BÁO CÁO ENZYM CYSTEINE_PROTEASES va SUBTILISIN

Công nghệ Enzyme
CYSTEINE PROTEASES
1. Giới thiệu
Protease cysteine (CPS) có mặt trong tất cả các sinh vật sống. Hơn hai
mươi họ của protease cysteine đã được mô tả nhiều, trong số đó
papain,bromelain, ficain, cathepsins động vật có tầm quan trọng công nghiệp.
Gần đây protease cysteine, trong lysosomal cathepsins cụ thể, đã thu hút sự
quan tâm của ngành công nghiệp dược phẩm điều trị bệnh như loãng xương,
viêm khớp dạng thấp, xơ cứng động mạch, ung thư, và viêm và bệnh tự miễn
dịch,.
2. Cấu trúc và chức năng
2.1. Phân loại và tiến hóa
Protease cysteine (EC.3.4.22) là các protein của khối lượng phân tử khoảng
21-30 kDa. Chúng xúc tác thủy phân các liên kết của peptide, amit, este, este
thiol và thiono ester.
CP có thể được chia thành:
• Exopeptidases: cathepsin X, carboxypeptidase B
• Endopeptidases: papain, bromelain, ficain, cathepsins
Exopeptidaseschia cắt liên kết peptide gần đầu amino hay hoặc carboxy
termini của co chất, trong khi endopeptidases cắt liên kết peptide từ xa-N hoặc
C-termini.
Cysteine proteases phân cắt thành 5 clans:
• CA (papain-like enzymes)
• CB (viral chymotrypsin-like CPs),
• CC (papain like endopeptidases of RNA viruses)
• CD (legumain-type caspases)
• CE (containingHis, Glu / ASP, Gln, Cysresidues in the catalytic
clef )
Các CPS được tổng hợp như là tiền chất không hoạt động với một N-terminal
propeptide N và một peptide tín hiệu.
2.2. Papain

Papain là cysteine protease được nghiên cứu nhiều nhất. Nó được phân tách
vào năm 1879 từ đu đủ và cũng là protease đầu tiên cho cấu trúc dạng tinh thể
được xác định.
Nhựa mủ khô đu đủ có chứa một hỗn hợp của ít nhất bốn protease cysteine
(papain, chymopapain, caricain, glycylendopeptidase) và enzyme khác.
Trung tâm hoạt động gồm –SH Cys 25 và nitrogen (b3) His159 bên cạnh đó
nhóm imidazole của His 159 liên kết với ASN 175. Phương pháp tinh chế
papain chiết nước giảm tác nhân chelat hóa, kết tủa muối và trích dung môi.
Tinh chế bằng phương pháp sắc ký ái lực
1
Công nghệ Enzyme
Papain gồm 212 amino acid với 3 cầu nối disulphide. Trọng lượng phân tử
23.4kDa. Nó có bản chất là protein có pI 8.75. Phân tử papain bị gấp thành 2
phần riêng biệt bởi 1 khe.
Một số cấu trúc phức hợp papain với các phân tử và chất ức chế được giải thích
bởi tia X. Sau khi khí hiệu của Schechter và Berger, cơ chất của nhóm papain
liên kết có ít nhất 7 acid amin trong Sn thích hợp. Dựa trên cơ sở của động lực
học và cấu trúc dữ liệu Turk et al. đề xuất rằng chỉ có 5 cơ chất quan trọng cho
cơ chất liên kết. Theo đề nghị của họ, S2, S1 và S1’ , subsite là quan trọng cho
cả 2 backbone và 1 chuỗi liên kết, trong khi S3 và S2’ thì chỉ quyết định cho 1
chuỗi. Một ưu tiên cho cơ chất có chứa một số chuỗi kỵ nước lớn ở vị trí P2
được tìm thấy, acid amin ở vị trí P1 của cơ chất ảnh hưởng đến cơ chất liên kết
với enzyme để có một mức độ nhỏ hơn. Có một số chấp nhận cho acid amin cơ
bản (Arg, Lys) trong vị trí này nhưng Val thì không chấp nhận. S3 liên kết với
enzyme để less constrained. Nó có thể thích nghi với chuỗi acid amin.
Nói chung papain có tính đặc hiệu rõ ràng và chia ra thành cấu tử peptide
khác. pH hoạt động tối ưu của papain 5.8 – 7 và tại nhiệt độ 50-57
0
khi casein
được dùng như một cơ chất. Papain được bảo quản trong nhiều tháng ở 4

