Nghiên cứu quy trình phân tích Carbaryl, Dimethoate, Vitamin C trong cải CANH với thiết bị HPLC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
MỞ ĐẦU
Dân số ngày càng gia tăng do đó nhu cầu về lương thực thực phẩm ngày càng đòi hỏi
nhiều, cụ thể là các loại rau cung cấp trong các bữa ăn hằng ngày. Rau xanh không chỉ cung
cấp một lượng lớn chất xơ, các sinh tố A, B, C … mà còn cung cấp các nguyên tố vi lượng và đa
lượng rất cần thiết trong cấu tạo tế bào. Rau xanh còn là một loại cây trồng có hiệu quả kinh tế
cao, đồng thời cũng là mặt hàng xuất khẩu quan trọng của nhiều nước trên thế giới.
Tuy nhiên thất thu hàng năm do các loài dòch hại gây ra cho nông nghiệp chiếm
khoảng 35% sản lượng mùa màng (khoảng 75 tỷ đô la); trong đó thiệt hại do sâu là 13,8%; do
bệnh cây là 11,6%; do cỏ dại là 9,5% (theo Cramer H.H., 1967). Nếu tính cho diện tích nông
nghiệp toàn thế giới là 1,5 tỷ hecta không kể đồng cỏ và bãi hoang thì thiệt hại bình quân là
47-60 đô la trên một hecta. Để tránh thất thu, hiện nay có nhiều biện pháp được áp dụng để
phòng trừ các loài dòch hại. Một trong các biện pháp đó là sử dụng thuốc bảo vệ thực vật.
Bên cạnh những ưu điểm của thuốc bảo vệ thực vật như diệt dòch hại nhanh, có khả
năng chặn đứng sự lan tràn phá hoại của sâu, bệnh, cho hiệu quả trực tiếp rõ rệt…nó còn có một
số nhược điểm, nếu sử dụng không đúng cách (phun quá liều hoặc phun gần ngày thu hoạch)
đôi khi thuốc có thể gây độc cho thực vật hoăïc còn lưu trong nông sản và gây độc cho người,
gia súc ăn phải, gây ô nhiễm môi trường…[3]
Theo thống kê, hàng năm ở miền Đông – Nam nước ta, tổng lượng thuốc bảo vệ thực
vật sử dụng lên đến con số 1000 tấn, trong đó thuốc bảo vệ thực vật dùng trên rau rất lớn chiếm
từ 50 – 80% tổng lượng thuốc dùng cho các loại cây trồng. Điều đó gây ra những mối nguy cho
sức khỏe con người. Một số nơi xảy ra ngày càng nhiều và phổ biến tình trạng ngộ độc do rau
xanh.
Trên thế giới, hàng năm có trên 40000 người chết vì ngộ độc rau trên tổng số 2 triệu
người bò ngộ độc (dựa theo thống kê của Tổ chức Lao động Quốc tế ILO). Tuy chưa có thống
kê chính thức về số người ngộ độc do thuốc trừ sâu ở nước ta, nhưng theo những thông báo từ
những năm qua về các trường hợp ngộ độc lẻ tẻ hay hàng loạt ở từng bệnh viện, từng đòa
phương cho thấy số người bò ngộ độc là một con số đáng kể.
Từ năm 1993 đến tháng 6 năm 1998, có đến hàng chục ngàn người bò nhiễm độc do ăn
phải rau quả còn dư lượng thuốc trừ sâu, nặng nhất vẫn là ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long.
Năm 1995, có 13000 người nhiễm độc và trong đó có đến 354 người chết.

Trên cơ sở các tài liệu tham khảo tiếp cận được và kết quả khảo sát sơ bộ của khóa
trước, luận văn này sẽ khảo sát thực nghiệm quy trình phân tích hàm lượng Carbaryl,
Dimethoate trong cải xanh bằng phương pháp HPLC, với mục đích nâng cao hiệu suất thu hồi
mẫu các hoạt chất đó từ rau để kết quả phân tích được chính xác hơn, và phù hợp với điều kiện
thực tiễn ở PTN Hóa sinh của Bộ môn Công nghệ Thực phẩm
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
1.1. CẢI XANH [6]

Tên khoa học: Brassia junecea
Rau cải có nhiều loại như: cải ngọt, cải đắng, cải bẹ trắng, cải thìa... được trồng quanh
năm ở nước ta. Cải xanh (cải đắng) có hàm lượng các hợp chất chứa lưu huỳnh và vitamin C
cao.
Đặc điểm: Cuống lá hơi nhỏ và tròn, phiến lá nhỏ hẹp. Chòu được nóng và mưa, nhanh
cho thu hoạch nên có tác dụng giải quyết rau giáp vụ rất tốt.

1.1.1. Thu hoạch và bảo quản
Cải xanh được thu hoặc sau 30 – 50 ngày gieo giống, khi đó lá cải dài khoảng 20 – 30
cm. Trong quá trình vận chuyển và buôn bán nên bảo quản cải xanh ở nhiệt độ lạnh, độ ẩm
khoảng 90 – 95%.

1.1.2. Sử dụng cải xanh
Cải xanh có thể dùng để ăn sống, nấu canh, muối mặn, muối chua.
Lợi ích: nhuận trường, trò chứng táo bón, ung thư kết ruột. Trong cải xanh có chất
albumin, vitamin B1, Coban, iot. Rễ và lá có nhiều chất kiềm thúc đẩy sự tiêu hoá, thúc đẩy cơ
thể hấp thu albumin bảo vệ gan, chống mỡ trong gan. Ăn nhiều cải xanh có tác dụng ngăn ngừa
ung thư gan và kết hợp điều trò bệnh ung thư và xơ cứng gan.
Bảng 1.1 . Thành phần dinh dưỡng trong 100g lá cải xanh
2

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP



Thành phần Hàm lượng
Nước 92
Protein (g) 2,4
Lipid (g) 0,4
Cacbonhydrat (g) 4,3
Canxi (mg) 160
Phospho (mg) 48
Sắt (mg) 2,7
Natri (mg) 24
Kali (mg) 227
Caroten (mg) 1,825
Chất xơ (mg) 1
Tro (mg) 1,1
Thiamin (mg) 0,06
Riboflavin (mg) 0,14
Niacin (mg) 0,8
Acid ascorbic (mg) 73
Năng lượng (cal) 24
3
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
1.2. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP [2]
1.2.1. Nguồn gốc, đònh nghóa
Phép sắc ký do chuyên viên thực vật Nga Tswett (1906) đề xuất năm 1903 khi nghiên
cứu về sắc tố thực vật. Ông là người đầu tiên đã tách được sắc tố trong lá cây. Mẫu được trích
bằng ether, cho dung dòch qua cột chứa chất hấp phụ CaCO3, trên cột xuất hiện nhiều vùng có
màu sắc khác nhau. Do đó phương pháp có tên là sắc ký. Từ đó phương pháp sắc ký trở thành

một kỹ thuật tách chất hữu hiệu và được phát triển nhanh.
Sắc ký lỏng là một kỹ thuật phân tích sắc ký dùng để tách riêng các ion hay phân tử
hòa tan trong một dung môi. Nếu dung dòch mẫu tiếp xúc với một pha tónh và một pha động,
các cấu tử trong mẫu sẽ tương tác với hai pha đó theo mức độ khác nhau. Mức độ tương tác
khác nhau xác đònh thời gian lưu của các chất khác nhau khi theo pha động qua cột, cho phép
tách các cấu tử trong mẫu ban đầu. Pha động là chất lỏng. Pha tónh đa dạng tùy thuộc vào kiểu
cột sắc ký (cột sắc ký hấp phụ, cột sắc ký phân bố, cột sắc ký lọc gel, cột sắc ký trao đổi ion),
vì vậy khả năng ứng dụng rất lớn, đối tượng phân tích đa dạng.
Sắc ký lỏng cao áp (HPLC) là một dạng thiết bò sắc ký lỏng hoạt động ở áp suất cao
hơn áp suất thông thường. Kích thước hạt vật liệu nhồi làm pha tónh rất bé (1 - 4 μm) nên làm
tăng số đóa lý thuyết và do đó tăng khả năng tách chất của thiết bò. Để tăng tốc độ dòng chảy
tới khoảng 0,1 – 10 ml/phút, người ta phải dùng áp suất cao (P = 100 – 200 bar). Phương pháp
này thực hiện ở nhiệt độ phòng nên phù hợp trong phân tích thực phẩm, vì các thành phần của
thực phẩm đa số là các chất dễ bò phân hủy ở nhiệt độ cao.

