bài giảng thực hành sinh học phân tử

Bài 1: MỘT SỐ KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG SHPT
Ngoài một số dụng cụ thường dùng cho tác thao tác vi sinh và hóa sinh, trong kỹ
thuật sinh học phân tử người ta còn sử dụng một số dụng cụ đặc trưng sau:
1. Sử dụng thiết bò:
Qui đònh chung:
• Không sử dụng bất kỳ một thiết bò nào khi chưa được hướng dẫn sử dụng. Chỉ khởi
động những thiết bò nào sắp sử dụng dưới sự hướng dẫn của ngưới trực tiếp quản lý
phòng thí nghiệm.
• Bao găng tay, khẩu trang, tóc cột cao (đối với những người tóc dài) để trách làm
nhiễm mẫu.
• Báo cáo ngay với người quản lý phòng thí nghiệm nếu phát hiện thiết bò nào hư
hỏng hoặc gặp sự cố khi vận hành. Đảm bảo các thí bò hoạt động trong tình trạng
tốt nhất.
• Lau chùi ngay các thiết bò khi sử dụng xong, nhất là trong trường hợp vương vãi
dung dòch hay hoá chất nào đó lên thiết bò.
2. Một số thiết bò thông dung trong SHPT
2.1 Micropipette(pipet man)
• Kiểm tra tình trạng hoạt động của pipetman
• Chỉnh về thể tích cần sử dụng. Thao tác xoắn vặn nútnê nnhẹ nhàng, trách
vặn quá nhanh hoặc vặn đi vặn lại nhiều lần làm hỏng răng của các
pipette.
• Chọn đầu típ thích hợp cho từng loại pipette:
Cỡ nhỏ: 1 - 10µl
Cỡ trung bình nhỏ: 10 - 100µl
Cỡ lớn: 100 - 1000µl
• Các đầu típ chỉ sử dụng một lần, sau đó phải được rữa sạch và hấp khử
trùng trở lại .
• n nhẹ nút vặ nđể đuổi hết không khí, cho đầu típ vào dung dòch và thả từ
từ để hút đúng lượng thể tích cần dùng.
2.2 ng eppendorf:
• Là ống bằng nhựa polyethylene hoặc polypropylene chứa thể tích nhỏ từ

0,2 – 2 ml. các eppendorf có thể được khử trùng ở điều kiện thông thường
(1atm, 120oC, 20 phút), chòu được nhiệt độ thấp -20 oC và các dung môi
hữu cơ như chloroform….
• Đánh số cẩn thận các ống cần sử dụng lên nền nhám của ống.
• Sau khi cho dung dòch vào ống, kiểm tra và đậy kín. Lau chùi sạch những
vết hoá chất dính bên ngoài ống.
2.3 Máy ly tâm
• Máy ly tâm phải luôn được vệ sinh sạch sẽ và giữ trong điều kiện khô ráo.
• Khi ly tâm phải cân bằng các ống ly tâm và đặt theo kiểu đối xứng nhau
từng cặp một hoặc chia đều trong rotor.
• Thể tích ống ly tâm thường chiếm ¾ thể tích của ống ly tâm. Không ly tâm
dung dòch quá mức cho phép.
- 1 -
• Chỉnh tốc độ quay, thời gian ly tâm. Đối với máy ly tâm lạnh thì cần phải
chỉnh thêm nhiệt độ về các thông số cần dùng.
• Xoắn nắp thật chặt trước khi ly tâm. Máy được khở động trong tình trạng
êm nhẹ, nếu máy rung mạnh là do thể tích trong ống không đều, cần điều
chỉnh lại thể tích trong các ống.
• Lau sạch ngay khi phát hiện có hoá chất và dung dòch vương vãi lên máy.
3. Nguyên tắc khi pha hoá chất.
3.1 Nguyên tắc chung
• Hóa chất được pha chế trong tủ hút.
• Đeo găng tay, khẩu trang khi pha chế các dung dòch chất độc tiềm năng như
acrylamide (độc dược thần kinh), ethidibromua (chất gây ung thư) hoặc các
cấht gây bỏng nặng như phenol, acid – base đđ….
• Dung dòch hóa chất nào nhiễm bẩn, cần thiết phải qua lọc bằng phin lọc với
đường kính lỗ lọc từ 0,2 – 0,45 µm.
• Thông thạo cách thức pha các hóa chất theo các nồng độ:
• Nồng độ mole
• Nồng độ %