0
.
Hoạt độ sẽ giảm trong quá trình lưu trữ là do quá trình oxy hóa một phần nhóm
thiol.
2.3. Bromelain
Các 'tên bromelain' ban đầu tổng hỗn hợp của proteases được tìm thấy trong
nước của thân cây và trái cây của dứa.
Nó là một đơn chuỗi protein glycosylated có trọng lượng phân tử 24,5 kDa,
chứa 212 amino
Phân tử bromelain có bảy cysteines, một trong số đó là tham gia vào việc
xúc tác. Các sáu khác có liên quan trong cặp hình thành ba cây cầu disulphide.
pH tối ưu cho hoạt động bromelain là 6-8,5 nhiệt độ tối ưu enzyme này là
50-60 C.
Bromelain được tác chế từ bột khô bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion
hay sắc ký ái lực. Bromelain nguyên chất ổn định ở - 20
0
. pH hoạt động tối ưu
của Bromelain 6 – 8.5 cho hầu hết các cơ chất, và khoảng nhiệt độ 50- 60
0
.
Fruit Bromelain là một chuỗi đơn glycosylated protein có trọng lượng phân
tử 25kDa. Nó có hoạt tính phân giải giống như phân tử bromelain và có tính
đặc hiệu rõ ràng cho cấu tử peptide.
2.4. Ficain
Ficain tên của protease cysteine phân lập từ mủ cao su khô.
Ficain có thể được tinh chế bằng lọc gel theo sau sắc ký cộng hóa trị.
pH tối ưu là 5-8, trong khi nhiệt độ tối ưu là 45-55 C.
enzyme này có đặc trưng rộng với sự chấp nhận của dư lượng amino acid kỵ
nước (Phe, Leu, Val).
2.5. Cathepsins

Lysosomal cathepsins là một nhóm quan trọng của enzym chịu trách nhiệm đối
với một số các quá trình sinh lý bao gồm cả sự xuống cấp protein của tế bào.
2
Công nghệ Enzyme
Tất cả Cathepsins có vùng hoàn chỉnh của 214 – 260 amino acid. Cấu trúc của
Cathepsins là một L-domain chứa cấu tử cysteine hoạt động, một α - helix bảo
tồn, R-domain với cấu tử histidine và 4-6 beta-strands. Với sụ chấp nhận của
cathepsins S, cathepsins người có pH acid tối ưu của lysosomal compartment
và chúng ngừng hoạt động tại neutral pH. Cathepsins có tính đặc hiệu khác
nhau mà có liên quan chức năng rõ ràng trong các mô khác nhau.
3.ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP CỦA CYSTEINE PROTEASE
Enzym thủy phân (proteases) đóng một vai trò quan trọng trong ngành công nghệ
sinh học. Cysteine proteaza của cây và những cathepsin động vật có tầm quan
trọng thương mại đáng kể do hoạt động phân giải protein mạnh mẽ của chúng .
Hầu hết các ứng dụng công nghiệp của các enzyms được mô tả cụ thể trong nhiều
cuốn sách được xuất bản trong những năm gần đây
Một số ứng dụng công nghiệp chủ yếu được trình bày :
ỨNG DỤNG ENZYM ĐƯỢC SỰ
DỤNG
LÝ DO SỬ DỤNG
Chất tẩy rửa sinh học papain, bromelain loại bỏ các vết bẩn protein
Ngành công nghiệp
bánh
bromelain, papain giúp cải thiện xủ lý các khối bột mì,
ngăn ngừa bột teo co lại, và cho phép
lưu lượng lò bánh mỳ nhanh hơn
Ngành công nghiệp
sản xuất bia
bromelain, papain loại bỏ vẩn đục (kết tủa) trong thời
gian lưu trữ bia, chia nhỏ protein ra