1.2.2. Hệ thống thiết bò HPLC
Hệ thống HPLC bao gồm 1 nguồn cung cấp pha động, một bơm, bộ phận nhập mẫu,
cột sắc ký, và một đầu dò.
Hình 1.1. Mô hình hệ thống HPLC
4
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Cột sắc ký
Cột HPLC thường ngắn, vào khoảng 10 – 25 cm và được nhồi pha tónh thích hợp. Các
hạt pha tónh nhồi cột HPLC thường có kích thước rất nhỏ (3, 5, 10 μm). Đường kính trong của
cột trong khoảng 2 – 4 mm. Các cột đều đã được chuẩn hóa theo tiêu chuẩn quốc tế.

Hình1.2. Cột sắc ký
Bơm
Là bộ phận quan trọng trong hệ thống HPLC. Bơm áp lực cao được sử dụng để đẩy

dung môi đi xuyên qua pha tónh. Kích thước hạt của pha tónh nhồi cột càng nhỏ thì áp suất bơm
chòu được phải càng cao. Yêu cầu đối với bơm HPLC là tạo được dòng pha động liên tục, ổn
đònh và không có xung. Có thể bố trí nhiều bơm lệch pha hoặc trước khi bơm vào cột, pha động
phải được bơm qua một đường nối ống đủ dài (> 1m). Dây nối phải chòu được áp lực. Bơm
thường sử dụng là bơm pittông. Các loại bơm HPLC hiện nay có thể cho vận tốc dòng: 0,1 – 10
ml/phút với mức dao động không lớn hơn 1%, áp lực lớn nhất lên đến 5000psi.
Đầu dò
Đầu dò sử dụng trong thiết bò HPLC rất đa dạng. Các loại đầu dò thông dụng là đầu
dò UV – VIS, đầu dò huỳnh quang, đầu dò dẫn nhiệt, đầu dò khúc xạ kế vi sai (RI), … Sự thay
đổi về cường độ ánh sáng do sự hấp thu tia UV, sự phát xạ huỳnh quang, … sẽ được ghi nhận lại
dưới sự thay đổi của điện thế đầu ra, biểu diễn trên một đồ thò theo thời gian chạy sắc ký – sắc
ký đồ. Thời gian lưu và diện tích peak là hai thông số đo quan trọng trong các phép sắc ký.
Máy ghi:
Vừa có khả năng vẽ đồ thò, xác đònh thời gian lưu, tính diện tích peak, ghi lại phương
pháp xác đònh, đồng thời có thể sử dụng máy ghi để điều khiển, chương trình hóa quá trình
chạy sắc ký.
Bộ phận nhập mẫu ( injector ):
Có thể nhập mẫu vào thiết bò HPLC một cách thủ công bằng xilanh. Cũng có bộ phận
nhập mẫu tự động hoàn toàn, chương trình hóa từ thể tích mẫu bơm vào, thời gian thay đổi mẫu,
thời gian rửa bộ phận nhập mẫu, nhiệt độ bơm mẫu, áp suất bơm mẫu. Thường áp suất bơm
mẫu nhỏ hơn 70 bar. Lúc đó mẫu mới tập trung vào đầu cột, đạt hiệu quả phân tích tốt.
Bình chứa pha động:
Thông thường là chai thủy tinh, được nối với bộ phận bài khí và nối với đầu vào của
bơm.
5
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

1.2.3. Nguyên tắc hoạt động
Bơm cao áp bơm pha động vào cột. Pha động được lọc trước bằng màng lọc với kích
thước lỗ xốp thích hợp. Có thể tiến hành phân tích ở nhiệt độ phòng, hoặc dùng lò điều nhiệt

hiệu chỉnh nhiệt độ cột khoảng 40 – 50
O
C mẫu được bơm vào hệ thống thông qua bộ phận nhập
mẫu. Sau đó mẫu được pha động đưa qua cột bảo vệ rồi cột phân tích. Trong cột phân tích, cấu
tử nào của mẫu có ái lực mạnh với pha động sẽ theo pha động đi ra trước, cấu tử nào có ái lực
yếu hơn sẽ đi ra sau. Pha động ra khỏi cột sẽ được đưa tới đầu dò. Sắc ký đồ, thời cũng như
diện tích các peak sẽ được thể hiện trên máy ghi dữ liệu.

1.3. THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT (BVTV)[3]
1.3.1. Đònh nghóa: thuốc BVTV hay nông dược là những chất độc có nguồn gốc tự nhiên hay
hóa chất tổng hợp được dùng để bảo vệ cây trồng và nông sản chống lại sự phá hoại của những
sinh vật gây hại đến tài nguyên thực vật. Những sinh vật gây hại chính gồm sâu hại, bệnh hại,
cỏ dại, chuột và các nhân tố khác.
1.2.2. Các nhóm thuốc BVTV
Thuốc BVTV được chia thành nhiều nhóm dựa trên đối tượng sinh vật gây hại:
Thuốc trừ bệnh
Thuốc trừ sâu
Thuốc trừ cỏ
Thuốc trừ ốc
Thuốc trừ nhện
Thuốc trừ tuyến trùng
Thuốc điều hòa sinh trưởng
Thuốc trừ chuột
Phân loại theo tính độc như sau:
Vạch màu đỏ trên nhãn là thuốc độc nhóm I, rất nguy hiểm.
Vạch màu vàng là thuốc độc nhóm II, cảnh báo có hại.
Vạch màu xanh da trời là thuốc độc nhóm III, lưu ý cẩn thận.
Vạch màu xanh lá cây là thuốc độc nhóm IV, ít độc.
Bảng 1.2. Phân loại thuốc BVTV theo tính độc
Nhóm LD

50
qua miệng LD
50
qua da LC
50
qua hô hấp
I
< 50mg/kg
<200mg/kg <0.05mg/L
II 50 -500mg/kg
200 – 2000 mg/kg
0.05 – 0.5 mg/L
III 500 - 5000 mg/kg
2000 – 5000 mg/kg
0.5 – 2 mg/L
IV
>5000mg/kg >5000 mg/kg
>2 mg/L
1.3.3. Các dạng thuốc BVTV
Nhũ dầu (ND, EC): thuốc ở thể lỏng, trong suốt. Dễ bắt lửa, cháy nổ.
Dung dòch (DD, SL, L, AS): hoà tan đều trong nước, không chứa chất hoá sữa.
6
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
Bột hoà nước (BTN, BHN, WP, DF, WDG, SP): dạng bột mòn, phân tán trong nước
thành dung dòch huyền phù)
Huyền phù (HP, FL, SC): phải lắc đều trước khi sử dụng.
Hạt (H, G, GR): chủ yếu được sử dụng để rải vào đất
Viên (P): chủ yếu được rải vào đất làm bả mồi.
Thuốc phun bột (BR, D): dạng bột mòn, không tan trong nước, rắc trực tiếp.

1.3.4. Giải thích một số thuật ngữ
Tên thuốc:
Tên thương mại: do công ty sản xuất hoặc phân phối thuốc đặt ra để phân biệt sản
phẩm giữa công ty này và công ty khác. Tên thương mại gồm 3 phần: tên thuốc, hàm lượng
hoạt chất và dạng thuốc.
Tên hoạt chất: là thành phần chủ yếu trong thuốc có tác dụng tiêu diệt dòch hại.
Độ độc:
LD
50
: chỉ số biểu thò độ độc cấp tính của một loại thuốc BVTV đối với động vật máu
nóng (đơn vò tính là mg chất độc/kg trọng lượng chuột). Chỉ số LD
50
chính là lượng chất độc gây
chết 50% cá thể chuột trong thí nghiệm. LD
50
càng thấp thì độ độc càng cao.
LC
50
: độ độc của một hoạt chất có trong không khí hoặc nước (đơn vò tính là mg chất
độc/thể tích không khí hoặc nước). Chỉ số LC
50
càng thấp thì độ độc càng cao.
Thời gian cách ly:
Là khoảng thời gian từ khi phun thuốc lần cuối đến khi thu hoạch nông sản nhằm bảo
đảm cho thuốc BVTV có đủ thời gian phân huỷ đến mức không còn có thể gây ra những tác
động xấu đến cơ thể của con người và gia súc khi tiêu thụ nông sản đó.
Dư lượng:
Là lượng chất độc còn lưu lại trong nông sản hoặc môi trường sau khi phun thuốc
BVTV. Dư lượng được tính bằng microgram hoặc miligram lượng chất độc trong 1kg nông sản
hoặc thể tích không khí, nước.