• Pha loãng dung dòch từ dung dòch mẹ .
• Pha chế dung dòch từ các dd gốc:EDTA (Ethylenediamintetraacetic acid)
0.5M, TE (tris – EDTA), SDS (sodium dodecyl sulfate)…
3.2 Các bước pha chế dung dòch
• Chuẩn bò lọ đựng sạch, dán nhãn rõ ràng.
• Cân hóa chất đúng theo lượng cần dùng. Cho vào cốc thuỷ tinh với một ít
nước cất 2 lần và thanh khuấy từ. Đợi đến khi chất rắn tan hoàn toàn hoặc
các pha trộn lẫn đều vào nhau thành một pha duy nhất.
• Bổ sung nước cất cho đến thể tích xác đònh cuối cùng.
• Trường hợp cần agar hoặc agarose thì các chất đó được cân trực tiếp trong
cốc dùng cuối cùng.
• Chỉnh pH về điểm cần thiết (nếu có)
• Khử trùng dung dòch (nếu có)
• Kiểm tra độ trong, tạp chất và độ nhiễm lần cuối trứơc khi cho vào lọ vô
trùng để bảo quản hay sử dụng. Các dung dòch đệm và dung dòch chế phẩm
sinh học cần được bảo quản trong điều kiện lạnh và thời gian ngắn.
3.3 Cơ đặc dung dịch
• Các dung dịch DNA và ARN được cơ đặc với ethanol như sau:
• Đo thể tích dung dịch DNA và điều chỉnh theo nồng độ cation đơn giản trị.
Nồng độ cuối cùng phải là 2 – 2,5 M đối với amoni acetate; 0,3 M đối với
natri acetate; 0,2 M đối với natrichlorua và 0,8 M đối với lithichlorua.
• Ion được sử dụng thường phụ thuộc vào thể tích DNA và các ử lý tiếp theo;
như ta có thể dùng natri acetate ức chế phâ nđọan Klenow, ion amoni ức chế
T4 polynucleotide kinase và ion chlorua ức chế DNA polymerase phụ thuộc
Rnase.
• Bổ sung MgCl2 vào với nồnf độ cuố icùng 10mM giúp tủa các phân đoạn
DNA nhỏ và các oligonucleotide. Tiếp theo bổ sung các cation đơn hóa trị, 2 –
- 2 -
2,5 thể tích ethanol được bổ sung, hòa trộn đều và bảo quản lạnh hơặc -20
o

C
trong 20 phút tới 1 giờ.
• Ly tâm 10 phút để thu DNA trong máy ly tâm bàn ở nhiệt độ phòng. Gạn bỏ từ
từ dịch nổi đi để sao cho tủa DNA khơng văng ra (thường khơng thể nhìn thấy
tủa).
• Để loại muối ra, rửa tủa với 0,5 – 1,0 ml 70% EtOH, ly tâm lại lần nữa, gạn
bỏ dịch nổi và làm khơ tủa. amoni acetate rất dễ hòa tan trong ethanol và được
loại bỏ rất dễ dàng khi rửa với 70% EtOH. Khó loại bỏ natri acetate và natri
chlorua hơn.
• Để làm khơ nhanh, ly tâm ngắ ntủa trong má ycơ chân khơng. Tuy nhiên
khơng nên áp dụng phương pháp cho các dịch DNA bởi vì nếu DNA q khơ
thì rất khó hòa lại và cũng có xu hướng biến tính các phân đoạn DNA nhỏ.
• Isopropanol cũng được dùng để tủa DNA nhưng có xu hướng tủa cùng với
muối và khó bay hơi hơn. Tuy ít khi dùng để tủa DNA hơn ethanol nhưng
thỉnh thoảng isopropanol vẫn được dùng để giữ tối thiểu các thể tích, ví dụ
tinh sạch plasmid với số lượng lớn.
3.4 Bảo quản chế phẩm sinh học
• Các chế phẩm DNA hoặc RNA phải được bảo quản trong chế độ rất
nghiêm ngặt.
• Dung dòch ethanol có thể gây hỏng AND nếu có mặt ion kim loại nặng.
• Da người có Nuclease nên không tiếp xúc trực tiếp với mẫu bằng da trần.
Các Rnase thường rất bền ngay cả khi đã được rữa sạch và khử trùng chúng
vẫn còn bám lại trên bề mặt của các chai lọ.
• 5
o
C là nhiệt độ cần thiết để bảo quản các sinh phẩm.
• -20
o
C có thể làm gẩy các DNA.
• -70

o
C là nhiệt độ dùng để bảo quản lâu dài các chế phẩm với điều kiện
trong môi trừơng có nồng độ muối hơn 1M, có mặt của EDTA (hơn 10mM)
ở pH = 8,5: hoặc bảo quản trong dòch nổi CsCl với EtBr trong tối ở 5
o
C.