từng phần trong mạch nha
Ngành công nghiệp
sữa
bromelain, papain nước sữa đã tách pho mat, chất làm
ngọt, pho mai
Ngành công nghiệp
nhiếp ảnh
Ficin hòa tan gelatin vào mảnh phim cho
phép khôi phục lại sự hiện diện của
bạc
Công nghiệp thực
phẩm
bromelain, papain,
cathepsins
tenderizer (cho) thịt, làm chất dinh
dưỡng cấp cao, làm những sản phẩm
Protein và bữa ăn sáng và đồ
uống, ổn định gelatin, thực phẩm sức
khỏe, thực phẩm lên men khô
rippening
Xử lý chất thải bromelain, papain dlowering độ nhớt của nước chiết
xuất (dính nước), Protein và sự sản
xuất peptit
3
Công nghệ Enzyme
Sự sản xuất
Chitooligosaccharides
bromelain thô,
papain thô
sự giải trùng hợp chitosan để sử dụng

trong dược,. thức ăn động vật, y học
Thủy hải sản bromelain, papain sự sản xuất surimi, Protein
hydrolyzates
Ngành công nghiệp
mỹ phẩm
bromelain, papain hiệu ứng speeling, sự tẩy trắng răng,
có thể giúp xua tan những mụn nhọt,
làm sạch mặt
Công nghiệp
Parmaceutic. và y học
bromelain, papain giết chết các tế bào bạch cầu bạch
huyết, probacteria, tuberculars ký
sinh trùng và trực khuẩn, giúp giảm
viêm, bình thường hóa chức năng của
túi mật này, giảm đau và tăng cường
tiêu hóa
Dệt bromelain, papain sử dụng để xử lý lông cừu, sôi bên
ngoài những tổ kén và tinh chế lụa tơ
tằm
Ngành công nghiệp
Da
Papain thuốc làm rụng lông cho da
Thức ăn gia súc bromelain, papain để tăng khả năng sử dụng và đảo
ngược của các protein làm giảm chi
phí thức ăn thô xanh và khai thác
nguồn protein
Công nghiệp Hóa
học(sythesis hữu cơ)
bromelain, papain tổng hợp aspartam, các hợp chất
antitumor, hoạt tính sinh peptide

3.1 Sản xuất bia và rượu:
Bia có độ sáng và trong được người tiêu dung ưa thích hơn.
Các thành phần khác nhau được sử dụng trong sản xuất bia kết hợp với protein tạo
ra các phức không hòa tan xuất hiện như là một kết tủa cố định. Khi bia được ướp
lạnh làm tăng tính không hòa tan và kết tủa mạnh hơn. Xử lý với một số enzyme
protein (thường là papain thô hoặc bromelain) kết quả trong bia giữ nguyên độ
trong và tươi khi ướp lạnh. Hiện tại ở một số nước châu Âu, papain ko được sử
dụng rộng rãi vì nhiều xu hướng cho các loại bia hiện hành .
3.2 Ngành công nghiệp bánh:
Protease được sử dụng trong ngành công nghiệp nướng(bánh) vì bột có thể được
làm nhiều hơn, nhanh chóng hơn nếu nó có chứa gluten đã được thủy phân một
4
Công nghệ Enzyme
phần. Khi các giống lúa mì cao gluten được sử dụng thì các gluten phải được thủy
phân một phần để làm bánh quy hoặc ngăn ngừa co rút của bánh pie thương mại.
Bromelain đã được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp nướng (bánh mì) vì
tốc độ phản ứng nhanh chóng của nó , pH rộng và Optima nhiệt độ và thiếu
amylase hoặc bên pentosanase hoạt động. Protease giúp cải thiện xử lý các khối
bột mì, ngăn ngừa bột teo co lại, và cho phép lưu lượng lò bánh nhanh hơn.
3.3. Thực phẩm chế biến
Thủy phân protein thực phẩm động vật hoặc thực vật được thực hiện cho các mục
đích khác nhau: để cải thiện các đặc tính dinh dưỡng, để làm chậm quá trình hư
hỏng, sự cải tiến những đặc tính chức năng khác (độ hòa tan, sủi bọt sự đông đặc,
và những khả năng nhũ tương hóa), ngăn ngừa những tương tác không mong
muốn, để thay đổi vị ngon và mùi hương, và loại bỏ những nhân tố độc hại hay
kìm hãm, ngoài ra enzim thủy phân mạnh mẽ được ưu tiên hơn các phương pháp
hóa học bởi vì nó tạo ra sản phẩm thủy phân có chứa hỗn hợp peptide được xác
định rõ và tránh sự phá hủy của axit L-amino và hình thành các chất độc hại.
Protease cysteine, đặc biệt là papain và bromelain, được sử dụng rộng rãi để thủy
phân protein làm sản phẩm có hương vị tuyệt vời hơn vì mất vị đắng . Hải sản ,