MRL (Maximum Residue Limit): mức dư lượng tối đa cho phép lưu tồn trong nông sản
mà không ảnh hưởng đến sức khoẻ con người, vật nuôi.
ADI (Acceptable Daily Intake): lượng chất độc chấp nhận hấp thu vào cơ thể, không
gây hại cho người và vật nuôi trong một ngày, được tính bằng microgram hoặc miligram hợp
chất độc trên 1 đơn vò thể trọng.

1.4. THUỐC TRỪ SÂU CARBARYL [10,15]
7
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
Carbaryl thuộc nhóm thuốc trừ sâu Carbamate.
Carbaryl là tên gọi thông dụng của 1-napthyl N-methylCarbamate.
Công thức hóa học: CH
3
NHCOOC
10
H
7
Công thức cấu tạo:

Hình 1.3. Carbaryl

1.4.1. Tính chất vật lý
Carbaryl ở dạng tinh khiết là tinh thể rắn, màu trắng, có mùi nhẹ, độ hoà tan trong
nước ở 20
o
C là dưới 0.1%, nhưng dễ hòa tan trong nhiều dung môi hữu cơ.
Nhiệt độ nóng chảy 138
o
C, nhiệt độ hóa hơi 193
o

C.
Bảng 1.3. Độ tan của Carbaryl trong một số dung môi
Dung môi Độ tan (g/kg)
Acetone 200 - 300
Methanol 79,6
Dicloromethan 242,6
Hexan 0,214
1.4.2. Tính chất hoá học
Bền trong môi trường acid, phân huỷ trong môi trường kiềm tạo thành 1-napthol.
Ổn đònh với nhiệt độ lên đến 70
o
C và ánh sáng. Khi bò gia nhiệt nó sẽ phân huỷ tạo
khói độc NOx.
1.4.3. Tính độc
Đối với người
Carbaryl dễ dàng được hấp thụ qua đường hô hấp và đường miệng, nhưng ít bò hấp thụ
hơn qua tiếp xúc với da. Khi tiếp xúc trực tiếp có thể gây bỏng da hoặc mắt. Hít vào hay nuốt
phải Carbaryl với lượng nhất đònh có thể gây ngộ độc cho hệ thần kinh, hệ hô hấp, gây ra các
triệu chứng nôn mửa, co thắt dạ dày, đau đầu, hôn mê, rối loạn thần kinh, suy hô hấp.
8
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
Dấu hiệu nhiễm độc tăng nhanh sau khi hấp thụ và cũng nhanh chóng kết thúc sau khi
không còn tiếp xúc nữa. Khi bò hấp thụ vào cơ thể người, nó sẽ nhanh chóng được bài tiết ra
theo nước tiểu (bài tiết khoảng 91.5% trong vòng 24h).
LD
50
qua miệng


= 614 mg/kg thể trọng, LD

50
qua da

> 5000 mg/kg thể trọng.
LC
50
= 2.43 mg/l.
ADI = 0.00-0.01mg/kg thể trọng.
Đối với động vật [3]
LD
50
(chuột) = 560 mg/kg thể trọng

1.4.4. Giới hạn dư lượng trên rau quả
Dư lượng tối đa cho phép của Carbaryl trong cải xanh là 10mg/kg rau.
Bảng 1.4. Giới hạn dư lượng tối đa của Carbaryl trên rau theo FAO/WHO (1994)
Sản phẩm MRL (mg/kg)
Dưa leo 3
Cải bắp 5
Cải xanh 10
1.4.5. Sử dụng[3]
Carbaryl là loại thuốc có tác dụng tiếp xúc và vò độc, có phổ phòng trò rộng hiệu lực
lâu dài. Tính độc của thuốc đối với sâu hại tăng lên khi nhiệt độ môi trường tăng cao. Carbaryl
thường được dùng để trò nhiều loài sâu hại lúa (rầy xanh, rầy nâu), hại cây ăn quả, rau (sâu
cuốn lá, rệp vải, rệp…), sâu hại cây công nghiệp (bông, thuốc lá…), bọ rầy dưa…
Chế phẩm 15ND thường được dùng ở nồng độ 0,125 – 0,33%, chế phẩm 50BHN dùng
ở nồng độ 0,05 – 0,2%; thuốc bột, thuốc hạt hàm lượng 2% được phun với lượng 20 – 25 kg/ha.
1.4.6. Phân tích dư lượng Carbaryl
1.4.6.1. Phương pháp quang phổ so màu:[11]
Carbaryl được trích trong methylen chloride (CH

2
Cl
2
), tiến hành loại pha nước bằng
Natri sulfate (Na
2
SO
4
) dạng bột khan. Sau đó, mẫu được cho phản ứng tạo màu với KOH 0.1N
trong Methanol, Acid acetic (CH
3
COOH), đồng thời cùng với thuốc thử màu p-nitrobenzen
diazonium tetrafluoborate.
Tiến hành đo độ hấp thu tại bước sóng 475 nm, lượng Carbaryl trong mẫu tiến hành
phân tích từ 0,1 – 1 mg/mẫu và ngưỡng phát hiện (LOD) của phương pháp khoảng 0,03
mg/mẫu.

9
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
1.4.6.2. Phương pháp sắc ký khí (GC)
Carbaryl được trích bằng CH
2
Cl
2
, sau đó được làm sạch bằng cách cho qua cột Florisil
sử dụng cloroform/hexan tỉ lệ 1/1 và 100% cloroform làm dung dòch rửa giải. Dư lượng được
xác đònh bằng sắc ký khí đầu dò Nitơ – Phot pho. Độ thu hồi mẫu là 85%, LOD từ 0.3 đến 0.5
ng và LOQ (ngưỡng đònh lượng) của đầu dò là 0.1 ppm.
Dư lượng được trích ra khỏi rau bằng Acetonitrile (CH
3

CN), dòch trích sau đó được làm
sạch bằng petroleum ete và kết tủa bằng dung dòch H
3
PO
4
– NH
4
Cl. Các tạp chất dạng phenol
được tách ra bằng cách: hòa CH
2
Cl
2
vào dòch trích và loại CH
2
Cl
2
bằng cách dùng dung dòch
KOH. Dư lượng Carbamate được xử lý với 1-flouro-2,4 dinitrobenzen để hình thành dẫn xuất
ete. Sau khi tạo dẫn xuất, tiến hành phân tích Carbaryl được pha trong iso-octan bằng thiết bò
sắc ký khí đầu dò khối phổ (GC/MS): cột sắc ký khí có kích thước: 30 m x 0.25 mm (id), cột
mao quản phim mỏng bằng thạch anh được phủ lớp silicon.
Chế độ vận hành: nhiệt độ cột: 70
O
C được giữ 1 phút, tăng nhiệt độ 5O
O
C/1 phút đến
16O
O
C và giữ ở 16O
O

