi yếu tố hoạt hoá tiểu cầu một cách phụ thuộc vào
nồng độ. Liều ức chế IC
50
của các chṍt trờn và ginkgolid B vào khoảng 18,2;
10,6; 114,2; 11,8 và 4,8 àmol/lít, tương ứng. Hoạt lực ức chế của ginkgolid B
bằng khoảng 2,8; 1,2; 22,8 và 1,4 lần lớn hơn của piperbetol, methylpiperbetol,
piperol A và piperol B. Các kết quả nghiên cứu cho thấy piperbetol,
methylpiperbetol, piperol A và piperol B là những chất đối kháng với cụ thể của
yếu tố hoạt hoá tiểu cầu in vitro [34].
Cao cụ̀n cuụ́ng lá trầu không cho chuột cống trắng cái uống 4 liều khác
nhau (250 – 1000 mg/kg/ngày), trong những ngày 1 – 10 sau khi giao hợp, có tác

dụng chống làm tổ phụ thuộc vào liều. Với liờ̀u uụ́ng 1g/kg, tỷ lệ ức chế làm tổ
90%. Tác dụng chống làm tổ do hoạt tính kháng steroid của cao trầu không.
Đồng thời trọng lượng tử cung giảm, và cùng với tác dụng chống làm tổ, có thể
trầu không tác động đến sự tiết hoặc việc sử dụng progesteron. Cao cụ̀n cuụ́ng lá
trầu không được cho chuột cống trắng đực uống với liều 800 – 1500 mg/kg, và
cho chuột nhắt trắng đực uống với liều 50 – 100 mg/kg trong 60 ngày liên tục để
nghiên cứu về tác dụng trên khả năng sinh sản và những thông số về hormon
nam tính khác trên các cơ quan sinh sản nam. Những kết quả nghiên cứu gợi ý
về tác dụng ức chế sự sinh tinh trùng hoặc kháng androgen của trầu không ở
chuột [29].
Trong thử nghiệm về tác dụng gõy biờ́n trạng gen gián phân, sự trao đổi
chéo, và đột biến ngược trên những chủng lưỡng bội của Saccharomyces
cerevisiae cho thấy cao nước lá trầu không không gây sự đột biến ở men khi

16

không có sự hoạt hoá chuyển hoá, không làm tăng tõ̀n suṍt những thờ̉ biờ́n trạng,
thể tái hợp và thể đột biến ngược, khụng gõy chờ́t tế bào và không ức chế sự
phân chia tế bào. Việc đánh giá hàm lượng DNA ở nhân các tế bào tuyến ở dạ
dày chuột nhắt trắng in situ bằng phương đo quan tế bào cho thấy sự biến đổi có
ý nghĩa của hàm lượng trung bình DNA sau thời gian dài (6 – 10 tháng) nhai lá
trầu không với hạt cau và vôi tôi.
Cao nước lá trầu không chế thành thuốc mỡ có tác dụng làm vết thương ở
thỏ chóng lành do thúc đẩy nhanh sự co và sự biờ̉u mụ hoá vết thương, ít ảnh
hưởng đến sự tạo mô hạt. Mỡ trầu không chứa 1% cao trầu không đã được áp
dụng cho 18 bệnh nhân bỏng vôi từ độ hai tới độ ba. Kết quả 7 bệnh nhân bỏng 6
– 18% khỏi sau 10 – 15 ngày, 7 bệnh nhân bỏng 40% khỏi sau 25 – 38 ngày, 4
bệnh nhân bỏng 25 – 46% khỏi sau 54 – 124 ngày. Mỡ trầu không 1% có tác
dụng tốt trị bỏng độ hai nông và sâu, và có tác dụng hạn chế đối với bỏng độ ba.
Dùng uống, trầu không làm giảm sốt ở một số bệnh nhân bỏng [1].

Thuốc đắp khụng gõy xót và phản ứng phụ khác. Tinh dầu trầu không có
tác dụng kích ứng trên da và niêm mạc, và gây phản ứng viêm khi tiêm dưới da
hoặc bắp thịt. Lá trầu không có tác dụng chống oxy hoá; đun nóng với dầu, mỡ,
bơ, ngăn chặn được sự ôi khét. Tác dụng này do phenol, đặc biệt là
hydroxychavicol có trong trầu không. Ảnh hưởng vờ̀ mụ bợ̀nh học của việc nhai
lá trầu không, hạt cau, với thuốc lá đã được nghiên cứu trên chuột nhắt trắng với
mô hình niêm mạc tuyến dạ dày: cho chuụ̣t uụ́ng liên tục trong 5 tháng cao chiết
từ thuốc lá với lá trầu không, hạt cau và vôi với liều thường dùng của người
nghiện nhai trầu, nhận thấy có hiện tượng dị sản ruột rõ rệt ở tất cả chuột. Tác
dụng này chủ yếu do thuốc lá; trầu không và vôi có tác dụng bảo vệ làm giảm
hiện tượng dị sản và loạn sản do thuốc lá. Các kết quả thí nghiệm làm sáng tỏ
nguyên nhân của hiện tượng người nhai trầu thường xuyờn với thuốc lá khối
lượng lớn dễ mắc bệnh ung thư [1].