- 3 -
BÀI 2 TÁCH CHIẾT DNA TỪ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
1. Nguyên tắc:
Việc thu nhận DNA từ tế bào gan động vật được tiến hành theo 2 bước:
• Bước 1: Cô lập nhân chứa DNA.
Người ta thường chọn tế bào mô gan làm vật liệu thu nhận DNA vì tế bào gan
tương đối đồng nhất về kích thước, thích hợp cho việc phân đoạn bằng kỹ thuật ly tâm.
Tế bào được phá vỡ bằng phương pháp hoá học, cơ học hay sóng siêu âm…, trong điều
kiện có dung dòch sinh lý thích hợp và nhân (chứa DNA) đựơc thu nhận dựa vào sự
khác nhau về khối lượng của chúng.
• Bước 2: Tách chiết DNA
Tiến hành loại bỏ các tạp chất dựa trên tính hoà tan khác nhau của chúng đối
với các dung môi hữu cơ. Các tác nhân thường dùng như:
 Phenol: chất làm biến tính mạnh protein và không hòa tan acid
nucleic.
 Chloroform: đi kèm với phenol, cũng có tác dụng biến tính
protein dù yếu hơn phenol và đồng thời loại bỏ hoàn toàn vết
phenol.
 Isoamyalcohol: Làm giảm bọt, ổn đònh hai pha nước và
chloroform sau ly tâm.
 Isobutanol: có tác dụng tách các phân tử hữu cơ như ethidium
bromide và làm đậm đặc dung dòch nucleic acid.
Để thu được tủa DNA tinh sạch từ dòch chiết trên, có thể tiến hành tủa bằng các

dung môi hữu cơ dễ bay hơi (ethanol ở nồng độ muối cao trong nhiệt độ lạnh hoặc
isopropanol không cần muối) kết hợp với ly tâm.
Tủa DNA được hoà tan trong dung dòch TE và bảo quản ở điều kiện nhiệt độ
thấp.
2. Nguyên liệu – hóa chất.
• Gan bò
• Dung dòch hỗn hợp 1: saccharose 0,2M + CaCl
2
0,001M, KCl 0,1M) Giữ
lạnh.
• Dung dịch hỗn hợp 2: saccharose 0,4M + CaCl
2
0,001M, KCl 0,1M) Giữ
lạnh.
• Dung dịch EDTA 0,1 M – NaCl 0,15M pH8.
• Triton X – 100
• Dung dỊch SDS 10%.
• Chloroform : isomylalhohol (24:1)
• Dung dịch TE (Tris 0,1M - EDTA 0,001M)
• Ethanol tuyệt đối .
3. Dụng cụ - thiết bị
- 4 -
• Micropipette 200µl, 1000µl và các tip tương ứng.
• Eppendorf 1,5 ml, 2ml.
• Que thủy tinh uốn cong, ống nghiệm thủy tinh.
• Cốc đựng đá, cốc đựng tip và dung dịch thải.
• Vải lược và dao cắt.
• Máy nghiền và máy ly tâm.
4. Phương pháp tiến hành.
• Bước 1: cô lập nhân .

Thu nhận dịch đồng nhất
Cắt 30 g thành từng miếng nhỏ, hco vào bình chứa giữa trong đá. Phá màng tế bào
bằng phương pháp cơ học nghiền các miếng gan bằng máy xay trong 70 ml dung dịch S1
lạnh trong 2 phút. Trong lúc nghiền, bình chứa vẫn được giữ lạn htrong đá. Sau đó, dịch
nghiền được lọc qua vải lọc, phần dịch đồng nhất được thu nhận lại trong bình chứa sạch,
cũng được giữ trong đá.
- Thu nhận phân đọan nhân
Tiến hành ly tâm 1 nhằm loại bỏ trong phần dịch nổi những bào quan nhỏ và nhẹ
như ti thể, không bào… Trong lần ly tâm 2, còn gọi là ly tâm trên đệm saccharose, chỉ có
nhân - bào quan có tỉ trọng cao nhất là có thể di chuyển xuyên qua lớp đệm saccharose
đậm đặc để lắng xuống đáy ống ly tâm trong thời gian và lực ly tâm đã tính toán.
Các chất tẩy (detergent) sử dụng gồm hai loại: Chất tẩy nhẹ (triton X 100) và chất
tẩy mạnh (SDS). Trước tiên, chất tẩy nhẹ phá vỡ màng hồng cầu; nêu không có công
đọan này thì hồng cầu sẽ cùng lắng với nhân trong lần ly t6am 2. sau khi đã thu nhận
phân đọan nhân mới dùng chất tẩy mạnh để phá màng nhân.
- Quy trình
Mỗi nhóm nhận 1 ml dung dịch đồng nhất trong ống eppendorf 2 ml(có ghi tên
tiểu nhóm).
Thêm 1 ml dung dịch S1, trộn đều bằng cách đảo ống.
Ly tâm 2000 vòng / phút trong 5 phút.
Hút dịch nổi bằng pipette pasteur.
Huyền phù hóa phẩn cặn trong 0,9 ml dung dịch S1 + triton X 100 1% bằng cách
dùng pipette pasteur hút và nhả trong khỏang 2 phút.
Cho 0,9 ml dd S2 vào một ống eppendorf 2 ml sạch.
Dùng pipette pasteur hút lớp cặn đã huyền phù nằm cho chảy chậm dọc theo
thành ống ống eppendorl sao cho lớp cặn huyền phù nằm trên lớp S2 tạo thành hai pha
không hòa lẫn nhau.
Ly tâm 2000v/p trong 5 phút.
Hút bỏ dịch nổi. Thu nhận phần cặn chứa phần lớn là nhân, đây là phân đọan nhân
tương đối thuần khiết.

