slide Sắc ký lớp mỏng trong hóa thực vật

SẮC KÝ LỚP MỎNG
SẮC KÝ LỚP MỎNG
GVHD:
GVHD:
NGUYỄN THỊ DiỆP CHI
NGUYỄN THỊ DiỆP CHI
SVTH:
SVTH:
NGUYỄN TRỊNH BẢN
NGUYỄN TRỊNH BẢN
DIỆP THỊ KIM CƯƠNG
DIỆP THỊ KIM CƯƠNG
HUỲNH TiẾN SĨ
HUỲNH TiẾN SĨ




SẮC KÝ LỚP MỎNG
SẮC KÝ LỚP MỎNG








Khái quát + cơ chế chính trong SKLM
Khái quát + cơ chế chính trong SKLM

Trang thiết bị trong SKLM
Trang thiết bị trong SKLM


Các bước tiến hành SKLM
Các bước tiến hành SKLM


Phạm vi ứng dụng của SKLM
Phạm vi ứng dụng của SKLM


Ứng dụng SKLM trong hóa thực vật
Ứng dụng SKLM trong hóa thực vật

KHÁI QUÁT CHUNG
KHÁI QUÁT CHUNG
Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatograpy)
Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatograpy)
Nhanh, gọn, tiện lợi, nhận biết biết nhanh số
Nhanh, gọn, tiện lợi, nhận biết biết nhanh số
lượng thành phần có trong hỗn hợp thông
lượng thành phần có trong hỗn hợp thông
qua hệ số lưu, dựa trên tính phân cực.
qua hệ số lưu, dựa trên tính phân cực.
=> TLC dùng chất hấp phụ làm pha tĩnh trải
=> TLC dùng chất hấp phụ làm pha tĩnh trải
thành lớp mỏng. Quá trình tách khi cho pha

thành lớp mỏng. Quá trình tách khi cho pha
động di chuyển qua pha tĩnh đã có mẫu.
động di chuyển qua pha tĩnh đã có mẫu.

CƠ CHẾ SẮC KÝ LỚP MỎNG
CƠ CHẾ SẮC KÝ LỚP MỎNG
Pha tĩnh:
Pha tĩnh:
chất hấp phụ trải thành lớp mỏng, mịn,
chất hấp phụ trải thành lớp mỏng, mịn,
đồng nhất được cố định trên phiến kính, kim loại hay
đồng nhất được cố định trên phiến kính, kim loại hay
nhựa; thường là silicagel, aluminium oxide, hoặc
nhựa; thường là silicagel, aluminium oxide, hoặc
cellulose phủ trên mặt phẳng chất trơ.
cellulose phủ trên mặt phẳng chất trơ.
Pha động:
Pha động:
hệ đơn thuần một dung môi hay hỗn
hệ đơn thuần một dung môi hay hỗn
hợp nhiều dung môi phối hợp với nhau theo tỷ lệ quy
hợp nhiều dung môi phối hợp với nhau theo tỷ lệ quy
định.
định.
Trong quá trình sắc ký các cấu tử trong mẫu thử di
Trong quá trình sắc ký các cấu tử trong mẫu thử di
chuyển trên lớp mỏng theo hướng pha động với những
chuyển trên lớp mỏng theo hướng pha động với những
tốc độ khác nhau dẫn đến việc tách – phân bố vị trí
tốc độ khác nhau dẫn đến việc tách – phân bố vị trí

khác nhau trên lớp mỏng => Sắc ký đồ
khác nhau trên lớp mỏng => Sắc ký đồ

Dựa vào cơ chế, TLC thành 4 loại
Dựa vào cơ chế, TLC thành 4 loại


Sắc ký hấp phụ
Sắc ký hấp phụ


Sắc ký phân bố
Sắc ký phân bố


Sắc ký trao đổi ion
Sắc ký trao đổi ion


Sắc ký rây phân tử
Sắc ký rây phân tử

Sắc ký hấp phụ
Sắc ký hấp phụ


Sự khác nhau ái lực hấp phụ của các chất đối
Sự khác nhau ái lực hấp phụ của các chất đối
với pha tĩnh và được biểu thị qua hằng số hấp phụ.
với pha tĩnh và được biểu thị qua hằng số hấp phụ.

