Nghiên cứu các thông số kỹ thuật cho sản xuất chế phẩm vi sinh vật cấy dùng cho trong chế biến, bảo quản thức ăn thô xanh và phụ phẩm nông nghiệp cho gia súc nhai lại

NGHIÊN CỨU CÁC THÔNG SỐ KỸ THUẬT CHO SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH
VẬT CẤY DÙNG CHO TRONG CHẾ BIẾN, BẢO QUẢN THỨC ĂN
THÔ XANH VÀ PHỤ PHẨM NÔNG NGHIỆP CHO GIA SÚC NHAI LẠI
1
Bùi Thị Thu Huyền, Dương Văn Hợp, Đào Thị Lương,
1
Trần Quốc Việt2 và
1
Ninh Thị Len
Viện Vi sinh vật và CNSH - Đại học Quốc Gia Hà Nội;
1
Bộ môn Dinh dưỡng, TACN và Đồng cỏ - Viện Chăn Nuôi
Tóm tắt
Tám chủng vi khuẩn được lựa chọn các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh trưởng và sinh tổng hợp axit.
Kết quả là môi trường thích hợp nhất là môi trường MRS hoặc cà chua, ở 30-37oC, pH 6-7, nồng độ NaCl 5%, trên
nguồn cacbon glucose, saccharose, với các nguồn nitơ hữu cơ (peptone, cao men). Nuôi cấy lắc, thời gian 3 ngày, tỷ
lệ giống cấy ban đầu khoảng 5-10%. Xây dựng các tổ hợp chủng vi sinh vật theo 2 hướng khác nhau để dùng cho
thử nghiệm ủ cỏ bao gồm: hỗn hợp các chủng sinh lactic đồng hình (gồm các chủng thuộc loài Lactobacillus
plantarum 2-10; 3-5, 8-10 và 9-17), hỗn hợp của các chủng đồng hình và dị hình (gồm các chủng 2-9; 9-17; L01;
L19 - Tổ hợp này kết hợp giữa các loài Lactobacillus plantarum, L. pentosus và Enterococcus lactis). Các tổ hợp này
được dùng trong sản xuất các chế phẩm dạng bột và dịch thể. Sau 4 tháng bảo quản, mật độ vi sinh vật vẫn duy trì ở
mức cao (khoảng 108 CFU/g).
1. Đặt vấn đề
Kỹ thuật ủ chua thức ăn xanh là phương pháp chế biến có quan hệ mật thiết đến các hoạt
động của các vi sinh vật. Điều kiện yếm khí, nhiệt độ, bản chất của vật liệu ủ (thành phần hoá
học, đặc tính vật lý vv), số lượng và cơ cấu quần thể vi sinh vật (VSV) có mặt ở nguyên liệu ủ
quyết định hiệu quả lên men và chất lượng của thức ăn ủ. Rất nhiều công trình nghiên cứu đã
được tiến hành nhằm hiểu rõ bản chất của quá trình lên men, qua đó đưa ra các biện pháp kỹ
thuật kiểm soát quá trình lên men trong chế biến thức ăn ủ chua.

Mặt khác theo McDonald (1991), một chất cấy vi khuẩn lactic cần phải đáp ứng được các
yêu cầu sau đây: (i) Phát triển mạnh, cạnh tranh được với các VK không mong muốn để chiếm
được ưu thế về số lượng trong quá trình lên men; (ii) phải là những vi khuẩn lên men đồng chất
để tạo ra được lượng axit lactic tối đa từ các đường hexose ngay khi chúng sẵn có; (iii) sống
được trong môi trường axit (pH = 4) và có khả năng sản sinh axit hữu cơ để ức chế các VK
không mong muốn khác; (iv) lên men được nhiều loại đường; (v) không sản sinh ra các các
dextran không mong muốn từ đường sucrose; (vi) không sản sinh ra mannitol từ đường fructose;
(vii) Không phân giải các axit hữu cơ; (viii) Sống hoặc tồn tại được trong điều kiện nhiệt độ đến
50
o
C; (ix) sinh trưởng tốt trên cây, cỏ đã ủ héo có độ ẩm thấp; (x) duy trì được hoạt tính trong
quá trình bảo quản.
Nội dung của nghiên cứu này thuộc đề tài: “Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật trong chế
biến, bảo quản để nâng cao tỷ lệ tiêu hóa, hiệu quả sử dụng thức ăn thô xanh, phế phụ
phẩm công nông nghiệp cho gia súc nhai lại” nhằm nghiên cứu các thông số kỹ thuật (môi
trường, thời gian lên men, tính tương thích của các chủng vi sinh vật ), sản xuất chế phẩm vi


sinh vật cấy dạng lỏng và dạng bột dùng trong chế biến và bảo quản thức ăn thô xanh và phụ
phẩm công, nông nghiệp.
2. Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.1. Vật liệu nghiên cứu
- Các chủng vi khuẩn lactic: 2-9; 2-10; 3-5; 4-14, 8-10; 9-17; L10; L19 được phân lập từ
các mẫu cỏ voi, thân cây ngô sau thu bắp được ủ chua, bã dứa.
- Các hóa chất nuôi cấy vi sinh vật, định tính, định lượng và phân loại sử dụng của các
hãng Merck, Sigma, Wako…
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy và các thông số lên men thích hợp đối với các chủng
VSV đã được lựa chọn.
- Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật cấy đa chủng dạng lỏng và bột.

