Nghiên cứu tổng hợp và thăm dò hoạt tính sinh học một số dẫn xuất của axit ursolic tách chiết từ cây sơn trà poilan (eriobotrya poilanei)

1

2

B GIÁO D C VÀ ĐÀO T O
Đ I H C ĐÀ N NG

Cơng trình đư c hồn thành t i
Đ I H C ĐÀ N NG

PHAN VĂN HÀ
Ngư i hư ng d n khoa h c: TS. NGUY N THANH TÂM
NGHIÊN C U T NG H P VÀ THĂM DỊ HO T TÍNH
SINH H C M T S

D N XU T C A AXIT URSOLIC

TÁCH CHI T T

CÂY SƠN TRÀ POILAN

(ERIOBOTRYA POILANEI)

Ph n bi n 1: GS.TS.NGND. ĐÀO HÙNG CƯ NG
Ph n bi n 2: GS.TSKH. NGUY N BIN

Chuyên ngành: Hóa H u cơ
Mã s : 60.44.27

Lu n văn ñư c b o v trư c H i ñ ng ch m Lu n văn t t
nghi p th c sĩ khoa h c h p t i Đ i h c Đà N ng vào ngày 26 tháng

8 năm 2011

TÓM T T LU N VĂN TH C SĨ KHOA H C

* Có th tìm hi u lu n văn t i:
- Trung tâm Thông tin- H c li u, Đ i h c Đà N ng
Đà N ng - Năm 2011

1

- Thư vi n trư ng Đ i h c Sư ph m, Đ i h c Đà N ng.

2


1

M

2
3. Đ i tư ng và ph m vi nghiên c u

Đ U

* Đ i tư ng nghiên c u

1. Lý do ch n ñ tài
Ngày nay, cùng v i s phát tri n m nh m c a xã h i loài
ngư i, các căn b nh nguy hi m như ung thư, viêm gan B...cũng gia
tăng m t cách đáng báo đ ng. Vi c tìm ki m các h p ch t có ho t

tính cao, các phương pháp ch a b nh m i ngày càng tr nên c n

-M u lá cây Sơn Trà Poilan.
-Các d n xu t amin, amit .
* Ph m vi nghiên c u

thi t. Nhi u h p ch t t nhiên có ho t tính đã đư c ng d ng vào

-Thu hái m u th c v t. Chi t tách, tinh ch axit ursolic.

th c t ñ s n xu t thu c phòng và ch a b nh. Đi u ch các d n xu t

-T ng h p các d n xu t m i t axit ursolic tách ñư c.

ñi t các ch t có ho t tính phân l p t ngu n th c v t v i hàm lư ng
l n là m t trong các con ñư ng hi u qu đ tìm ki m các ch t có ho t

-Th ho t tính sinh h c c a các ch t t ng h p ñư c.
4. Phương pháp nghiên c u

tính sinh h c cao và lý thú.
Axit ursolic là m t tritecpen t n t i khá ph bi n trong nhi u
loài th c v t khác nhau. Axit ursolic và các d n xu t có tác d ng h

5. Ý nghĩa khoa h c và th c ti n c a đ tài
Trong khn kh đ tài này, chúng tơi đã s d ng axit ursolic

tr ch a b nh ung thư, kháng viêm, kháng khu n, kháng HIV... và là

tách ñư c t cây Sơn Trà Poilan ñ ti n hành nghiên c u t ng h p

thành ph n chính trong m ph m đ phịng ng a và ch ng l i b nh

m t s d n xu t m i nh m tìm ki m các ch t có ho t tính lý thú, t

ung thư da t i Nh t B n.

đó có th tìm ra các thu c phịng và ch a b nh m i đ nâng cao s c

Khi nghiên c u thành ph n hóa h c cây Sơn Trà Poilan c a

kh e, cu c s ng c a con ngư i. Vì v y, k t qu c a ñ tài s có ý

Vi t Nam, chúng tơi đã phân l p ñư c axit ursolic v i hàm lư ng khá

nghĩa khoa h c và th c ti n.

cao (0.32% so v i m u khơ). Vì v y, đ t n d ng ngu n nguyên li u

6. C u trúc c a lu n văn

này và góp ph n tìm ki m nh ng d n xu t có ho t tính lý thú c a axit
ursolic, đ tài ñ nh hư ng t ng h p m t s d n xu t amin, amit vào
các nhóm th hydroxy

v trí C-3 và carboxyl

C-28.

Ph n m đ u g m 03 trang, k t lu n g m 01 trang và tài li u

tham kh o 09 trang. N i dung c a lu n văn chia làm 3 chương:
Chương 1: T ng quan- 35 trang.

2. M c đích c a ñ tài
-Nghiên c u t ng h p các d n xu t amin, amit.
-Nghiên c u ho t tính sinh h c c a các ch t t ng h p ñư c .

1

Chương 2: Th c nghi m- 09 trang.
Chương 3: K t qu nghiên c u và th o lu n- 27 trang

2


3

4

CHƯƠNG 1

ph m, th o dư c và các loài th c v t khác như táo, húng qu , b c hà,

T NG QUAN

o i hương, m n...[43], [68].

1.1. CÁC H P CH T TRITECPEN
1.1.1. Khái ni m chung
1.1.2. M t s khung tritecpen chính

1.1.2.1. Tritecpen m ch th ng
1.1.2.2. Tritecpen khung dammaran
1.1.2.3. Tritecpen khung hopan
1.1.2.4. Tritecpen khung lupan
1.1.2.5. Tritecpen khung oleanan

Axit Ursolic 74

1.1.2.6. Tritecpen khung friedelan
1.1.2.7. Tritecpen khung taraxeran (friedooleanan)
1.1.3. Sinh t ng h p các tritecpen
1.1.4. Ho t tính sinh h c
1.1.4.1. Ho t tính ch ng ung thư và kh i u
1.1.4.2. Ho t tính ch ng vi rút và kháng khu n

Các nghiên c u dư c lý ñã ch ra r ng axit ursolic th hi n
ph ho t tính đa d ng như: kháng khu n, kháng n m, ch ng viêm
nhi m, b o v gan, ch ng l i các t bào ung thư và kh i u... Axit
ursolic có kh năng ngăn ch n và c ch s t o u ung thư
ño n khác nhau c a nhi u lo i ung thư như vú, gan, ru t.
Do t n t i nhi u trong t nhiên t nhi u ngu n khác nhau và

1.1.4.3. Ho t tính ch ng viêm
1.1.5. M t s

nghiên c u v t ng h p các d n xu t c a các

có nhi u ho t tính lý thú nên axit ursolic ñư c s d ng làm nguyên
li u ñ u ñ t ng h p nhi u d n xu t có ho t tính m i và m nh hơn.

tritecpen
1.2. T NG QUAN V

các giai

AXIT URSOLIC VÀ CÁC D N XU T

C A NÓ

1.2.2. M t s

nghiên c u v t ng h p các d n xu t c a axit

ursolic

1.2.1. Axit ursolic

T n t i r ng rãi trong t nhiên v i hàm lư ng khá cao, và có

Axit ursolic ( axit 3β-hydroxy-urs-12-en-28-oic, AU) (74)

nhi u ho t tính thú v , nhi u d n xu t m i c a axit ursolic có ho t

cịn đư c g i là urson, prunol, micro-merol..., là m t tritecpen khơng

tính lý thú hơn đã đư c t ng h p. S chuy n hóa các nhóm ch c

ñ c, ch t r n d ng b t, màu tr ng, có cơng th c phân t là C30H48O3

hydroxyl

và có th k t tinh trong c n tuy t đ i. Nó t n t i nhi u trong th c

dãy các d n xu t m i có ho t tính sinh h c lý thú hơn.

3

C-3 và nhóm cacboxyl

4

C-17 c a axit ursolic t o thành


5

6

Các s n ph m t ph n ng axetyl hóa c a nhóm hydroxyl và
amit hóa nhóm cacboxylic c a axit ursolic đ u có ho t tính sinh h c
cao hơn so v i axit ursolic. Hai h p ch t este hóa v i nhóm isopropyl
C17-COOH và nhóm succinyl

C3-OH c a axit ursolic cũng th

hi n ho t tính đ c t bào khá m nh đ i v i dòng t bào ung thư tuy n
ti n li t NTUB1

ngư i v i các giá tr IC50 là 7.97 µM và 8.65 µM

[62].
Nh ng bi n ñ i hóa h c

ngh Vi t Nam xác ñ nh tên khoa h c.
*Chi t m u th c v t và phân l p axit ursolic
M u lá (1800g) đư c s y khơ, nghi n nh và ngâm chi t 3
l n trong h n h p metanol:nư c (85:15)

nhi t đ phịng. Sau khi

c t lo i dung môi dư i áp su t gi m, d ch nư c cịn l i đư c chi t l n
lư t v i các dung môi n-hexan, etyl axetat, n-butanol. C t lo i dung

vòng A c a axit ursolic t o h liên

h p 1-en-2-cyano-3-one hay 1-en-2-trifluoro-3-one trong các d n
xu t ñ u cho th y kh năng c ch khá m nh s sinh trư ng c a 4
dòng t bào ung thư: KU7, 253JB-V (ung thư bàng quang) và Panc-1
và Panc-28 (ung thư tuy n t y) [18]. Hay d n xu t m i 5β-(1-methyl2-ethyl)-10α-(3-aminopropy-l)des-A-urs-12-en-28-oic acid th hi n
ho t tính đ c t bào đ i v i dịng t bào ung thư tuy n ti n li t
NRP.152 v i n ng ñ

– Vi n Sinh thái và Tài nguyên Sinh v t – Vi n Khoa h c và Cơng

mơi dư i áp su t gi m thu đư c các c n d ch chi t tương ng v i
kh i lư ng là 12, 110 và 130g.
50 g d ch chi t EtOAc ñư c ñưa lên c t silicagel, gi i h p
b ng h n h p n-hexan: EtOAc v i t l EtOAc tăng t 50 đ n 100%,
sau đó b ng h n h p EtOAc:MeOH v i t l MeOH tăng t 0 ñ n
50% thu ñư c 20 phân ño n.

c ch là IC50=3.3µM [22]. S bi n đ i hóa

Các phân ño n 1- 10 xu t hi n k t t a b t màu tr ng, chúng

h c k t h p trên c vòng A và vòng C c a axit ursolic t o h p ch t

tơi đã l c hút, l y ph n ch t r n và r a nhi u l n v i n-hexan, thu

bis-enone có kh năng c ch s hình thành nitric oxit (NO) v i n ng

đư c 11,7g b t, ký hi u là EPE1, cho m t v t trong b n m ng phân

đ

tích, nhưng là m t h n h p ch a 2 ch t chính trong ph

c ch tương ng IC50=5.1 µM [55].
CHƯƠNG 2

1

H-NMR. Vì

v y đ tăng kh năng phân tách c a h n h p này chúng tơi đã ti n
hành ph n ng axetyl hóa EPE1. Tinh ch s n ph m axetyl hóa b ng

TH C NGHI M
2.1. CHI T TÁCH AXIT URSOLIC

c t silicagel v i h dung mơi n-hexan: EtOAc = 92:8 thu đư c hai
ch t axit 3β-axetyl ursolic và axit 3β-axetyl pomolic . Th y phân
s n ph m axit 3β-axetyl ursolic v i NaOH 4N thu ñ

* M u th c v t

ursolic (hàm lư ng 0.32% so v i m u khơ) (Hình 2.1).
M u lá cây Sơn Trà Poilan t i r ng qu c gia Bì Dúp, Núi Bà
thu c t nh Lâm Đ ng vào tháng 3 năm 2009 và do TS. Đ Ti n Hi p

5

6

c 5,8 g axit


7

8

2.2. T NG H P CÁC D N XU T
Lá cây E. poilanei (1,8 kg)

V TRÍ C3-OH C A

AXIT URSOLIC.

1. Phơi khô, nghi n nh
2. Ngâm chi t trong MeOH : H2O (85:15)

to phịng

3. C t quay chân khơng, lo i metanol

D ch H2O
1. Thêm 250ml H2O
2. Chi t phân l p l n lư t v i n-hexan, EtOAc và n-butanol

D ch EtOAc

D ch n-hexan

D ch BuOH

D ch H2O cịn l i

C t lo i dung mơi
C n EtOAc
(50g)

SKC silicagel n-Hexan: EtOAc,lư ng
EtOAc 50-100% và EtOAc:MeOH,
lư ng MeOH 0 - 50%
thu ñư c 20 phân ño n(PD EPE1-

EPE20)

Phân ño n 1-10

Phân ño n 11

.......
.

Phân ño n 20

1. L c, hút ch t r n
2. Th c hi n ph n ng acetyl hóa h n
h p ch t r n thu ñư c
3. Th y phân axit 3β-acetyl ursolic
Axit ursolic 5.8 g (0.32% so v i m u khơ)

Hình 2.1: Sơ ñ chi t, tách axit ursolic t lá cây Sơn Trà Poilan

7

Hình 2.2: Sơ đ t ng h p các d n xu t 89, 90

nhóm C3-OH c a

axit ursolic
2.2.1. T ng h p ch t axit 3-oxo-urs-12-en-28-oic 87
100 mg CrO3 ( 1 mmol ) hòa trong 10 ml H2SO4 30% ñư c
nh d n vào h n h p 46 mg axit ursolic ( 0,1 mmol) hòa tan trong 10
ml axeton. H n h p ph n ng đư c khu y

8

nhi t đ phịng 1 gi .

9

10
áp su t gi m t i khơ thu đư c c n r n màu tr ng, c n này

C t lo i dung môi h u cơ dư i áp su t gi m r i chi t b ng EtOAc

h u cơ

(50 ml), pha h u cơ r a 2 l n v i nư c c t (20 ml + 20 ml) r i c t

ñư c làm s ch b ng c t silicagel h dung môi n-hexan: EtOAc= 4:1

lo i dư i áp su t gi m thu ñư c ch t r n, ñem tách trên c t silicagel

thu ñư c 27 mg s n ph m 89. Hi u su t: 83 %.

v i h dung mơi n-hexan: EtOAc= 7:1 thu đư c 30 mg ch t 87. Hi u
su t: 65 %.

H-NMR (CDCl3): δ 0.80 (3H, s, CH3), 0.86 (3H, d, J=6.3

1

Hz, CH3), 0.94 (3H, J=6.3 Hz, CH3), 1.02 (3H, s, CH3), 1.07 (3H, s,

H-NMR (CDCl3): δ 0.83 (3H, s, CH3), 0.86 (3H, d, J=6.5

CH3), 1.12 (3H, s, CH3), 2.18 (3H, s, -COCH3), 2.19 (1H, d, J=11.5

Hz, CH3). 0.96 (3H, d, J=6.0 Hz, CH3), 1.03 (3H, s, CH3), 1.06 (3H,

Hz, H-18), 2.30 (1H, m, H-2a), 2.93 (1H, m, H-2b), 5.25 (1H, m, H-

s, CH3), 1.09 (3H, s, CH3), 2.19 (1H, d, J=11.5 Hz, H-18), 2.36 (1H,

12).

1

m, H-2a), 2.51 (1H, m, H-2b), 5.25 (1H, m, H-12).

2.2.4. T ng h p ch t axit 3-hydrazono-urs-12-en-28-oic 90

2.2.2. T ng h p ch t axit 3-hydroxyimino-urs-12-en-28-oic 88
H n h p c a 46 mg (0,1 mmol) ch t oxo 87 và 1 ml

30 mg oxo 87 (0,066 mmol) và 0.1 ml hydrazin hòa trong 10
ml EtOH, h n h p ph n ng khu y

nhi t ñ 600C trong 3 gi . D ch

NH2OH.HCl 40% trong nư c đư c hịa tan vào 2 ml pyridine/methanol

ñư c ñ ngu i xu ng nhi t ñ phịng, sau đó c t lo i dung mơi và

60 C. Sau đó c t lo i dung mơi h u cơ

hydrazin dư i áp su t gi m, c n cịn l i đư c chi t ba l n b ng

dư i áp su t gi m, c n cịn l i đư c chi t ba l n b ng EtOAc, d ch chi t

EtOAc, d ch chi t ñư c g p l i r i r a v i nư c, làm khan b ng

ñư c g p l i r i r a v i nư c, làm khan b ng Na2SO4, l c d ch chi t. C t

Na2SO4, l c d ch chi t. C t lo i dung môi, c n ñư c tinh ch trên c t

lo i dung môi, ñem tách c n thu ñư c trên c t silicagel CH2Cl2: MeOH=

silicagel h dung môi nhexan: EtOAc= 3: 1 thu ñư c 20 mg ch t 89.

98: 2 thu ñư c 34 mg oxim 88. Hi u su t: 73 %.

Hi u su t: 65%

v i t l 1/1 ñư c ñun 4 gi

0

H-NMR (CDCl3): δ 0.82 (3H, s, CH3), 0.88 (3H, d, J=7.0 Hz,

H-NMR (CDCl3): δ 0.83 (3H, s, CH3), 0.86 (3H, d, J=6.0

1

1

CH3), 0.96 (3H, d, J=6.0 Hz, CH3), 1.02 (3H, s, CH3), 1.06 (3H, s, CH3),

Hz, CH3), 0.93 (3H, d, J=6.5 Hz, CH3), 0.98 (3H, s, CH3), 1.02 (3H,

1.07 (3H, s, CH3), 1.15 (3H, s, CH3), 2.22 (1H, d, J=11.5 Hz, H-18),

s, CH3), 1.08 (3H, s, CH3), 1.14 (3H, s, CH3), 2.10 (1H, m, H-2a),

2.26 (1H, m, H-2a), 3.04 (1H, m, H-2b), 5.26 (1H, t-like, H-12).

2.20 (1H, d, J=9.2 Hz, H-18), 2.48 (1H, m, H-2b), 5.26 (1H, t-like,

2.2.3. T ng h p axit 3-acetocyimino-urs-12-en-28-oic 89
0,1 ml anhidrit axetic ñư c nh vào dung d ch c a 30 mg
oxim 88 (0,064 mmol) trong 1 ml pyridine
h p ph n ng ñư c khu y

H-12);

C-NMR (CDCl3): δC 182.6 (-COOH), 161.25 (C=N-NH2),

13

138.1 (C-13), 125.64 (C-12).

nhi t đ phịng. H n

nhi t ñ này 2 gi r i c t lo i dung môi

9

10


11

2.3.T NG H P CÁC D N XU T

12

V TRÍ C17-COOH C A

AXIT URSOLIC

d n vào h n n p này, ph n ng khu y 12 gi

nhi t ñ phòng. Sau

khi ph n ng k t thúc 30 ml CH2Cl2 ñư c thêm vào, pha h u cơ ñư c
r a v i nư c (20 ml), làm khan b ng Na2SO4, c t lo i dung môi, c n

2.3.1. T ng h p ch t axit 3β-acetyl ursolic 91

thu ñư c ñem tách trên c t silicagel, h dung mơi n-hexan:EtOAc =

Hịa tan 46mg (0,1 mmol) axit ursolic 74 trong h n h p 2 ml
pyridin và 5 ml anhidrit axetic. H n h p ñư c khu y

6:1 thu ñư c 53 mg ch t 92. Hi u su t: 76%.

nhi t đ

phịng trong 14 gi . Sau đó c t lo i pyridin và anhidrit axetic dư dư i
áp su t gi m t i khi thu ñư c c n r n màu tr ng, c n này đư c hịa
tan trong 50 ml EtOAc, r a d ch chi t h u cơ b ng 10 ml dung d ch
HCl 5%, sau đó pha h u cơ r a 3 l n v i nư c. Làm khan b ng
Na2SO4, c t lo i dung mơi và c n đư c làm s ch b ng c t silicagel
v i h dung môi n-hexan: EtOAc = 10:1 thu ñu c 46 mg s n ph m
91. Hi u su t: 92%.
H-NMR (CDCl3): δ 0.77 (3H, s, CH3), 0.85 (3H, d, J=6.0

1

Hz, CH3), 0.86 (3H, s, CH3), 0.95 (3H, s, CH3), 0.96 (3H, s, CH3),
1.07 (3H, s, CH3), 1.25 (3H, s, CH3), 2.04 (3H, s, H3CCOO), 2.18
(1H, d, J=3.5 Hz, H-18), 4.50 (1H, m, H-3), 5.23 (1H, t, J=3.5 Hz, H12)
2.3.2. T ng h p Methyl N-(3β-acetoxy-urs-12-en-28-oyl]-11β
amino undecanoate 92
Hòa tan 49 mg axit 3β-acetyl ursolic 91 (0,1mmol) trong 3
ml CH2Cl2, oxalyl clorua (0.1) ml ñư c thêm vào. H n h p ñư c
khu y

nhi t đ phịng 48 gi . Sau đó c t lo i CH2Cl2 và oxalyl

clorua dư dư i áp su t gi m t i khi thu ñư c c n r n khơ, c n này
hịa tan trong 5 ml CH2Cl2 và 50 µl triethylamin. Dung d ch c a 22

Hình 2.3: Sơ đ t ng h p d n xu t amid 93, 94

mg NH2(CH2)10COOCH3 (0,1 mmol) trong 3 ml CH2Cl2 đư c nh

COOH c a axit ursolic

11

12

nhóm C17-


13

14

2.3.3. T ng h p d n xu t amit axit 93

h u cơ, làm khan b ng Na2SO4, c t lo i dung mơi, tách trên c t

Hịa tan 35 mg ch t 92 (0,05 mmol) vào h n h p 5 ml
THF/MeOH (1:1) r i dung d ch NaOH 4N (0,5 ml) ñư c nh vào
nhi t ñ phịng, ph n ng khu y ti p

nhi t đ này 15 gi . C t lo i

silicagel, h dung mơi n-hexan:EtOAc = 3:1 thu đư c 27 mg ch t 94.
Hi u su t: 45%.
H-NMR (CDCl3): δ 0.76 (3H, s, CH3), 0.85 (3H, d, J=6.0

1

dung môi h u cơ dư i áp su t gi m, c n còn l i đư c hịa tan trong

Hz, CH3), 0.86 (3H, d, J= 6.8 Hz, CH3), 0.89 (3H, s, CH3), 0.93 (6H,

nư c c t và trung hòa b ng HCl 2N ñ n pH=7, chi t b ng CH2Cl2 (50

s, CH3), 1.07 (3H, s, CH3), 2.03 (3H, s, -OCOCH3), 2.58 (4H, br s,

ml), d ch chi t ñư c r a v i nư c, làm khan b ng Na2SO4, l c d ch

NH2 và -CH2NH2), 2.95 (1H, m), 3.26 (1H, m) c a nhóm -

chi t, c t lo i dung môi, tinh ch s n ph m b ng c t silicagel, h

CONHCH2), 4.46 (1H, dd, J=5.5, 10 Hz, H-3), 5.28 (1H, br s, H-12),

dung môi n-hexan: EtOAc = 2:1 thu ñư c 30 mg ch t 93. Hi u su t:

5.86 (1H, br.s, -CONH).

95%.

CHƯƠNG 3
H-NMR (CDCl3): δ 0.78 (s, 3H, CH3), 0.87 (3H, d, J=6.5

1

K T QU VÀ TH O LU N

Hz, CH3), 0.93 (3H, d, J=7.0 Hz, CH3), 0.99 (3H, s, CH3), 1.07 (3H,

s, CH3), 1.26 (3H, s, CH3), 2.32 (2H, t, J= 7.5 Hz, -CH2-COOH), 3.02
(1H, br s), 3.22 (m, 1H) c a -CONH-CH2, 3.28 (m, 1H, H-3), 5.31

3.1. CHI T TÁCH AXIT URSOLIC
T d ch chi t t ng v i h n h p dung môi MeOH : H2O (85 :

(1H, br s, H-12), 5.93 (1H, br s, -CONH-).

15) c a lá cây Sơn Trà Poilan sau khi c t lo i dung môi dư i áp su t

2.3.4. T ng h p N-(3β-acetoxy-urs-12-en-28-oyl)-1,7-diaminohep-

gi m ñư c phân b l n lư t trong các dung môi n-hexan, EtOAc và

-tane 94

chi t EtOAc b ng s c ký c t trên silicagel, k t tinh v i các h dung

Hòa tan 49 mg axit 3β-acetyl ursolic 91 (0,1mmol) trong 3
ml CH2Cl2, oxalyl clorua 0,1 ml ñư c thêm vào. H n h p ñư c
khu y

BuOH. C t lo i dung môi thu ñư c các c n chi t tương ng. T c n

nhi t đ phịng 48 gi . Sau đó c t lo i CH2Cl2 và oxalyl

clorua dư dư i áp su t gi m t i khi thu ñư c c n r n khơ, c n này
hịa tan trong 5 ml CH2Cl2 . Dung d ch này ñư c nh vào h n h p
dung d ch c a 65 mg

NH2(CH2 )7NH2

triethylamin trong 3 ml CH2Cl2,
khu y ti p

(0,5 mmol) và 15 mg

nhi t đ phịng. Sau đó ñư c

nhi t ñ này 12 gi , khi ph n ng k t thúc 30 ml CH2Cl2

ñư c thêm vào, pha h u cơ ñư c r a v i nư c (20 ml), tách l y pha

13

mơi thích h p và các ph n ng axetyl hóa, ph n ng xà phịng hóa đã
phân l p đư c 5,8 g axit ursolic (hàm lư ng 0,32% so v i m u khơ)
(Hình 2.1). Các s li u ph

1

H-NMR và

13

C-NMR c a axit ursolic

tách ñư c phù h p v i tài li u đã cơng b .
3.2. NGHIÊN C U T NG H P CÁC D N XU T C A AXIT
URSOLIC

3.2.1. Ph n ng

nhóm C3-OH c a axit ursolic

3.2.1.1. T ng h p axit 3-acetocyimino-urs-12-en-28-oic 89

14


15

16

Ph n ng ñư c th c hi n theo sơ đ 2 ( hình 2.2)
•
Ph

Ch t 87, 88

1

H và 13C-NMR cho th y phân t ch t 87 có ch a m t

nhóm ketone (δC = 217.7), m t nhóm axit (δC = 184.1), m t n i đơi
d ng >C=CH- [δH = 5.25 (1H, t, J = 3.5), δC = 138.0 s; 125.6 d)
Trên ph

1

H và 13C-NMR cũng cho th y phân t ch t 88 có

m t nhóm axit (δC = 182.8), m t n i đơi d ng >C=CH- [δH = 5.25
(1H, t, J = 3.5), δC = 138.1 s; 125.6 d], ngồi ra tín hi u c a nhóm
ketone khơng cịn mà xu t hi n tín hi u c a nhóm >C=N

δC =167.6

S li u ph c ng hư ng t h t nhân 1H và 13C-NMR c a hai
ch t 87, 88 phù h p v i tài li u đã cơng b [7], [53].
•

Ch t 89
Khi so sánh s li u ph

1

H-NMR c a ch t 89 v i ch t 88

trong cùng h dung môi CDCl3, chúng tôi nh n th y tín hi u c a các
pic khơng có s thay đ i nhi u, ngồi s xu t hi n thêm pic
c a nhóm -COCH3 trên ph
Ph

δH 2.18

1

H-NMR c a 89.

IR cho th y các ñ nh h p th

1765 cm-1 (axit

carbonyl), 1692 cm-1 (>C=N) (hình 3.7)
Ph kh i ESI-MS cho pic ion phân t t i m/z = 512 [M + H]+.
K t h p các d li u ph h ng ngo i, ph kh i ESI-MS và
ph

H, 13C-NMR, chúng tôi k t lu n c u trúc c a d n xu t thu đư c

1

chính là cơng th c 89
Hình 3.7: Ph IR c a ch t 89

15

16


17

18

3.2.1.2. T ng h p axit 3-hydrazono-urs-12-en-28-oic 90
Khi cho oxo 87 tác d ng v i hydrazin trong EtOH

nhi t ñ

60 C trong 3h thu ñư c ch t hydrazono 90 v i hi u su t 65%.

0

•

Ch t 90
Ph IR c a nó cho đ nh h p th ñ c trưng c a nhóm NH2 t i

3458 cm-1 và nhóm carboxyl t i 1689 cm-1
Ph kh i va ch m electron ESI-MS cho pic ion phân t t i
m/z = 469 [M + H]+ .
Trên ph

13

C-NMR c a ch t 90, xu t hi n thêm pic

161.25 ppm c a nhóm C=N-NH2. So sánh ph

δ

1

H-NMR c a ch t 90

v i oxo 87, chúng tôi nh n th y 2 tín hi u c a H-2a và H-2b c a 90
d ch chuy n v phía trư ng cao kho ng 0.1 và 0.5 ppm là do nh
hư ng c a nhóm C=O

87 đã đư c thay th b i nhóm C=N-NH2

trong 90.
K t h p ph IR, ph kh i và ph

1

H và 13C-NMR cho th y

ch t thu ñư c phù h p v i c u trúc c a ch t 90. (hình 3.12)
3.2.2. Ph n ng

nhóm C17-COOH c a axit ursolic

3.2.2.1. T ng h p axit N-(3β -Hydroxy-urs-12-en-28-oy)]-11-amino
undecanoic 93
Ph n ng ñư c th c hi n theo sơ đ 3 (hình 2.3)
•

Ch t 91
Ch t 91 cho pic ion phân t

kh i ESI-MS. Ph

1

m/z = 497 [M - H]- trong ph

H và 13C-NMR cho th y 91 chính là s n ph m

17

Hình 3.12: Ph

1

H-NMR c a ch t 90

18


19

20

axetyl hóa c a axit ursolic, đư c th hi n qua các tín hi u c a m t
nhóm axit (δC = 183.97), m t nhóm metyl có g n v i oxy (δH = 4.50
m, δC = 80.97 d), m t n i đơi d ng >C=CH- [δH = 5.23 (1H, t, J =
3.5), δC = 137.99 s; 125.75 d], m t nhóm axetyl [δH = 2.04 (3H, s), δC
= 171.02, 21.18] và b y nhóm metyl.
•

Ch t 93
Ph IR cho th y các ñ nh h p th

3434 cm-1 (OH), 1710

cm-1 (carbonyl acid), 1630 cm-1 (amid carbonyl). Ph ESI-MS cho
pic ion phân t t i m/z = 663 [M + Na]+
Trên ph

1

H-NMR c a 93, xu t hi n tín hi u

nhóm -NH amit, và các tín hi u c a nhóm H-3
triplet c a -CH2- g n nhóm axit
singulet

