Nghiên cứu quy trình phân lập, nhân giống dạng dịch thể để nuôi trồng nấm Đầu khỉ (Hericium erinaceus (Bull.: Fr.) Pers.) và tách chiết một số polysaccharide có hoạt tính sinh học
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (4.55 MB, 167 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
=====***=====
Cồ Thị Thùy Vân
NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH PHÂN LẬP, NHÂN GIỐNG DẠNG
DỊCH THỂ ĐỂ NUÔI TRỒNG NẤM ĐẦU KHỈ (HERICIUM
ERINACEUS (BULL.: FR.) PERS.) VÀ TÁCH CHIẾT MỘT SỐ
POLYSACCHARIDE CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC
LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Hà Nội - 2015
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
=====***=====
Cồ Thị Thùy Vân
NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH PHÂN LẬP, NHÂN
GIỐNG DẠNG DỊCH THỂ ĐỂ NUÔI TRỒNG NẤM
ĐẦU KHỈ (HERICIUM ERINACEUS (BULL.: FR.)
PERS.) VÀ TÁCH CHIẾT MỘT SỐ
POLYSACCHARIDE
CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 62420201
LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS.TS. Lê Mai Hương
2. PGS.TS. Trần Liên Hà
Hà Nội - 2015
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi; các số liệu, kết quả, hình
ảnh nêu trong Luận án là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công
trình của tác giả nào khác.
Hà Nội, ngày tháng năm 2015.
TM tập thể Giáo viên hƣớng dẫn
Giáo viên HD 1
Nghiên cứu sinh
PGS.TS. Lê Mai Hƣơng
Cồ Thị Thuỳ Vân
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Lê Mai Hương, Phòng Sinh
học thực nghiệm - Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa
học & Công nghệ Việt Nam và PGS.TS. Trần Liên Hà, Bộ môn Vi sinh – Hóa sinh
– Sinh học phân tử - Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm – Đại học
Bách khoa Hà Nội, đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên
cứu để tôi hoàn thành Luận án này;
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong Viện Công nghệ sinh học
và Công nghệ thực phẩm – Đại học Bách khoa Hà Nội đã truyền đạt cho tôi những
kiến thức quí báu cũng như giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập tại
trường; Đồng thời xin được gửi lời cảm ơn tới sự giúp đỡ, cộng tác của các cán bộ
phòng Nghiên cứu – Trung tâm công nghệ sinh học thực vật – Viện di truyền nông
nghiệp; các cán bộ phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hóa học các hợp chất thiên
nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam;
Tôi xin cảm ơn GS.TSKH. Trịnh Tam Kiệt đã cho tôi những lời khuyên và
chỉ dẫn cho tôi rất nhiều kiến thức về nấm lớn.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc cùng toàn thể cán bộ công nhân
viên Trung tâm công nghệ sinh học thực vật – Viện di truyền nông nghiệp đã tạo
điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu để tôi hoàn thành
nhiệm vụ học tập được giao.
Hà Nội, ngày tháng năm 2015
Cồ Thị Thùy Vân
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
i
MỤC LỤC
TRANG
MỞ ĐẦU
1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN
5
1.1. Tình hình nghiên cứu và sản xuất và sử dụng nấm dƣợc liệu
5
1.1.1. Tình hình nghiên cứu và sản xuất nấm dược liệu
5
1.1.2. Tình hình nghiên cứu và sử dụng nấm dược liệu trong chăm sóc
sức khỏe cộng đồng
10
1.1.2.1. Tình hình nghiên cứu tách chiết các hợp chất có hoạt tính
sinh học trong nấm dược liệu
15
1.1.2.2 Tình hình nghiên cứu tách chiết các hợp chất có hoạt tính
sinh học trong nấm dược liệu ở nước ta
16
1.2. Nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus (Bull.: Fr.) Pers.
17
1.2.1. Giới thiệu về nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus (Bull.: Fr.) Pers.
17
1.2.2. Vị trí nấm Đầu khỉ trong phân loại nấm học
18
1.2.3. Đặc điểm hình thái quả thể và một số đặc tính sinh học của nấm
Đầu khỉ
18
1.2.4. Thành phần hóa học của nấm Đầu khỉ H. erinaceus
19
1.2.4.1. Một số thành phần dinh dưỡng trong nấm Đầu khỉ
19
1.2.4.2. Một số thành phần hóa học mang lại giá trị dược liệu cho
nấm Đầu khỉ
20
1.2.5. Tình hình nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên thế giới và trong nước
25
1.2.6. Một số phương pháp được sử dụng để tách polysaccharide từ quả
thể và hệ sợi nấm dược liệu
30
1.2.6.1. Phương pháp tách chiết trong cồn
30
1.2.6.2. Phương pháp tách chiết trong nước nóng
30
1.2.6.3. Phương pháp tách chiết trong kiềm nóng kết hợp với sự
hỗ trợ của lò vi sóng và siêu âm
31
1.2.6.4. Phương pháp tách chiết trong nước nóng kết hợp với sự
hỗ trợ của lò vi sóng và siêu âm
32
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
34
2.1. Vật liệu
34
2.2. Các loại môi trƣờng
36
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
39
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu tuyển chọn, xây dựng QTCN phân lập
giống nấm Đầu khỉ
39
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
ii
2.3.1.1. Khảo nghiệm, tuyển chọn giống nấm Đầu khỉ
39
2.3.1.2. Phân lập giống nấm Đầu khỉ
40
2.3.1.3. Nghiên cứu độ tuổi của quả thể nấm thích hợp để phân
lập giống gốc
41
2.3.1.4. Nghiên cứu các điều kiện nhân giống gốc nấm Đầu khỉ
41
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu xây dựng QTCN nhân giống nấm Đầu
khỉ dạng dịch thể các cấp.
42
2.3.2.1. Nhân giống Đầu khỉ dạng dịch thể trung gian cấp 1 (dung
tích 200 ml)
42
2.3.2.2. Nhân giống Đầu khỉ dạng dịch thể trung gian cấp 2 (dung
tích 2000 - 5000 ml)
43
2.3.2.3. Nhân giống Đầu khỉ dạng dịch thể sử dụng trong nuôi
trồng nấm Đầu khỉ trên nguồn cơ chất tổng hợp (dung tích 120 lít)
44
2.3.2.4. Phương pháp kiểm tra chất lượng giống nấm dạng dịch
thể
45
2.3.3. Phương pháp nghiên cứu xây dựng QTCN nuôi trồng nấm Đầu khỉ
trên nguồn cơ chất tổng hợp sử dụng giống nấm dạng dịch thể.
46
2.3.3.1. Phương pháp xử lý nguyên liệu nuôi trồng nấm Đầu Khỉ
46
2.3.3.2. Nghiên cứu điều kiện thích hợp để nuôi trồng nấm Đầu khỉ
trên nguồn cơ chất tổng hợp, sử dụng giống nấm dạng dịch thể.