2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Môi trường nghiên cứu
2.1.3.1. Môi trường MRS (g/l)
Glucoza-20,0; K
2
HPO4-2,0; CaCO
3
-5,0; CH
3
COONa-5,0; Cao thịt- 10,0; Triamoni
xitrat-2,0; Pepton-10,0; MgSO
4
.7H
2
O- 0,58; Cao nấm men-5,0; MnSO
4
.4H
2
O- 0,28; Tween
80- 1 ml; Thạch- 15,0; Nước cất vừa đủ- 1000 ml; pH= 7,0; khử trùng ở 121
o
C/15 phút
- Môi trường dịch thể bỏ thạch và CaCO
3
2.1.3.2. Môi trường cà chua (g/l)
Cà chua-100; Glucoza- 20; Nước cất vừa đủ-1000 ml; pH= 6,5; khử trùng ở 105
o
C/15
phút
2.1.3.3. Môi trường Giá- đường (g/l)

Gía-100; Glucoza- 20; Nước cất vừa đủ-1000 ml; pH= 6,5; khử trùng ở 105
o
C/15 phút
2.1.3.4. Môi trường vi khuẩn axit lactic (g/l)
Pepton-10, cao men-5; Natri axetat -12; glucoza-10; dung dịch A- 5ml; dung dịch B-5
ml; nước đủ 1000ml; pH-5,1-5,3
Dung dịch A: K
2
HPO4-10,0; KH
2
PO4-10,0; nước- 1000 ml
Dung dịch B: MgSO
4
.7H
2
O- 4,0; NaCl-0,2; FeSO
4
.7H
2
0-0,2; MnSO
4
.H
2
O-0,2; nước-
1000 ml.
2.1.3.5. Môi trường GYP-axetat natri (g/l)
Glucoza-10; cao men- 10; peptone-10; axetat natri-10; MgSO
4
.7H
2

O- 0,2; MnSO
4
.H
2
O-
10 mg; FeSO
4
.7H
2
0-10 mg; NaCl-10 mg; nước đủ 1000ml, pH-6,8
2.1.3.6. Môi trường bột chua cải tiến (g/l)
Maltose-20; cao nấm men-3; Tween-80; trypticase peptone-6; nước -1lit; pH-5,6


2.3.2. Phương pháp nghiên cứu
2.3.2.1. Các phương pháp định tính và định lượng
2.3.2.1.1. Định lượng axit theo Therner
Lấy 10ml dịch nuôi vi khuẩn đã li tâm, bỏ sinh khối, bổ sung 20ml nước cất và thêm 2
giọt phenolphtalein (nồng độ 1% trong cồn 90
0
). Sau đó chuẩn độ bằng NaOH 0,1N đến khi xuất
hiện màu hồng nhạt bền trong 30 giây thì dừng lại. Ghi lại thể tích NaOH (ml) đã dùng. Độ axit
được tính như sau:
Hàm lượng axit (g/l)= V
NaOH
tiêu tốn x 0,009
2.3.2.1.2. Xác định khả năng sinh trưởng bằng mật độ quang (OD)
Mật độ tế bào vi khuẩn trong dịch nuôi cấy được đo trên máy quang phổ ở bước sóng
600nm
2.3.2.2. Phương pháp nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy và các thông số lên men thích hợp

- Lựa chọn môi trường nuôi cấy, nguồn cacbon và nitơ trong môi trường nuôi cấy thích
hợp cho khả năng sinh trưởng và sinh axit của các chủng vi khuẩn
Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên 6 môi trường dịch thể khác nhau, pH 6, lắc ổn
nhiệt (220 vòng/phút) ở nhiệt độ 37
o
C. Với nguồn cơ chất là C: nuôi cấy trên môi trường MRS
dịch thể chứa glucose hoặc thay thế glucose bằng 6 nguồn cacbon khác (saccharose, lactose, tinh
bột tan, bột gạo, bột sắn, bột ngô). Với nguồn cơ chất là N: nuôi cấy trên môi trường MRS dịch
thể chứa nguồn nitơ hữu cơ (peptone, cao men, cao thịt) hoặc thay thế bằng 4 nguồn nitơ vô cơ
khác là NH
4
+
, NO
3
-
, NO
2
-
, Urê.
- Lựa chọn nhiệt độ nuôi cấy và pH thích hợp cho khả năng sinh trưởng và sinh axit của
các chủng vi khuẩn
Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên các bình tam giác chứa môi trường MRS dịch thể,
lắc ổn nhiệt (220 vòng/phút): với dải nhiệt độ cần kiểm tra là 20, 25, 30; 37 và 45
o
C; ở 37
o
C với
dải pH khác nhau 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9.
- Nghiên cứu các thông số kỹ thuật cho lên men dịch thể cấp 3.
Các chủng vi khuẩn được nuôi trên môi trường MRS, ở 30

o
C, pH 6, trên nguồn cacbon là
saccharose ở các chế độ khí, tỷ lệ giống cấy (2; 5; 10 và 15%) (trong 3 ngày) và thời gian lên
men khác nhau (1-7 ngày), lắc 200 v/ph.
Sau thời gian lên men, xác định sinh khối (OD) và hàm lượng axit sinh ra. Từ đó chọn được các
điều kiện nuôi cấy thích hợp cho các chủng vi khuẩn lactic.
- Nghiên cứu khả năng tổ hợp các chủng vi sinh vật trong bảo quản chế phẩm dạng lỏng.
Các chủng vi sinh vật được nuôi cấy riêng rẽ và trộn với nhau theo tỷ lệ như nhau và
được bổ sung 30% vào dung dịch 5% rỉ đường. Bảo quản theo thời gian. Sau 1 tuần kiểm tra số
lượng vi sinh vật.
2.3.2.3. Phương pháp nghiên cứu sản xuất chế phẩm dạng lỏng và bột
2.3.2.3.1. Nghiên cứu sản xuất chế chế phẩm dạng bột bằng phương pháp sấy phun