• Bước 2: tách chiết DNA
Huyền phù hóa phân đọan nhân trong ,9 ml dung dịch EDTA – NaCl.
Thêm vào 45µl dung dịch SDS 10% để đạt nồng độ SDS cuối cùng là 0,5%.
Vortex 2 phút. Dung dịch trở nên nhớt do DNA được giải phóng ra môi trường.
Thêm 0,9ml chloroform: isoamylalcohol.
Vortex 5 phút cho đến khi được dịch huyền phù trắng.
Ly tâm 10.000v/ p trong 5 phút.
Thu nhận phần dịch nổi, chuyển qua một ống nghiệm sạch.
- 5 -
Thêm khỏang 1,8 ml ethanol tuỵêt đối lạnh. Khi thấy các sợi DNA trắng đụt xuất
hiện ở mặt phân cắt nước – ethanol thì dùng que thủy tinh đầu cong quấn lại, rút ra khỏi
dung dịch và để khô tự nhiên.
Nhúng đầu que có DNA vào một ống eppendorf 1,5ml có chứa 50µl dung dịch TE
và xoay đều trong khỏang 5 – 10 phút để hòa tan DNA. Giữ mẫu DNA trong tủ lạnh.
- 6 -
Bài 3: Xác định hàm lượng và độ tinh sạch của ADN bằng phương
pháp đo quang phổ hấp thụ
1. Nguyên tắc
1.1 Đo hàm lượng ADN
Tùy vào cấu trúc của mỗi chất mà chúng có một đỉnh hấp thụ nhất định. Đối với nucleic
acid, do sự tương tác giữa các proton và các electron của vòng purine và pyrimine mà nó có khả
năng hấp thụ lớn nhất ở bước sóng 260nm trong vùng tử ngoại và hấp thụ cực tiểu ở bước sóng từ
230nm-240nm và không hấp thụ ở vùng có bước sóng lớn hơn 310nm. Dựa vào tính chất này mà
người ta có thể xác định được hàm lượng các nucleic acid bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ
ở bước sóng 260nm.
Độ hấp thụ này còn phụ thuộc vào các nhân tố như là: pH, nhiệt độ, cường độ ion. độ hấp
thụ tăng lên khi ở trong môi trường acid hoặc kiềm. Trong thí nghiệm này pha loãng ADN trong
dung môi là nước và ở nhiệt độ phòng.
Công thức tính hàm lượng và độ tinh sạch của ADN.
Hàm lượng ADN (ng/µl) =50×HSPL×OD

260
(1)
Công thức (1) được áp dụng tính hàm lượng của ADN sợi đôi. Đối với ADN biến tính sợi đơn
hay ARN, oligonucleotid thì độ hấp thụ ở bước sóng 260nm tăng lên và được tính bởi công thức
sau:
Hàm Lượng ARN hay ADN sợi đơn (ng/µl) = 40× HSPL×OD
260
(2)
Hàm lượng oligonucleotid (ng/µl) = 20× HSPL×OD
260
(3)
Trong đó
HSPL : hệ số pha loãng
OD
260
: chỉ số đo được ở bước sóng 260nm
OD
280
: chỉ số đo được ở bước sóng 260nm
1.2 Đo độ tinh sạch của ADN
Trong mẫu ADN thường có lẫn phenol và protein. Những tạp chất này làm tăng độ
hấp thụ ở bước sóng 280nm vùng tử ngoại. Vì vậy độ tinh sạch của dung dịch nucleic acid
được đánh giá bằng tỉ lệ giữa độ hấp thụ ánh sáng ở hai bước sóng 260nm và 280nm.Được
tính bằng công thức sau:
Độ sạch nucleic acid = OD260/OD280 (4)
Nếu tỉ lệ này nằm trong khoảng 1,8 đến 2 thì dung dịch ADN được xem là tinh sạch.
Tỉ lệ này thấp hơn 1,8 chứng tỏ mẫu có lẫn tạp chất. Đối với dung dịch ADN sợi đôi, nếu tỉ
lệ quá lớn thì chứng tỏ ADN có chứa trong mẫu bị biến tính hay bị phân hủy.
1.3 Hiệu ứng siêu sắc (hyporchromic effect)
Hiệu ứng siêu sắc là độ hấp thụ ở bước sóng của ADN tăng lên khi ADN biến tính

