Khảo sát đánh giá nguồn gen lúa nếp (gen thơm, waxy và kháng bệnh bạc lá) bằng chỉ thị phân tử

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC





ĐỀ CƯƠNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
“ Khảo sát đánh giá nguồn gen lúa nếp
(gen thơm, waxy và kháng bệnh bạc lá)
bằng chỉ thị phân tử ”
G.V hướng dẫn : ThS. Nguyễn Quốc Trung
Bộ môn CNSH ứng dụng
Khoa CNSH -
Trường ĐHNN HN
Sinh viên thực hiện : Đoàn Thị Hoa
Mã sinh viên : 533265
Lớp : CNSHA-K53
HÀ NỘI – 2012
I. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Lúa nếp là một trong những nhóm lúa đặc sản lâu đời của nhân dân Việt
Nam và được sử dụng vào nhiều mục đích khác nhau như: nấu xôi, làm các loại
bánh trưng, bánh dày, bánh dẻo, làm đồ uống như rượu và nhiều loại đồ ăn khác,
đó là những thứ không thể thiếu trong các dịp lễ, tết. Lúa nếp đã góp phần làm
nên hương vị độc đáo, giàu tính nhân văn của văn hóa ẩm thực Việt Nam. Lúa
nếp chiếm khoảng 10 % diện tích sản xuất lúa và khoảng 10% lượng gạo được
tiêu dùng của người Việt Nam.
Nếp có giá thành cao, tuy nhiên các dòng lúa nếp Việt Nam khá nghèo

nàn, có thể chia thành 2 nhóm
- Giống nếp địa phương: Nếp cái hoa vàng, nếp cau, nếp hoa trắng… chất
lượng gạo tốt, cơm thơm, dẻo và ngon, nhưng năng suất thấp, cây cao dễ đổ.
- Giống lúa nếp mới chọn tạo như TK90, 315, 415…năng suất khá, thấp
cây nhưng chất lượng gạo kém,một số giống không thơm, cơm ít dẻo đặc biệt dễ
bị nhiễm bệnh đạo ôn, bạc lá và rầy nâu.
Trong đó, bệnh bạc lá do vi khuẩn Xanthomonas oryzea là loại bệnh gây
hại nghiêm trọng đến năng suất và phẩm chất cây lúa. Có nhiều biện pháp để
phòng trừ bệnh bạc lá trong đó ưu việt hơn cả là chọn giống kháng bệnh vừa cho
hiệu quả kinh tế cao, vừa cho sản phẩm sạch, lại không gây ô nhiễm môi trường.
Nhiều gen đã được nghiên cứu ứng dụng trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh
bạc lá và những giống lúa mang một trong các gen này có mức độ kháng cao,
phổ kháng rộng.
Như vậy, việc đánh giá nguồn gen lúa nếp đặc biệt là gen thơm, gen
waxy, gen kháng bạc lá không chỉ có ý nghĩa trong việc bảo tồn các giống lúa
đặc sản mà còn có ý nghĩa quan trọng trong công tác chọn tạo giống lúa chất
lượng cao.
Ngày nay, chỉ thị phân tử đã được sử dụng rộng rãi như một công cụ hữu
hiệu trong nghiên cứu đánh giá bộ gen của lúa.
2
Xuất phát từ cơ sở trên, để chọn tạo các dòng giống lúa nếp chất lượng
cao, kháng bệnh bạc lá, chúng tôi tiến hành đề tài : “Khảo sát đánh giá nguồn
gen lúa nếp (gen thơm, waxy và kháng bệnh bạc lá) bằng chỉ thị phân tử”.
1.2. Mục đích và yêu cầu
1.2.1 Mục đích
Tuyển chọn ra được các giống lúa nếp địa phương năng suất cao, chất
lượng tốt, kháng bệnh bạc lá.
1.2.2 Yêu cầu
- Sử dụng chỉ thị phân tử xác định gen chính quy định mùi thơm, gen
waxy và gen kháng bệnh bạc lá lúa Xa4, xa5, Xa7 của các dòng/ giống lúa nếp