- Chất mang có thành phần như sau: Tinh bột-10 g; Whey- 10 g; Natri Glutamat- 0,05 g
- Dịch lên men vi sinh vật- 100 ml
- Nhiệt độ không khí đầu vào vòi phun: 160
o
C; nhiệt độ không khí đầu ra vòi phun: 55
o
C,
tốc độ bơm: 2lít/giờ.
Xác định số lượng vi sinh vật
2.3.2.3.2. Nghiên cứu chế phẩm dạng bột bằng phương pháp lên men xốp
- 40 ml dịch lên men vi sinh vật được trộn 100g với các cơ chất cám gạo, bột gạo, bột
sắn, sấy khô ở 40
o
C. Xác định số lượng vi sinh vật.
- Các chế phẩm dạng bột sau khi sấy khô, được đóng gói 5 kg hàn kín trong túi PE; các
chế phẩm dạng dịch được phân vào các can 20l. Bảo quản chế phẩm tại các điều kiện khác nhau

trong điều kiện nhiệt độ phòng (28 – 37
0
C) và nhiệt độ 10
o
C. Việc kiểm tra, đánh giá chất lượng
sản phẩm được tiến hành theo thời gian: 15 ngày, 30 ngày, 45 ngày, 60 ngày
3. Kết quả và thảo luận
3.1. Ảnh hưởng của các môi trường lên men khác nhau đến khả năng sinh trưởng và sinh
axit của các chủng vi khuẩn lactic
Ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy khác nhau đến khả năng sinh trưởng và sinh
axit của các chủng vi khuẩn được trình bày ở bảng 1.
Bảng 1. Sinh trưởng và sinh axit trên các môi trường nuôi cấy có nguồn cacbon và nitơ khác
nhau

Điều kiện nuôi cấy
Ký hiệu chủng
2-9
2-10
3-5
4-14
8-10
9-17
L01
L19
1. Môi trường nuôi cấy:
Cà chua:
- Hàm lượng axit (g/l)
- Sinh khối (OD)

13,5
1,707


13,5
1,488


13,5
1,674


14,4
1,686


12,5
1,411


12,0
1,568


12,0
1,556


13.0
1,677

Giá đỗ:
- Hàm lượng axit (g/l)
- Sinh khối (OD)

9,0
1,56

4,5
1,41

9,0
1,631

4,5
1,330

9,0
1,474

9.0
1,483

4,5
1,473

4,5
1,611
MRS:
- Hàm lượng axit (g/l)
- Sinh khối ( OD)

20,2
2,136

22,5
2,303

23,4
2,017

21,6
2,089

20,2
2,077

20,7
2,007

20,0
1,948

21,0
2,002
Môi trường vi khuẩn axit lactic
- Hàm lượng axit (g/l)
- Sinh khối (OD)

16,2
1,009

18,0
0,977

19,0
1,199

20,0
0.877

20,3
1,209

18,0
0,934

10,8
0,787

19,8
1,025
Môi trường GYP-axetat natri
- Hàm lượng axit (g/l)
- Sinh khối ( OD)

15,2
0,914

18,0
0,901

18,0
0,923

14,0
0,654

16,0
0,900

16,8
0,919

12,6
0,763

18,0
0,780
Môi trường bột chua cải tiến

Điều kiện nuôi cấy
Ký hiệu chủng
2-9
2-10
3-5
4-14
8-10
9-17
L01
L19
- Hàm lượng axit (g/l)
- Sinh khối (OD)
9,0
0,708
18,0
1,005
19,8
0,904
9,0
0,676
16,8
0,914
18,0
0,912
8,1
0,898
13,5
0,880

Cả 8 chủng lựa chọn đều sinh trưởng và sinh axit trên 6 môi trường nuôi cấy khác nhau,

nhưng tốt nhất ở môi trường MRS mặc dù ở các mức độ khác nhau không nhiều giữa các chủng.
Đối với 5 môi trường còn lại thì sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn trên môi trường cà chua
(OD 1,411 – 1,707) là cao hơn so với môi trường vi khuẩn lactic, giá đường, GYP và bột chua
cải tiến. Tuy nhiên hàm lượng axit sinh ra cao nhất trên các môi trường rẻ tiền là môi trường vi
khuẩn lactic (10,8 – 20,3 g/l), thấp hơn là nuôi cấy trên môi trường cà chua (12 – 14,4 g/l). Do đó
môi trường nuôi cấy thích hợp nhất cho các chủng vi khuẩn lactic vừa sinh axit nhiều nhất và cho
tốc độ sinh trưởng cao nhất bên cạnh môi trường MRS là môi trường cà chua.
3.2. Ảnh hưởng của các môi trường chứa nguồn cacbon và nitơ khác nhau đến khả năng
sinh trưởng và sinh axit của các chủng vi khuẩn lactic
Nhìn vào các kết quả ở bảng 2 ta thấy, với các môi trường có chứa nguồn cacbon khác
nhau (1 nguồn đường đơn, 2 nguồn đường kép, 4 nguồn tinh bột khác nhau), khả năng sinh
trưởng và sinh axit của 8 chủng vi khuẩn đều tốt nhất trên các nguồn đường đơn và kép (trừ
chủng 8-10 không mọc và chủng L01 phát triển kém trên nguồn lactose). Trong đó, khi môi
trường nuôi cấy có chứa nguồn glucose thì sự sản sinh axit là cao nhất (18,8 – 22,8 g/l) và có sự
đồng đều giữa các chủng; thấp hơn là trên môi trường nuôi cấy có nguồn lactose và sarcarose.
Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Maizirwan Mel và cs (2008) khi nghiên
cứu môi trường tối thích cho sự sản sinh axit lactic của chủng Lactobacillus rhamnosus; của I. A.
Adesokan và cs (2009) trên các chủng L. plantarum, L. fermentum, L. casei, L. brevis, L.
acidophilus khi môi trường nuôi cấy có chứa nguồn glucose. Trên môi trường nuôi cấy có chứa
nguồn cacbon là đường lactose thì chủng 8-10 không mọc nên môi trường này không được lựa
chọn. Do đó, ta chọn nguồn C là sacarose là nguồn C tương đối rẻ tiền hơn thay cho nguồn
glucose trong môi trường nuôi cấy để thích hợp cho các chủng nghiên cứu sinh trưởng và sản
sinh axit.
Khi nuôi riêng rẽ từng nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ, các chủng nghiên cứu đều sinh trưởng
và sinh axit nhưng kém hơn khi nuôi hỗn hợp các nguồn hữu cơ (pepton, cao men, cao thịt) với
nhau trong môi trường nuôi cấy MRS. Với nguồn nitơ hữu cơ, sự sinh trưởng của các chủng cao
nhất trên môi trường có chứa cao thịt, thấp hơn khi nguồn nitơ là pepton. Tuy nhiên sự sản sinh
axit lại cao hơn khi môi trường nuôi cấy có chứa pepton hoặc cao nấm men. Khi thay thế nguồn
nitơ hữu cơ bằng nguồn vô cơ (amon, nitrat, nitrit hoặc ure) thì sự sinh trưởng và sinh axit là
giảm một cách đáng kể, các chủng đều sinh trưởng rất kém và sinh axit rất thấp. Các kết quả