tức là hai sợi đơn tách rời khỏi nhau. ADN không bền đối với nhiệt. Khi tăng nhiệt độ của
ADN lên quá nhiệt độ Tm (Điểm nóng chảy) thì mạch đôi sẽ tách ra do sự phá vỡ của các
liên kết Hidro. Nểu để nhiệt độ giảm từ từ thì hai sợi đơn lại bắt cặp với nhau nhưng chúng
không có khả năng bắt cặp lại khi làm lạnh đột ngột sau khi biến tính.
2. Dụng cụ và hóa chất
Mẫu ADN: mẫu được tách ra từ lá mía ở bài trước
Nước cất tuyệt trùng
Đá lạnh
- 7 -
Eppendorf 1.5ml
Micropipette 20, 200, 1000µl
Máy soi màu
Máy lắc Vortex
Bếp
3. Các bước thí nghiệm
Biến tính ADN
- Hút 5µl ADN mẫu cho vào 2 eppendorf loại 1.5ml. Chú ý trước khi hút mẫu cần phải
vortex để trộn đều mẫu.
1 Đun cách thủy mẫu ADN trong vòng 10 phút .
2 Làm lạnh đột ngột một ống bằng cách đặt trên đá đang tan trong 10 phút. Ống còn lại thì
làm nguội ở nhiệt độ phòng.
Chuẩn bị mẫu
- Pha loãng 100 lần mẫu ADN bằng nước cất tuyệt trùng (5µl ADN + 495µl nước cất tuyệt
trùng).
- Pipetting hoặc Vortex chộn đều dung dịch pha
Đo độ hấp thụ trên máy soi màu
1 Rửa sạch cuvet thạch anh rồi tráng bằng nước cất để khô ráo.
2 Nước cất tuyệt trùng (nước dùng pha loãng ADN) để làm chuẩn chuẩn chỉnh cân bằng máy.
3 Lắc đều dung dịch mẫu đo trước khi tiến hành đo mẫu.
4 Đo ở bước sóng 260nm và 280nm.

Kết quả
Kết quả đo OD260 và OD280 của các mẫu ADN
Bước sóng ADN không biến tính ADN biến tính ADN phục hồi sau biến tính
260nm
280nm

- 8 -
Bài 4 TÁCH CHIẾT TÒAN PHẦN RNA CỦA VI KHUẨN
1. Nguyên tắc:
Việc tách chiết RND cũng bao gồm các bước cơ bản như đối với DNA. Nhưng do RNA dễ
bị thủy giải bới Rnase, khó đảm bảo nguyên vẹn trong quá trình tách chiết nên trong thao tác cầ
ntuân thủ một số nguyên tắc chung.
Sử dụng các chất có khả năng biến tính mạnh protein như guanidium thiocyanate để ức chế
Rnase. Sử dụng nước đã qua xử lý với DEPC (Diethypyrocarbonate) để loại RNase.
Sử dụng phenol pH = 4 để ức chế Rnase, loại protein và DNA.
Thao tác trong điều kiện nghiêm ngặt tối đa: lạnh, mang găng tay, thao tác trong tủ cây vô
trùng.
Chất lượng của RNA tòan phẩn tách chiết sẽ được đánh giá sơ bộ qua điện di trên gel
agarose.
2. Vật liệu hóa chất
• Vi khuẩn Escherichia coli
• Trizol (phenol pH4, guanidium thiocyanate, glycerol, sodium acetate)
• Chloroform : isoamylacohol
• Isopropanol
• Ethanol 70%
• Nước đã xử lý với DEPC
3. Dụng cụ - thiết bị
• Pipetman 1000µl, 200µl, 10µl và các tip tương ứng
• Eppendorf 1,5µl
• Máy ly tâm

• Máy vortex
4. Quy trình:
• Mỗi nhóm được nhận 1 ống eppendorf 1,5ml chứa 100µl dung dịch vi khuẩn E.coli.
• Thêm vào 900µl dung dịch trizol + 200µl chloroform:isoamyalcohol, vortex kỹ trong
5 phút.
• Ly tâm 13.000v/p trong 10 phút.
• Thu dịch nổi có chứa RNA vào một ống eppendorf 1,5ml khác.
• Thêm một thêm tích isopropanol lạnh và để ở -20
0
C trong 1 giờ.
• Ly tâm với tốc độ 13.000v/p trong 10 phút. Lọai bỏ dịch nổi (hút từ từ phần nước
bên trên trách hút nhầm cặn RNA ở phía dưới).
• Thêm vào 1 ml ethanol 70%.
• Ly tâm ở tốc độ 13.000v/p trong 5 phút, lọai bỏ dịch nổi (thao tác giống ơ trên).
• Hòa cặn RNA trong 10µl H
2
O (đã qua xử lý DEPC), giữ ở nhiệt độ -20
o
C.