Chất tan bị giữ lại trên bề mặt rắn (hấp phụ) và
Chất tan bị giữ lại trên bề mặt rắn (hấp phụ) và
bị dung môi động đẩy ra (phản hấp phụ)
bị dung môi động đẩy ra (phản hấp phụ)


Chất có ái lực mạnh sẽ đẩy chất yếu hơn về
Chất có ái lực mạnh sẽ đẩy chất yếu hơn về
phía trước làm cho bề mặt không có khoảng trống và
phía trước làm cho bề mặt không có khoảng trống và
sắc ký đồ tạo thành vệt dài.
sắc ký đồ tạo thành vệt dài.


Tốc độ di chuyển và khả năng tách phụ thuộc
Tốc độ di chuyển và khả năng tách phụ thuộc
vào sự có mặt của tạp chất và bề mặt riêng.
vào sự có mặt của tạp chất và bề mặt riêng.


Sự cân bằng phụ thuộc nồng độ, nhiệt độ, áp
Sự cân bằng phụ thuộc nồng độ, nhiệt độ, áp
suất.
suất.

Sắc ký phân bố
Sắc ký phân bố
Pha tĩnh

Pha tĩnh
: chất lỏng không tan với pha động và
: chất lỏng không tan với pha động và
được gắn vào một chất mang thích hợp.
được gắn vào một chất mang thích hợp.
Pha động:
Pha động:
chuyển dịch trên pha tĩnh kéo theo
chuyển dịch trên pha tĩnh kéo theo
những chất cần tách và những chất nầy được phân bố
những chất cần tách và những chất nầy được phân bố
giữa hai pha cho tới khi hình thành trạng thái cân
giữa hai pha cho tới khi hình thành trạng thái cân
bằng.
bằng.
Hệ số phân bố khác nhau của mỗi chất với pha
Hệ số phân bố khác nhau của mỗi chất với pha
động, tĩnh.
động, tĩnh.

Chú ý:
Chú ý:
SKLM tẩm những chất ưa dầu (pha tĩnh không phân
SKLM tẩm những chất ưa dầu (pha tĩnh không phân
cực) và pha động phân cực => Sắc ký phân bố
cực) và pha động phân cực => Sắc ký phân bố
pha đảo dùng tách chất kỵ nước.
pha đảo dùng tách chất kỵ nước.
Pha tĩnh thường H
Pha tĩnh thường H

2
2
O, pha động chất hữu cơ không
O, pha động chất hữu cơ không
hòa tan trong H
hòa tan trong H
2
2
O nhưng có cho thêm H
O nhưng có cho thêm H
2
2
O hay đã
O hay đã
được làm bão hòa nước.
được làm bão hòa nước.
Tách chất có độ phân cực TB, pha tĩnh là dung môi
Tách chất có độ phân cực TB, pha tĩnh là dung môi
phân cực không bay hơi: formamid, PEG. Pha
phân cực không bay hơi: formamid, PEG. Pha
động là chất lỏng không phân cực như
động là chất lỏng không phân cực như
cloroform…
cloroform…

Sắc ký trao đổi ion:
Sắc ký trao đổi ion:
Pha tĩnh
Pha tĩnh
: Chất có khả năng trao đổi ion với ion chất

: Chất có khả năng trao đổi ion với ion chất
cần phân tích (nhựa, dẫn chất cellulose)
cần phân tích (nhựa, dẫn chất cellulose)
Ái lực khác nhau của các ion trong mẫu và pha tĩnh
Ái lực khác nhau của các ion trong mẫu và pha tĩnh
Nhựa trao đổi ion chứa nhóm hóa học thích hợp:
Nhựa trao đổi ion chứa nhóm hóa học thích hợp:
Cationit:
Cationit:
R-H
R-H
+
+
+ Na
+ Na
+
+


R-Na
R-Na
+
+
+ H
+ H
+
+
Anionit:
Anionit:
R-OH

R-OH
-
-
+ Cl
+ Cl
-
-




R-Cl
R-Cl
-
-
+ OH
+ OH
-
-

Sắc ký rây phân tử
Sắc ký rây phân tử
Sự tách dựa trên kích thước phân tử khác nhau của
Sự tách dựa trên kích thước phân tử khác nhau của
chất tan để lọt sâu vào trong các hốc của pha tĩnh.
chất tan để lọt sâu vào trong các hốc của pha tĩnh.
Các chất có kích thước phân tử nhỏ thì lọt vào
Các chất có kích thước phân tử nhỏ thì lọt vào
trong các hốc của pha tĩnh và bị giữ lại đó sẽ ra
trong các hốc của pha tĩnh và bị giữ lại đó sẽ ra