địa phương.
- Đánh giá một số đặc điểm nông sinh học chính, năng suất, chất lượng và
khả năng kháng bệnh bạc lá của các dòng/giống lúa nếp địa phương.
3
II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tình hình chọn tạo giống lúa nếp chất lượng
2.1.1 Tình hình chọn tạo giống lúa nếp chất lượng trên thế giới
2.1.2 Tình hình chọn tạo giống lúa nếp chất lượng ở Việt Nam
2.2 Chỉ thị phân tử
2.3 Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị gen mùi thơm
2.4 Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị gen waxy
2.5 Nghiên cứu về bệnh bạc lá trên lúa nếp
2.5.1 Nguyên nhân gây bệnh
2.5.2 Triệu chứng
2.5.3 Tác hại của bệnh bạc lá lúa
2.5.4 Cơ sở khoa học của chọn giống kháng bạc lá
4
III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Địa điểm: Khu ruộng thí nghiệm và phòng thí nghiệm phòng sinh học
phân tử và công nghệ sinh học ứng dụng, khoa CNSH, trường ĐH Nông Nghiệp
Hà Nội.
- Thời gian nghiên cứu: từ 01/2012 đến 07/2012.
3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Vật liệu
- 50 giống lúa nếp địa phương và giống đối chứng là TK90
- Các isolate vi khuẩn bạc lá được phân lập và bảo quản tại phòng thí
nghiệm bộ môn Công nghệ Sinh học Ứng dụng trường ĐHNN Hà Nội.
3.2.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.2.1 Thí nghiệm đồng ruộng

a. Bố trí thí ngiệm ngoài đồng ruộng
+ Thời vụ: Vụ xuân năm 2012
+ Thí nghiệm được bố trí theo từng ô, mỗi ô 1 giống
+ Các tổ hợp được bố trí tuần tự không nhắc lại
+ Mỗi giống cấy 5 m
2
+ Hàng cách hàng 20 cm
+ Cây cách cây 11 cm, cấy 1 dảnh
+ Bón phân và chăm sóc như đại trà
b. Theo dõi một số chỉ tiêu nông sinh học
Tiến hành theo phương pháp của IRRI.
+ Chiều dài lá đòng: đo 5-10 lá từ tai lá đến đỉnh lá đòng, tiến hành vào thời
kỳ lúa chín.
+ Chiều rộng lá đòng: đo 5-10 lá, đo phần rộng nhất của lá, đo vào thời kỳ lúa chín.
+ Chiều cao cây: tiến hành đo vào thời kỳ chín, đo từ mặt đất đến phần cao nhất
của bông lúa không kể râu.
+ Chiều dài bông: đo từ đốt cổ bông đến đầu mút bông, đo vào thời kỳ lúa chín.
5
+ Số nhánh tối đa: đếm số nhánh tối đa của từ 5-10 khóm/ giống.
+ Số nhánh hữu hiệu: đếm số nhánh cho bông của 5-10 khóm/ giống, đếm vào
thời kỳ lúa kết thúc làm đòng đến trỗ.
+ Số bông hữu hiệu: đếm số bông cho năng suất của 5-10 khóm/ giống, đếm vào
thời kỳ chín.
+ Số hạt chắc trên bông hữu hiệu: đếm số hạt chắc/ bông của 5-10 bông/ giống.
+ Tổng số hạt trên bông: đếm tổng số hạt trên bông của 5-10 bông/ giống.
+ Khối lượng 1000 hạt: cân 2 lần khối lượng 500 hạt nếu sai số không quá 3%
thì lấy khối lượng 1000 hạt là tổng khố lượng 2 lần cân.
+ Năng suất tiềm năng: Tính theo công thức
NSTN= (AxBxCxD) x 10
-4

(tạ /ha).
Trong đó:
A: số bông hữu hiệu/ khóm.
B: Số hạt chắc/ bông chính.
C: Khối lượng 1000 hạt.
D: Mật độ cấy (số khóm/m
2
).
Với mỗi giai đoạn quan sát, tiến hành lập bảng.
c. Đánh giá cảm quan mùi thơm
Theo Sood và Siddiq (1978), mùi thơm được đánh giá cảm quan như sau:
Mùi thơm trên lá: Thu 10 lá của mỗi mẫu giống ở giai đoạn lúa đẻ nhánh
rộ. Lấy 1g lá, cắt thành những đoạn dài 5 mm, bỏ vào ống nghiệm, ngâm với
5ml dung dịch KOH 1,7%, đậy nắp lại và để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
Mức độ thơm được chấm điểm bởi 5 người cho theo 3 mức rồi lấy trung bình.
Điểm 1: không thơm Điểm 2: hơi thơm Điểm 3: thơm
Mùi thơm của gạo: Lấy 10 hạt của mỗi giống, vừa mới thu hoạch, bóc vỏ,
làm trắng rồi nghiền nhỏ. Bột gạo của mỗi giống được cho vào một ống chứa
500µl KOH 1,7%, đậy nắp và để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Đánh giá mùi
thơm cũng bằng phương pháp ngửi của 5 người rồi cho điểm như trên.
d. Đánh giá hàm lượng amylose, độ dẻo của cơm các giống lúa
6
* Nhiệt hoá hồ
Lấy 6 hạt gạo đã xát trắng, không có vết nứt, gãy, sắp vào đĩa petri. Cho
vào mỗi đĩa 10 ml dung dịch KOH 1.7%, đậy nắp và để trong 23 giờ ở nhiệt độ
30
o
C. Nhiệt trở hồ được xác định bằng mức lan rộng và độ trong suốt của gạo
sau khi xử lý (theo phương pháp của Little và cs). Đánh giá nhiệt hoá hồ và độ
phân huỷ theo thang điểm IRRI.(1996)