trứng và thực vật (đậu nành, lúa mì, gạo, hoa hướng dương, mè và ngô) được thủy
phân protein không chỉ tăng cường hương vị tuyệt vời trong một loạt các loại thực
phẩm mà còn cải thiện đồng hóa protein
Casein và whey (nước sữa đã pho mát) là một số protein quan trọng có sẵn trong
tự nhiên. Whey protein tạo ra sự gia tăng đáng kể trong việc hình thành bọt và cấu
trúc bọt xốp ổn định có thể giảm bớt bởi sự thủy phân protein. Những sản phẩm
thủy phân protein sữa cũng được sử dụng trong y tế và củng cố những đồ uống
thể thao, ở trẻ sơ sinh tiêu hóa dinh dưỡng kém và thức ăn kiêng dể tiêu hóa.

Enzym được áp dụng rộng rãi trong một số công thức nấu ăn để làm thịt mềm hơn.
Tính mềm dẻo và không dai được xác định là những yếu tố quan trọng nhất ảnh
hưởng đến sự hài lòng của người tiêu dùng khi cảm nhận bằng vị giác. Làm mềm
thịt có thể được thực hiện bằng cách phá vỡ các-liên kết chéo giữa các sợi protein
thịt (collagen và elastin), hoặc bằng cách chia thịt thành những mãnh nhỏ Các
enzym truyền thống này là papain, bromelain hoặc ficin. được phun hoặc rắc vào
thịt. Tuy nhiên, các enzym có nguồn gốc thịt - cathepsins và calpains - đóng một
vai trò đặc biệt trong việc làm mềm thịt của quá trình lão hóa được kiểm soát. Thịt
từ động vật lớn tuổi vẫn còn khó khăn nhưng có thể được làm mềm bằng cách
tiêm papain không hoạt động vào tĩnh mạch cổ các động vật sống lâu trước khi
giết mổ. Sau khi giết mổ, việc giảm kết quả gây ra sự tích tụ các thiol tự do trong
bắp thịt, kích hoạt papain làm mềm thịt. Đây là một quá trình có hiệu quả cao khi
chỉ cần 2-5 ppm của enzyme không hoạt động được tiêm., Tuy nhiên, gần đây cho
5
Công nghệ Enzyme
thấy rằng điều này đã phá hủy nội tạng của động vật như tim , gan và thận nên
không thể bán ra thị trường Hoạt động của papain khó kiểm soát và lẫn vào quá
trình nấu. Papain và bromelain cũng như protease cysteine nội sinh được sử dụng
để tăng tốc quá trình chín của xúc xích khô lên men. Và sấy khô giăm bông . Các
hoạt động của protease cysteine nội sinh (chủ yếu là cathepsins) hoạt hóa trong
thời gian nấu được gây ra sự giảm phẩm cấp myosin và sự mất mát kế tiếp (của)