sau. Chất có kích thước phân tử lớn nằm ngoài các
sau. Chất có kích thước phân tử lớn nằm ngoài các
hốc này sẽ ra trước.
hốc này sẽ ra trước.
Pha tĩnh: Gel (thường là gel Sephadex) dùng để tách
Pha tĩnh: Gel (thường là gel Sephadex) dùng để tách
các chất có phân tử lượng khác nhau. Một số loại
các chất có phân tử lượng khác nhau. Một số loại
Gel sephadex: G-50, G-75, G- 100, G-150
Gel sephadex: G-50, G-75, G- 100, G-150

TRANG THIẾT BỊ
TRANG THIẾT BỊ


Chất hấp phụ
Chất hấp phụ


Bản mỏng
Bản mỏng


Dung môi
Dung môi


Bình sắc ký
Bình sắc ký

Chất hấp phụ
Chất hấp phụ


1.
1.
Silicagel
Silicagel


Silicagel có chất dính
Silicagel có chất dính

Silicagel 13% bột bó: Silicagel G (Anasil), Silicagel G (60) (Merek)
Silicagel 13% bột bó: Silicagel G (Anasil), Silicagel G (60) (Merek)

Silicagel 05% bột bó: Silicagel D-5, DS-5
Silicagel 05% bột bó: Silicagel D-5, DS-5


Silicagel có chất dính và chất chỉ thị huỳnh quang:
Silicagel có chất dính và chất chỉ thị huỳnh quang:
13% bột bó, chất chỉ thị huỳnh quang Silicagel GF254 (Merek Anasil)
13% bột bó, chất chỉ thị huỳnh quang Silicagel GF254 (Merek Anasil)


Silicagel không có chất dính:
Silicagel không có chất dính:

Silicagel H của Merek Anasil D-O (camag)
Silicagel H của Merek Anasil D-O (camag)




Silicagel không có chất dính, có chất chỉ thị:
Silicagel không có chất dính, có chất chỉ thị:


HF254 (Merek), DF-O (Camag)
HF254 (Merek), DF-O (Camag)


Silicagel đã silan hóa dùng cho TLC pha đảo:
Silicagel đã silan hóa dùng cho TLC pha đảo:


PF254 silanized RP-2…
PF254 silanized RP-2…

•
2. Nhôm oxyd
2. Nhôm oxyd
•
3. Cellulose
3. Cellulose
•
4. Kieselgur hay cát biển
4. Kieselgur hay cát biển

•
5. Thạch cao
5. Thạch cao
•
6. Các chất khác: Polyamide
6. Các chất khác: Polyamide


ionit vô cơ – hữu cơ
ionit vô cơ – hữu cơ


Sephadex
Sephadex



Bản mỏng
Bản mỏng


5*20cm
5*20cm


Bản mỏng dính chắc
Bản mỏng dính chắc


Bản mỏng không dính chắc

Bản mỏng không dính chắc


10*20cm
10*20cm


20*30cm
20*30cm

Dung môi
Dung môi
Dung môi
Dung môi
€
€
0
0
Dung môi
Dung môi
€
€
0
0
Ete dầu hỏa
Ete dầu hỏa
0.01
0.01
Ete etylic
Ete etylic

0.38
0.38
Hexan
Hexan
0.01
0.01
Chloroform
Chloroform
0.40
0.40
Heptan
Heptan
0.01
0.01
Metylen
Metylen
chcloride
chcloride
0.42
0.42
Cyclohexan
Cyclohexan
0.04
0.04
Dicloetan
Dicloetan
0.49
0.49
Cacbon
Cacbon

tetrecloride
tetrecloride
0.18
0.18
Acetone
Acetone
0.56
0.56
Ete
Ete
Isopropylic
Isopropylic
0.28
0.28
Dioxin
Dioxin
0.56
0.56
Toluene
Toluene
0.29
0.29
Butanol
Butanol
0.56
0.56
Benzene
Benzene
0.32
0.32