47
2.3.3.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm
47
2.3.4. Phương pháp xác định một số thành phần dinh dưỡng, vitamin, axit
amin trong nấm Đầu khỉ
49
2.3.5. Phương pháp nghiên cứu một số điều kiện tách chiết thu nhận
polysaccharide trong quả thể nấm Đầu khỉ
49
2.3.5.1. Phương pháp thu nhận polysaccharide trong mẫu quả thể
nấm nấm Đầu khỉ
49
2.3.5.2. Lựa chọn hóa chất kiềm thích hợp
50
2.3.5.3. Nghiên cứu nồng độ dung dịch NaOH thích hợp
50
nấm
50
2.3.5.5. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
50
2.3.5.6. Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên các
dòng tế bào ung thư người nuôi cấy invitro
51
2.3.5.7. Phương pháp kiểm tra hoạt tính ức chế hình thành khối u 3
chiều trên thạch mềm (anti-tumor promoting assay) in vivo
52
2.3.5.8. Phương pháp nghiên cứu trên động vật thực nghiệm
53
2.3.6. Phương pháp xử lý số liệu
54
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
iii
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
55
3.1. Kết quả tuyển chọn, phân lập lại giống nấm Đầu khỉ H. erinaceus
50
3.1.1. Kết quả so sánh, đánh giá và khảo nghiệm 4 giống nấm Đầu khỉ
H. erinaceus trên diện hẹp
51
3.1.1.1. Một số đặc trưng hình thái của 4 giống nấm Đầu khỉ
nghiên cứu tuyển chọn
51
3.1.1.2. Thời gian sinh trưởng của 4 giống nấm Đầu khỉ khảo
nghiệm
52
3.1.1.3. Đánh giá khả năng chống chịu đối với các loại sâu bệnh hại
của 4 giống Đầu khỉ nghiên cứu
57
3.1.1.4. Kết quả phân tích một số thành phần dinh dưỡng trong nấm
Đầu khỉ He1
59
3.1.2. Kết quả phân lập lại giống nấm Đầu khỉ
61
3.1.2.1. Ảnh hưởng của phương pháp phân lập đến sự mọc của hệ
sợi nấm Đầu khỉ
61
3.1.2.2. Xác định thời điểm phân lập
63
3.1.2.3. Kết quả nghiên cứu môi trường dinh dưỡng phân lập
giống nấm Đầu khỉ
65
a. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sự sinh trưởng của hệ sợi
giống gốc
65
b. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự sinh trưởng của hệ sợi
66
c. Ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng đến sự
sinh trưởng của sợi nấm
68
3.1.2.4. Xác định nhiệt độ thích hợp nuôi giống gốc nấm Đầu khỉ
70
3.2. Kết quả nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ nhân giống nấm
Đầu khỉ dạng dịch thể
73
3.2.1. Nhân giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể (dung tích
200ml)
73
3.2.1.1. Kết quả nghiên cứu chế độ khử trùng môi trường dinh dưỡng
73
3.2.1.2. Kết quả nghiên cứu môi trường nhân giống nấm Đầu khỉ dạng
dịch thể trung gian cấp 1
74
3.2.1.3. Ảnh hưởng của pH môi trường dinh dưỡng dạng dịch thể đến
76
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
iv
sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể
3.2.1.4. Kết quả xác định tỷ lệ giống cấy thích hợp khi cấy chuyển
sang môi trường dịch thể
76
3.2.1.5. Kết quả nghiên cứu nhiệt độ nuôi giống nấm Đầu khỉ trung gian
cấp 1 dạng dịch thể
77
3.2.1.6. Chế độ nuôi giống
77
a. Nghiên cứu chế độ nuôi giống trung gian cấp 1 trên máy lắc
80
b. Nghiên cứu các chế độ nuôi giống trên máy khuấy từ
81
3.2.1.7. Kết quả nghiên cứu đường cong sinh trưởng của giống nấm
Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể
82
3.2.2. Nhân giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 2 dạng dịch thể (dung tích
2000ml – 5000ml)
85
3.2.2.1. Kết quả nghiên cứu chế độ khử trùng môi trường dinh
dưỡng
85
3.2.2.2. Kết quả nghiên cứu thành phần môi trường nhân giống
trung gian cấp 2 nấm Đầu khỉ dạng dịch thể
86
3.2.2.3. Kết quả nghiên cứu tuổi giống trung gian cấp 1 dạng dịch
thể cấy chuyển sang giống trung gian cấp 2
87
3.2.2.4. Kết quả xác định tỷ lệ giống cấy thích hợp khi cấy chuyển
sang môi trường dịch thể
88
3.2.2.5. Kết quả nghiên cứu chế độ sục khí cho bình lên men dung
tích 2-5 lít
89
3.2.2.6. Kết quả nghiên cứu chế độ sục khí cho bình lên men dung
tích 2-5 lít
90
3.2.2.7. Kết quả xây dựng đường cong sinh trưởng của giống
trung gian cấp 2 dạng dịch thể
92
3.2.3. Lên men nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể qui mô 120 lít
95
3.2.3.1. Kết quả nghiên cứu thành phần môi trường nhân giống thể
tích 120 lit
95
3.2.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện khử trùng
môi trường dinh dưỡng đến chất lượng môi trường dinh dưỡng
95
3.2.3.3. Kết quả nghiên cứu tuổi giống trung gian cấp 2 dạng dịch
thể cấy chuyển sang bình lên men nhân giống thể tích 120 lít
96
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
v
3.2.3.4. Kết quả nghiên cứu tỷ lệ giống cấy chuyển sang nồi lên
men thể tích 120 lít
97
3.2.3.5. Kết quả xây dựng đường cong sinh trưởng của nuôi trồng
dạng dịch thể, thể tích 120lit (nghiên cứu thời gian lên men)
98
3.3. Kết quả nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ nuôi trồng nấm
Đầu khỉ sử dụng giống dạng dịch thể.
104
3.3.1. Ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất phối trộn đến khả năng nhiễm
bệnh trong môi trường nuôi cấy và sự sinh trưởng, phát triển của hệ
sợi nấm Đầu khỉ
104
3.3.2. Ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng phối trộn và phương
pháp khử trùng đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trong quá
trình nuôi trồng thu quả thể
107
3.3.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy vào bịch nguyên liệu đến sự sinh
trưởng, phát triển của hệ sợi nấm Đầu khỉ
111
3.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu
khỉ trong nuôi trồng
113
3.3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành và phát triển quả thể
114
3.3.6. Hiệu quả kinh tế mang lại khi áp dụng qui trình công nghệ nuôi
trồng nấm Đầu khỉ sử dụng giống dạng dịch thể
116
3.4. Kết quả tách chiết và thử hoạt tính sinh học của polysaccaride từ
nấm Đầu khỉ H. erinaceus
120
3.4.1. Nghiên cứu quy trình tách chiết
120
3.4.1.1. Lựa chọn hóa chất kiềm thích hợp
120
3.4.1.2. Nghiên cứu tối ưu hóa nồng độ dung dịch NaOH
120
3.4.2. Xác định hàm lượng polysaccharide trong quả thể nấm Đầu khỉ
He1 trong từng thời điểm nuôi
122
3.4.3. Kết quả kiểm tra hàm lượng polysaccharide trong quả thể nấm
Đầu khỉ khô mới thu hái và sau thời gian bảo quản 6 tháng
124
3.4.4. Kết quả thử hoạt tính của polysaccharide thu nhận được
125
3.4.4.1. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (Antimicrobial
assay)
125
3.4.4.2. Hoạt tính gây độc tế bào (Cytotoxicity assay)
126
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
vi
3.4.4.3. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế hình thành khối u trên
thạch mềm của các phân đoạn polisaccarid
127
3.4.4.4. Kết quả thử nghiệm in vivo tính an toàn và hiệu lực của chế
phẩm polysaccharide tổng HT1 trên động vật thực nghiệm
128
a. Kết quả nghiên cứu an toàn của chế phẩm HT1
128
a1. Tác dụng của HT1 đối với trọng lượng cơ thể thỏ
129
a2. Tác dụng của HT1 trên điện tim của thỏ khi dùng chế
phẩm HT1 6 tuần
129
a3. Tác dụng của HT1 đến một số chỉ số huyết học trên
thỏ khi dùng HT1 6 tuần
131
a4. Tác dụng của HT1 đối với hoạt độ enzym SGOT,
SGPT của thỏ
133
a5. Tác dụng HT1 đối với hàm lượng Creatinin của thỏ
134
b. Kết quả nghiên cứu tác dụng bảo vệ phóng xạ của chế phẩm
HT1
134
c. Tác dụng của HT1 đối với quá trình tạo máu
135
Chƣơng 4. KẾT LUẬN
138
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ TRONG PHẠM VI
LUẬN ÁN
141
TÀI LIỆU THAM KHẢO
142
Phụ lục
149
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
vii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
1.