C trong 1 phút, và tăng cứ 3,5
O
C lên đến 270
O
C và giữ ở 270
O
C trong 10
phút. Sử dụng khí mang: Heli, độ tinh khiết 99,999%. Tốc độ dòng qua cột: 1.2ml/phút. [12]
Dư lượng được trích ra khỏi rau bằng CH
2
Cl
2
, tách pha nước bằng dung dòch muối
NaCl và muối Na
2
S0
4
khan. Dòch trích được cô quay bốc hơi đến khô và tráng lại bằng Hexan,
sau đó được cho qua cột làm sạch. Sử dụng cột Florisil được rửa giải với trình tự như sau: 6 ml
hỗn hợp Hexan/Aceton (4/1), 5 ml Hexan, dòch trích Carbaryl và sau cùng là 6 ml hỗn hợp
Hexan/Aceton (4/1). Thu dòch rửa giải và cô quay đến khô, tráng lại bằng 0.5 ml Hexan. Dư
lượng được xác đònh bằng thiết bò sắc ký khí cột mao quản HP-5 MS (hãng Agilent, USA): kích
thước 30 m x 0,25 mm (id) x 0,25 mm lớp phim, sử dụng Heli làm khí mang.
Điều kiện vận hành: 70
O
C trong 2 phút, tăng nhiệt độ cứ 25
O
C/ph đến 150
O
C, sau đó

tăng cứ 3
O
C/ph đến 200
O
C, rồi 8
O
C/ph đến 280
O
C, giữ ở nhiệt độ này trong 10 phút. Nhiệt độ
injector được giữ ở 220
O
C. Đầu dò khối phổ MS: nhiệt độ nguồn ion (ion source temperarture):
230
O
C, nhiệt độ bề mặt (interface temperature): 280
O
C.[16]

1.4.6.3. Sắc ký lỏng (HPLC)
Dư lượng được trích bằng Methanol, làm sạch bằng cột Nuchar Celite và dùng hỗn
hợp Toluen – CH
3
CN (1:3) để rữa giải. Sau khi qua cột, mẫu được pha loãng và tiến hành phân
tích bằng sắc ký lỏng cao áp, pha đảo, đầu dò huỳnh quang. Sau khi qua cột sắc ký, Carbaryl
được tạo dẫn xuất với o-phthalaldehyde và 2-mercaptoethanol tạo thành chất phát huỳnh
quang. Độ thu hồi mẫu ≥ 95%. Sử dụng cột nhồi: cột C8 pha đảo: 25 cm x 4.6 mm x 6 μm. Điều
kiện vận hành: tốc độ pha động: 1.5 ml/ph, tỉ lệ pha động: 12% Acetonitile (CH3CN) :88%
nước. Quá trình thủy phân tạo dẫn xuất ở 100
O
C và nhiệt độ cột là 35

O
C. Đầu dò huỳnh quang
đo ở bước sóng 340 và 455 nm. Thời gian lưu Carbaryl: khoảng 20 phút.
10
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
Sử dụng cột C8: 4 x 250 mm, nhiệt độ cột: 45
O
C. Tốc độ dòng: 0.8 ml/ph, đầu dò
huỳnh quang có tạo dẫn xuất sau cột với OPA. Pha động: nước - methanol với chương trình trộn
thành phần pha động như sau:
 0 - 2 phút: 15% methanol
 42 phút: 70% methanol
 Thời gian lưu Carbaryl: 32 phút [17]
Sử dụng cột pha đảo C18: 250 x 4 mm x 5 μm, đầu dò huỳnh quang. Tốc độ dòng: 0.8
ml/ph, nhiệt độ cột: 37
O
C. Pha động: nước / methanol CH
3
0H, tỉ lệ thay đổi theo gradient:
 2 phút: 12 % CH
3
0H
 42 phút: 66% CH
3
0H
 Thời gian lưu Carbaryl: khoảng 37-39 phút[13]
Sử dụng cột Wakosil II-3C18 RS: 150 x 2 mm (id) x 3.5 μm, đầu dò huỳnh quang. Tốc
độ dòng: 0.2 ml/ph và nhiệt độ cột: 50
O
C. Pha động sử dụng: Acetonitrile/nước với thay đổi

gradient như sau:
 10 phút: 20-60% acetonitrile
 20 phút: 60-70% acetonitile
 22-30 phút: 100% acetonitrile
 Thời gian lưu Carbaryl khoảng 15-16 phút [14]
Sử dụng cột Superiorex (monomeric ODS): 150 x 4.6 mm (id) x 5 μm. Tốc độ dòng: 1
ml/ph, nhiệt độ cột: nhiệt độ thường, đầu dò UV: bước sóng 220 nm. Pha động: 100% Methanol.
Thời gian lưu Carbaryl: 2.96 phút. [19]
Sử dụng cột Dupont Zorbax ODS: 25 cm x 4.6 mm (id) x 6 μm. Tốc độ dòng: 1 ml/ph,
đầu dò UV: bước sóng 280 nm. Pha động: 55% Acetonitrile/45% nước. Thời gian lưu Carbaryl:
6.5 phút. LOQ của phương pháp (chiều cao peak bằng 5 lần chiều cao của đường nền): 6.8
ng/lần tiêm thể tích 10 μl. Carbaryl được pha trong dung môi là Acetonitrile. [20]

1.5. THUỐC TRỪ SÂU DIMETHOATE [21]
Thuộc nhóm trừ sâu thuộc nhóm lân hữu cơ, có tên gọi theo danh pháp quốc tế là
O,O-dimethyl S–methylcarbamoylmethyl – phosphorodithioate.
Công thức hoá học: C
5
H
12
NO
3
PS
2

Công thức cấu tạo:
Hình 1.4. Dimethoate.
11
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
Tên thương mại:Cekuthoate, Chimigor 40, Cygon 400, Daphene, De-Fend, Demos NF,

Devigon, Dimate 267, Dimet, Dimethoat Tech 95%, Dimethopgen, Ferkethion, Fostion MM,
Perfekthion, Rogodan, Rogodial, Rogor, Roxion, Sevigor, Trimetion.

1.4.1. Tính chất vật lí [22]
Dạng tinh khiết là những tinh thể màu trắng nóng chảy ở ~ 45 – 48
o
C, dạng kỹ nghệ
là một chất dễ tan trong dung môi hữu cơ (chloroform, benzene, toluene, rượu, ester, ketone,
methylen chloride, acetone và etanol), tan nhiều trong nước, tan ít trong carbon tetrachloride,
diethyl eter, hexan, không tan trong xăng ete. Độ bay hơi không đáng kể (0.107mg/m
3
ở 20
o
C).
Bảûng 1.5. Độ tan của Dimethoate trong một số dung môi ở 25
0
C.
Dung môi Độ tan (g/100mL)
Aceton 140
Acetonitril 140
Cyclohexane 120
Dodecane 0,043
Etanol 150
Ethyl acetate 120
Hexane 0,03
2-propanol 120
Methanol 160
Dicloromethane 150
1-octanol 52
Toluene 100

Xylene 31
1,2-dicloroethane 120
n-heptane 0,024
1.5.2. Tính chất hoá học [23]
Dimethoate tương đối bền trong môi trường acid, thuỷ phân nhanh trong môi trường
kiềm, phân huỷ nhanh khi gia nhiệt đến nhiệt độ >80
0
C. Sự phân huỷ này tạo ra các khí độc hại
dimethyl sulfic, carbon monoxide, methyl mercaptane, pentoxide phospho.
Dimethoate phân huỷ trong thời gian ngắn trong đất, nước và cây trồng. Thời gian tồn
tại trong đất của Dimethoate là 4 – 16 ngày, ngắn hơn trong đất ẩm. Trong nước sông, sau 18h
– 8 tuần thì bò giảm một nửa. Trong động vật cũng như trong thực vật, cơ chế biến đổi của
Dimethoate là giống nhau. Nó bò oxi hoá thành O,O-dimethyl-phosphorothioate và hydro hóa
12
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
thành O,O-dimethyl-phosphorodithioate, - phosphorothioate, -phosphat. Sự oxi hoá Dimethoate
tạo nên hợp chất omethoate, một chất độc và là chất ức chế enzyme cholinesterase mạnh, nó
cũng phân huỷ trong môi trường nhanh như Dimethoate.