kết cấu
Trong sản xuất surimi, quá nhiều hoạt động protease cysteine là không mong
muốn, do đó ức chế proteinase được áp dụng để ngăn chặn làm suy giảm tính đặc
quánh. Các ứng dụng khác bao gồm: sản xuất đậu mất nước, thức ăn trẻ em, thực
phẩm dễ dàng tiêu hóa của bệnh nhân, kẹo mềm, khử mùi thực phẩm
3.4. Thức ăn vật nuôi :
Việc bổ sung papain vào một số thức ăn xanh thô để pha trộn có thể làm tăng giá
trị sẵn có của protein, giảm chi phí thức ăn gia súc và khai thác nguồn protein.
Một ứng dụng quan trọng của protease trong ngành công nghiệp thức ăn cho thú
nuôi là sản xuất nguyên liệu thô hóa lỏng và tạo ra một hương vị chấp nhận được.
Sau đó trộn vào thức ăn khô của vật nuôi để cải thiện vị ngon của nó.
3.5. Sử dụng sản phẩm phụ.
Gần đây, vật liệu chitosan đã nhận được sự quan tâm đáng kể vì chúng rất hữu ích
trong thực phẩm và nông nghiệp, các ngành công nghiệp vì có những hoạt tính
sinh học khác nhau. Chitosan là một dẫn xuất của chitin deacylated là một
polysaccharide thiên nhiên phong phú tìm thấy trong các bộ xương ngoài của các
sinh vật như động vật giáp xác, côn trùng, và trong nấm. Vật liệu Chitin thu được
từ ngành công nghiệp thủy hải sản như một sản phẩm chất thải rắn. Chitosan
depolymerisation tăng độ hòa tan của nước và làm giảm độ nhớt cũng như hình
thành gel đàn áp trong thời gian lưu trữ. Vì vậy các depolymerisation của chitosan
có thể tạo ra các vật liệu liên quan đến chitosan trong nhiều lĩnh vực. Papain,
bromelain và ficin thô được sử dụng rộng rãi cho depolymerisation chitosan Tuy
nhiên, thủy phân chitin và chitosan bằng bromelain gốc là kết quả của chitinase và
các hoạt động chitosanase hiện diện trong enzyme thô chứ không phải do
bromelain, proteases cysteine từ cây được sử dụng để cải thiện việc thu hồi các
protein từ chất thải lò mổ và chế biến đậu nành. Các protein được thu hồi sau đó
được sử dụng trong cả hai ngành thức ăn gia súc và ngành công nghiệp thực phẩm
do có giá trị dinh dưỡng tốt và có tính năng vượt trội .
6
Công nghệ Enzyme

Ngày nay papain và protease vi khuẩn kiềm cũng được sử dụng đối với chất thải
cá để giảm độ nhớt của chất lỏng ở cá trong sản xuất thức ăn gia súc, cũng như để
trích xuất carotenoproteins từ tôm nâu .
protease cysteine cũng được sử dụng trong tiêu phí cơ xương (xương làm sạch) và
quá trình phục hồi thịt. Để khôi phục vật chất này, xương được nghiền nát và ủ ở
60
0
C với protease trung tính hoặc kiềm cho đến 4 giờ.
Các bùn thịt được sử dụng trong thịt, xúp đóng hộp và những xương không protein
được sử dụng như một nguồn Gelatin
3.6. Công nghiệp thuộc da
Papain hoạt động như một tác nhân gây rụng lông. Papain cùng với silicat hòa tan
được sử dụng như thuốc làm rụng lông cho da, làm cho sản phẩm nhẵn bóng.
3.7. Công nghiệp dệt may
Papain được dùng để chế biến lông cừu và tinh chế tơ lụa, sẽ cho ra các sản phẩm
không co rút và khá mềm mại do papain có thể hòa tan sericin nhưng không ảnh
hưởng đến protein sợi tơ.
3,8. Công nghiệp mỹ phẩm
Papain giúp xua tan các mảng sần và mụn, làm sạch da mặt và thúc đẩy lưu thông
máu giúp cho làn da khỏe mạnh và mềm mại. Papain và bromelain được dùng
trong các sản phẩm lột da mặt.
3.9. Hóa hữu cơ
Papain sử dụng trong tổng hợp axit amin, các peptide có hoạt tính sinh học, thuốc
chống ung thư và polyaspartate.
4. Sử dụng protease cysteine trong ngành dược và y tế
Bromelain được xem như một hợp chất điều trị kể từ năm 1957. Nguyên
tắc hoạt động của Bromelain: ức chế kết tập tiểu cầu, chống viêm, điều tiết
cytokine và sự miễn dịch, làm lành da bị bỏng, chống khối u, tăng cường hấp thu
các loại thuốc khác, làm loãng đàm ứ động, trợ giúp tiêu hóa, góp phần làm lành
vết thương và tăng cường hệ tim mạch và tuần hoàn.