- 9 -
Bài 5 KỸ THUẬT ĐIỆN DI
1. Nguyên tắc
Người ta dùng kỹ thuật điện di để tách các phần tử ra khỏi hỗn hợp nào đó dựa trên cơ sở:
trong một điện trường, các phân tử nằm trong pha lỏng sẽ di chuyển với vận tốc tùy thuộc tỉ lệ giữa
điện tích và khối lượng của chúng. Nếu hai phân tử có cùng khối lượng, phân tử nào có điện tích
lớn hơn sẽ di chuyển về điện cực ngược dấu nhanh hơn.
Thông thường người ta dùng hai loại gel là gel agarose và gel polyacrylamid. Gel agarose
cho phép phân tách các phân tử ADN sợi đôi có kích thước từ 100 đến 10.000 cặp Nu. Còn gel
polyacrylamid cho phép phân tách các phân tử ADN sợi đơn có kích thước nhỏ dưới 500 nucleotid

và còn có thể tách riêng từng phân tử ADN có kích thước khác nhau một nucleotid. Tùy theo kích
thước đối tượng ADN muốn tách mà ta có thể pha gel với các nồng độ khác nhau.
Nồng độ Agarose Kích thước phân tử ADN cần phân li (bp)

0.6% 1000 - 20000
0.7% 800 - 10000
1% 500 - 7000
1,2% 400 - 6000
1,5% 200 - 3000
2,0% 100 - 2000
Gel polyacrylamide cho những lỗ nhỏ, thích hợp để phân tách những đọan DNA sợi đơn có
kích thước dưới 500 bp, hiệu quả phân tách có thể đạt 1 Nu. Sau khi phân tích điện di xong, tiến
hành nhuộm ethidium bromide. Chất này sẽ gắn xen vào giữa các base của phân tử DNA và phát
hùynh quang dưới tia tử ngọai. Điều này cho phép phát hiện vị trí các đọan DNA trên gel với việc
sử dụng thang mẫu DNA chuẩn(DNA LADDER). Các thang mẫu thường sử dụng như λ - Hind III
hay φX 174-Hae III.
Vật liệu – hóa chất
• DNA bộ gan động vật
• DNA plasmid pGEM3
• Thang DNA chuẩn λ-hind III
• Agarose
• Dung dịch điện di TAE 1X (pha lõang từ TAE 50X)
Đệm điện di TAE 1×
- Tris base 0,4M 44,8g
- Acetic acid 0,2M 11,4g
- EDTA 0,01M 20,0ml
Định mức đến 1000ml
• Dung dịch nạp mẫu 6X:
- Glycerol 30%
- Brommophenol Blue 0,25%

- Tris 200mM
- Na
2
EDTA 20mM
• Ethidium bromide (10mg/ml)
2. Dụng cụ - thiết bị
• Bộ nguồn và buồng điện di ngang:
Thiết bị gồm có các bộ phận chính sau:
- Nắp: là phần trên của thiết bị có thể tháo rời.
- 10 -
λHinIII digest
bp
23130
9416
6557
2322
2027
564
125
- Các dây dẫn: gồm hai dây dẫn màu đen và màu đỏ nối vào cực dương và cực âm của bộ điện
di với nguồn điện.
- Điện cực: cắm trong gel gồm hai điện cực dương (có màu đỏ), âm (có màu đen)
- Khuôn đổ gel: dùng để đổ gel chạy điện di. Khuôn gồm khay, giá đỡ, các miếng gạc hút bọt
và lược.
- Buồng điện di: dùng để chạy điện di, gồm buồng chạy điện di, điện cực, buồng làm lạnh.
Thang ADN (maker)
Khi điện di thì người ta thường điện di với thang ADN chuẩn hay
còn gọi là maker để dựa vào đó mà ta có thể xác định được mẫu
ADN đem đi điện di. Trong bài thí nghiệm này chúng ta sử dụng λ-
HinIII, các phân tử ADN của phase λ sau khi được cắt bởi enzyme

cắt hạn chế HinIII. Kích thước của các phần tử có trong thang được
biểu diễn ở hình bên.
• Pipetteman 10µl
• Eppendorf 1,5 ml; 2,0 ml
• Bàn đèn UV
• Lò viba
• Máy lắc ổn nhiệt.
3. Quy trình:
• Chuẩn bị gel agarose
- Cân 1g agarose vào 1 erlen 250ml (đối với gel agarose
1%)
- Thêm vào vừa đủ 100ml dung dịch TAE 1X.
- Làm tan agarose bằng cách đun trong lò viba. Bao miệng
hình tam giác bằng nilông rồi đun nóng trong lò viba 30
giây, lắc cho gel tan hoàn toàn. Nếu chưa tan hoàn toàn
thì lại làm tiếp như trên cho đến khi gel tan hoàn toàn.
Chú ý không để cho gel trào ra miệng bình ra ngoài vì gel agarose nóng chảy gây
bỏng rất nặng. Để nguội dung dịch agarose đến khỏang 50 - 55
o
C.
- Trong lúc chờ agarose nguội, chuẩn bị bản điện di.
- Đổ agarose lỏng vào bản điện di và lắp lược.
- Khi agarose đã đông đặc hoàn toàn, đặt bản điện di vào bồn điện di và tháo lược ra.
đổ đệm vào buồng điện di. Đổ cho đến khi mức dung dịch đệm cao hơn mặt bản gel
khoảng 1cm
• Chuẩn bị đặt mẫu:
- Trong một ống eppendorf 1,5ml, cho vào 10µl mẫu và 2µl dung dịch nạp mẫu, trộn
đều bằng pipetman.
- Dùng pipetman bơm mẫu và thang DNA chuẩn vào các giếng. thường người ta
không sử dụng 2 giếng ngoài cùng.