nghiên cứu này cũng phù hợp với các kết quả nghiên cứu của I. A. Adesokan và cs (2009) trên
chủng L. plantarum, sau 48 giờ nuôi cấy khi môi trường có chứa nguồn nitơ riêng rẽ là cao nấm
men (sự sản sinh axit lactic cao nhất là 2,98 g/l) , KNO
3
(sự sản sinh axit lactic giảm còn là 0,85


g/l). Vì vậy, nguồn pepton hoặc cao nấm men hoặc hỗn hợp hai chất này được lựa chọn là nguồn
nitơ có trong môi trường nuôi cấy, thích hợp cho sự sinh trưởng và sinh axit của các chủng được
lựa chọn.


Bảng 2. Sinh trưởng và sinh axit trên các môi trường nuôi cấy có nguồn cacbon và nitơ khác
nhau

Điều kiện nuôi cấy
Ký hiệu chủng
2-9
2-10
3-5
4-14
8-10
9-17
L01
L19
1. Môi trường chứa nguồn cacbon
D-glucoza
-Hàm lượng axit (g/l)
- Sinh khối (OD)

20,0
2,234


21,8
2,326


22,8
2,103


20,8
2,124


20,0
1,917


20,0
2,162


18,8
1,905


20,3

2,073
D-Lactoza
-Hàm lượng axit (g/l)
- Sinh khối (OD)

22,8
2,377

18,8
2,123

20,3
2,293

20,3
2,226

Khôn
g mọc

20,0
2,241

9,0
1,273

20,0
2,209
Saccaroza
-Hàm lượng axit (g/l)

- Sinh khối (OD)

19,8
2,108

16,8
2,050

21,8
2,058

20,0
2,100

15,2
1,420

16,8
2,053

15,2
1,805

18,8
2,008
Tinh bột tan
-Hàm lượng axit (g/l)
- Sinh khối (OD)

14,0

0,318

14,4
0,419

15,3
0,624

13,5
0,455

14,0
0,676

14,4
0,618

14,4
0,647

14,0
0,409
Tinh bột sắn
-Hàm lượng axit (g/l)
- Sinh khối (OD)

5,4
0,211

3,6

0,303

4,1
0,452

3,2
0,214

4,2
0,229

4,1
0,388

4,2
0,333

5,8
0,234
Bột gạo
-Hàm lượng axit (g/l)
- Sinh khối (OD)

14,4
0,498

14,4
0,377

13,5

0,501

13,1
0,540

14,4
0,310

13,5
0,321

14,4
0,501

14,9
0,551
Bột ngô
-Hàm lượng axit (g/l)
- Sinh khối (OD)

4,1
0,259

5,8
0,407

5,0
0,510

4,1

0,315

3,6
0,321

5,4
0,545

4,5
0,374

5,8
0,422
2. Môi trường chứa nguồn nitơ








Amon:
-Hàm lượng axit (g/l)
- Sinh khối (OD)

3,2
0,180

9,0

1,343

6,8
0,282

2,7
1,240

5,0
0,347

4,1
0,244

5,4
0,161

10,8
0,265
Nitrat:
-Hàm lượng axit (g/l)
- Sinh khối (OD)

2,2
0,347

2,2
0,542

1,6

0,300

2,6
0,736

3,2
0,371

9,0
0,445

1,5
0,325

2,6
0,368
Nitrit:
-Hàm lượng axit (g/l)
- Sinh khối (OD)

2,2
0,298

2,2
0,317

1,6
0,341

1,4

0,276

1,4
0,208

1,2
0,327

1,2
0,280

1,4
0,338
Ure:
-Hàm lượng axit (g/l)
- Sinh khối (OD)

0,9
0,666

2,6
0,609

0,9
0,350

0,9
0,645

2,6

0,532

1,1
0,204

1,4
0,456

1,8
0,225



Điều kiện nuôi cấy
Ký hiệu chủng
2-9
2-10
3-5
4-14
8-10
9-17
L01
L19
Pepton:
-Hàm lượng axit (g/l)
- Sinh khối (OD)

9,6
0,96

10,4
0,649

6,6
0,75

8,2
0,713

7,6
0,644

7,6
0,723

10,4
1,034

8,7
0,960
Cao nấm men:
-Hàm lượng axit (g/l)
- Sinh khối (OD)

8,2
0,382

10,9
1,696

10,4
0,628

6,3
1,067

9,4
0,251

7,3
0,326

11,2
1,106

7,2
0,766
Cao thịt:
-Hàm lượng axit (g/l)
- Sinh khối (OD)

6,8
1,067

10,6
1,556

7,2
1,214

5,2
1,202

4,8
0,252

7,2
1,808

12,6
1,056

7,2
1,269
3.3. Ảnh hưởng của các nhiệt độ nuôi cấy và môi trường có độ pH khác nhau đến khả năng
sinh trưởng và sinh axit của các chủng vi khuẩn lactic
Tám chủng vi khuẩn lựa chọn được nuôi cấy trong các điều kiện khác nhau: nhiệt độ 20 -
45
o
C, pH từ 3 - 9. Kết quả được trình bày ở bảng 3.
Bảng 3. Ảnh hưởng của các nhiệt độ nuôi cấy, môi trường có độ pH khác nhau đến khả năng
sinh trưởng và sinh axit của các chủng vi khuẩn lactic

Điều kiện nuôi cấy
Ký hiệu chủng
2-9
2-10
3-5
4-14
8-10

9-17
L01
L19
1. Nhiệt độ nuôi cấy








20
0
C:
-Hàm lượng axit (g/l)
- Sinh khối (OD)

18
0,212

18
0,410

20
0,331

18
0,359

18
0,200

18
0,200

18
0,322

18
0,203
25
0
C
-Hàm lượng axit (g/l)
- Sinh khối (OD)