17

Chương 2
THỰC NGHIỆM
2.1 MẪU THỰC VẬT
Nguyên liệu thực vật là lá trầu thu hoạch vào tháng 2 năm 2009 tại Hải
Dương. Tên khoa học được giám định tại Phòng thực vật, Viện Sinh thái và Tài
nguyên sinh vật thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 5 kg nguyên liệu
tươi được rửa sạch, loại bỏ phần hư hỏng, phơi khô ở điều kiện thường sau đó
sấy ở nhiệt độ 40-45
0
C đến khụ giũn rồi nghiền nhỏ thu được 1kg bột mịn khụ,
dựng để nghiên cứu thành phần hóa học của trầu không.
2.2 DỤNG CỤ, HÓA CHẤT
Các dung môi hữu cơ dùng để chiết mẫu thực vật, khảo sát sắc kí lớp
mỏng, sắc kí cột phải là dung môi tinh khiết (PA).

Dung môi etyl axetat kỹ thuật được rửa axớt 3 lần với dung dịch Na
2
CO
3
5%,
sau đó được rửa bằng nước cất đến pH = 7. Làm khô bằng Na
2
SO
4
khan sau đó
bằng CaCl
2
khan, cất lấy etyl axetat ở phân đoạn có nhiệt độ sôi 76-78
0
C.
Dung môi n-hexan kỹ thuật được rửa bằng axớt H
2
SO
4
đậm đặc, sau đó
bằng nước cất đến pH = 7, làm khô bằng Na
2
SO
4
khan và cất lấy ở phân đoạn có
nhiệt độ sôi 67- 68
0
C.
Sắc kí lớp mỏng (SKLM) được chạy trên những bản nhụm trỏng sẵn sili
cagel 60F

254
độ dầy 0,2 mm của hãng Merck.
Các sắc kí đồ lớp mỏng được nhận bằng thuốc thử vanilin/H
2
SO
4đ
1%
(dùng để nhận biết cỏc nhúm chất như steroit, tecpenoit, các chất màu, chất
sỏp…) được điều chế như sau: cho 0,2g vanilin vào 10 ml H
2
SO
4
đặc 98% khuấy
đến cho tan hết, thu được dung dịch thuốc thử. Thuốc thử FeCl
3
5% trong etanol
(dùng để nhận biết các hợp chất phenolic).
Chất hấp phụ dùng trong quá trình sắc kí cột là silicagel cỡ hạt 0,040-
0,063 mm của hãng Merck.

18

2.3 NHIỆM VỤ, PHƯƠNG PHÁP VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
2.3.1 Nhiệm vụ của đề tài
-Khảo sát SKLM để tìm được hệ dung môi tối ưu cho sắc ký cột.
- Phõn lập các chất từ cặn chiết M.
- Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được.
2.3.2 Phương pháp nghiên cứu
Dựng các phương pháp sắc ký: sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột để phân tích,
phân lập và nhận biết các chất.

Kết hợp các phương pháp phổ để xác định công thức cấu tạo các hợp chất
phân lập được: Phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ
hạt nhân một chiều (
1
H-NMR,
13
C-NMR, DEPT) và 2 chiều (HSQC, HMBC).
2.3.3 Thiết bị nghiên cứu
- Dung môi được loại trờn mỏy cất quay chân không RV-10 control D của
Đức.
- Phổ hồng ngoại (IR) được ghi trờn mỏy Impac 410-Nicolet FT-IR.
- Phổ khối lượng LC-MS (70eV) được ghi trờn mỏy LC-MS-OBBITRAP-
XL hãng Thermo SCIENTIFIC-USA
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR):
1
H-NMR,
13
C-NMR,
13
C-NMR-DEP-
135,
13
C-NMR-DEP-90, HSQC, HMBC, được ghi trờn mỏy Brucker Advance-
500 MHz, chuẩn nội TMS (tetrametyl silan), độ chuyển dịch hóa học (δ) được
biểu thị bằng ppm, hằng số J tính theo Hz.
2.4 ĐIỀU CHẾ CÁC CẶN CHIẾT TỪ LÁ TRẦU (PIPER BETLE L.)
Ngâm 1000g bột củ bột lá trầu khô trong 2 l metanol trong ba ngày ở nhiệt
độ phòng. Lọc Butsne lấy dịch và ngõm thờm 2 lần nữa. Gộp dịch lọc, loại bớt
metanol dưới áp suất giảm đến còn 600 ml. Thêm nước để nồng độ metanol là
60%. Chiết 5 lần bằng n-hexan, mỗi lần 100 ml thu được cặn n-hexan (cặn H).