Papain có tác dụng chữa lành vết thương, loại bỏ các mô hoại tử, mụn cóc
và sẹo, điều trị mụn trứng cá, làm sạch da và là một thành phần của kem đánh
răng. Papain còn dùng để điều trị bệnh Parkinson, tạo vắc-xin uốn ván và kháng
thể.
7
Công nghệ Enzyme
Chymopapain được sử dụng để phân hủy đĩa đệm xương sống bị hư hỏng
của con người.
Đó chỉ là một vài giá trị ứng dụng của cysteine protease. Trong tương lai kỹ thuật
di truyền sẽ được áp dụng đối với enzym để đáp ứng theo yêu cầu của con người.
SUBTILISIN
1. Giới thiệu
Enzym proteases có mặt khắp mọi nơi trong tự nhiên. Subtilisin
(EC.3.4.21.62) là một phân nhánh của nhóm serine proteases (EC.3.4.21 ) với
điểm đặc trưng là sử dụng đơn phân Serine (Ser) nằm trong trung tâm xúc tác phản
ứng của enzyme. Trung tâm hoạt động của enzyme này là bộ 3 amino acid truyền
thống của serine proeases Aspartate, Histidine và Serine giống như enzyme trypsin
và chymotrypsin ở hệ tiêu hóa động vật có vú. Subtilisin là phân nhóm lớn thứ hai
và thuộc phân nhóm S8 của protease, trong đó có hơn 200 enzym đã biết trình tự
axit amin. Chúng bao gồm nhiều loại hoạt động trong phạm vi rộng lớn, chẳng hạn
như endopeptidases, exopeptidases, oligopeptidases. Hơn 20 phân nhóm được chia
thành 6 nhóm lớn dựa trên cấu trúc và chức năng giống nhau của chúng. Subtilisin
được tìm thấy trong Archaebacteria, Eubacteria, Eukaryotes và Virus. Subtilisin
vi khuẩn là phân nhóm quan trọng và được nghiên cứu rộng rãi, liên quan đến sự
nâng cao hiệu quả xúc tác và tính ổn định của chúng. Đặc biệt subtilisin thu nhận
từ vi khuẩn có nhiều ứng dụng trong chất tẩy rửa.
2. Đặc tính chung của sutilisin
8
Công nghệ Enzyme
Serine proteases có một bộ ba axit amin xúc tác đặc trưng là Aspartate,