1.5.3. Tính độc của Dimethoate: [24]
Đối với người:
Dimethoate thuộc nhóm độc II.
LD
50
qua miệng là 235mg/kg, qua da >400mg/kg.
ADI: 0.02mg/kg thể trọng / ngày.
Nồng độ cao nhất được chấp nhận của Dimethoate trong nước uống là 0.02mg/L.
Đối với một số động vật : [25]
Qua miệng: LD
50

đối với chuột đực là 387, chuột cái 160, thỏ 300, lợn 350, gà 108, vòt
40, chim cút 84 mg/kg, với gấu 0.1 – 0.2 mg/con.
Qua đường hô hấp: LC
50
(4h) đối với chuột >1.6mg/1L không khí.
1.4.4. Giới hạn dư lượng Dimethoate trên rau quả
Dư lượng tối đa cho phép của Dimethoat trong cải xanh là 2mg/kg rau.
Bảng 1.6. Dư lượng tuyệt đối của Dimethoate đối với một số rau quả
Loại rau quả Dư lượng tyệt đối(mg/kg)
Rau ăn quả, ăn củ 0,5 – 1
Các loại rau 2(TCVN 5624-1991)
Ngũ cốc 0,05
Dưa chuột 2
Cải bắp, cải xanh 2 (ASEAN)
Cà chua 1(TCVN 5624-1991)
Hạt tiêu 1(TCVN 5624-1991)
Quả chanh 2(TCVN 5624-1991)
Nho Hy lạp, quả lý chua (đen) 2(TCVN 5624-1991)
Dâu tây 1(TCVN 5624-1991)
1.5.5. Sử dụng Dimethoate [3]
13
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
Tác động nội hấp, tiếp xúc và xông hơi, diệt được những loài chích hút nhựa cây, sâu
nhai gặm, cả nhện đỏ và tuyến trùng Rotylenchus similis Coll hại chuối. Dimethoate trò hữu
hiệu rệp, bọ xít, bọ cánh tơ, nhện đỏ trên bông, chè, cam, đậu, lạc, ngô…
Nồng độ thường dùng 0.05-0.075% chế phẩm 50ND. Dùng ở nồng độ cao hơn (0.1-
0.15%) thuốc diệt được các loài sâu đục lá như dòi đục lá đậu, sâu vẽ bùa hại cam…Ở nhiệt độ
cao (>18
o
C) thuốc tác động lên côn trùng nhanh hơn và mạnh hơn. Hiệu lực trừ sâu của thuốc

kéo dài từ 2 - 3 tuần. Cây sinh trưởng càng mạnh hoạt động sống càng cao, thuốc càng chóng
phân huỷ trong cây thành những chất không độc. Ngoài ra thuốc còn được dùng trong chăn nuôi
thú y.
Sau khi phun Dimethoate vào rau quả, phải để một thời gian sau mới thu hoạch và
đem tiêu thụ. Thời gian cách li đối với một số loại cây rau được cho ở bảng 1.5.
Bảng 1.7. Thời gian cách li của Dimethoate cho một số loại nông sản
Loại cây trồng Thời gian cách li (ngày)
Rau 7 – 10
Lúa, khoai tây, cây ăn quả 14
Ngũ cốc 21
1.5.6. Các phương pháp phân tích hàm lượng Dimethoate
1.5.6.1. Sắc ký khí [26, 22]
Chuẩn bò dung dòch mẫu chuẩn:
Cân khoảng 10mg chất chuẩn Dimethoate, chính xác đến 4 hoặc 2 số lẻ cho vào bình
đònh mức 10mL, đònh mức đến vạch bằng toluene, được dung dòch gốc, nồng độ 1mg/mL.
Dùng pipet lấy chính xác 1mL dung dòch gốc vào bình đònh mức 10mL, tiếp tục đònh
mức bằng dung môi ở trên, được dung dòch nồng độ 0.1mg/mL.
Bằng phương pháp pha loãng liên tục từ dung dòch có nồng dộ thu được, ta được dãy
dung dòch chuẩn.
Chuẩn bò dung dòch mẫu thử
Cân khoảng 20g mẫu cho vào cối giã trong 30 phút đồng thời cho nước vào 100ml →
thêm 200mL aceton + khuấy trong 10 phút → cho vào 8g celite và lọc chân không thu được thể
14
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
tích → thêm 20g NaCl + lắc trong vài phút → lắng 1h để tách pha → thêm 200mL
dichloromethane + lắc và để trong 12h → thêm 30g Na
2
SO
4
vào pha hữu cơ→ khuấy + lắng

trong 20 phút → lọc qua lớp bông thuỷ tinh và lớp Na
2
SO
4
3 – 4cm → cho bay hơi đến khô
trong thiết bò cô quay chân không ở 40
0
C → thêm vào 2mL iso-octane và dung dòch được cho
qua cột nhồi với 1g silicagel 60 (ký hiệu hỗn hợp số N
0
7734, cỡ hạt 70/ 230 mesh) → thêm vào
2mL toluene và cho hỗn hợp qua cột, 6mL toluen được cho vào cột và chất lỏng được cho bay
hơi đến 1mL → thêm vào toluene đến 2mL rồi đem phân tích trên thiết bò sắc kí khí.
Điều kiện phân tích
Sử dụng sắc kí khí với pha tónh là chất lỏng.
Cột mao quản: DB-210, 30m × 0.32mm i.d, 0.5µm film.
Nhiệt độ buồng bơm mẫu: 200
0
C.
Nhiệt độ cột: 160
0
C.
Nhiệt độ detector: 250
0
C.
p suất đầu (head pressure): 7.5 psi
Giữ ở nhiệt độ ban đầu trong 1 phút, tăng nhiệt độ 16
0
C/phút đến 200
0

C, giữ ở nhiệt
độ cuối cùng trong 7 phút
Các điều kiện vận hành đầu dò quang kế ngọn lửa (FPD)
Tốc độ dòng hydro: 200mL/phút.
Tốc độ dòng không khí: 100mL/phút.
Tốc độ dòng nitơ: 30mL/phút.
Tỷ lệ tách dòng 12.5:1.
1.5.6.2. Sắc kí lỏng [27]
Thiết bò sắc kí LC – MS ( Hewlett – Packard, Waldbronn, Đức), cột đảo pha C18, 250
× 4.6 mm của Phenomenex.
Pha động: methanol :nước với thành phần (theo thể tích) của methanol thay đổi 45%
→ 55% → 75% trong quá trình phân tích. Còn nước được chỉnh pH 3.8 bằng acid formic.
Chuẩn bò mẫu phân tích:
Lấy 10 mL mẫu nước, chỉnh pH 2.5 bằng HCl, Dimethoat được trích ra bằng 3 phần
50mL dichlomethan, loại nước bằng Na
2
SO
4
, cô quay đến khô sau đó tráng bình bằng 1mL
methanol : nước = 6:4 (theo thể tích), sau đó lọc qua màng trước khi phân tích trên thiết bò sắc
kí.
1.5.6.3. Sắc kí lỏng cao áp HPLC [28]
15
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
Thiết bò: thiết bò sắc kí HPLC Hewlett Packard HP 1100 với đầu dò UV , sử dụng cột
Phenomenex Shpereclon ODS2, 5µm, 120 mm × 4.6mm
Pha động: Acetonitril/dung môi A với tỷ lệ là 1/9 (theo thể tích). Với dung môi A
được pha như sau: hòa tan 11.32g H
3
PO