Etylacetat
Etylacetat
0.58
0.58



N.Tắc lựa chọn:
N.Tắc lựa chọn:
Tính chất hỗn hợp
Tính chất hỗn hợp
cần phân tích.
cần phân tích.
Khả năng hấp phụ
Khả năng hấp phụ
pha tĩnh
pha tĩnh
Độ bay hơi, độ nhớt,
Độ bay hơi, độ nhớt,
sự phân lớp và độ
sự phân lớp và độ
tinh khiết của hỗn
tinh khiết của hỗn
hợp dung môi
hợp dung môi

Bình sắc ký
Bình sắc ký
•
Đáy tròn, vuông hoặc chữ nhật

Đáy tròn, vuông hoặc chữ nhật

Lựa chọn điều kiện sắc ký
Lựa chọn điều kiện sắc ký


Chọn pha tĩnh:
Chọn pha tĩnh:

Bản chất chất cần tách
Bản chất chất cần tách

Chọn bản mỏng, chất hấp phụ thích hợp
Chọn bản mỏng, chất hấp phụ thích hợp


Chọn dung môi:
Chọn dung môi:

Khả năng hòa tan được mẫu
Khả năng hòa tan được mẫu

Tra cứu tài liệu tìm dung môi (nếu có)
Tra cứu tài liệu tìm dung môi (nếu có)

Chọn dung môi theo độ phân cực tăng dần
Chọn dung môi theo độ phân cực tăng dần

Chọn dung môi theo “vi kỹ thuật vòng”
Chọn dung môi theo “vi kỹ thuật vòng”

Quá trình và kỹ thuật sắc ký
Quá trình và kỹ thuật sắc ký
Chuẩn bị bản mỏng
Chuẩn bị bản mỏng
Bản mỏng, bình sắc ký thích hợp
Bản mỏng, bình sắc ký thích hợp
Chuẩn bị dung môi
Chuẩn bị dung môi
Chấm dung dịch lên bản mỏng
Chấm dung dịch lên bản mỏng
Khai triển sắc ký
Khai triển sắc ký
Giải ly để dung môi giải ly di chuyển xuống
Giải ly để dung môi giải ly di chuyển xuống
Giải ly để dung môi giải ly di chuyển lên
Giải ly để dung môi giải ly di chuyển lên
Giải ly nhiều lần liên tiếp
Giải ly nhiều lần liên tiếp
Giải ly hai chiều
Giải ly hai chiều

Phát hiện vết
Phát hiện vết


Phương pháp vật lý:
Phương pháp vật lý:
Đèn chiếu tia UV 254nm
Đèn chiếu tia UV 254nm

Đèn chiếu tia UV 366nm
Đèn chiếu tia UV 366nm
Phương pháp hóa học:
Phương pháp hóa học:
Thuốc thử đặc trưng
Thuốc thử đặc trưng
Thuốc thử không đặc trưng
Thuốc thử không đặc trưng

Phân tích vết:
Phân tích vết:
Giá trị Rf có thể thay đổi tùy thao nhiều yếu tố:
Giá trị Rf có thể thay đổi tùy thao nhiều yếu tố:
•
Loại bản mỏng
Loại bản mỏng
•
Hoạt độ của bản mỏng lúc sử dụng
Hoạt độ của bản mỏng lúc sử dụng
•
Độ dầy của lớp hấp phụ
Độ dầy của lớp hấp phụ
•
Thành phần của dung môi
Thành phần của dung môi
•
Kỹ thuật sắc ký
Kỹ thuật sắc ký
•
Lượng mẫu chấm lên bản mỏng

Lượng mẫu chấm lên bản mỏng

Ứng dụng
Ứng dụng


Công bố đặc điểm hợp chất vừa chiết, tách, cô lập
Công bố đặc điểm hợp chất vừa chiết, tách, cô lập


Định luợng và bán định lượng
Định luợng và bán định lượng


Kiểm tra hai chất có giống nhau hay không, định
Kiểm tra hai chất có giống nhau hay không, định
tính và thử độ tinh khiết.
tính và thử độ tinh khiết.