Thêm nước vào dịch bị chiết đến 50% metanol, chiết 5 lần bằng diclometan, mỗi
lần 100 ml, thu được cặn diclometan (cặn M). Pha loãng dịch đến nồng độ
metanol là 25% rồi chiết tiếp 5 lần bằng etyl axetat, mỗi lần 100 ml, thu được

19

cặn etyl axetat (cặn E) và dịch metanol-nước (cặn W) Làm khô các dịch chiết
bằng Na
2
SO
4
khan, rồi loại dung môi ở áp suất thấp thu được các cặn chiết tương
ứng H, M, E, W trong bảng 2.1
Bảng 2.1. Hiệu suất của các cặn chiết thu được từ lá trầu so với trọng lượng
khô
Cặn chiết
n-hexan
(H)
Diclometan
(M)
Etylaxetat
(E)
Cặn nước
(W)
Khối lượng (g) 46,2 41,9 18,0
60,3
Hiệu suất (%) 4,62 4,19 1,80 6,03
2.5 KHẢO SÁT CÁC CẶN CHIẾT LÁ TRẦU BẰNG SKLM
2.5.1 Các bước tiến hành sắc ký lớp mỏng (SKLM)
Kỹ thuật đưa chất lên bản mỏng: Lấy một lượng nhỏ cặn chiết nghiên cứu

hòa tan bằng dung môi thích hợp (sử dụng dung môi dễ bay hơi để hòa tan chất)
sao cho dung dịch thu được không quá loãng hay quá đặc. Sau đó dùng capila
thủy tinh lấy chất rồi chấm lên bản mỏng sao cho vết chất phải tròn, gọn, cỏch
mộp trờn của bản mỏng 0,5 cm; cỏch chõn bản mỏng 0,7 cm; vệt chất nọ cách
vệt chất kia 0,5 cm. Phải làm khô vệt chất trước khi chấm thêm chất mới lên bản
mỏng, nhưng không đưa quá nhiều chất lên bản mỏng. Triển khai với hệ dung
môi khi vệt chất đã hoàn toàn khô.
Tiến hành SKLM: Pha hệ dung môi với tỉ lệ thích hợp cho vào bình sắc kớ cú
nỳt nhỏm và lắc kĩ. Đặt một mảnh giấy lọc vào thành bình để bão hòa dung môi.
Lượng dung môi lấy sao cho khi triển khai SKLM không để cho dung môi ngập vết
chất.
Cho bản mỏng đã chấm vào bình sắc kí, bản mỏng được đặt nghiêng một
góc 15
0
. Bình sắc kí phải để yên trong suốt quá trình triển khai. Khi tiền tuyến
dung môi cỏch mộp trờn 0,3 cm thì lấy bản mỏng ra. Làm khô bản mỏng, sau đó
hiện sắc phổ dưới đèn tử ngoại rồi bằng thuốc hiện vanilin/H
2
SO
4đ
1% và FeCl
3
5%.

20

2.5.2 Khảo sát các cặn chiết lá trầu
• Sắc ký lớp mỏng cặn chiết H
Tiến hành khảo sát sắc ký lớp mỏng cặn chiết H ta tìm được hệ dung môi
tối ưu là n-hexan: etyl axetat 10:2; v/v, phát hiện vệt chất trên lớp mỏng bằng

cách phun thuốc thử vanilin/H
2
SO
4
1%, và bằng dung dịch FeCl
3
5%. Kết quả
thu được trong bảng 3.1 chương 3 - kết quả và thảo luận.
• Sắc ký lớp mỏng cặn chiết M
Tiến hành sắc ký lớp mỏng cặn chiết M, tìm được hệ dung môi tối ưu là
diclometan 100%, phát hiện vệt chất bằng thuốc thử vanilin/H
2
SO
4
1% và bằng
FeCl
3
5%. Kết quả thu được trong bảng 3.2 chương 3 - kết quả và thảo luận.
• Sắc ký lớp mỏng cặn chiết E
Sắc ký lớp mỏng cặn chiết E với hệ dung môi triển khai là n-hexan: etyl
axetat 1:1 v/v, phát hiện vệt chất trên lớp bản mỏng bằng thuốc hiện
vanilin/H
2
SO
4
1%, và bằng FeCl
3
5%. Kết quả thu được trong bảng 3.3 chương 3
- kết quả và thảo luận.
2.6 NGHIấN CỨU PHÂN LẬP CÁC CHẤT TỪ CẶN CHIẾT M