13
1,249

17
1,309

10
1,437

12
1,445

18

1,219

18
1,204

20
1,456

18
1,225
30
0
C
-Hàm lượng axit (g/l)
- Sinh khối (OD)

21,3
2,10

23,0
2,12

20,1
2,22

22,0
2,00

20,7
2,00

20,9
2,00

19,7
1,80

21,1
2,00
37
0
C
-Hàm lượng axit (g/l)
- Sinh khối (OD)

20,0
2,234

21,8
2,326

22,8
2,103

20,8
2,124

20,0
1,917

20,0
2,162

18,8
1,905

20,2
2,073
45
0
C
-Hàm lượng axit (g/l)
- Sinh khối (OD)

12,8
0,923

14,4
0,744

12,8
0,807

11,8
0,850

11,8
0,882

11,8

0,812

12,4
0,727

11,8
0,998
2. Môi trường có pH








3
-Hàm lượng axit (g/l)
- Sinh khối (OD)

20,0
0,254

18,8
0,307

20,0
0,430

20,0

0,413

22,0
0,298

22,0
0,320

22,0
0,356

20,0
0,438
4











Điều kiện nuôi cấy
Ký hiệu chủng
2-9
2-10
3-5

4-14
8-10
9-17
L01
L19
-Hàm lượng axit (g/l)
- Sinh khối (OD)
12,0
0,623
10,0
0,504
8,8
0,522
12,0
0,641
12,0
0,559
10,0
0,598
10,0
0,596
11,0
0,702
5
-Hàm lượng axit (g/l)
- Sinh khối (OD)

18,0
0,970

18,0
0,892

14,4
0,679

16,2
0,898

18,4
0,878

16,2
0,883

18,4
0,899

18,0
0,838
6
-Hàm lượng axit (g/l)
- Sinh khối (OD)

20
2,183

22
2,311

22,5
2,113

20,8
2,166

20,4
1,934

20,2
2,103

18,9
1,986

20,2
2,087
7
-Hàm lượng axit (g/l)
- Sinh khối (OD)

18,0
1,122

18,0
1,971

18,0
0,958

18,0
1,105

18,2
0,987

18,0
0,942

18,0
0,948

18,0
0,872
8
-Hàm lượng axit (g/l)
- Sinh khối (OD)

13,0
1,280

14,0
1,307

7,8
0,508

8,1
0,725

11,3
0,950

8,6
0,612

10,2
1,834

4,6
0,594
9
-Hàm lượng axit (g/l)
- Sinh khối (OD)

3,2
0,423

4,2
0,302

4,8
0,322

4,8
0,402

3,2
0,369

4,2
0,391

3,2
0,315

3,0
0,303

Ở dải nhiệt độ nuôi từ 20-45
o
C, khả năng sinh trưởng của cả 8 chủng vi khuẩn lactic tăng
khi nhiệt độ tăng từ 20
o
C lên đến 37
o
C. Khi nhiệt độ tăng lên 45
o
C mật độ quang giảm. Khả năng
sản sinh axit lactic của các chủng vi khuẩn thì cao nhất khi nuôi cấy tại nhiệt độ là 30
0
C, thấp
hơn là ở nhiệt độ 37
0
C.

Các số liệu cũng cho thấy, nhiệt độ từ 30
o
C đến 37
o

C là thích hợp nhất
đối với các chủng vi khuẩn lactic. Nhìn chung, những chủng có khả năng sinh trưởng tốt cũng là
những chủng có khả sản sinh axit lactic cao.
Khi nuôi ở các pH từ 3-9, cả 8 chủng vi khuẩn đều có khả năng sinh trưởng và sinh axit,
nhưng tăng dần từ pH 3-7 và giảm dần khi pH nuôi càng kiềm. Thích hợp nhất cho sinh trưởng
và sinh axit ở cả 8 chủng lựa chọn là pH 6-7 với mức tương đương nhau.
Các kết quả khi nuôi cấy 8 chủng ở các nhiệt độ nuôi cấy và môi trường có độ pH khác
nhau đến khả năng sinh trưởng và sinh axit của các chủng vi khuẩn lactic được so sánh với các
kết quả nghiên cứu của I. A. Adesokan và cs (2009) trên chủng L. plantarum khi nhiệt độ và pH
tối thích là 30
0
C và 6,5.
3.4. Ảnh hưởng môi trường có nồng độ NaCl khác nhau đến khả năng sinh trưởng và sinh
axit của các chủng vi khuẩn lactic
Bảng 4. Ảnh hưởng của môi trường nồng độ NaCl khác nhau đến khả năng sinh trưởng và sinh
axit của các chủng vi khuẩn lactic
Môi trường chứa các
nồng độ NaCl
Ký hiệu chủng
2-9
2-10
3-5
4-14
8-10
9-17
L01
L19


Môi trường chứa các

nồng độ NaCl
Ký hiệu chủng
2-9
2-10
3-5
4-14
8-10
9-17
L01
L19
0%
-Hàm lượng axit (g/l)
- Sinh khối (OD)

20,0
2,234

21,8
2,326

22,8
2,103

20,8
2,124

20,0
1,917

20,0

2,162

18,8
1,905

20,2
2,073
1%
-Hàm lượng axit (g/l)
- Sinh khối (OD)

18,0
1,661

18,0
1,948

18,8
1,563

20
1,870

18,2
1,340

20,0
1,880

18,8

1,793

18,2
1,576
3%
-Hàm lượng axit (g/l)
- Sinh khối (OD)

18
1,128

18
0,998

18
0,998

20
0,963

18,2
1,150

18,2
1,086

16,2
0,861

18,9

0,896
5%
-Hàm lượng axit (g/l)
- Sinh khối (OD)

18
1,106

18
0,949

18
0,958

18,2
0,955

18
1,011

18
0,983

14,4
0,831

19,3
0,854
7%
-Hàm lượng axit (g/l)

- Sinh khối (OD)

16,2
0,601

14,4
0,436

16,2
0,699

16,2
0,663

14,4
0,641

14,4
0,613

7,0
0,472

18
0,579
8%
-Hàm lượng axit (g/l)
- Sinh khối (OD)