CT
Công thức
2.
CTĐC
Công thức đối chứng
3.
CTNT
Công thức nuôi trồng
4.
CSH
Chứng sinh học
5.
DMEM
Dulbecco’s Modified Eagle Medium
6.
DMSO
Dimethylsulfoxide
7.
FAO
Tổ chức Nông nghiệp và Thực phẩm thế giới
8.
PGA
Potato glucose agar
9.
PSF
Dịch kháng sinh: 100đơn vị/ ml Penicilin, 100 g /ml Streptomycin
sulfate, 0,25 g /ml Amphotericin B
10.
HEP
Polysaccharide tách chiết từ Hericium erinaceus
11.
HPLC
Sắc ký lỏng cao áp
12.
KH&CN
Khoa học và Công nghệ
13.
KLC
Khuẩn lạc cầu
14.
IC
50
Inhibitory concentration 50% - Nồng độ ức chế tối thiểu 50%
15.
LD
50
Lethal dose 50, Liều độc cấp tính
16.
MEME
Minimum Essential Medium with Eagle’s salt
17.
MTĐC
Môi trường đối chứng
18.
NAA
Nonessential Amino Axit
19.
NCS
Nghiên cứu sinh
20.
QTCN
Qui trình công nghệ
21.
TCVN
Tiêu chuẩn Việt Nam
22.
TCPTN
Tiêu chuẩn phòng thử nghiệm
23.
TSB
Trypcase Soya Broth
24.
YF
Quả thể nấm khi còn non
25.
YM
Hệ sợi nấm
26.
YE
Dịch lọc môi trường nuôi cấy nấm Đầu khỉ
27.
SKS
Sinh khối sợi
28.
XPĐ
Xuất phát điểm
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
viii
DANH MỤC CÁC BẢNG
TRANG
Bảng 1.1: Thành phần dinh dưỡng của quả thể nấm Đầu khỉ
19
Bảng 1.2: Thành phần và hàm lượng axit amin trong quả thể nấm Đầu khỉ H.
erinaceus
20
Bảng 1.3: Hàm lượng một số thành phần hóa sinh của nấm Đầu khỉ
20
Bảng 1.4: Một số thành phần có hoạt tính sinh học mang lại lợi ích sức khỏe
của H. erinaceus
21
Bảng 2.1: Thành phần môi trường phân lập nấm Đầu khỉ
37
Bảng 2.2: Thành phần các môi trường nuôi cấy giống Đầu khỉ trung gian cấp 1
dạng dịch thể
37
Bảng 2.3: Thành phần các môi trường nuôi cấy giống Đầu khỉ trung gian cấp 2
dạng dịch thể
38
Bảng 2.4. Thành phần môi trường nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể
38
Bảng 2.5: Thành phần môi trường nuôi trồng nấm Đầu khỉ
38
Bảng 3.1: Đặc trưng hình thái hệ sợi và quả thể của các giống nấm Đầu khỉ H.
erinaceus khảo nghiệm trên môi trường PGA và CTNT 1
55
Bảng 3.2: Thời gian sinh trưởng, phát triển của các giống nấm Đầu khỉ khảo
nghiệm
57
Bảng 3.3: Thành phần và mức độ sâu bệnh hại trên bốn giống nấm Đầu khỉ
57
Bảng 3.4: Kết quả phân tích thành phần dinh dưỡng và vitamin cuả nấm Đầu
khỉ He1
59
Bảng 3.5: Kết quả phân tích thành phần axit amin cuả nấm Đầu khỉ He1
60
Bảng 3.6: Ảnh hưởng của phương pháp phân lập đến sự mọc của hệ sợi nấm
Đầu khỉ trên môi trường thuần khiết
62
Bảng 3.7: Ảnh hưởng của độ tuổi quả thể nấm đến chất lượng giống gốc
64
Bảng 3.8: Ảnh hưởng của nguồn cacbon đối với sự sinh trưởng của hệ sợi nấm
Đầu khỉ
65
Bảng 3.9: Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu
khỉ
67
Bảng 3.10: Đặc điểm của hệ sợi giống gốc nấm Đầu khỉ trên các môi trường
dinh dưỡng khác nhau
69
Bảng 3.11: Đặc điểm của hệ sợi nấm Đầu khỉ trên môi trường thuần khiết nuôi
trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau
70
Bảng 3.12: Ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến chất lượng môi trường dinh
dưỡng (dungtích 200 ml)
73
Bảng 3.13: Ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng đến sự sinh
trưởng của giống dịch thể trung gian cấp 1
74
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
ix
Bảng 3.14: Ảnh hưởng của pH môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng của hệ sợi
nấm Đầu khỉ trong môi trường CT8
76
Bảng 3.15: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến sự sinh trưởng của giống nấm
Đầu khỉ trung gian cấp 1 trong môi trường CT8
76
Bảng 3.16: Ảnh hưởng của chế độ nuôi lắc và khuấy đến sự sinh trưởng của
giống Đầu khỉ trung gian cấp 1 trong môi trường CT8
79
Bảng 3.17: Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến hình thái và sinh khối hệ sợi nấm Đầu
khỉ trong môi trường CT8
80
Bảng 3.18: Ảnh hưởng của tốc độ khuấy từ đến hình thái và sinh khối hệ sợi
Nấm Đầu khỉ trong môi trường CT8
81
Bảng 3.19: So sánh giống dịch thể trung gian cấp 1 khi nuôi ở 2 chế độ: nuôi
lắc, nuôi khuấy từ
81
Bảng 3.20: Ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến chất lượng môi trường dinh
dưỡng (dung tích 2000 – 5000 ml)
85
Bảng 3.21: Sự sinh trưởng giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 2 trong các môi
trường dinh dưỡng khác nhau
86
Bảng 3.22: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến kích thước và đặc điểm hệ sợi
nấm Đầu khỉ trong CT12
87
Bảng 3.23: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến sự sinh trưởng của giống nấm
Đầu khỉ trung gian cấp 2 dạng dịch thể trong CT12
88
Bảng 3.24: Ảnh hưởng của chế độ sục khí đến sự sinh trưởng của giống dịch thể
trong môi trường CT12
89
Bảng 3.25: Ảnh hưởng của chất phá bọt trong quá trình nhân giống Đầu khỉ
trung gian cấp 2
91
Bảng 3.26. Sự sinh của giống Đầu khỉ trung gian cấp 2 trong môi trường CT12
ở từng thời điểm nuôi
92
Bảng 3.27: Ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến chất lượng môi trường dinh
dưỡng trong bình lên men 120lit
95
Bảng 3.28: Sinh khối sợi nấm Đầu khỉ trong nồi lên men 120 lít ở từng thời
điểm nuôi
98
Bảng 3.29: Ảnh hưởng của công thức phối trộn nguyên liệu và phương pháp
khử trùng đến tỷ lệ nhiễm
107
Bảng 3.30: Ảnh hưởng của công thức phối trộn nguyên liệu nuôi trồng đến sự
sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ và năng suất nấm thương phẩm
110
Bảng 3.31: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy vào bịch nguyên liệu đến sự sinh
trưởng, phát triển của hệ sợi nấm Đầu khỉ trên CTNT3
112
Bảng 3.32. So sánh tổng thời gian nuôi trồng và năng suất nấm Đầu khỉ khi sử
dụng giống dịch thể và giống trên cơ chất hạt
113
Bảng 3.33: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến đặc điểm hệ sợi nấm Đầu khỉ trên
CTNT3
114
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
x
Bảng 3.34: Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường đến sự hình thành và phát triển
quả thể nấm Đầu khỉ trên CTNT3
117
Bảng 3.35: Hoạch toán đầu vào cho 1 tấn nguyên liệu đã xử lý để nuôi trồng
nấm Đầu khỉ
119
Bảng 3.36: Bảng tổng hợp năng suất trung bình nuôi trồng nấm Đầu khỉ qua 3
lần sản xuất lặp lại
119
Bảng 3.37: Bảng tổng hợp hiệu quả kinh tế thu được khi nuôi trồng nấm đầu
khỉ sử dụng giống dạng dịch thể
120
Bảng 3.38. Khả năng chiết của các loại dung dịch kiềm khác nhau
120
Bảng 3.39. Độ chiết (tương ứng với độ nhớt) thay đổi theo nồng độ của NaOH
121
Bảng 3.40: Hàm lượng polysaccharide của các mẫu nấm thu hái tại các thời
điểm khác nhau
123
Bảng 3.41: Hàm lượng polysaccharide trong hai mẫu Đầu khỉ mới thu hái và
qua bảo quản
124
Bảng 3.42: Hoạt tính kháng vi khuẩn cuả hai phân đoạn polysaccharide thu
được
125
Bảng 3.43: Hoạt tính kháng nấm cuả hai phân đoạn polysaccharide thu được
125
Bảng 3.44: Hoạt tính gây độc tế bào trên 4 dòng ung thư người của hai phân
đoạn polysaccharide thu được
126
Bảng 3.45: Hoạt tính ức chế tạo u trên thạch mềm của các phân đoạn
polisaccaride
127
Bảng 3.46 : Sự thay đổi trọng lượng cơ thể thỏ khi dùng HT1 trong 6 tuần (n =
8)
129
Bảng 3.47: Sự thay đổi tần số tim thỏ (chu kỳ/phút) ở đạo trình D
II
khi dùng
HT1 ở các thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8)
129
Bảng 3.48: Sự thay đổi biên độ sóng điện tim thỏ (mV) ở đạo trình D
II
khi dùng
HT1 ở các thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8)
130
Bảng 3.49: Sự xuất hiện sóng điện tim bệnh lý thỏ ở đạo trình D
II
khi dùng
HT1 ở các thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8)
130
Bảng 3.50: Sự thay đổi số lượng hồng cầu ( 10
12
/l) ở thỏ khi dựng HT1 ở các
thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8)
131
Bảng 3.51: Sự thay đổi hàm lượng hemoglobin (g/l)ở thỏ khi dùng HT1 ở các
thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8)
131
Bảng 3.52: Sự thay đổi số lượng bạch cầu ( 10
9
/l) ở thỏ khi dựng HT1 ở các
thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8)
132
Bảng 3.53: Sự thay đổi số lượng tiểu cầu ( 10
9
/l) ở thỏ khi dựng HT1 ở các
thời điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8)
132
Bảng 3.54: Sự thay đổi hoạt độ enzym SGOT của thỏ khi dùng HT1 ở các thời
điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8)
133
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
xi
Bảng 3.55: Sự thay đổi hoạt độ enzym SGPT của thỏ khi dùng HT1 ở các thời
điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8)
133
Bảng 3.56: Sự thay đổi hàm lượng Creatinin của thỏ khi dùng HT1 ở các thời
điểm XPĐ, 3 và 6 tuần (n = 8)
134
Bảng 3.57: Tác dụng bảo vệ phóng xạ của HT1 khi dùng 30 ngày liều
0,5g/kg/24 giờ
134
Bảng 3.58: Số lượng tế bào ở nhóm chuột nhắt trắng dưới tác dụng của chiếu xạ
và chiếu xạ + HT1
135
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
xii
DANH MỤC HÌNH
TRANG
Hình 1.1: Sản lượng nuôi trồng nấm trên thế giới
5
Hình 1.2: Hiệu quả kinh tế khi canh tác một số sản phẩm nông nghiệp trên cùng
một đơn vị diện tích (1 mẫu) trong một năm
6
Hình 1.3: Sản lượng một số loại nấm chủ lực nuôi trồng ở Việt Nam trong năm 2011
7
Hình 1.4: Một số hình ảnh mô tả các công đoạn nuôi trồng nấm sử dụng giống
nấm dạng dịch thể ở một số công ty Hàn Quốc
9
Hình 1.5: Liên kết β -1, 3 và β -1, 6 trong chuỗi polysaccharide
12
Hình 1.6: Nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus trong tự nhiên
17
Hình 1.7: Hình thái quả thể nấm Đầu khỉ nuôi trồng nhân tạo
18
Hình 3.1: Một số sâu bệnh hại trên nấm Đầu khỉ trong giai đoạn ươm sợi và ra
quả thể
58
Hình 3.2: Bào tử chủng nấm Đầu khỉ (He1)
61
Hình 3.3: Bào tử chủng nấm Đầu khỉ (He1) dày đặc, đảm hình chuỳ mang 4 bào
tử với các mụn gai trên bề mặt
61
Hình 3.4: Hệ sợi nấm Đầu khỉ được phân lập từ bào tử và mô nấm
62
Hình 3.5: Các giai đoạn phát triển của quả thể nấm Đầu khỉ tính từ khi xuất hiện
mầm quả thể trên bịch nguyên liệu nuôi trồng
63
Hình 3.6: Sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trên môi trường thuần khiết khi
sử dụng quả thể phân lập ở các giai đoạn phát triển khác nhau
64
Hình 3.7: Hệ sợi phát triển trên MTĐC có bổ sung thêm các nguồn các bon khác nhau
66
Hình 3.8: Hệ sợi phát triển trên MTĐC có bổ sung các nguồn nito khác nhau
68
Hình 3.9: Hệ sợi nấm Đầu khỉ sinh trưởng trên các môi trường dinh dưỡng khác nhau
69
Hình 3.10: Tốc độ sinh trưởng của hệ sợi giống gốc nấm Đầu khỉ trên các công
thức môi trường dinh dưỡng khác nhau
70