Tìm hiểu sơ bộ về mẫu chất khảo sát
Tìm hiểu sơ bộ về mẫu chất khảo sát


Chuẩn bị cho việc sắc ký cột
Chuẩn bị cho việc sắc ký cột

Ứng dụng vào hóa thực vật
Ứng dụng vào hóa thực vật
•

Sự tách sắc tố thực vật
Sự tách sắc tố thực vật
(Separating of plant Pigment)
(Separating of plant Pigment)
•
Sự tách hỗn hợp nhuộm Lipophilic
Sự tách hỗn hợp nhuộm Lipophilic
(Separating of Lipophilic Dye Mixture)
(Separating of Lipophilic Dye Mixture)

Sự tách sắc tố thực vật
Sự tách sắc tố thực vật
Hóa chất và nguyên liệu
Hóa chất và nguyên liệu
Ether dầu mỏ, acetone, isopropanol, NaCl, CaCO
Ether dầu mỏ, acetone, isopropanol, NaCl, CaCO
3,
3,
Na
Na
2
2
SO
SO
4,,
4,,
lá
lá
thực vật tươi (fresh leaves)
thực vật tươi (fresh leaves)

Thiết bị và dụng cụ
Thiết bị và dụng cụ
Máy sấy quay, bình TLC 22 x 22 x10
Máy sấy quay, bình TLC 22 x 22 x10
bản silicagel TLC ( DC- Alufolien, F254 Kieselgur
bản silicagel TLC ( DC- Alufolien, F254 Kieselgur
Kieselgel 60/, Art.5567 Merck)
Kieselgel 60/, Art.5567 Merck)
cái cọ, cái cối và chày
cái cọ, cái cối và chày
Phễu tách 100ml, 5 ống đong 25ml, ống đong 100ml, erlen
Phễu tách 100ml, 5 ống đong 25ml, ống đong 100ml, erlen
100ml, bình đáy tròn 100ml.
100ml, bình đáy tròn 100ml.

Hazards and safety precautiona:
Hazards and safety precautiona:


ete dầu hỏa dễ cháy, tính độc hại thay đổi theo
ete dầu hỏa dễ cháy, tính độc hại thay đổi theo
thành phần. => tránh phải sự hít vào
thành phần. => tránh phải sự hít vào
Acetol và isopropanol có tính cháy cao
Acetol và isopropanol có tính cháy cao
Dung môi khai triển (pha động):
Dung môi khai triển (pha động):
100ml ete dầu hỏa, 11ml isopropanol
100ml ete dầu hỏa, 11ml isopropanol
Chuẩn bị bình sắc ký:

Chuẩn bị bình sắc ký:
Dm khai triển cho vào bình bao trùm đáy một độ sâu 0.5cm. Đậy
Dm khai triển cho vào bình bao trùm đáy một độ sâu 0.5cm. Đậy
nắp, chờ dm bão hòa hơi nước.
nắp, chờ dm bão hòa hơi nước.

Chiết sắc tố lá (extraction of the leaf pigment):
Chiết sắc tố lá (extraction of the leaf pigment):
Lá tươi nghiền với 22ml acetol, 3ml dầu hỏa và một
Lá tươi nghiền với 22ml acetol, 3ml dầu hỏa và một
thìa CaCO
thìa CaCO
3,
3,
dd sau lọc cho vào phễu tách cùng 20ml
dd sau lọc cho vào phễu tách cùng 20ml
ete dầu hỏa và 20 ml NaCl 10%. Chờ dd tách lớp,
ete dầu hỏa và 20 ml NaCl 10%. Chờ dd tách lớp,
lớp dưới cho vào becker, lớp trên đem rửa 3-4 lần
lớp dưới cho vào becker, lớp trên đem rửa 3-4 lần
với 5ml nước. Rồi cho vào Erlen và làm khô với 4
với 5ml nước. Rồi cho vào Erlen và làm khô với 4
thìa Na
thìa Na
2
2
SO
SO
4,
4,

sau đó rót vào bình đáy tròn sấy còn
sau đó rót vào bình đáy tròn sấy còn
khoảng 3ml
khoảng 3ml
Chấm dịch chiết lên bản mỏng:
Chấm dịch chiết lên bản mỏng:
Vẽ 1 đường thẳng cách đáy bản 1.5 cm bằng viết chì,
Vẽ 1 đường thẳng cách đáy bản 1.5 cm bằng viết chì,
dùng ống pasteur chấm dịch chiết lên bản, lặp lại
dùng ống pasteur chấm dịch chiết lên bản, lặp lại
nhiều lần đến khi có màu xanh đậm, vết chấm kế
nhiều lần đến khi có màu xanh đậm, vết chấm kế
tiếp được thực hiện sau khi được sấy khô vết chấm
tiếp được thực hiện sau khi được sấy khô vết chấm
trước, hàng chấm được mỏng và thẳng là tốt
trước, hàng chấm được mỏng và thẳng là tốt