3,6

0,114

3,6
0,117

3,6
0,108

4,7
0,344

4,5
0,314

6,0
0,103

4,5
0,112

4,7
0,094

Nồng độ muối cũng ảnh hưởng tới khả năng sinh trưởng và sinh axit của cả 8 chủng nuôi
cấy, nhìn chung chúng đều phát triển tốt ở môi trường có nồng độ muối dưới 5%, tuy nhiên ở
nồng độ cao hơn chúng vẫn có thể sinh trưởng mặc dù ở mức kém hơn. Quan sát các số liệu tại
bảng 4 ta thấy khi môi trường có chứa 8% NaCl thì sự sinh trưởng của các chủng gần như bị ức
chế hoàn toàn, dẫn đến sự sản sinh axit cũng kém nhất.
3.5. Nghiên cứu các thông số kỹ thuật cho lên men dịch thể cấp 3
3.5.1. Lựa chọn chế độ cung cấp khí

Các chủng vi khuẩn được nuôi trên môi trường MRS, ở 30
o
C, pH 6, sử dụng nguồn
cacbon là saccharose ở các chế độ khí khác nhau: lắc 200 v/ph; để tĩnh và nuôi trong điều kiện kị
khí không bắt buộc. Sau 3 ngày, xác định sinh khối (OD), pH sau nuôi và hàm lượng axit sinh ra.
Kết quả ở bảng 5.
Bảng 5. Lựa chọn chế độ cung cấp khí
Chế độ nuôi
Chủng
2-9
2-10
3-5
4-14
8-10
9-17
L01
L19
Nuôi kị khí:
-Hàm lượng axit (g/l)
- Sinh khối (OD)

19,8
0,919

20
0,963

20,5
0,828

19,8
0,941

20
0,888

18,9
0,913

9,0
0,831

18,4
0,914
Nuôi lắc:










-Hàm lượng axit (g/l)
- Sinh khối (OD)
19,8
2,092
21,8

2,326
22,8
2,103
20,8
2,124
20,0
1,917
20
2,162
18,8
1,905
20,2
2,073
Nuôi tĩnh:
-Hàm lượng axit (g/l)
- Sinh khối (OD)

20,3
1,820

20,0
2,012

17,0
0,972

20,0
2,196

21,6

1,730

18,2
0,989

10,5
1,645

18,0
2,151

Khi nuôi ở các chế độ khí khác nhau, hàm lượng axit sinh ra của các chủng nghiên cứu
không khác nhau nhiều. Nhưng sinh khối của các chủng nuôi giảm khi nuôi tĩnh và càng giảm
hơn khi nuôi chế độ kị khí. Từ kết quả ta chọn phương pháp thì phải nuôi vi khuẩn ở chế độ cung
cấp nhiều ôxy, nếu sử dụng ủ chua thức ăn thì nuôi ở chế độ kị khí.
3.5.2. Lựa chọn tỷ lệ giống cấy thích hợp
Các chủng vi khuẩn được nuôi trên môi trường MRS, ở 30
o
C, pH 6, nguồn cacbon thay
bằng saccharose, lắc 200 v/ph, ở các tỷ lệ giống cấy khác nhau: 2; 5; 10 và 15%. Sau 3 ngày, xác
định sinh khối (OD) và hàm lượng axit sinh ra.
Bảng 6. Lựa chọn tỷ lệ giống cấy thích hợp
Tỷ lệ giống cấy ban
đầu
Chủng
2-9
2-10
3-5
4-14
8-10

9-17
L01
L19
2 (%)
-Hàm lượng axit (g/l)
- Sinh khối (OD)

10,8
1,591

12,0
1,693

12,5
1,428

14,8
1,641

13,0
1,585

12,9
1,613

13,9
1,631

14,4
1,514

5 (%)
-Hàm lượng axit (g/l)
- Sinh khối (OD

19,8
2,062

21,8
2,326

22,8
2,103

20,8
2,124

20,0
1,917

20,0
2,162

18,8
1,905

20,2
2,073
10 (%)
-Hàm lượng axit (g/l)
- Sinh khối (OD)

20,3
2,020

21,0
2,012

22,7
0,972

20,0
2,196

20,6
1,730

20,3
0,989

19,3
1,645

20,8
2,151
15 (%)
-Hàm lượng axit (g/l)
- Sinh khối (OD)

20,9
2,093

20,8
2,324

22,8
2,107

20,2
2,125

20,0
1,919

20,0
2,160

18,8
1,903

20,2
2,075
Kết quả bảng trên cho thấy, lượng giống cấy ban đầu cho quá trình lên men ở các chủng
nghiên cứu thích hợp nhất cho sinh trưởng và sinh axit trong là 5%. Khi tỷ lệ giống cấy tăng lên
lớn hơn 5% thì sự sinh trưởng và sinh axit biến đổi không nhiều. Do đó, để tiết kiệm chi phí thì
tỷ lệ giống cấy thích hợp nhất cho quá trình lên men vi khuẩn lactic là từ 5 – 10%.
3.5.3. Lựa chọn thời gian lên men vi sinh vật trong nồi lên men 10l
Các chủng vi khuẩn được nhân giống từ ống nghiệm đến cấp 3 trên môi trường MRS, lắc
200 vòng/phút ở 30
o
C. Từ môi trường nhân giống vi khuẩn được cấy vào thiết bị lên men thể tích

10 lít, chứa 5 lít môi trường thường với tỷ lệ tiếp giống 5%. Quá trình lên men diễn ra trong điều kiện
nhiệt độ 30
o
C, khuấy liên tục với vận tốc 200 vòng/phút, sục khí liên tục (0,5 lít không khí/lít dịch lên
men/phút). Cứ sau 1 ngày, xác định sinh khối (OD) và hàm lượng axit sinh ra.