Hình 3.11: Tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau
71
Hình 3.12: Qui trình phân lập giống gốc nấm Đầu khỉ
72
Hình 3.13: Sinh khối sợi nấm Đầu khỉ trong các môi trường dinh dưỡng khác nhau
75
Hình 3.14: Sinh khối sợi nấm trong các công thức môi trường khác nhau
75
Hình 3.15: Hệ sợi nấm Đầu khỉ sinh trưởng trong môi trường CT8 ở chế độ nuôi
lắc tạo thành dạng khuẩn lạc cầu có nhiều tua gai xung quanh
76
Hình 3.16: Ảnh hưởng của tỉ lệ giống cấy đến sinh khối hệ sợi nấm trong môi
trường CT8
77
Hình 3.17: Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu
khỉ trong môi trường CT8
78
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
xiii
Hình 3.18: Hình thái hệ sợi nấm Đầu khỉ trong môi trường CT8 ở các chế độ nuôi
79
Hình 3.19: Sự phát triển của giống trung gian cấp 1 nuôi trên máy lắc lắc và nuôi
trên máy khuấy từ khi cấy chuyển sang bình lên men 5 lít, thời gian
nuôi 7 ngày
82
Hình 3.20: Đường cong sinh trưởng của giống Đầu khỉ trong môi trường nuôi
dưỡng CT8
82
Hình 3.21: Qui trình nhân giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 1 dạng dịch thể,
dung tích 200ml
84
Hình 3.22: Môi trường khử trùng ở 115
o
C trong thời gian lần lượt là 30, 40, 50,
60, 70phút
85
Hình 3.23: Hệ sợi nấm Đầu khỉ sinh trưởng trong môi trường khử trùng ở 115
o
C
trong thời gian 70 phút và môi trường khử trùng ở 115
o
C trong thời
gian 70 phút
87
Hình 3.24: Hệ sợi nấm Đầu khỉ sinh trưởng trong các công thức môi trường dinh
dưỡng khác nhau
88
Hình 3.25: Ảnh hưởng của tỉ lệ giống cấy đến sinh khối hệ sợi nấm trong môi
trường CT12
89
Hình 3.26: Giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 2 trong môi trường CT12 sau 7
ngày nuôi
90
Hình 3.27: Ảnh hưởng của chế độ sục khí đến sự sinh trưởng của giống dịch thể
trong môi trường CT12 và mức độ tạo bọt
91
Hình 3.28: Tác dụng của chất phá bọt trong quá trình lên men có sục khí, chế độ
sục khí 0,4 - 5,5lit khí/1lit dịch nuôi/phút
93
Hình 3.29: Đường cong sinh trưởng của giống trong môi trường nuôi dưỡng dạng
dịch thể trung gian cấp 2
94
Hình 3.30: Qui trình nhân giống nấm Đầu khỉ trung gian cấp 2 dạng dịch thể,
dung tích 5000ml
95
Hình 3.31: Ảnh hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng
của giống nấm Đầu khỉ trong môi trường dịch thể
96
Hình 3.32: Ảnh hưởng của tuổi giống trung gian cấp 2 sử dụng để cấy chuyển
sang thể tích 120lit đến sinh khối sợi nấm Đầu khỉ trong môi trường
CT16
97
Hình 3.33: Ảnh hưởng của tỉ lệ giống trung gian cấp 2 sử dụng để cấy chuyển
sang bình dung tích 120 lít đến sinh khối sợi nấm Đầu khỉ trong môi
trương CT16
99
Hình 3.34: Đường cong sinh trưởng của giống nấm Đầu khỉ trong môi trường
CT16 dung tích 120lit
100
Hình 3.35: Sợi nấm Đầu khỉ sinh trưởng trong bình lên men dung tích 120 lít, sau
5 ngày nuôi cấy
102
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
xiv
Hình 3.36: Qui trình sản xuất giống nấm các cấp
103
Hình 3.37: QTCN lên men nhân giống nấm Đầu khỉ dạng dịch thể dung tích 120 lít
105
Hình 3.38: Ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất phối trộn đến tỷ lệ nhiễm bịch nguyên
liệu nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên CTNT1
106
Hình 3.39: Ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất phối trộn đến tốc độ phát triển của hệ
sợi nấm Đầu khỉ trên CTNT1
109
Hình 3.40: Tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ trên các công thức nuôi
trồng khác nhau khi sử dụng giống cấy dạng hạt và giống cấy dạng
dịch thể
99
Hình 3.41: Giống dạng hạt và giống dạng dịch thể phát triển trong CTNT3
112
Hình 3.42: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Đầu khỉ
trên CTNT3
113
Hình 3.43: Quả thể nấm Đầu khỉ trên công thức CTNT 3 nuôi trồng ở các khoảng
nhiệt độ khác nhau
115
Hình 3.44: QTCN nuôi trông nấm Đầu khỉ sử dụng giống nấm dạng dịch thể
116
Hình 3.45: So sánh QT sử dụng giống dạng hạt và QT sử dụng giống dạng dịch
thể trong nuôi trồng nấm Đầu khỉ
118
Hình 3.46: Qui trình chiết polysaccharide
121
Hình 3.47: Phổ MS của Polysaccharide thu được
122
Hình 3.48: Sự tích lũy polysaccharide theo thời gian của quả thể nấm Đầu khỉ He1
124
Hình 3.49: Hoạt tính ức chế tạo u trên thạch mềm của các phân đoạn
Polysaccharide
127
Hình 3.50: Thử nghiệm HT1 trên chuột
136
Hình 3.51: Kết quả thử hoạt tính in vivo chiết phẩm của nấm Đầu khỉ
136
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
1
MỞ ĐẦU
Nấm lớn có ý nghĩa rất quan trọng trong đời sống, chúng có vai trò trong nền kinh
tế, khoa học và tham gia vào các chu trình chuyển hóa vật chất - năng lượng trong tự
nhiên. Nhiều loài nấm lớn được sử dụng làm thực phẩm giàu dinh dưỡng, một số được sử
dụng làm dược phẩm để chữa trị một số bệnh nguy hiểm như tim mạch, béo phì, giải độc
và bảo vệ tế bào gan, phòng và điều trị loãng xương… Trên thế giới có khoảng hơn 2000
loại nấm có thể ăn và dùng làm thuốc, ngoài nguồn nấm thu hái từ thiên nhiên, người ta đã
trồng được hơn 60 loại theo phương pháp thủ công, bán công nghiệp, công nghiệp với hiệu
quả và năng suất cao. Nhiều nhà khoa học cho rằng nấm sẽ là một trong những thực phẩm
rất quan trọng và thông dụng của con người trong tương lai [16].