• Chuẩn bị cột sắc ký
Cột sắc ký được dựng cú khúa kớn ở dưới, chiều dài 120cm, đường kính
3cm. Rửa sạch cột bằng hỗn hợp axit sunfocromic, rửa lại bằng nước cất rồi
tráng bằng cồn, làm khô cột. Khóa cột phải được tra mỡ silicon để đảm bảo xoay
chuyển dễ dàng.
• Nhồi cột theo phương pháp nhồi ướt
Cân 150g silica gel (cỡ hạt 0,040-0,063mm của hãng Merck) hòa với 200
ml n-hexan trong cốc thủy tinh dung tích 500ml. Khuấy đều đến khi trong cốc
không còn bọt khí. Mở khóa cột và đổ nhanh hỗn hợp sili cagel trong dung môi
n-hexan lên cột. Dùng quả bóp cao su gõ nhẹ lên cột nhiều lần cho các hạt sili

21

cagel dồn xuống để không còn bọt khí trong cột. Chú ý không để cột bị khô và
sau khi nhồi xong phải để cột ổn định trong 12 giờ.
• Tẩm mẫu
Cân 8 g cặn chiết M, hòa tan bằng 3 ml diclometan. Sau đó cho thêm từ từ
khoảng 16 g silica gel, trộn đều hỗn hợp và làm bay hơi hết dung môi, thu được
một hỗn hợp chất ở dạng bột tơi.
• Tiến hành sắc ký cột
Mở khóa dưới cho dung môi n-hexan ra khỏi cột cho đến khi bề mặt dung
môi cách bề mặt silica gel 2 mm. Cho toàn bộ mẫu đã chuẩn bị ở trên lên đầu
cột. Bề mặt của lớp sili cagel tẩm mẫu ở phía trên và lớp sili cagel nhồi cột phía
dưới phải đảm bảo tạo thành một mặt phẳng ngang so với cột để trong quá trình
rửa giải chất xuống đều, cho hiệu quả phân tách cao. Rắc một lớp mỏng silica gel
lên trên, rồi phủ một lớp bông thủy tinh để trỏnh cỏc khuếch tán ngược.
Tiến hành rửa giải bằng dung môi diclometan. Tốc độ rửa giải là 25 giọt/
phút. Kết quả thu được 150 phân đoạn, mỗi phân đoạn chứa 4 ml.
Các phân đoạn thu được đem tiến hành khảo sát lớp mỏng bằng dung môi
diclometan, gom các phân đoạn có sắc phổ giống nhau thành nhóm và đánh số

thứ tự cỏc nhúm T
0
cho đến T
6
.
Nhóm Các phân đoạn có sắc phổ giống nhau Khối lượng (g)
T
0
3-11 0,08
T
1
32-41 1,3
T
2
13-30 1,6
T
3
43-69 1,8
T
4
71-102 0,1
T
5
103-129 0,05
T
6
130-150 2,9
T
1
hiện một vệt tròn màu vàng với sắc ký lớp mỏng, là chất lỏng, màu

vàng sáng. T
1
cho R
f
= 0,75 khi khảo sát sắc ký lớp mỏng với dung môi
diclometan, hiện màu vàng với thuốc hiện vanilin/H
2
SO
4
1%.

22

Nhóm T
3
hiện 2 vệt màu vàng và màu hồng khi khảo sát SKLM với dung
môi diclometan, do đó chúng tôi tiếp tục tiến hành sắc ký cột lần 2 để tách 2 chất
này. Sử dụng cột sắc ký có chiều dài 80cm, đường kính 1,5cm, với dung môi rửa
giải là diclometan. Thu được 20 phân đoạn, mỗi phân đoạn chứa 4ml. Gom
những phân đoạn có sắc phổ giống nhau, thu được 3 nhóm:
Nhóm Các phân đoạn có sắc phổ giống nhau Khối lượng (g)
CM
1
1-7 0,82
CM
2
13-20 0,38
CM
3
8-12 0,52