4
và 32.86g KH
2
PO
4
bằng 1000mL nước cất, loại dùng
cho HPLC. Trộn dung dòch vừa chuẩn bò với nước theo tỉ lệ 9 /1 (theo thể tích). Ta được dung
môi A.
Vận hành:
Lượng mẫu bơm vào: 15 µL
Bước sóng: 210 nm.
1.5.6.4. Sắc kí bản mỏng
Dư lượng Dimethoate được chiết tách ra khỏi mẫu bằng aceton và n – hexan, sau đó
làm sạch bằng cách cho qua cột Florisil đã làm mất hoạt tính và phản hấp phụ bằng hệ dung
môi rửa giải. Xác đònh dư lượng Dimethoat trên sắc kí lớp mỏng bằng cách so sánh Rf và màu
sắc vết màu với vết Dimethoat chuẩn sau khi phun thuốc hiện màu đặc hiệu.
Hệ dung môi rửa giải: ete etylic/petroleum ete = 1/1 (theo thể tích).
Hệ dung môi triển khai sắc kí: n- hexan/aceton = 7/3 (theo thể tích).
Dung dòch thuốc thử hiện màu: cân 0.2g palladi clorua vào bình đònh mức 100mL. Hòa
tan và đònh mức đến vạch bằng dung dòch HCl 0.01N.
Ngoài ra hiện nay, để phát hiện nhanh dư lượng thuốc trừ sâu lân hữu cơ, cacbamat
trong nông sản, thực phẩm và các mẫu môi trường, các nhà khoa học thuộc Phòng Nghiên cứu
Hoá sinh và Sinh học phân tử, viện công nghệ sinh học và thực phẩm (trường Đại học Bách
khoa Hà Nội) đã nghiên cứu và chế tạo thành công bộ KIT Enzyme phát hiện nhanh dư lượng
thuốc trừ sâu. Nguyên tắc thử: Enzyme acetylcholinesterase (AchE) xúc tác thuỷ phân cơ chất
acetylcholin thành cholin và acetic. Acid acetic sẽ phản ứng với chất chỉ thò tạo màu vàng. Nếu
mẫu phân tích có thuốc trừ sâu lân hữu cơ, cacbamat sẽ kiềm hãm hoạt động của AchE, hàm
lượng acetic giảm, màu sẽ thay đổi. Dựa vào sự thay đổi màu so với mẫu đối chứng (không có
thuốc trừ sâu), hoặc dựa vào thang màu chuẩn có thể đònh tính hoặc bán đònh lượng thuốc trừ
sâu trong mẫu phân tích [29].

1.6. VITAMIN C [4]
Vitamin C tồn tại trong tự nhiên dưới 3 dạng phổ biến là acid ascorbic, acid
dehydroascorbic và dạng liên kết ascorbigen. Nó chỉ tồn tại ở dạng L trong các sản phẩm thiên
nhiên.
Cho tới nay người ta phát hiện thấy 14 đồng phân và đồng đẳng của vitamin C có hoạt
tính chống bệnh hoại huyết và 15 chất đồng phân không có hoạt tính.
16
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
Công thức phân tử C
6
H
8
O
6
.
Hình 1.5. Acid ascorbic
1.6.1. Tính chất vật lý
Acid ascorbic tinh khiết tồn tại ở dạng tinh thể, không màu hoặc có màu trắng. Acid
ascorbic thường không có mùi, có vò chua acid, tan vô hạn trong nước, ít tan trong ethanol,
không tan trong ether và chloroform. Nhiệt độ nóng chảy 190
o
C.
Acid ascorbic bò hoá đen khi để trực tiếp ngoài ánh sáng mặt trời, tuy nhiên sự biến
màu nhẹ có thể không làm mất hoạt tính chữa bệnh của acid ascorbic. Thậm chí khi không có
mặt ánh sáng thì acid ascorbic vẫn dễ dàng bò biến tính khi tiếp xúc với độ ẩm trong không khí
và sự phân huỷ này càng nhanh khi nhiệt độ môi trường càng cao.

1.6.2. Tính chất hoá học
Trong dung dòch, acid ascorbic nhanh chóng bò oxi hoá khi có mặt không khí và pH

vùng kiềm. Acid ascorbic bền trong môi trường trung tính, acid, không bền trong môi trường có
các ion kim loại như Cu
2+,
Fe
2+,
Enzym ascorbatoxydase…

1.6.3. Nguồn gốc
Acid ascorbic có cả nguồn gốc tự nhiên và nhân tạo. Trong tự nhiên, acid ascorbic
được tìm thấy trong các loại rau quả tươi. Nguồn thức ăn chứa vitamin C rất tốt là những trái
cây thuộc họ citrus hay nước ép từ trái họ citrus, quả mọng, hồ tiêu xanh hay đỏ, cà chua, bông
cải, rau cải bó xôi.
Bảng 1.8. Thành phần Vitamin C trong một số nguyên liệu thực phẩm
STT Nguyên liệu Vitamin C (mg/100g)
1 Dứa 17
2 Cải bắp 30
3 Me 75
4 Vải 167
5 Hạt điều 1
6 Dưa leo 12
7 Nhãn 8
17
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
8 Chanh 46
9 Cải xanh 70
10 Ớt 250
1.6.4. Vai trò của Vitamin C [30]
Vitamin C được Albert Szent-Gyorgyi phân lập năm 1928. Gần 70 năm sau, các nhà
nghiên cứu đã khám phá ra nhiều lợi ích của vitamin C trên sức khoẻ. Đây là loại vitamin mà
cơ thể cần nhiều nhất. Đối với người bình thường cần khoảng 80 – 100mg Vitamin C trong 24

giờ. Tuỳ thuộc vào hệ di truyền và các yếu tố trong lối sống, một số người đòi hỏi lượng
Vitamin C nhiều hơn lượng trung bình của một người bình thường nhằm ngăn chặn sự gián đoạn
của các phản ứng sinh hoá quan trọng. Chẳng hạn như người lớn tuổi, uống rượu, người bò bệnh
tiểu đường, người hút thuốc lá thường bò thiếu Vitamin C.
Không như hầu hết các loại động vật khác, cơ thể người không thể tự sản xuất vitamin
C. Một bệnh do thiếu hụt vitamin C phổ biến nhất là bệnh scorbus (scurvy). Các triệu chứng
kinh điển của bệnh này gồm: chảy máu nướu răng, chậm lành vết thương, các vết thâm tím
rộng trên da (mảng xuất huyết dưới da, dân gian thường gọi là “vết ma cắn”). Thêm vào đó là
sự dễ bò nhiễm trùng, hysteria và trầm cảm cũng là những tiêu chuẩn chẩn đoán.
Vitamin C hiện nay là một chế phẩm bổ sung vitamin phổ biến nhất. Trong khi các
nhà nghiên cứu và các chuyên gia vẫn còn bàn cãi về nhiều khía cạnh khác nhau của vitamin
C, một điều không thể chối cãi rằng loại vitamin này đóng một vai trò hết sức quan trọng trong
mọi hoạt động của cơ thể người. Vitamin C có đặc tính chữa lành bệnh scorbut (bệnh chảy
máu). Tạo điều kiện dễ hấp thu Fe nhưng nếu nhiều quá thì vitamin C sẽ ảnh hưởng đến quá
trình hấp thu Cu.
Tăng đào thải các kim loại độc như Pb và các chất ô nhiễm khác, giảm stress do giúp
tổng hợp hormon thượng thận. Tham gia vào cơ chế miễn dòch, chống lại nhiễm trùng vi khuẩn
và virus. Giảm tuần hoàn histamin, một chất trung gian gây dò ứng và một vài tai biến khi có
thai. Vitamin C có khả năng chống oxi hoá: nó ngăn chặn quá trình sản xuất các gốc tự do, bảo
vệ acid béo không no của màng tế bào. Ức chế quá trình tạo thành Nitrosamin (chất gây ung
thư trong dạ dày) và trung hoà một số chất độc.
Ức chế quá trình sản xuất các gốc tự do, mà các gốc này sẽ phá huỷ gen. Độc tính của
Vitamin C hầu như không có bởi dư lượng Vitamin C có thể được đào thải qua nước tiểu. Tuy
nhiên, cần thận trọng để tránh dùng nhiều vitamin C với người bò sỏi thận. Tác dụng phụ chính
của quá liều vitamin C là tiêu chảy. Kết hợp với sắt hay đồng, vitamin C có thể trở thành tiền
oxy hoá thay vì chống oxy hoá. Cần tránh cho trẻ sơ sinh dùng vitamin C trong tháng đầu sau
sinh, bởi vì hồng cầu của trẻ sơ sinh bò phá huỷ sẽ giải phóng ra sắt. Cung cấp thêm vitamin C
cũng bò chống chỉ đònh ở những người bò nhiễm sắt.