Việt Nam là một nước nông nghiệp, giàu tiềm năng lâm nghiệp do đó nguồn phế
liệu từ nông, lâm nghiệp như rơm rạ, mùn cưa, bã mía, thân ngô, lõi ngô… rất dồi dào, đây
là nguồn nguyên liệu thích hợp để trồng nấm; Bên cạnh đó điều kiện tự nhiên của nước ta
rất phù hợp với việc nuôi trồng nấm. Trong mười năm trở lại đây, ngành sản xuất nấm ăn –
nấm dược liệu ở nước ta đã có những bước tiến đáng kể nhưng vẫn chậm phát triển hơn rất
nhiều so với các nước trên thế giới do ít đầu tư vào nghiên cứu, ứng dụng công nghệ tiên
tiến cũng như thiết bị hiện đại để sản xuất nấm ăn – nấm dược liệu. Công nghệ nhân giống
và nuôi trồng nấm ở nước ta hiện nay chỉ sử dụng giống nhân trên cơ chất rắn như nhân
giống trên môi trường thạch, trên mùn cưa, thóc, que sắn; đây là phương pháp truyền thống
tuy được sử dụng một cách phổ biến do quá trình sản suất đơn giản nhưng lại có một số
nhược điểm sau:
+ Thời gian nhân giống các cấp kéo dài;
+ Giống nấm nhân trên cơ chất rắn có chất lượng không ổn định, tuổi giống không
đồng nhất trong toàn bộ chai giống hay túi giống;
+ Phương pháp nhân giống trên cơ chất rắn gặp nhiều khó khăn trong việc sản xuất
giống với số lượng lớn do hệ số nhân giống thấp;
+ Thao tác cấy chuyển giống khó tự động hóa, chịu nhiều tác động của yếu tố ngoại
cảnh làm tăng nguy cơ nhiễm. Việc kiểm soát nhiễm đối với giống nấm nhân trên cơ chất
rắn cũng gặp nhiều khó khăn;
+ Nguyên liệu nhân giống đắt, chi phí nhân công, chi phí khấu hao điện năng, khấu
hao nhà xưởng cao;
Hiện nay, công nghệ nhân giống nấm lớn dạng dịch thể đang là hướng nghiên cứu
được các nhà nghiên cứu nấm đặc biệt quan tâm vì giống nấm dạng dịch thể so với giống
trên cơ chất tổng hợp dạng rắn (mùn cưa, thóc, que sắn…) có rất nhiều ưu điểm vượt trội
như:
+ Chu kỳ phát triển của giống nấm trong môi trường dịch thể nhanh, qua đó rút
ngắn được thời gian nhân giống các cấp và nuôi trồng nấm;
+ Tuổi giống nấm dạng dịch thể đồng đều, chất lượng giống nấm ổn định do được
kiểm soát một cách nghiêm ngặt với các phương pháp thử đơn giản, có kết quả tức thì, độ
chính xác cao;
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
2
+ Sinh lực giống khỏe do giống phát triển trong môi trường dịch thể được cung cấp
đầy đủ dinh dưỡng và được sử dụng trong đúng giai đoạn sinh trưởng mạnh nhất của hệ
sợi;
+ Công nghệ nhân giống dạng dịch thể đáp ứng được mọi nhu cầu về giống từ qui
mô nhỏ đến lớn, với hệ số nhân giống cao;
+ Giá thành sản xuất giống thấp do quá trình sản xuất tiết kiệm được nguyên nhiên
vật liệu nhân giống, điện năng, nhân công.
Ngoài ra, phương pháp này còn thuận lợi trong việc sản xuất nấm trên qui mô công
nghiệp.
Đối tượng nghiên cứu của Luận án là nấm Đầu khỉ Hericium erinaceus (Bull.: Fr.)
Pers., đây là một loại nấm quí có giá trị dinh dưỡng và dược liệu cao, được sử dụng để hỗ
trợ điều trị hiệu quả một số bệnh như ung thư, bệnh tim mạch, bệnh về đường tiêu hóa,
bệnh mất trí nhớ… Với các lợi ích lớn về giá trị dinh dưỡng, dược liệu và kinh tế mà loại
nấm này mang lại, hiện nay các nhà khoa học trong nước cũng như trên thế giới đang rất
quan tâm nghiên cứu nhằm hoàn thiện qui trình nhân giống, nuôi trồng, chế biến sau thu
hoạch… để tạo ra các sản phẩm phục vụ công tác phòng chữa bệnh, tăng cường sức khỏe
cộng đồng.
Nhận định được tầm quan trọng trong việc ứng dụng công nghệ mới vào sản xuất
giống nấm và nấm thương phẩm, góp phần thúc đẩy quá trình công nghiệp hóa ngành sản
xuất nấm trong nước, qua đó tạo ra nguồn nguyên liệu có giá trị dược học cao cung cấp cho
ngành công nghiệp chế biến thực phẩm và dược phẩm, tạo ra các sản phẩm chức năng phục
vụ mục đích nâng cao sức khỏe cộng đồng, Nghiên cứu sinh đã lựa chọn thực hiện Luận án:
“Nghiên cứu quy trình phân lập, nhân giống dạng dịch thể để nuôi trồng nấm Đầu khỉ
(Hericium erinaceus (Bull.: Fr.) Pers.) và tách chiết một số polysaccharide có hoạt tính
sinh học”
Luận án là một phần nội dung của Đề tài thuộc Chương trình KH&CN trọng điểm
cấp nhà nước KC.06/11-15 do Bộ Khoa học và Công nghệ chủ trì: “Nghiên cứu xây dựng
qui trình công nghệ nhân giống dạng dịch thể để sản xuất nấm ăn và nấm dược liệu”; mã
số KC06.01/11-15; thời gian thực hiện từ tháng 01/2012 đến tháng 6/2014, do Nghiên cứu
sinh làm chủ nhiệm và Đề tài nghị định thư cấp nhà nước: “Nghiên cứu quá trình chuyển
hóa các polymer tự nhiên bởi enzyme từ nấm Việt Nam”, thời gian thực hiện 2011-2013,
do PGS.TS Lê Mai Hương làm chủ nhiệm.
Mục tiêu của Luận án
- Đưa ra được qui trình công nghệ phân lập lại giống nấm Đầu khỉ H. erinaceus;
- Đưa ra được qui trình công nghệ nhân giống nấm Đầu khỉ H. erinaceus dạng dịch
thể các cấp với dung tích từ 200ml đến 120 lít;
- Đưa ra được qui trình công nghệ nuôi trồng nấm Đầu khỉ H. erinaceus trên nguồn
cơ chất tổng hợp sử dụng giống nấm dạng dịch thể;
- Đưa ra được qui trình công nghệ tách chiết polysaccharide từ quả thể nấm Đầu
khỉ H. erinaceus thành phẩm, đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất này;
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
3
Nội dung của luận án
- Xây dựng và hoàn thiện qui trình công nghệ tuyển chọn, phân lập lại giống nấm
Đầu khỉ H. erinaceus nhằm lựa chọn được giống nấm Đầu khỉ có chất lượng tốt, năng suất
cao, có đặc tính sinh học phù hợp với điều kiện nuôi trồng tại Việt Nam, chủ động trong
việc nhân giống, duy trì, bảo tồn nguồn giống ổn định cung cấp cho sản xuất;
- Nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ nhân giống dạng dịch thể các cấp
(giống trung gian cấp 1 dung tích 200 ml, giống trung gian cấp 2 dung tích 2000 – 5000
ml, giống sử dụng trong nuôi trồng dung tích 120 lít) để sử dụng trong nuôi trồng nấm Đầu
khỉ trên nguồn cơ chất tổng hợp;
- Nghiên cứu xây dựng qui trình nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên nguồn cơ chất tổng
hợp sử dụng giống dạng dịch thể, so sánh hiệu quả của việc sử dụng giống nấm dạng dịch
thể với giống nấm dạng rắn;
- Nghiên cứu tách chiết polysaccharide từ quả thể nấm Đầu khỉ thành phẩm, đánh
giá một số hoạt tính sinh học của hợp chất này.