- Đậy nắp buồng điện di, cắm điện cực.
- Điện di với hiệu điện thế 90 – 120 V trong 30 phút.
• Nhuộm và hiển thị trên gel.
- Sau khi điện di xong, rút điện mở nắp và lấy bản gel ra.
- Cho bản gel vào chậu dung dịch nhuộm ethidium bromide ngâm trong vòng 30 phút.
Chú ý phải đeo bao tay khi tiếp xúc với ethidium bromide vì chất này gây ung thư.
- Vớt bảng gel ra và xem kết quả trên đèn máy chụp gel.
- 11 -
Bài 6: Ứng dụng PCR (Polymerase Chain Reaction) để phát hiện
chủng E. coli
1.Nguyên tắc
Phương pháp PCR thường được dùng để phát hiện các khuẩn mang mầm mống bệnh hay các
chủng vi sinh vật có trong môi trường. Đem nhân dòng bằng phương pháp PCR một gen đặc hiệu
của một chủng vi sinh vật nào đó, nếu đoạn gen đó được nhân lên thì chứng tỏ chủng vi sinh vật đó
có chứa trong mẫu cần kiểm tra. Ở đây chúng ta sử dụng đầu mồi của gen rnhA có trong chủng E.
Coli để kiểm tra sự hiện diện của chủng E.coli trong mẫu cần phân tích .
Một thí nghiệm để phát hiện khuẩn mang mầm mống bệnh gồm các bước sau:
- Tăng sinh: Tăng số lượng vi khuẩn có trong mẫu trước khi đem tiến hành nhân dòng bằng
cách nuôi cấy vi sinh vật trong dịch nuôi.
- Xử lí mẫu: Thu vi sinh vật sau khi nuôi cấy và phá bỏ màng tế bào để thu ADN
- Phản ứng PCR: nhân dòng bằng phương pháp PCR
- Phân tích sản phẩm sau khi nhân dòng bằng phương pháp điện di ADN
1.1 Nguyên tắc của phản ứng PCR
PCR là phương pháp khuếch đại tạo dòng trong ống nghiệm nhằm mục đích thu một lượng lớn
bản sao của một trình tự DNA xác định. Đầu tiên ADN đích ( target ADN) được làm biến tính để
tách mạch đôi thành mạch đơn(annealing) Nhiệt độ sau đó được hạ thấp cho phép mồi (primer) có
thể bắt cặp với sợi khuôn. Với sự có mặt của các dNTP, DNA polymerase và trong môi trường phản
ứng thích hợp đoạn mồisẽ được nối dài để tạo ra mạch ADN mới.Chu trình trên được lặp đi lặp lại
nhiều lần từ một lượng ADN nhỏ ta có thu được hàng triệu bản sao.
1.2 Mồi (primer)

Mồi là đoạn ADN ngắn khoảng trên dưới 20 nucleotid có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu
mạch khuôn ADN có mang một đầu 3'-OH tự do giúp ADN polymerase khởi đầu sự tổng hợp một
chuỗi mạch mới. Khi cung cấp hai mồi chuyên biệt: mồi xuôi (sens primer) và mồi ngược (antisens
primer) để bắt cặp bổ xung với hai đầu của một trình tự ADN thì sau nhiều chu kì thì ta thu được
sản phẩm chủ yếu là đoạn ADN nằm giữa hai mồi. Kết quả phản ứng PCR phụ thuộc nhiều vào
đoạn mồi được thiết kế.
Mồi thiết kế phải tuân thủ theo các nguyên tắc sau:
- Mồi thường khoảng trên dưới 20 nucleotid và có lượng GC vào khoảng 50-60%.
- Tm của mồi xuôi và ngược không khác nhau quá xa.
- Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự ADN cần khuếch đại, không trùng với trình tự lặp
lại trên gen.
- Trình tự của mồi được chọn sao cho không thể có sự bắt cặp bổ xung giữa mồi xuôi và mồi
ngược và cũng không có những cẩu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp bổ xung giữa các phần khác
nhau của một mồi.
Muốn thực hiện được phản ứng PCR thì nhiệt độ annealing phải thấp hơn nhiệt độ Tm của mồi.
• Cách tính nhiệt độ Tm. Có nhiều cách tính nhưng ở đây người ta thường dùng cách tính
đơn giản sau:
Tm= 4(G+C) + 2(A+T) + 35 - 2n
- n: tổng số nucleotid
- G, C, A, T: tổng lượng các nucleotid G, C, T, A
Cách tính này đúng với các đoạn mồi từ 16 đến 35 nucleotid
1.3 Tag polymerase
Được chiết tách từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquticus sống ở suối nước nóng. Enzyme Tag
Polymerase không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính của các acid nucleotid và có khả năng xúc tác
phản ứng tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình.
- 12 -
2. Hóa chất và dụng cụ
2.1 Hỗn hợp Primer
Nồng độ 2.5 pmol/µl
Nhân dòng đoạn ADN dài 967bp có chứa gen rnhA