1.6.5. Các phương pháp phân tích Vitamin C

18
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
1.6.5.1. Phân tích Vitamin C bằng phương pháp HPLC [5]
Phương pháp này được giới thiệu trong nhiều tài liệu tham khảo và đã trở thành một
bài thí nghiệm trong PTN Hóa sinh, bôï môn CN thực phẩm. Cột sắc ký sử dụng là cột pha đảo
ODS C18. Pha động sử dụng là dung dòch đệm phosphate pH = 2,8 trộn với methanol theo tỷ lệ
thể tích 90/10, lưu lượng pha động qua cột 1 mL/phút. Sử dụng đầu dò UV đo độ hấp thụ ở bước
sóng 245 nm.
Mẫu rau quả được nghiền trong dung dòch đệm phosphate pH = 2,8 để trích Vitamin C
ra, pha loãng theo tỷ lệ thích hợp rồi phân tích như với các mẫu chuẩn. Hàm lượng Vitamin C
trong mẫu được xác đònh bằng cách nội / ngoại suy tín hiệu của mẫu từ đường chuẩn.

1.6.5.2. Phân tích vitamin C bằng phương pháp chuẩn độ [1]
Chuẩn độ với 2,6- dichloroindophenol (DCP)
Đây là một phương pháp hữu dụng để đònh lượng vitamin C trong rau quả. Cơ sở của
phương pháp này là phản ứng oxi hóa acid ascorbic trong dung dòch bởi DCP thành dạng
dehydroascorbic acid. Sản phẩm của phản ứng oxy hóa khử này đều không màu. Phương trình
phản ứng (pH=3)
C6H8O6 (không màu) + C12H7O2NCl2(đỏ) → C6H6O6 (không màu) + C12H9O2NCl2 (không màu)
Sự chuẩn độ này đặc biệt thuận lợi bởi vì DCP cũng đóng vai trò như chất chỉ thò màu.
Khi nhỏ dung dòch DCP vào một dung dòch có chứa vitamin C, thì hỗn hợp phản ứng không màu
cho đến khi tất cả lượng vitamin C có trong hỗn hợp chuyển hết thành dạng dehydroascorbic
acid. Giọt dung dòch DCP tiếp theo thêm vào nếu xuất hiện màu đỏ chứng tỏ đó là giọt DCP
còn dư và phản ứng đã kết thúc. Do đó, điểm tương đương được xác đònh (chỉ thò) khi dung dòch
chuẩn độ từ không màu chuyển sang màu đỏ của DCP.
Yếu điểm của phương pháp này là dung dòch DCP rất kém bền nên chúng ta chỉ pha
dung dòch ngay trước khi sử dụng chúng.
Trước khi tiến hành chuẩn độ, cần xử lý mẫu thực phẩm với metaphosphoric acid.
Bước xử lý với acid này nhằm làm biến tính và kết tủa protein trong mẫu để tránh ảnh hưởng
đến kết quả phân tích, đồng thời cũng nhằm giúp ổn đònh acid ascorbic tránh bò phân huỷ. Acid

hoá đến pH nhỏ hơn 4 cũng nhằm làm giảm phản ứng của DCP với các hợp chất khác.
Chuẩn độ bằng iode
Đây là qui trình chuẩn độ ngược, lượng ion I
3

-
dư trong dung dòch sau khi đã phản ứng
với Vitamin C được xác đònh bằng cách cho phản ứng với dung dòch thiosulfate. Cơ sở của
phương pháp chuẩn độ Vitamin C bằng Iod là phản ứng oxi hoá Vitamin C thành
dehydroascorbic acid, C6H6O6 theo phương trình sau:
I
3

-
+ C
6
H
8
O
6
+ H
2
O → C
6
H
6
O
6
+3 I
-

+ 2H
+
19
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
Lượng ion I
3

-
trong dung dòch sau khi Vit.C đã phản ứng hết sẽ được xác đònh bằng
phép chuẩn độ với dung dòch thiosulfate S
2
O
3
2
-
theo phương trình sau:
I
3

-
+ 2 S
2
O
3
2
-

→ 3 I
-
+ S

4
O
6
2
-
Có một khó khăn là phải pha chế dung dòch I
3

-
từ dung dòch KIO3 và muối rắn KI
trong điều kiện acid như phương trình sau:
6H
+
(aq)+KIO
3
(aq)+8KI(s) → 9K
+
(aq)+3I
-
(aq)+3H
2
O(l)
Lượng I
3

-
tạo thành có thể được tính toán thông qua lượng KI và KIO3 đã sử dụng.
Lượng này trừ đi lượng dư trong chuẩn độ với thiosulfate sẽ thu được lượng I
3

-
đã phản ứng với
acid ascorbic.
CHƯƠNG 2. MÔ TẢ THỰC NGHIỆM
2.1. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ
2.1.1. Hóa chất và thiết bò sử dụng
Hóa chất:
20
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
Carbaryl_Bayer_Độ tinh khiết 98%
Dimethoat (độ tinh sạch >98%)
Acetonitrile (loại dùng cho HPLC, của J.Baker (USA))
Methanol_Merk_HPLC
Aceton_Trung Quốc
NaCl_Trung Quốc
KH
2
PO
4
(Trung Quốc).
H
3
PO
4
(Trung Quốc)
Thiết bò:
Máy sắc ký lỏng_ hãng Shimazdu SPD – 6AV_ Đầu dò UV – VIS
Bể đánh siêu âm_ Decon
Máy cô đặc chân không_ Heidolph WB 2000
Máy đo quang phổ hấp thu_ Spectronic Genesys 8

Máy đo độ ẩm _ Scaltec SMO 01
Máy khuấy từ
Hệ thống lọc chân không
Cân phân tích Sartorius 1 số lẻ và 4 số lẻ
Máy xay Magic Bullet.
Phễu chiết 250mL.
Becher 100mL, 250mL, 500mL
Ống đong 100 mL, 250mL.
Bình đònh mức 10, 25, 50, 100 mL.
Cuvette thạch anh.
Màng lọc 0.45µm, giấy lọc.

2.1.2. Thiết bò sắc kí lỏng cao áp HPLC
Hệ thống HPLC (Shimazu) gồm bơm LC -10AS, đầu dò quang phổ SPD-6AV và máy
ghi Chromatopac CR 6A.
Sử dụng cột C18 của Phenomebex (USA),Gemini 5µm – 110A
0
, 250 × 4.6mm, thuộc
loại sắc kí pha đảo. Riêng đối với Vitamin C sử dụng ET 250/8/4 Nucleosil® 120 – 5 C18 thuộc
loại cột sắc ký lỏng pha đảo còn gọi là cột ODS hay RP – 18.

2.2. VẬN HÀNH THIẾT BỊ THIẾT BỊ SẮC KÍ LỎNG CAO ÁP HPLC
2.2.1. Vận hành bơm
Đặt giá trò áp suất cực đại (P.MAX): 300 kgf/cm
2
. Mục đích là để bảo vệ cột và các hệ
thống khác, khi áp suất vượt P.MAX, bơm sẽ tự động tắt.
21
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
Đặt giới hạn dưới của áp suất (P.MIN) nhằm mục đích không cho không khí vào hệ

khi có sự cố hở trên hệ thống và an toàn khi đo.
Đặt lưu lượng pha động (FLOW RATE): 1mL/phút và không nên đặt quá giá trò này
trừ trường hợp cần rửa sạch hệ thống.

2.2.2. Đầu dò (DETECTOR)
Detector SPD –6AV của hãng Shimadzu thuộc loại detector hấp thu tử ngoại và khả
kiến (UV – VIS).
Chọn bước sóng đo: chọn bước sóng đo thích hợp với chất cần phân tích nhằm nâng
cao độ nhạy của quy trình phân tích.
Chọn mức đáp ứng (RESPOND) chuẩn (STD).
Khi cần chỉnh độ hấp thu về mức không, sử dụng nút ZERO.

2.2.3. Máy ghi Chromatopac CR6A
Máy ghi này gồm các bộ phận: bàn phím cài đặt chương trình với các phím điều
khiển, bộ phận nối với detector để thu nhận tín hiệu, bộ phận nối cảm ứng để khởi động đồng
thời hệ thống chạy mẫu và hệ thống ghi, bộ phận in cảm ứng, xử lý dữ liệu theo chương trình
cài đặt sẵn và in thành sắc kí đồ.