Kết quả của luận án có ý nghĩa khoa học và thực tiễn như sau:
- Ý nghĩa khoa học:
+ Đánh giá một số đặc tính sinh học và đưa ra một số kỹ thuật tuyển chọn, phân
lập, nhân giống, nuôi trồng nấm Đầu khỉ là cơ sở cho việc định hướng tuyển chọn nguồn
giống nấm dược liệu mới phù hợp để triển khai sản xuất đại trà trong điều kiện môi trường
sinh thái của nước ta.
+ Đưa ra được qui trình công nghệ nhân giống và sử dụng giống nấm dạng dịch thể
để nuôi trồng nấm Đầu khỉ góp phần làm thay đổi phương thức nhân giống nấm, sản xuất
giống nấm, nấm thương phẩm theo định hướng công nghiệp, áp dụng công nghệ sinh học
vào sản xuất để dần thay thế phương pháp nhân giống nấm truyền thống (nhân giống trên
cơ chất rắn như mùn cưa, thóc, đậu tương, đỗ xanh, kê, que gỗ…); đây là phương pháp
nhân giống mới đang được các nước có ngành sản xuất nấm phát triển quan tâm nghiên
cứu, ứng dụng do phương pháp nhân giống này có rất nhiều ưu điểm so với phương pháp
nhân giống trên cơ chất rắn.
+ Đưa ra qui trình tách chiết polysaccharide có hoạt tính sinh học từ nấm Đầu khỉ
nhằm khẳng định giá trị dược liệu của loại nấm này, kết quả nghiên cứu của luận án là tiền
đề cho các nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực sản xuất các thực phẩm chức năng từ nấm
dược liệu phục vụ nền y học hiện đại, nâng cao sức khỏe cộng đồng.
- Ý nghĩa thực tiễn:
+ Kết quả của luận án phù hợp với định hướng chính sách phát triển ngành nông
nghiệp công nghệ cao, ứng dụng công nghệ sinh học vào sản xuất nông nghiệp nhằm tạo ra
nguồn sản phẩm hàng hoá ổn định, thúc đẩy phát triển kinh tế nông nghiệp đặc biệt là tại
các vùng nông thôn;
+ Kết quả của luận án là cơ sở thúc đẩy sự phát triển nghề trồng nấm ở Việt Nam,
góp phần xúc tiến quá trình tuần hoàn sinh học có ích trong nông nghiệp (tận dụng phế thải
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
4
từ nông, lâm nghiệp có nguy cơ gây ô nhiễm môi trường) đồng thời tạo nên nguồn thực
phẩm giàu dinh dưỡng và có giá trị dược liệu, giá trị kinh tế cao.
Những đóng góp mới của Luận án:
Công nghệ nhân giống và sử dụng giống nấm dạng dịch thể để nuôi trồng nấm
không thực sự là công nghệ mới trên thế giới nhưng trong bối cảnh sản xuất nấm tại Việt
Nam hiện nay thì đây thực sự là hướng mới cần được ưu tiên nghiên cứu, phát triển nhằm
từng bước thay đổi phương thức sản xuất giống nấm, nấm thương phẩm, mang lại hiệu quả
kinh tế cao theo hướng sản xuất qui mô công nghiệp, dần dần đưa máy móc vào sản xuất
nấm nhằm giảm thiểu lao động nặng nhọc cho người trồng nấm, kích thích người lao động
cũng như các doanh nghiệp tham gia sản xuất nấm nhằm tăng sản lượng nấm thương phẩm
một cách nhanh chóng, tạo nguồn thu cao và ổn định cho người trồng nấm. Hơn nữa việc
áp dụng công nghệ mới vào sản xuất sẽ tạo ra một khối lượng lớn các sản phẩm nấm phục
vụ cho tiêu dùng và cung cấp cho ngành công nghiệp chế biến, sản xuất thực phẩm chức
năng; Vậy những đóng góp mới của luận án là:
- Đã tuyển chọn được chủng nấm Đầu khỉ có khả năng phát triển tốt trong điều kiện
nuôi trồng ở Việt Nam, hoàn thiện phương pháp phân lập lại chủng nấm này có cơ sở để
bảo quản và sử dụng lâu dài;
- Đưa ra được qui trình công nghệ nhân giống dạng dịch thể từ quy mô phòng thí
nghiệm đến quy mô 120 lít để sử dụng trong nuôi trồng nấm Đầu khỉ H. erinaceus trên
nguồn cơ chất tổng hợp, so sánh hiệu quả của việc sử dụng giống nấm dạng dịch thể với
giống nấm dạng rắn;
- Đưa ra được qui trình nuôi trồng nấm Đầu khỉ trên nguồn cơ chất tổng hợp sử
dụng giống dạng dịch thể.
- Đã tách chiết và bước đầu nghiên cứu tác dụng của polysaccharide từ nấm Đầu
khỉ bao gồm: hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định, hoạt tính gây độc tế bào nuôi cấy
invitro, hoạt tính gây độc tế bào nuôi cấy trên thạch mềm, kiểm tra độ an toàn và khả năng
bảo vệ phóng xạ trên động vật thử nghiệm.
Luận án được thực hiện tại:
- Viện công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm -Trường Đại Học Bách khoa Hà Nội.
- Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam
- Trung tâm công nghệ sinh học thực vật – Viện Di truyền Nông nghiệp
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
5
Chƣơng 1: TỔNG QUAN
1.1. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng nấm dƣợc liệu
1.1.1. Tình hình nghiên cứu, sản xuất nấm dược liệu
Hiện nay, nghề trồng nấm ăn – nấm dược liệu phát triển ở mọi Châu lục; có gần 80
nước nuôi trồng các loại nấm Mỡ, nấm Hương, nấm Sò, Mộc nhĩ … trong đó ở các nước
công nghiệp phát triển như Mỹ, Đức, Pháp, Nhật Bản,… đã nuôi trồng nhiều loại nấm và
lượng tiêu dùng hàng năm cũng rất lớn, qui mô sản xuất nấm đã được cơ giới hoá từ khâu sử
lý nguyên liệu đến thu hái; năng suất nấm tươi trung bình đạt 45 - 50% so với khối lượng
nguyên liệu khô ban đầu [16]. Thị trường tiêu thụ nấm ăn lớn nhất hiện nay là Mỹ, Nhật Bản,
Đài Loan và các nước Châu Âu. Mức tiêu thụ bình quân tính theo đầu người hàng năm ở
Châu Âu, Châu Mỹ là 2 - 3kg/người/năm; Đức, Nhật Bản là khoảng 4kg/người/năm [4].
Các nước có công nghệ nuôi trồng nấm dược liệu phát triển rất chú ý tới việc
nghiên cứu, chọn tạo theo nhiều phương pháp khác nhau để tạo ra các giống nấm có giá trị
dinh dưỡng, giá trị dược học và giá trị kinh tế cao để đưa vào sản xuất. Các thành tựu khoa
học kỹ thuật trong việc chọn tạo giống nấm đã tạo ra sự đa dạng các chủng loại nấm, nhiều
giống nấm có năng suất cao, phẩm chất tốt, có tính chống chịu và thích nghi cao với điều
kiện môi trường [25].