Histidine và Serine. Trong đó, serine có vai trò hình thành liên kết cộng hóa trị với
nguyên tử carbon trong nhóm carboxyl của phân tử cơ chất nhờ có hỗ trợ của
histidine, aspartate như một chất ái lực để gắn enzym với cơ chất. Điểm chú ý ở
đây là cấu trúc hình học trung tâm hoạt động của các phân nhóm tương tự nhau,
tuy nhiên có sự khác nhau của các nếp gấp protein và một số trình tự khác. Sự sắp
xếp của các cấu tử xúc tác ở trung tâm hoạt động mang lại mối liên hệ giữa các
phân nhóm, ví dụ như ở chymotrypsin trình tự các cấu tử là his-ser-asp, còn ở
subtilisin là asp-his-ser.
Tất cả các enzyme xúc tác quá trình thủy phân peptide và liên kết este đều
thông qua sự hình thành của acyl-enzym. Sau khi phức hợp enzyme-cơ chất hình
thành, nguyên tử carbon trong nhóm carbonyl hình thành liên kết với vùng hoạt
động serine. Trong subtilisin, xảy ra các bước sau:
Bước 1: Acyl hóa: Hình thành liên kết cộng hóa trị giữa nhóm -OH của
serine với nguyên tử carbon trong nhóm carboxyl của phân tử cơ chất nhờ có hỗ
trợ của nhóm imidazole từ histidine bằng liên kết LBHB (low-barrier hydrogen
bond). Kết quả phản ứng này là tạo ra một hợp chất trung gian và một ion
imidazolium (phản ứng cộng). Hợp chất trung gian không bền này nhanh chóng bị
thủy phân thành một acyl-enzyme, vòng imidazole và một amine (phản ứng khử).
Bước 2: Khử acyl hóa: Phức hệ acyl - enzyme bị thủy phân bởi phân tử
H
2
O theo chiều ngược lại của bước một. Trong đó, nhóm imidazole chuyển proton
của gốc -OH từ serine cho nhóm amine để tái sinh lại enzyme.
Hầu hết các proteases S8 đều là endopeptidase, chúng hoạt đông ở pH
kiềm, có nhiều loại chịu nhiệt tốt, do đó chúng có nhiều ứng dụng. Hầu hết chúng
không đặc hiệu do có số vòng tuần hoàn cao và sự tách nước ở đầu C của phân tử
kỵ nước. Subtilisin có thể gắn lên cơ chất lớn hơn peptide hay protein do đó chúng
còn được sử dụng cho các phản ứng mà cơ chất không có trong tự nhiên trong các
phản ứng tổng hợp. Trong các trường hợp đó thì subtilisin có sức chịu đựng ở
trong nhân hơn là ở nhóm carboxyl. Ngoài ra chúng còn bị ức chế bởi các chất ức

chế serine proteases, ví dụ như diisopropyl fluorophosphates hay
phenylmethanesulfonyl fluoride.
Cấu trúc bậc ba của chúng được xác định dưới các điều kiện khác nhau, các
protease S8 có 3 phân lớp với 7 nếp gấp β được kẹp giữ hai lớp vòng xoắn α (Hình
1). Sự ổn định cấu trúc của các enzyme này được minh họa bởi sự ổn định của
subtilisin Carlsberg trong dung môi hữu cơ. Điểm đặc trưng khác của các nhóm
proteases là sự có mặt của một hay nhiều Calcium binding, chúng góp phần rất lớn
vào khả năng chịu nhiệt của các enzym.
9
Công nghệ Enzyme
Sự phát triển của kỹ thuật tái tổ hợp DNA đã đưa đến một cuộc cách mạng
trong sự phát triển của các enzym mới và sự nghiên cứu cấu trúc và chức năng của
protein. Mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng của subtilisin đã được trình bày
trong những nghiên cứu gần đây, sự đột biến đơn ở subtilisin BPN’ không gây ra
sự biến đổi cấu trúc của nó, chúng chỉ bị xáo trộn nhỏ nhưng không làm thay đổi
cấu trúc. Điều này đóng vai trò quan trọng trong quá trình xúc tác của enzym, và
enzym subtilisin Carlsberg cũng có đặc tính này do chúng chỉ khác subtilisin
BPN’ khoảng 31%. Tuy nhiên những trình tự khác nhau này vẫn phải được kể đến
trong các nhóm enzym. Toàn bộ cấu trúc của subtilisin không thể làm xáo trộn
một cách dễ dàng bằng đột biến, đột biến đơn có thể dẫn đến những ảnh hưởng
quan trọng trong hiệu quả xúc tác, cơ chất và tính ổn định.
3. Công nghệ sinh học về subtilisins
Subtilisin trở thành một mô hình cho những nghiên cứu khoa học về
protein. Những nghiên cứu khoa học của Subtilisin được bắt đầu từ năm 1960,
mục đích là nghiên cứu về những protein xúc tác và tính ổn định của chúng. Từ
lúc kỹ thuật tạo dòng (gene cloning) ra đời vào trước năm 1980, đã có nhiều
nghiên cứu về sự vận dụng gen của Subtilisin. Ví dụ như sự tiến hóa có hướng của
Subtilisin E từ Bacillus subtilis đã được biến đổi thành một enzyme có chức năng
tương đồng với enzyme chịu nhiệt (thermitase) từ Thermoactinomyces vulgaris,
nó cũng là một loại Subtilisin có 47% trình tự tương đồng với Subtilisin SBN’.