δ 5.93 c a

δ 3.28 và pic d ng

2.32 ppm, khơng th y tín hi u

δ ≈ 4 ppm c a nhóm methyl ester và nhóm acetyl

δ≈2

ppm.
Ph

13

C-NMR cũng cho th y khơng có tín hi u c a nhóm

axetyl và nhóm metyleste .
K t h p ph h ng ngo i, ph kh i và ph c ng hư ng t h t
1

nhân H và

13

C-NMR chúng tôi nh n th y nhóm axetyl và nhóm

metyl este đ u b th y phân ñ t o thành ch t 93. (hình 3.16)
3.2.2.2. T ng h p các d n xu t N-(3β-acetoxy-urs-12-en-28-oyl)1,7-diaminoheptane 94

Hình 3.16: Ph IR c a ch t 93

Tương t như 92, ch t 94 ñư c t ng h p b ng ph n ng c a
axit 3-axetyl ursolic 91 sau khi ñã ñư c ho t hóa nhóm cacboxyl nh
oxalyl clorua v i 1,7-diaminoheptane trong CH2Cl2

nhi t đ phịng

•

Ch t 94
Trên ph

1

H-NMR c a ch t 94, xu t hi n nh ng pic

c a nhóm -NH amit, δ 2.95 và 3.26 c a 2 proton Ha, Hb c nh nhóm

(hình 2.3).

19

δ 5.86

20


21

amit

22

v trí C-28, 4.26 ppm c a H-3 và pic d ng br s c a NH2

2.58 ppm. So sánh ph

1

δ

1

H-NMR c a 94 v i H-NMR c a axit 3β-

3.3. NGHIÊN C U HO T TÍNH GÂY Đ C T
D N XU T T NG H P ĐƯ C

axetyl ursolic[3] và N-(3β-acetoxy-urs-12-en-28-oyl)-1,9-diaminnon-ane [53], chúng tôi k t lu n c u trúc ñ ngh phù h p v i 94.

BÀO CÁC

K t qu nghiên c u ho t tính gây ñ c t bào c a các d n xu t
t ng h p đư c trên 4 dịng ung thư

ngư i ñư c nêu

b ng dư i

ñây:
KB

: ung thư bi u mô

Hep-G2 : ung thư gan
Lu

: ung thư ph i

MCF7 : ung thư vú
Như trên b ng 3.2 ta th y, 3 ch t t ng h p ñư c 89, 90, và 93
ñ u có ho t tính đ i v i c 4 dịng t bào KB, Hep-G2, Lu và MCF7.
Trong đó, d n xu t 89 có kh năng c ch m nh hơn nhi u so v i
axit ursolic trên c 4 dòng t bào v i các giá tr IC50 tương ng là
4.32, 4.31, 5.44 và 3.43 µg/ml.
B ng 3.2: K t qu

th

ho t tính gây đ c t bào c a

ursolic acid và các d n xu t t ng h p ñư c

STT

Tên m u

K t qu : Giá tr IC50 (µg/ml) c a m u
µ
th trên
các dịng t bào
KB

1
2
Hình 3.20: Ph 1H-NMR c a ch t 94

21

B1-ch t
89
B2-ch t
90

HepG2

Lu

MCF7

4,32

4,31

5,44

3,43

23,23

46,05

123,07

55,36

22


23

3
4
Ch t
tham
kh o

A5-ch t
93
Axit
Ursolic
Ellipticin

24

11,60

17,90

17,56

14,44

10,23

11,75

12,23

8,0

0,621,25

0,621,25

0,621,25

0,621,25

K T LU N
1. Đã nghiên c u qui trình chi t tách hi u qu axít ursolic t
lá cây Sơn Trà thu hái t i r ng qu c gia Bì Dúp, Núi Bà thu c t nh

Lâm Đ ng v i hàm lư ng tương ñ i cao (0,32% so v i tr ng lư ng
lá khơ).
2. T axit ursolic tách đư c, đã t ng h p ñư c 4 d n xu t c a
nó là ch t 89, 90, 93 và 94, trong đó 3 ch t 89, 90, 93 là các h p ch t
m i, đ n nay chưa có tài li u nào công b .
3. C u trúc hóa h c các ch t s ch: axit ursolic và các ch t
t ng h p ñư c ñư c xác ñ nh b ng các phương pháp ph hi n ñ i
như ph h ng ngo i, ph kh i, và ph c ng hư ng t h t nhân.
4. K t qu th ho t tính gây ñ c t bào c a 3 ch t 89, 90 và
93 trên 4 dòng t bào ung thư Lu, KB, Hep-G2 và MCF7 cho th y c
3 d n xu t đ u có ho t tính trên 4 dịng t bào đem th , trong đó ch t
89 th hi n ho t tính cao nh t và cao hơn nhi u so v i axit ursolic.

23

24