Nghiên cứu và công nghệ sản xuất nấm ăn trên thế giới ngày càng phát triển mạnh
và đã trở thành ngành công nghiệp thực phẩm thực thụ. Hiện nay các nước Tây Âu như
Anh, Pháp, Bỉ, Hà Lan… là các nước đi đầu trong lĩnh vực nuôi trồng, chọn tạo giống
nấm, trồng nấm theo phương pháp công nghiệp, cơ giới hoá từ khâu xử lý đến thu hái và
chế biến sản phẩm. Các nước và các vùng lãnh thổ như Đài Loan, Indonesia, Singapore,
Hàn Quốc, Trung Quốc, Nhật Bản, nghề trồng nấm phát triển theo mô hình trang trại vừa
và nhỏ. Ước tính chỉ riêng năm 2004 sản lượng nấm ăn trên thế giới đã đạt trên 10 triệu tấn
nấm tươi [70].
Hình 1.1: Sản lượng nuôi trồng nấm trên thế giới (tấn x 1000) [70]
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
6
Số lượng các nước trồng nấm cũng đang phát triển với tốc độ nhanh: năm 1939
toàn thế giới chỉ có 10 nước sản xuất nấm ăn, đến năm 1995 đã có trên 100 nước; Theo
phân tích tốc độ phát triển tổng sản lượng nấm trên thế giới là trên 13% [2]; Với xu thế
ngày càng phát triển về qui mô sản xuất, phương thức sản xuất, nguồn nguyên liệu sản
xuất, loại hình sản phẩm và chủng loại sản phẩm cũng ngày càng đa dạng.
Trung Quốc được đánh giá là một trong những nước có tổng sản lượng nấm cũng
như mức độ tăng trưởng lớn nhất thế giới. Theo số liệu thống kê của hội nấm ăn Trung
Quốc, tính riêng trong năm 2011 tổng sản lượng nấm của Trung Quốc là 25,71 triệu tấn,
chiếm khoảng 60% tổng sản lượng nấm ăn trên thế giới, mỗi năm Trung Quốc xuất khẩu
hàng triệu tấn nấm sang các nước phát triển thu về nguồn ngoại tệ hàng tỷ đô la; sản lượng
suất nấm ăn – nấm dược liệu của Trung Quốc liên tục tăng mạnh, trung bình mỗi năm tăng
1,58 triệu tấn [70, 73].
Hiệu quả kinh tế thu được từ việc nuôi trồng nấm so với các cây nông nghiệp chủ
đạo khác cũng được phân tích đánh giá, kết quả cho thấy hiệu quả thu được từ việc canh
tác nấm là cao hơn hẳn so với một số cây nông nghiệp khác;
Hình 1.2: Hiệu quả kinh tế khi canh tác một số sản phẩm nông nghiệp trên cùng một đơn vị
diện tích (1 mẫu) trong một năm; đơn vị: Nhân dân tệ [73]
Theo sự đánh giá của các chuyên gia Trung Quốc thì nấm ăn có giá trị sản lượng
ròng là 28.500 nhân dân tệ trong một mẫu (1 hecta bằng 15 mẫu) canh tác/ năm. Giá trị sản
lượng gấp 3,8 lần so với cà chua trồng trong nhà kính là 7.500 nhân dân tệ trong cùng một
khu vực, gấp 29,4 lần so với bông (970 nhân dân tệ), gấp 53,8 lần so với ngô (530 nhân
dân tệ), gấp 67,1 lần so với lúa mì (425 nhân dân tệ) [73].
Việt Nam bắt đầu nghiên cứu và sản xuất nấm từ những năm 1970 [11, 16]. Trải
qua nhiều thăng trầm, đến nay ở một số địa phương việc sản xuất nấm đã tạo ra nhiều công
ăn, việc làm, tận dụng được thời gian nông nhàn và đem lại nguồn thu đáng kể cho nông
dân. Mặc dù vậy trên thực tế việc sản xuất, chế biến và tiêu thụ nấm ăn - nấm dược liệu
chủ yếu mới chỉ phát triển ở quy mô nhỏ, phân tán, sản phẩm nấm tiêu thụ trên thị trường
nội địa là chính, chưa tương xứng với tiềm năng và giá trị vốn có của nó. Trong những
CỒ THỊ THÙY VÂN LUẬN ÁN TIẾN SĨ
7
năm đầu của thế kỷ 21 (từ 2000 - 2009), có sự quan tâm chỉ đạo và định hướng phát triển
nghề trồng nấm của Bộ Nông nghiệp & PTNT, Bộ Khoa học và Công nghệ, các cơ quan
nghiên cứu khoa học như Trung tâm Công nghệ sinh học thực vật – Viện Di truyền Nông
nghiệp; Đại học Khoa học tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội,… đã đi sâu nghiên cứu và
phát triển mở rộng nghề trồng nấm [4]; Đến năm 2009 cả nước sản xuất được khoảng
250.000 tấn nấm các loại. Mỗi năm tổng kim ngạch xuất khẩu Mộc nhĩ và nấm Rơm là chủ
yếu đạt khoảng 60 triệu USD [4]. Cho đến nay, hầu hết các tỉnh trong cả nước hiện nay đều
đã bắt đầu phát triển nghề sản xuất nấm với nhiều quy mô khác nhau; Chiếm đa số là các
hộ sản xuất từ 1,0 đến 6,0 tấn nguyên liệu/ hộ/ năm; Các hộ này chủ yếu sử dụng phương
thức sản xuất thủ công, tận dụng các thiết bị tự chế, không đồng bộ nên năng suất nấm
thấp, giá thành sản phẩm cao và việc chế biến, tiêu thụ còn hạn chế [4].
Bên cạnh đó, việc nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học theo phương pháp lên
men lỏng để nhân giống nấm ăn - nấm dược liệu ở dạng dịch thể cũng đã có một số đơn vị
bước đầu quan tâm nghiên cứu thăm dò như:
- Trung tâm nghiên cứu nấm ăn trường Đại học tổng hợp Hà Nội;
- Khoa Sinh học - Đại học Tổng hợp Hà Nội;
- Trung tâm công nghệ sinh học thực vật – Viện di truyền nông nghiệp;
Sản lượng nấm ở Việt Nam (2011): Việt Nam đang nuôi trồng trên 16 loại nấm: ở
phía Nam chủ yếu là nấm Rơm, nấm Mộc nhĩ; ở phía Bắc là nấm Sò, nấm Mỡ, nấm
Hương, nấm Linh chi… Theo số liệu thống kê sản lượng nấm ăn – nấm dược liệu các loại
của cả nước năm 2011 đạt khoảng 250.000 tấn [4]. Trong đó theo thứ tự là:
Hình 1.3: Sản lượng một số loại nấm chủ lực nuôi trồng ở Việt Nam trong năm 2011
(Đơn vị: tấn) [4]
- Thị trường tiêu thụ trong nước chủ yếu là tiêu thụ nấm tươi, nấm phơi sấy khô.
Thị trường xuất khẩu chủ yếu là xuất khẩu nấm nguyên liệu dưới dạng nấm Mỡ muối, nấm
Rơm muối. Kim ngạch xuất khẩu đạt khoảng 90 triệu USD / năm [4].
- Các vùng sản xuất nấm chủ yếu [4]:
