Luận văn : PHÂN LẬP, KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌM HIỂU KHẢ NĂNG SINH ENZYME CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS ĐỂ SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC part 7 doc

 Môi trƣờng Clark lubs
Thành phần
g/l
Pepton bột
7 g
Glucose
5 g
KH
2
PO
4

5 g
Nước cất
1000 ml
pH
6,7 – 7,1

 Môi trƣờng lên men các loại đƣờng
Thành phần
g/l
Cao thịt
5 g
Pepton bột
10 g
Đường
10 g
Phenol red
0,01 g

Nước cất
1000 ml
pH
7,4
Hấp khử trùng ở 121
0
C/15 phút.
 Môi trƣờng Simons Citrate Agar
Thành phần
g/l
Sodium citrate
2 g
K
2
HPO
4

1 g
MgSO
4

0,2 g
Brothymol blue
0,08 g
NaCl
5 g
NH
4
H
2

PO
4

1 g
Agar
18 g
pH
6,9 ± 0,2



 Môi trƣờng khử Nitrate
Thành phần
g/l
Cao thịt
3 g
Pepton bột
5 g
NaNO
3

1 g
Agar
7 g
Nước cất
1000 ml
pH
7,0 ± 0,2

 Môi trƣờng Lòng đỏ trứng

Thành phần
g/l
Cao thịt
1 g
Pepton bột
10 g
Mannitol
10 g
NaCl
10 g
Phenol red
0,0025 g
Agar
15 g
Nước cất
1000 ml
pH
7,2 ± 0,2

Chia 225 ml môi trường vào bình tam giác. Khử trùng ở 121
0
C/15 phút.
Khi môi trường nguội đến 50
0
C thêm 12,5 ml dung dịch lòng đỏ trứng gà. Trộn đều
rồi đổ vào các đĩa petri vô trùng.
Cách pha dung dịch lòng đỏ trứng: rửa sạch trứng, sát trùng trứng bên
ngoài bằng cồn. Dùng kẹp đập trứng, bỏ phần lòng trắng, chuyển phần lòng đỏ vào
bucher có chứa 25 - 30 ml nước muối sinh lí vô trùng. Bảo quản dung dịch này ở
4

0
C để dùng.



 Môi trƣờng Rỉ đƣờng + 2% Tinh bột
Thành phần
g/l
KH
2
PO
4

20 g
K
2
HPO
4

20 g
MgSO
4

0,5 g
(NH)
4
SO
4

40 g

Nước cất
1000 ml
Tinh bột
20 g
pH
5 – 6

 Môi trường rỉ đường + 1% Tinh bột, môi trường rỉ đường 1% tinh bột + 0,5%
peptone tương tự như môi trường rỉ đường + 2% tinh bột, chỉ thay đổi tỉ lệ tinh
bột cho vào.
 Môi trƣờng TSB + 1% Tinh bột
Thành phần
g/l
Soy pepton
15 g
Tryptone peptone
5 g
NaCl
5 g
Nước cất
1000 ml
Tinh bột
10 g
pH
7,3 ± 0,2

 Hóa chất
Nước muối sinh lí 9%
o

NaCl 9 g
Nước cất 1000 ml
Dung dịch Iod 0,02N


Cân 2 g KI hòa tan trong 3 ml nước cất, lắc đều cho tan, them nước cất vào
cho đến 100 ml
Dung dịch tinh bột 0,1%
Tinh bột 0,1 g
Nước cất thêm đến 100 ml
Trộn tinh bột với khoảng 10 ml nước cất, thêm tiếp 80 ml nước cất đang sôi,
khuấy đều, để nguội, thêm nước cất đến 100 ml.
Dung dịch casein 0,1%
Casein 0,1 g
NaOH 0,1N 5 ml
Nước cất 25 ml
Đun cách thủy cho đến khi tan hoàn toàn. Làm lạnh dùng HCl 0,1N chỉnh
pH = 8. Thêm nước cất để đủ 100 ml.
Nước muối 0,1%
Cân 0,1 g muối NaCl hòa tan trong 100 ml nước cất.
Dung dịch acid acetic 1% trong ethanol
Acid acetic đặc 1 ml
Nước cất 49 ml
Ethanol 96% 50 ml
Hòa tan acid acetic đặc trong nước cất và ethanol.
 Phƣơng pháp nhuộm Gram
Các bước tiến hành :
Phết canh khuẩn lên miếng lam
Cố định mẫu bằng cách hơ qua ngọn đèn cồn
Đặt giấy lọc lên vết phết vi khuẩn

Nhuộm bằng crystal violet trong 2 phút
Rửa nước, thấm khô
Đặt giấy lọc lên vết phết vi khuẩn
Cố định màu bằng lugol trong 1 phút


Rửa nước, thấm khô
Tẩy cồn 96
0
khoảng 15 giây
Rửa nước, thấm khô
Đặt giấy lọc lên vết phết vi khuẩn
Nhuộm màu bằng dung dịch Fuchsine kiềm loãng
Rửa nước, thấm khô
Xem kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần (vật kính dầu)
 Thử các phản ứng sinh hóa
 Khả năng lên men đường
Chuẩn bị:
Môi trường đường: maltose, glucose, saccharose
Giống vi khuẩn Bacillus subtilis
Ống nghiệm, ống Durham
Cách làm: cho vào ống nghiệm đã có sẵn môi trường đường một ống
Durham hấp khử trùng ở 121
0
C/15 phút. Sau đó cấy vi khuẩn vào môi trường ủ ở
37
0
C/24 giờ. Quan sát sự đổi màu sinh hơi. Nếu vi khuẩn có khả năng lên men
đường, chuyển đường thành rượu, rượu lên men thành acid làm pH môi trường
giảm, sẽ chuyển màu môi trường.

Kết quả:
Phản ứng (-): môi trường có màu hồng đỏ
Phản ứng (+): môi trường có màu vàng
 Thử phản ứng Catalase
Chuẩn bị:
Dung dịch H
2
O
2
30%
Lame
Giống vi khuẩn Bacillus subtilis
Cách làm: dung piptte lấy một ít vi khuẩn, phết lên giữa lame kính sạch và
khô. Sau đó nhỏ giọt H
2
O
2
30% lên vết vi khuẩn. Đọc kết quả su khoảng 15 giây.



Kết quả:
Phản ứng (-): không có hiệ tượng sủi bọt
Phản ứng (+): có hiện tượng sủi bọt
 Thử phản ứng VP (Voges Proskauer)
Chuẩn bị:
Giống vi khuẩn Bacillus subtilis
Môi trường Clark lubs
α – naphtol 10%, NaOH 40%
Cách làm: cấy vi khuẩn vào môi trường Clark lubs, nuôi ở nhiệt độ

37
0
C/24 giờ. Sau đó nhỏ 3 – 5 giọt NaOH 40% và 3 – 5 giọt α – naphtol 10%. Sau
15 phút đọc kết quả.
Kết quả:
Phản ứng VP (-): môi trường có màu vàng
Phản ứng VP (+): môi trường có màu đỏ.
 Thử phản ứng MR (Methyl – Red)
Chuẩn bị:
Môi trường Clark lubs
Thuốc thử Methyl Red
Giống vi khuẩn Bacillus subtilis
Cách làm: Dùng que cấy vòng lấy vi khuẩn cấy vào môi trường Clark lubs,
nuôi ở nhiệt độ 37
0
C/24 giờ. Sau đó nhỏ 2 – 3 giọt thuốc thử Methyl Red vào canh
khuẩn và đọc kết quả.
Kết quả:
Phản ứng MR (-): môi trường có màu vàng
Phản ứng MR (+): môi trường có màu đỏ.
 Thử phản ứng khử Nitrate (NO3)
Chuẩn bị:
Môi trường Nitrate
Dung dịch thuốc thử Giess A, Giess B


Giống vi khuẩn Bacillus subtilis
Cách làm: Dùng que cấy thẳng lấy vi khuẩn cấy sâu vào môi trường thạch
nitrate, nuôi ở nhiệt độ 37
0

C/24 giờ. Sau 24 giờ nhỏ vào môi trường 2 – 3 giọt Giess
A, sau đó nhỏ tiếp 2 – 3 giọt Giess B.
Kết quả:
Phản ứng (-): môi trường có màu vàng
Phản ứng (+): môi trường có màu đỏ
 Thử khả năng sử dụng Citrate
Chuẩn bị:
Môi trường Citrate
Giống vi khuẩn Bacillus subtilis
Cách làm: cấy vi khuẩn vào môi trường Citrate. Nuôi ở nhiệt độ 37
0
C/24
giờ.
Kết quả:
Phản ứng (-): môi trường có màu xanh lá mạ non
Phản ứng (+): môi trường có màu xanh dương
 Các phƣơng pháp thực hiện
 Phương pháp kiểm tra hoạt tính amylase (Phương pháp Wolhgemuth)
Phương pháp này xác định lượng enzyme ít nhất có thể phân giải hoàn toàn
lượng tinh bột với chất chỉ thị màu Iodine.
Một đơn vị Wolhgemuth là lượng enzyme ít nhất mà sau 30 phút ở 30
0
C,
khi có ion clorine có thể phân giải 1 mg tinh bột đến các sản phẩm không tạo màu
với Iodine. Hoạt tính của enzyme được biểu diễn bằng số đơn vị Wolhgemuth trên
1 ml dịch môi trường hoặc 1 ml dung dịch chiết enzyme.
Thiết bị, vất liệu và hóa chất:
Bình tam giác hay bình cầu
Ống nghiệm
Máy ly tâm hay máy lọc

Pipette


Dung dịch enzyme: Nghiền cẩn thận môi trường thạch có chưa vi sinh
vật, cân 20 – 100 g cho vào bình tam giác hay bình cầu, thêm 500 – 1000 ml dung
dịch NaCl 1%, lắc liên tục từ 1 – 2 giờ trên mấy lắc ở nhiệt độ phòng. Lọc hoặc ly
tâm để thu được dịch chiết trong suốt. Nếu môi trường nuôi cấy là dịch thể chỉ cần
ly tâm tách sinh khối rồi sử dụng phần chất lỏng trong suốt thu được để phân tích.
Dung dịch tinh bột 0,1%
Dung dịch NaCl 0,1%
Dung dịch iod 0,02%
 Cách tiến hành:
Chuẩn bị 10 ống nghiệm, cho vào mỗi óng 1 ml dung dịch NaCl 0,1%.
Thêm vòa ống thứ nhất 1 ml enzyme ròi lắc đều, lấy 1 ml chuyển sang ống thứ hai
lại lắc đều và lấy 1 ml chuyển sang ống thứ ba… Cứ thế cho đến ống thứ 10, sau
cùng lấy 1 ml ở ống thứ 10 bỏ đi. Cho vào mỗi ống 2 ml dung dịch tinh bột 0,1%,
lắc đều, giữ ở 30
0
C trong 30 phút. Làm lạnh, cho vào mooyj giọt dung dịch Iodine
0,02 N. Ghi nhận ống có độ pha loãng lớn nhất mà không cho tạo màu với Iodine.
Ví dụ: Các ống từ 1 đến 4 không tạo màu, nhưng ống thứ 5 trở đi có màu
thì hoạt tính của enzyme trong 1 ml dung dịch enzyme là 16 x 2 = 32 đơn vị. Trong
đó 16 là độ pha loãng của dung dịch enzyme trong ống thứ tư, 2 là số mg tinh bột
trong mỗi ống nghiệm.

 Phương pháp kiểm tra hoạt tính protease (Phương pháp Gross và
Fluld)
Trong môi trường kiềm yếu, casein bị hòa tan nhưng khi thêm acid acetic
trong ethanol, casein bị kết tủa. Trái lại, các sản phẩm thủy phân của casein lại
không bị kết tủa trong điều kiện này. Phương pháp Gross và Fluld dựa trên cơ sở
xác định lượng enzyme ít nhất cần thiết để phân giải 2 mg casein đến mức không bị
kết tủa bởi acid acetic trong ethanol.
Một đơn vị hoạt động là lượng enzyme 1ml dung dịch nghiên cứu có khả
năng phân giải 1 mg casein ở 38
0
C trong thời gian 30 phút.
 Thiết bị, vật liệu và hóa chất
Bể điều nhiệt hay tủ ấm (38
0
C)
Máy lắc ống nghiệm (vortex mixer)
Ống nghiệm
Dung dịch casein 0,1%
Dung dịch acid acetic 1% trong ethanol
 Cách tiến hành:
Chuẩn bị 12 ống nghiệm sạch, khô
Cho vào mỗi ống 1ml nước cất, trừ ống thứ nhất.
Cho vào ống thứ nhất và ống thứ hai mỗi ống 1 ml dịch chứa enzyme, lắc
đều. Chuyển 1 ml dung dịch của ống thứ hai vào ống thứ ba, lắc đều. Chuyển 1 ml

dung dịch của ống thứ ba vào ống thứ tư, lắc đều. Cứ như vậy cho đến ống thứ 12.
Kaays 1 ml từ ống thứ 12 bỏ đi. Như thế thể tích chất lỏng trong tất cả các ống đều
là 1 ml.
Tăng nhiệt độ của các ống đến nhiệt độ 38
0
C bằng cách đặt chúng vào bể
điều nhiệt cài ở 38
0
C từ 10 – 15 phút.
Thêm vào mỗi ống 2 ml dung dịch casein 0,1% có nhiệt độ 38
0
C, lắc đều.
Giữ ở 38
0
C trong 30 phút.
Đúng 30 phút làm lạnh ngay trong nước đá để ngừng phản ứng. Nhỏ theo
vách mỗi ống vài giọt dung dịch acid acetic trong dung dịch ethanol.


Nếu thấy tất cả các ống đều có kết tủa trắng, chứng tỏ lượng enzyme không
đủ để phân giải hết casein. Cần phải chuẩn bị lại dụng dịch enzyme có nồng độ cao
hơn. Còn nếu ở tất cả các ống đều không xuất hiện kết tủa cần phải pha loãng dung
dịch enzyme đem phân tích.
Trong trường hợp có một số ống xuất hiện kết tủa, số còn lại không kết tủa
thì chọn lấy ống không kết tủa cuối cùng (đứng trước ống bắt đầu cho kết tủa) là
ống có lượng enzyme bé nhất có khả năng phân giải hoàn toàn 2 mg casein.
Ví dụ: ở ống thứ 7 là ống cuối cùng không cho kết tủa, lượng enzyme ban
đầu pha loãng 64 lần trong ống này, tương đương với 0,0156 ml dung dịch enzyme
ban đầu, và như vậy 1 ml dung dịch enzyme ban đầu có hoạt độ là 2/0,0156 = 128
đơn vị. Từ đó tính ra hoạt độ của enzyme trong 1 g chế phẩm.