*Phân tích hàm lượng amylase
Định lượng amylose theo phương pháp của H. Seko, 2003: hạt lúa được
bóc vỏ, xát trắng, nghiền nhỏ. Lấy 100 mg bột đã nghiền, bổ sung vào 1ml
Ethanol 95%, 9 ml NaOH 1N. Đun sôi ở 100
o
C trong 10 phút và định mức cho
đủ 100 ml. Lấy 5 ml dung dịch hoà tan, cho thêm 1 ml CH
3
COOH 1M, 2 ml
dung dịch iodine. Định mức cho đủ 100 ml, giữ ấm ở 30
o
C trong thời gian 20
phút rồi đo OD ở bước sóng 620 nm trên máy đo quang phổ và đọc giá trị. Đối
chiếu bảng quy đổi tìm ra hàm lượng amylose. Phân nhóm hàm lượng amylose
theo tiêu chuẩn IRRI (1988)
c. Đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá bằng lây nhiễm nhân tạo
* Môi trường nuôi cấy vi khuẩn
Vi khuẩn Xanthomonas oryzae được nuôi cấy trên môi trường Wakimoto.
Thành phần môi trường gồm:
+ Khoai tây: 300g
+ Đường saccarose: 15g
+ Pepton: 5g
+ Agar: 17g
+ Na
2
HPO
4
.12H
2
O: 2g

+Ca
2
(NO
3
)
2
.4H
2
O: 0.5g
+ Nước cất: 100ml, pH= 6.8-7.0
Môi trường Wakimoto được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121
0
C trong ống
nghiệm thời gian 20 phút, tạo mặt phẳng nghiêng.
7
Trước khi lây nhiễm nguồn vi khuẩn được cấy bảo quản trong môi trường
sữa ở -30
0
C, được cấy truyền sang môi trường Wakimoto ở 28
0
C sau 48-72h,
sau đó pha loãng dung dịch vi khuẩn bằng nước cất vô trùng đạt được nồng độ
10
8
CPU/ml để gây bệnh.
* Phương pháp lây nhiễm
Lây nhiễm theo phương pháp cắt đầu lá: dùng kéo đã khử trùng nhúng
vào dung dịch chứa vi khuẩn gây bệnh bạc lá ( mỗi chủng vi khuẩn dùng một
kéo vô trùng) cắt lên đầu lá lúa một đoạn dài khoảng 2-5 cm và lây nhiễm vào
giai đoạn lúa làm đòng-trỗ, mỗi chủng một cây, trên một cây cắt toàn bộ các lá

xanh trên đó.
Trước khi lây nhiễm, tiến hành làm thí nghiệm để xác định khả năng duy
trì độc tính của các chủng vi khuẩn trong quá trình bảo quản bằng cách lây thử
trên dòng mẫn cảm IR24. Sau 5 ngày thấy đầu lá héo xanh và tái đichứng tỏ các
chủng vi khuẩn này có độc tính có thể dùng để lây nhiễm được.
* Đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá
Sau khi lây nhiễm được 20 ngày tiến hành đo chiều dài vết bệnh theo
phương pháp do giáo sư Satoru Taura đề xuất.
Dựa vào chiều dài của vết bệnh để đánh giá tính kháng của các giống như
sau:
+ Chiều dài vết bệnh < 8cm: kháng bạc lá (R)
+ Chiều dài vết bệnh từ 8-12cm: nhiễm vừa (M)
+ Chiều dài vết bệnh >12cm: nhiễm nặng (S)
3.2.2.2 Thí nghiệm trong phòng
a. Chiết tách DNA
Quy trình chiết tách DNA tổng số theo Zheng và cs (1995) có cải tiến.
+ Bước 1: thu ngắt mẫu lá khoẻ dài khoảng 2 cm bỏ vào ống nghiệm có dung
tích 1.5 ml, đánh dấu tên giống rồi bỏ vào tủ lạnh.
+ Bước 2: các mẫu lá được cắt nhỏ 0.5 cm rồi bổ vào cối sứ sạch.
8
+ Bước 3: nhỏ 400 µl dung dịch chiết xuất DNA vào cối rồi lấy chày nghiền
nhỏ mẫu lá.
+ Bước 4: nghiền nhỏ mẫu lá cho đến khi dung dịch chuyển sang màu xanh
đen chứng tỏ tế bào lá đã vỡ và diệp lục được giải phóng ra.
+ Bước 5: đổ thêm 400 µl dung dịch chiết xuất DNA vào và trộn lẫn rồi
chuyển dung dịch đó vào ống nghiệm đã đánh số.
+ Bước 6: đổ và ống nghiệm 400µl dung dịch hỗn hợp Phenol: chlorofom:
isoaminalchohol (25:24:1). Sau đó li tâm 13000 vòng/ phút trong 5 phút.
+ Bước 7: đổ vào ống nghiệm 400 µl (2 chlorofom: 1 isoaminalchohol).
+ Bước 8: cho 800 µl ethanol (96%) trộn đều sau đó ly tâm 5 phút với tốc độ