2.2.4. Cài đặt các thông số
ATTEN: có giá trò từ 0 đến 10, giá trò càng nhỏ thì khoảng biểu diễn trên sắc kí đồ
càng nhỏ, dùng ATTEN nhỏ khi để đo nồâng độ thấp mà không ảnh hưởng tính diện tích peak,
thường dử dụng ATTEN = 10.
METHOD (phương pháp): sử dụng phương pháp 61 để cho kết quả diện tích peak dò
được đồng thời đánh dấu vò trí peak.
SLOPE (độ nhạy): Slope càng nhỏ độ nhạy càng cao, nên đặt <200.
MIN.AREA (diện tích peak tối thiểu)
STOP.TIME ( thời gian ngừng ghi sắc kí đồ)
SPEED (tốc độ giấy): thường dùng 5, muốn peak dạng sắc nhọn thì giảm SPEED.

2.2.5. Chuẩn bò máy trước khi tiến hành phân tích

Nước cất hay pha động trước khi bơm vào cột phải được loại khí bằng siêu âm.
22
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
Nhấn nút POWER của bơm, để ổn đònh trong 15 phút. Kiểm tra áp suất cực đại và cực
tiểu.
Khi áp suất ổn đònh, rửa đường ống bằng nước cất 2 lần và pha động trong 10 phút.
(xoay nút tháo ở vò trí mở (DRAIN 180
0
), nhấn nút rửa PURGE).
Nhấn nút PURGE hoặc PUMP để dừng bơm. Xoay van tháo 180
0
để khóa chặt. Rửa
đường ống trước cột bằng nước cất và pha động trong 10 phút.
Gắn cột vào, cho vận hành bơm, bơm pha động qua cột 20 – 30 phút. Nếu cần thiết
rửa cột bằng dung dòch acetonitril : nước = 90 : 10 (theo thể tích) trong 15 – 20 phút trước khi
cho pha động chạy qua.
Chỉnh độ hấp thu về không bằng cách nhấn nút ZERO trên detector. Kiểm tra đường
nền bằng lệnh SHIFT DOWN PLOT ENTER. Trong quá trình kiểm tra nếu đường nếu đường
nền bò lệch vài phút thì nhấn lại ZERO, đợi đường nền thẳng lặp lại nhóm lệnh trên để kết thúc
kiểm tra.
2.3. KHẢO SÁT QUY TRÌNH PHÂN TÍCH CARBARYL, DIMETHOATE BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP (HPLC)
2.3.1. Khảo sát phổ hấp thụ tia UV của Carbaryl, Dimethoate trong dung dòch
Tiến hành quét phổ dung dòch Carbaryl - 55%Acetonitrile:45%nước ở nồng độ 10ppm,
dung dòch Dimethoate - 55%Acetonitrile:45%nước nồng độ 10ppm. Sử dụng cuvet thạch anh và
quy trình quét phổ tự động trong vùng bước sóng từ 190 nm đến 400 nm.

2.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần pha động
Phân tích Carbaryl trong các mẫu chuẩn với sự thay đổi thành phần pha động
Acetonitrile-nước theo các tỷ lệ thể tích 85/15, 70/30, 55/45, 40/60. Tốc độ dòng giữ cố đònh

1mL/phút. Thể tích bơm mẫu 20µL. Đầu dò UV hoạt động ở bước sóng 220nm. Mỗi mẫu chuẩn
đo 3 lần, lấy giá trò trung bình của thời gian lưu và diện tích peak..
Tiến hành tương tự với các mẫu chuẩn Dimethoate. Tốc độ dòng giữ cố đònh 1mL/phút.
Thể tích bơm mẫu 20µL. Đầu dò UV hoạt động ở bước sóng 204nm.
So sánh diện tích peak, thời gian lưu, hình dạng sắc ký đồ thu được ở các hệ pha động
khác nhau từ đó lựa chọn tỷ lệ pha động tối ưu.

2.3.3. Xây dựng đường chuẩn xác đònh hàm lượng Carbaryl, Dimethoate trong dung
dòch
Đường chuẩn xác đònh hàm lượng Carbaryl trong dung dòch:
Pha chuẩn gốc: cân 0.05g carbaryl, hoà tan và đònh mức 50mL bằng acetonitrile, thu
được dung dòch gốc có nồng độ 1000ppm.
23
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
Pha loãng dung dòch gốc thành các nồng độ mong muốn (1, 2, 5, 10, 20) bằng nước
cất:

Thể tích dung dòch rút
ra, mL
Bình đònh mức sử
dụng, mL
Nồng độ dung dòch thu
được, ppm
1
1
50
100
20
10
Từ dung dòch carbaryl 10ppm:

Thể tích dung dòch rút
ra, mL
Bình đònh mức sử
dụng, mL
Nồng độ dung dòch thu
được, ppm
5
5
1
10
25
10
5
2
1
Điều kiện vận hành HPLC:
Hệ pha động chạy sắc ký: 55%Acetonitrile-45%nước (sử dụng Acetonitrile HPLC, nước
cất 2 lần).
Tốc độ dòng: 1 ml/phút.
Đầu dò UV-VIS: bước sóng 220 nm.
Thể tích tiêm mẫu: 20 µl/mẫu.
Mỗi mẫu chuẩn được đo 3 lần, lấy giá trò trung bình của diện tích peak và thời gian lưu.
Phương trình biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích peak vào nồng độ chính là phương
trình đường chuẩn.
Đường chuẩn xác đònh hàm lượng Dimethoate trong dung dòch:
Pha chuẩn gốc: cân 0.05g Dimethoate, hoà tan và đònh mức 50mL bằng Acetonitrile, thu
được dung dòch gốc có nồng độ 1000ppm.
Pha loãng dung dòch gốc thành các nồng độ mong muốn (1, 2, 5, 10, 20) bằng pha động
chạy HPLC:
Thể tích dung dòch rút

ra, mL
Bình đònh mức sử
dụng, mL
Nồng độ dung dòch thu
được, ppm
1
1
50
100
20
10
Từ dung dòch dimethoate 10ppm:
24
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
Thể tích dung dòch rút
ra, mL
Bình đònh mức sử
dụng, mL
Nồng độ dung dòch thu
được, ppm
5
5
1
10
25
10
5
2
1
Điều kiện vận hành HPLC:

Hệ pha động chạy sắc: dung dòch 55%acetonitrile-45%nước (sử dụng Acetonitrile
HPLC, nước cất 2 lần dùng cho phân tích).
Tốc độ dòng giữ cố đònh 1mL/phút.
Thể tích bơm mẫu 20µL.
Đầu dò UV hoạt động ở bước sóng 204nm.
Mỗi mẫu chuẩn được đo 3 lần, lấy giá trò trung bình của diện tích peak và thời gian
lưu.

2.3.4. Nghiên cứu độ thu hồi mẫu qua cột của Carbaryl, Dimethoate
Sử dụng các mẫu chuẩn Carbaryl, Dimethoate nồng độ 1-20ppm.
Ở chế độ qua cột: mỗi nồng độ phân tích 3 lần lấy giá trò trung bình diện tích peak.
Ở chế độ không qua cột (mẫu được pha động dẫn thẳng đến đầu dò không qua cột
phân tích): sau khoảng 1 phút, ta lại bơm 20 µL mẫu vào, sau 5 – 6 phút thì dừng (các lần bơm
từ lần 2 trở đi không nhấn phím START). Tính giá trò trung bình của diện tích peak.
Tỷ số diện tích peak của mẫu qua cột và mẫu không qua cột ở cùng nồng độ cho ta độ
thu hồi mẫu qua cột

100(%)
×=
kqc
qc
S
S
H
Trong đó:
S
qc
– diện tích peak của mẫu qua cột.
S
kqc

– diện tích peak của mẫu không qua cột.
2.4. KHẢO SÁT QUY TRÌNH XỬ LÝ VÀ PHÂN TÍCH HÀM LƯƠNG CARBARYL,
DIMETHOATE TRONG CẢI XANH
2.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của số bậc trích ly lên hàm lượng Carbaryl, Dimethoate
Sử dụng mẫu 25ml Carbaryl 20ppm trong nước cất, tiến hành trích ly như đối với rau
đến bậc 3 theo sơ đồ:
25