Bảng 7. Lựa chọn thời gian lên men vi sinh vật trong nồi lên men 10l
Sinh trưởng và sinh axit
theo thời gian
Chủng
2-9
2-10
3-5
4-14
8-10
9-17
L01
L19
1 ngày
+Hàm lượng axit (g/l)
+ Sinh khối (OD)

9,5
0,638

9,0
0,745

8,5

0,688

7,5
0,719

10,0
0,752

9,5
0,686

9,5
0,674

10,5
0,651
2 ngày
+ Hàm lượng axit (g/l)
+ Sinh khối (OD)

17,8
0,921

17,8
0,859

18,0
0,934

18,0

0,929

17,8
0,884

18,0
0,937

16,2
0,715

17,8
0,891
3 ngày
+ Hàm lượng axit (g/l)
+ Sinh khối (OD)

20,0
2,234

21,8
2,326

22,8
2,103

20,8
2,124

20,0

1,917

20,0
2,162

18,8
1,905

20,2
2,073
4 ngày
+ Hàm lượng axit (g/l)
+ Sinh khối (OD)

20,0
2,238

20,0
2,290

20,8
2,136

20,0
2,130

20,8
2,131

19,8

2,181

18,7
1,814

20,0
1,929
5 ngày
+ Hàm lượng axit (g/l)
+ Sinh khối (OD)

20,0
1,902

19,8
2,026

19,8
1,825

19,8
1,93

20,0
1,89

19,0
2,047

18,5

1,798

19,5
1,901
6 ngày
+ Hàm lượng axit (g/l)
+ Sinh khối (OD)

19,8
1,841

19,0
1,900

19,0
1,821

18,8
1,844

19,0
1,83

18,8
2,008

18,0
1,729

19,2

1,86
7 ngày
+Hàm lượng axit (g/l)
+ Sinh khối (OD)

19,5
1,722

19,0
1,862

19,0
1,716

18,4
1,840

18,8
1,783

18,8
1,912

17,8
1,659

19,0
1,823

Qua các số liệu ở bảng 7 ta thấy, các chủng nuôi cấy sinh axit đồng thời với quá trình

sinh trưởng ngay từ ngày đầu tiên. Sau 1 tuần nuôi cấy, hàm lượng axit cũng không có sự thay
đổi nhiều. Thời gian lên men thích hợp nhất đối với các chủng là sau 72 giờ. Sau 72 giờ gần như
hàm lượng axit sinh ra không tăng, trong khi đó sự sinh trưởng của các chủng lại bắt đầu giảm.
Điều này có thể xuất phát từ nguyên nhân, lượng axit sinh ra nhiều, giảm pH môi trường nuôi
cấy dẫn đến ức chế sự sinh trưởng của chính các chủng vi khuẩn này. Với các kết quả nghiên cứu
của I. A. Adesokan và cs (2009) trên chủng L. plantarum, L. fermentum, L. casei, L. brevis, L.
acidophilus thì thời gian lên men thích hợp nhất lại là 48 giờ. Khi thời gian lên men là 72 giờ thì
sự sinh axit lactic lại có phần giảm nhẹ.
3.5.4. Khả năng tổ hợp các chủng vi sinh vật trong bảo quản chế phẩm dạng lỏng
Theo Mcdonald. (1991), trong hỗn hợp ủ chua chất lượng tốt, sự axit hóa được thực hiện
đầu tiên bởi các VK lactic lên men đồng hình, đặc biệt là các L. plantarum và L. curvatus, nhưng
chỉ sau 4 ngày, 85% các chủng VK tham gia vào quá trình axit hóa là các chủng lên men dị hình
và chúng chiếm ưu thế cho đến cuối thời kỳ lên men. Một nghiên cứu khác (Dellaglio, 1985) đã


cho thấy, quá trình lên men được bắt đầu bởi các vi khuẩn lactic lên men đồng hình, chúng
chiếm ưu thế trong 60 ngày đầu, sau đó số lượng của chúng bắt đầu giảm dần cùng với sự chiếm
ưu thế của nhóm VK lên men dị hình.
Từ các tài liệu tham khảo trên, chúng tôi xây dựng các tổ hợp chất cấy vi sinh vật theo 2
hướng khác nhau dùng cho thử nghiệm ủ cỏ bao gồm: hỗn hợp các chủng sinh lactic đồng hình,
hỗn hợp của các chủng đồng hình và dị hình.
- Tổ hợp 1: gồm các chủng thuộc loài Lactobacillus plantarum 2-10; 3-5, 8-10 và 9-17 là
các chủng có khả năng sinh axit đồng hình, bacteriocin, enzym ngoại bào cao, dải pH và nhiệt độ
sinh trưởng rộng, sử dụng được nhiều nguồn đường cho sinh trưởng
- Tổ hợp 2: gồm các chủng 2-9; 9-17; L01; L19 sinh axit đồng hình và dị hình,
bacteriocin, enzym ngoại bào cao, dải pH, nhiệt độ sinh trưởng rộng, sử dụng được nhiều nguồn
đường cho sinh trưởng Tổ hợp này kết hợp giữa các loài Lactobacillus plantarum, L. pentosus
và Enterococcus lactis. Các chủng vi khuẩn này đều không có tính đối kháng lẫn nhau nên hoàn
toàn có thể phát triển bình thường trong 1 tổ hợp.
Các chủng vi sinh vật được nuôi cấy riêng rẽ và trộn lại với nhau theo tỷ lệ như nhau và

được bổ sung 30% vào dung dịch 5% rỉ đường, bảo quản theo thời gian. Cứ sau 2 tuần kiểm tra
số lượng vi sinh vật.
Bảng 8. Số lượng vi sinh vật trong các tổ hợp
Thời gian bảo
quản (tuần)
Số lượng vi sinh vật (cfu/ml)
Tổ hợp 1
Tổ hợp 2
0
1,2 x 10
8

1,0 x 10
8

2
5,2 x 10
9

6,5 x 10
9

4
4,5 x 10
9

6,6 x 10
9

8

7,2 x 10
7

2,6 x 10
8

12
1,5 x 10
6

6,4 x 10
7

16
5,5 x 10
5

1,2 x 10
6


Kết quả sau thời gian bảo quản, cả 2 tổ hợp các chủng đều phát triển tốt, tăng số lượng
sau 2 tuần và vẫn duy trì tốt sau 8 tuần. Số lượng vi sinh vật trên cả 2 tổ hợp đều giảm mạnh sau
16 tuần bảo quản, chỉ còn 10
5
- 10
6
tế bào/ml. Tuy vậy, nếu hoạt hóa lại bằng môi trường thích
hợp số lượng vi sinh vật lại tăng lên 10
8