13000 vòng/ phút. Đổ phần dung dịch phía trên, giữ lại phần kết tủa dưới đáy
ống nghiệm.
+ Bước 9: rửa kết tủa bằng ethanol 70%, làm khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng
bằng cách úp ngược ống nghiệm lên giấy thấm.
+ Bước 10: hoà tan kết tủa bằng 50µl dung dịch TE rồi bảo quản ở nhiệt độ
-20
0
C hoặc 4
0
C.
Bảng 3.1 Thành phần dung dịch chiết tách
Thành phần Nồng độ dd mẹ Nồng độ dd
làm việc
Hỗn hợp 50ml dd
chiết tách
Tris-HCl pH=8 1M 50mM 2.5ml
EDTA pH=8 0.5M 0.25mM 2.5ml
NaCl 5M 300mM 3.0ml
SDS 10% 1% 5.0ml
H
2
O 37.0ml
Bảng 3.2 Thành phần dung dịch TE
Thành phần Nồng độ dd mẹ Nồng độ dd làm việc Thể tích 50ml
Tris-HCl 1M 10Mm 0.5ml
EDTA 0.5M 1Mm 0.1ml
H
2
O 49.9ml
b. Tiến hành nhân PCR

9
Quy trình phản ứng PCR: sau khi cho đủ các thành phần phản ứng và
DNA cần nhân vào ống PCR (các ống này được đánh số thứ tự theo các giống
lúa) sau đó cho vào trong máy nhân gen để chạy phản ứng PCR. Đặt chu kỳ
nhiệt cho phản ứng.
* Gen mùi thơm
- Sử dụng cặp mồi (theo Bradbury và cs., 2005)
ESP: 5’-TTG TTT GGA GTC TGC TGA TG-3’
IFAP: 5’-CAT AGG AGC AGC TGA AAT ATA TACC-3’
Bảng: Chu kỳ nhiệt cho gen thơm
Bước Nhiệt độ (
0
C) Thời gian
1 94 2 giây
2 94 5 giây
3 58 5 giây
4 72 5 giây
5 Lặp lại 30 lần từ bước 2
6 72 5 phút
7 4
* Gen waxy
Sử dụng cặp mồi (Ayres et al., 1997)
F 484: 5’-CTT TGT CTA TCT CAA GAC AC-3’
R 485: 5’ TTG CAG ATG TTC TTC CTG ATG-3’
Bảng: Chu kỳ nhiệt cho gen Waxy
Bước Nhiệt độ (
0
C) Thời gian
1 94 5 phút
2 94 45 giây

3 55 1 phút
4 72 1 phút
5 Lặp lại 35 lần từ bước 2
6 72 7 phút
7 4
*Gen kháng bạc lá Xa4 xa5, Xa7
10
Quy trình PCR xác định gen kháng bệnh bạc lá do GS.TS.S. Taura và
cộng sự đề xuất.
Thành phần nhân PCR:
Bảng 3.Thành phần phản ứng PCR cho một gen Xa4, xa5, Xa7
Thành phần Nồng độ gốc Thể tích cần lấy(µl)
H
2
O 13,3
PCR buffer (có chứa Mg
2+
) 10X 2,0
dNTP 2,5mM 1,6
Primer Forward 10 pmol/µl 1,0
Primer Reverse 10 pmol/µl 1,0
DNA taq polymerase 5unit/µl 0,1
Tổng thể tích cocktail 19,0
DNA mẫu 1 µl 1,0
Tổng thể tích 20 L
Nếu PCR không chứa Mg
2+
thì phải bổ sung thêm Mg ở nồng độ cuối
cùng bằng 0.5- 1.5 mM
Các Primer dùng trong PCR:

Gen Chỉ thị NS
T
Trình tự mồi Tài liệu
Xa4
Npb
181
11
F5'- ATC GAT CGA TCT TCA CGA
GG-3'
Yoshida et
al.1992
Npb 78 R5'- GTG CTA TAA AAG GAC TTC
GGG-3'
xa5 RG556 5
F5’-TAG CTG CTG CCG TGC TGT
GC-3’
R5’-AAT ATT TCA GTG TGC ATC
TC-3’
Xa7 P3 6
F5'- CAG CAA TTC ACT GGA GAT
GTG GTT-3'
Taura et
al.2003
R5'-CAT CAC GGT CAC CGC CAT
ATC GGA- 3'
Chu kỳ nhiệt
Bảng: Chu kỳ nhiệt cho gen Xa4, Xa7
11
Bước Nhiệt độ (
0

C) Thời gian
1 94 4 phút
2 94 1 phút
3 56 1 phút
4 72 2 phút
5 Lặp lại 34 lần từ bước 2
6 72 8 phút
7 4
Bảng: Chu kỳ nhiệt cho gen xa5
Bước Nhiệt độ (
0
C) Thời gian
1 94 4 phút
2 94 1 phút
3 60 1 phút
4 72 1 phút 50 giây
5 Lặp lại 34 lần từ bước 2
6 72 7 phút
7 4
c. Chạy điện di
- Chuẩn bị gel chạy điện di: cân 1.5g agarose cho vào 50ml dung dịch
TAE và 50ml nước cất đem đun sôi trong lò vi sóng, sau đó lấy đem ra khuấy từ
từ cho tới khi dung dịch trong suốt.
- Đổ dung dịch agarose 1.5% vào khuôn gel cho tới khi đông đặc thì rút
lược ra. Đổ đầy dung dịch TAE vào bể điện di sao cho ngập giếng.
- Trải một màng parafin, nhỏ 1 µl loading dye, trộn với 8 µl dung dịch
PCR, sau đó trộn đều và nhỏ hỗn hợp vào giếng. Nhỏ theo thứ tự của các giống
DNA của các giống đã được đánh số.
- Cắm nguồn điện một chiều (75V) chạy điện di trong khoảng 25 đến 50
phút. DNA mang điện tích âm sẽ chạy về cực dương của nguồn điện.

- Sau khi chạy điện di xong, nhuộm bản điện di bằng ethilium bromide
nồng độ 10mg/ml trong 10 phút.
- Quan sát vệt băng dưới đèn chiếu tia UV và chụp ảnh bản điện di.
12
IV. KẾ HOẠCH, DỰ KIẾN
4.1Dự kiến kết quả nghiên cứu
- Tuyển chọn được một số dòng giống chất lượng từ nguồn vật liệu địa
phương.
- trong nguồn vật liệu đánh giá
4.2 Tiến trình thực hiện đề tài
STT Thời gian thực hiện Nội dung công việc
1 2012 Tìm tài liệu liên quan đến vấn đề nghiên cứu
2 2012 Tiến hành các thí nghiệm, thu thập số liệu trong
phòng và ngoài đồng ruộng
3 /2012 Tiến hành chạy PCR trong phòng thì nghiệm trên
các nguồn vật liệu
4 /2012 Tổng hợp số liệu, viết báo cáo
13
V. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyễn Đức Thành, Đặng Thị Minh Lụa, Nguyễn Minh Phương, Lê Thị Bích
Thủy. Phân tích đa dạng di truyền các dòng lúa tú lệ và một số giống nếp đặc
sản dựa vào các gen và chỉ thị liên quan đến chất lượng hạt gạo. Tạp chí Sinh
học, T9/2008.
2. Phan Hữu Tôn, Tống Văn Hải. Sàng lọc các giống lúa có gen mùi thơm bằng
chỉ thị phân tử. Tạp chí Khoa học & Phát triển, tập 8,số 4, 2010.
3. J. S. Bao Æ H. Corke Æ M. Sun, 2006, Microsatellites, single nucleotide
polymorphisms and a sequence tagged site in starch-synthesizing genes in
relation to starch physicochemical properties in nonwaxy rice (Oryza sativa L.).
Theor Appl Genet (2006) 113:1185–1196.
14

15