CM
2
là chất lỏng màu vàng nhạt, hiện sắc phổ màu hồng với thuốc thuốc
thử vanilin/H
2
SO
4
1%. CM
2
cho R
f
= 0,425 với dung môi chạy sắc ký là
diclometan.
+ T
1
là chất lỏng màu vàng sáng, khối lượng 1,30g.
IR (Film): ν
max
cm
-1
3571 (OH); 2941, 1131 (OCH
3
); 2849 (CH
2
); 1638,
1594, 1443 (C=C thơm); 3083 (CH thơm); 760 (CH thơm) (xem phụ lục1).
1
H-NMR (DMSO, δ, ppm): 3,25 (2H, d, 2H- 1’); 3,72(3H, d); 5,02(2H, m,
2H- 3’); 5,89 (1H, q, 1H-2’); 6,55 (1H, dd, J= 8; 1,8 Hz, 1H-5); 6,63 (1H, d,
J=1,8 Hz, 1H-3); 6,81 (1H, d, J=8 Hz,1H-6); 8,8 (1H, s, 1H-OH-1) (xem phụ lục

3.1, 3.2).
13
C- NMR (DMSO, δ, ppm): 145,99 (C-1); 146,48 (C-2); 115,83 (C-3);
132,3 (C-4); 118,83 (C-5); 112,37 (C-6); 38,89 (C-1’); 138,05 (C-2’); 115,21 (C-
3’); 55,68 (OCH
3
) (xem phụ lục 4).
+ CM
2
: là chất lỏng màu vàng nhạt, khối lượng 0,38g.
1
H-NMR (DMSO, δ, ppm): 6.95 (1H, d, J= 8,5 Hz, 1H- 2); 6,96-6,6 (1H,
ddd, 1H- 3); 6,96- 6,6 (1H, ddd, 1H- 5); 6,95 (1H, d, J= 8,5 Hz, 1H-6); 2,23 (2H,
d, J= 7 Hz, 2H- 1’); 5,92- 5,87 (1H, m, 2H- 2’); 5,04- 4,97 (2H, m, 2H-3’); 9,18
(1H, s, 1H- OH) (xem phụ lục 6.1, 6.2).

23

13
C- NMR (DMSO, δ, ppm): 155,52 (C-1); 129,27 (C-2); 115,13 (C-3);
129,69 (C -6); 115,13 (C-5); 129,69 (C-6); 38,68 (C-1’); 138,32 (C-2’); 115,13
(C-3’) (xem phụ lục 7.1, 7.2).
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 ĐIỀU CHẾ CÁC CẶN CHIẾT TỪ LÁ TRẦU (PIPER BETLE L.)

24

Qui trình chiết các lớp chất đã được trình bày ở mục 2.4. Toàn bộ qui trình
được tóm tắt theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 3.1: Quy trình điều chế các cặn chiết từ lá trầu ( Piper betle L.)
Quy trình chiết trên cho phép chúng tôi thu được các chất trong lá trầu
thành các lớp chất có độ phân cực tăng dần theo sự phân cực của dung môi chiết
tương ứng. Lớp chất kém phân cực được chiết bằng dung môi n-hexan (cặn H)
chiếm 4,62% tính theo nguyên liệu khô, lớp chất này là các hydrocacbon, chất
sỏp, cỏc lignan… Lớp chất có độ phân cực trung bình được chiết bằng
diclometan (cặn M) chiếm 4,19% khối lượng nguyên liệu khô, đây là các ete,
andehit, xeton… Lớp chất có độ phân cực cao hơn được chiết bằng etyl axetat
(cặn E) chiếm 1,80% khối lượng nguyên liệu khụ, chỳng là các ancol, phenol…

1000g bột lá trầu khô
Dịch MeOH- nước
1. Ngâm 3 lần bằng MeOH, Lọc butsle
2. Cất loại đến V= 600ml, pha nước còn 60% MeOH
Dịch MeOH- nước
Dịch n-hexan
Cặn H
46,2g
(4,62%)
Dịch MeOH- nước Dịch diclometan
Dich MeOH- nước Dịch etylaxetat
Cặn M
41,9g (4,19%)
Cặn W
60,3g (6,03%)
Cặn E
18,0g (1,8%)
Chiết bằng n-hexan
1.Pha loãng còn 40% MeOH
2.Chiết bằng diclometan

1. Pha loãng còn 25% MeOH
2. Chiết bằng etyl axetat
1. Làm khô
2. Loại dung
môi
1. Làm khô
2. Loại dung môi
1. Làm khô
2. Loại dung môi
25