-10
9
tế bào/ml


3.6. Sản xuất chế phẩm dạng bột
Từ các nghiên cứu tối ưu cho sản xuất chế phẩm dạng bột bằng phương pháp sấy phun và
phương pháp lên men xốp với các cơ chất cám gạo, bột gạo, bột sắn, sấy khô ở 40
o
C. Kết quả
xác định số lượng vi sinh vật được trình bày ở bảng 9.
Bảng 9. Nghiên cứu chế phẩm dạng bột
Tổ hợp
Phương pháp
Trước khi xử
lý
Sau sấy
phun
Cơ chất trộn
Cám gạo
Bột gạo
Bột sắn
Tổ hợp 1
Sấy phun

6 x 10
9

16 x 10
8

Trộn cơ chất

6 x 10
9


6 x 10
9

7,7 x 10
8

9 x 10
7

Tổ hợp 2
Sấy phun

7 x 10
9

26 x 10
8

Trộn cơ chất

7 x 10
9


18 x 10
8

8,5 x 10
8

2 x 10
8


Kết quả ở bảng 9 cho thấy, số lượng vi khuẩn giảm khoảng 3 - 4 lần trong quá trình sấy
phun đối với cả 2 tổ hợp, trong khi đó số lượng vi khuẩn nghiên cứu ở thí nghiệm lên men xốp
với cơ chất là cám gạo thì cao hơn với tổ hợp 1 nhưng lại thấp hơn khi lên men với tổ hợp 2. Các
cơ chất lên men là bột gạo và bột sắn thì thấp hơn hẳn.Mặt khác khi phân lập chế phẩm ở dạng
sấy phun ta thấy không có các vi sinh vật nhiễm vào chế phẩm, còn trên chế phẩm dạng lên men
xốp lại vẫn thấy xuất hiện các khuẩn lạc lạ nhiễm vào. Điều này thật dễ hiểu vì điều kiện sấy
phun ở nhiệt độ cao hơn so với lên men xốp nên không tạo điều kiện cho các vi sinh vật lạ phát
triển.Vi sinh vật bị nhiễm trong chế phẩm lên men xốp này, khả năng đã có sẵn trong cơ chất và
chủ yếu là các loại có bào tử nên không bị tiêu diệt khi pH giảm. Vì vậy trong quá trình sản xuất
chế phẩm dạng bột theo phương pháp lên men xốp có thể sử dụng cơ chất là cám gạo.
3.7. Bao gói và bảo quản sản phẩm dạng bột
Sản xuất 5 kg chế phẩm cho mỗi tổ hợp chủng theo các điều kiện tối ưu. Sau khi sấy khô,
từ 2 phương pháp trộn trực tiếp trên cám và sấy phun, được đóng gói hàn kín trong túi PE và bảo

quản trong điều kiện nhiệt độ phòng. Việc kiểm tra, đánh giá chất lượng sản phẩm được tiến
hành theo thời gian: 2 tuần/lần.
Bảng 10. Số lượng vi sinh vật trong các tổ hợp bảo quản
Thời gian bảo
quản (tuần)
Số lượng vi sinh vật (cfu/ml)
Tổ hợp 1
Tổ hợp 2
Sấy phun
Lên men xốp
Sấy phun
Lên men xốp
0
16 x 10
8

6 x 10
9

26 x 10
8

18 x 10
8

2
14 x 10
8

5 x 10

9

22 x 10
8

15 x 10
8

4
13 x 10
8

4 x 10
9

19 x 10
8

13 x 10
8

8
9 x 10
8

1 x 10
9

15 x 10
8

10 x 10
8

12
7 x 10
8

7 x 10
8

12 x 10
8

6 x 10
8



16
5 x 10
8

4 x 10
8

9 x 10
8

3 x 10

8


Kết quả bảng 10 cho thấy, các tổ hợp chủng có số lượng không thay đổi sau 4 tuần bảo
quản. Số lượng tế bào giảm nhẹ sau 14 tuần bảo quản. Công việc này sẽ được tiếp tục thực hiện
cho đến khi kết thúc đề tài.
4. Kết luận
- Tám chủng vi khuẩn được lựa chọn các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh trưởng và
sinh tổng hợp axit cao nhất trên môi trường MRS và cà chua, ở 30-37
o
C, pH 6-7, nồng độ NaCl
<5%, trên nguồn cacbon glucose, saccharose, với các nguồn hữu cơ (peptone hoặc cao men).
Nuôi cấy lắc, thời gian 3 ngày, tỷ lệ giống cấy ban đầu khoảng 5-10%.
- Xây dựng các tổ hợp chủng vi sinh vật theo 2 hướng khác nhau để dùng cho thử nghiệm
ủ cỏ bao gồm: hỗn hợp các chủng sinh lactic đồng hình, hỗn hợp của các chủng đồng hình và dị
hình.
- Xây dựng được quy trình sản xuất cho các chế phẩm dạng bột và dịch thể.
- Các chế phẩm vẫn duy trì số lượng như ban đầu sau 4 tháng bảo quản.
Tài liệu tham khảo
1. Adeosokan.I.A, Odetoyinbo.B.B and Okanlawon.B.M. 2009. Optimization of lactic acid production by
lactic acid bacteria isolated from some tradiotional fermented food in Nigieria. Parkistan Journal of
Nutrition 8 (5): p. 611-615.
2. McDonald P, Henderson N, Heron S. 1991. The Biochemistry of Silage, Second Edition. Chalcombe
Publications, Marlow, Buckinghamshire, England.
3. Maizirwan Mel, Mohamad Ismail Abdul Karim, Mohamad Ramlan Mohamed Salleh and Noraini Alamin
Mohamad Amin. 2008. Optimizing media of Lactobacillus rhamnosus fỏ lactic acid fermentation. Journal
of applied Sciences 8 (17): p. 3055-3059.