Trình tự Nucleotid:
5'-CCATGTACGCCAAAGAATTCCGGAT-3'
3'- CTCTCTTTGTTGAATTTTGAAGTGC-5'

2.2 Hóa Chất
Hỗn hợp dùng trong phản ứng PCR
- Tag polymerase 0,025 U/µl (1,25U/50µl)
- Tris-HCl (pH 8.8 ) 75mM
- ( NH4)2SO4 20mM
- Tween 20 0,01%
- dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 200µM mỗi loại
- MgCl2 1,5mM
Các hóa chất dùng cho điện di ADN

2.3 Dụng cụ
Máy li tâm
Eppendorf 1.5ml, 0.2ml, 0.5ml
Micropipette 20, 200, 1000µl
Máy PCR
Máy điện di ngang80 -150V
Bộ nguồn điện di điện thế từ
Bộ chụp ảnh trên đèn UV
Tủ ấm
Máy lắc Vortex
3. Các bước thí nghiệm
3.1 Xử lí mẫu
- Dùng đầu tăm chấm và lấy coloni được nuôi cấy trong thạch nuôi rắn .Chú ý không để thạch
nuôi dính theo tăm vì trong gel có chứa các chất gây ảnh hưởng đến phản ứng PCR.
- Cho coloni lấy được ở trên vào Eppendorf có chứa 100µl nước cất tuyệt trùng.
- Đun sôi trong vòng 5 phút

- Tiến hành quay li tâm ở tốc độ10000rpm, trong vòng 5 phút, sau đó lấy phần nước dịch lỏng
có chứa ADN đem đi nhân dòng.
3.2 Phản ứng PCR
Thiết lập chương trình cho máy PCR
Step1. 94 độ 1min (Biến tính ADN)
Step2. 98 độ 20 sec (Tách ADN sợi đôi thành sợi đơn)
Step3. 60 độ 20 sec (Mồi bắt cặp với sợi khuôn)
Step4. 68 độ 1min (Phản ứng kéo dài)
Step5. lặp lại Step2 đến Step4 29 lần
Step6. 72 độ 10min ( Tổng hợp nốt các đoạn chưa được hoàn chỉnh)
Step7 4 độ ∞
Pha chế dung dịch phản ứng (Dung dịch phản ứng phải được pha chế trên đá)
- 13 -
- Hút 45µ l hỗn hợp phản ứng PCR vào trong ống eppendof 0.2ml. Sau đó cho 4µl dung dịch
hỗn hợp primer. Cuối cùng cho 2µl dung dịch mẫu đã được xử lí ở trên.
- Lắc nhè và quay li tâm cho dung dịch phản ứng chảy hết xuống đáy không còn bám trên
thánh ống ( Spin down)
- Đặt eppendof và máy PCR
- Khởi động chương trình (khoảng từ 1 đến 2 tiếng)
3.3 Điện di sản phẩm sau phản ứng-Điện di trên gel Agarose (0.8%)
- Gel pha trong dung dịch đệm điện di 0.5×TBE rồi đun nóng bằng lò vi sóng cho đến khi gel
được nóng chảy hoàn toàn.
- Trong khi để cho gel nguội đến 50 độ, tiến hành lắp dụng cụ điện di. Sau khi gel nguội đổ
gel vào khuôn gel có cắm lược và chờ cho gel đông tụ hoàn toàn.
- Sau khi gel đông tụ rút lược đổ đệm điện di ngập bản gel 1-2mm
- Pha 2µl ADN mẫu + (1µl thuốc nhuộm) + 7µl nước cất tuyệt trùng. Dùng pipetman tra hỗn
hợp mẫu và 2µl maker vào từng giếng gel.
- Chạy điện di với hiệu điện thế 80V trong vòng 30 phút.
- Nhuộm gel bằng dung dịch nhuộm trong vòng 30 phút.
- Soi gel trên đèn UV và chụp ảnh.

- 14 -