Năm phát sinh đột biến gen bất kỳ, sự tái tổ hợp để tạo nên Subtilisin E 5-3H5.
10
Công nghệ Enzyme
Nhiệt độ tối ưu của những enzyme tiến hóa này là 17
0
C và chu kỳ bán phân rã là
65
0
C cao gấp 200 lần so với những loại subtilisin E hoang dại khác. Hơn nữa, 5-
3H5 hoạt động mạnh hơn theo hướng thủy phân hơn những loại hoang dại ở tất cả
nhiệt độ từ 10-90
0
C. Mặc dù những trình tự khác nhau của enzyme thermitase của
Subtilisin E với 157 vị trí, chỉ cần thay thế 8 amino acid để biến đổi subtilisin E
trở thành một enzyme giống với thermitase. Trước đây sự thay thế này được công
nhận là biến đổi ổn định (asparagine thay thế cho serine ở vị trí 218 và aspartate
thay cho asparagine ở 76 vị trí còn lại), được phân bố theo một kiểu nào đó trên bề
mặt của enzyme. Những nghiên cứu đã chứng minh rằng sự tiến hóa có hướng đã
cung cấp một công cụ có tác động mạnh đến sự thích nghi nhiệt và hiệu quả của
nó hay đi đến hiệu quả để thao tác trên vi khuẩn thermostability mà không làm
giảm hoạt tính của enzyme.
Những nghiên cứu gần đây về các đột biến ổn định của subtilisin BPN’ đã
giúp cho những hiểu biết về cấu trúc cơ bản chịu nhiệt của enzyme này. Nhân tố
căn bản của những nghiên cứu này là việc khắc phục mất canxi khi có sự hiện diện
của chất làm mềm nước (chelators) trong quá trình làm sạch. Hai biến đổi mới của
subtilisin độc lập canxi được tạo ra, ở đây thì sự giống nhau cao về vị trí của
canxi được xóa bỏ, và sau khi được chọn lựa thì tăng thêm khả năng chịu nhiệt từ
một vị trí đột biến bất kỳ.
Cấu trúc phân tử của 2 loại enzyme này được so sánh với những cấu trúc
của subtilisin trước đây, mặc dù có những khác nhau về trình tự, nói chung thì

những cấu trúc là giống nhau nhưng không có vùng liền kề với đầu N-terminal.
Một trong những khác nhau là hình thành liên kết disulfid giữa những vùng của
cysteine. Liên kết disulfid này giữ đầu N-terminal và làm tăng thêm khả năng chịu
nhiệt. Thêm vào đó những liên kết disulfid kết hợp để tăng thêm khả năng chịu
nhiệt lên đến 1200 lần dưới những điều kiện kìm hãm, về bản chất cơ bản bởi vì
sự ổn định của những đầu N-terminal. Gần đây những đột biến gen ở những vị trí
xác định vô cùng quan trọng trong chu trình bán rã của enzyme subtilisin BNP’ có
canxi tự do, cùng với những ứng dụng tiềm năng của công nghệ sinh học.
Những enzyme đơn từ những sinh vật ưa nhiệt thường có hiệu quả xúc tác
cao ở những nhiệt độ thấp và nhạy với nhiệt độ cao hơn với những enzyme ưu
nhiệt khác. Trong quá trình cố gắng tìm hiểu quá trình tiến hóa và những phân tử
thích nghi với nhiệt độ thấp, hướng tiến hóa đã được cãi tiến để chuyển đổi thành
một protease chịu nhiệt giống subtilisin từ vi khuẩn Bacillus sphaericus, SSII, trở
thành những enzyme ưu nhiệt tương ứng. Một dạng đột biến bất kỳ được tạo ra từ
tái tổ hợp để cải tiến những biến thể đột biến với một tốt độ thay thế (k
cat
), ở 10
0
C,
tăng lên 6.6 lần và hiệu quả xúc tác (k
cat
/K
m
) 9.6 lần của loài hoang dại. Chu kỳ
bán phân rã của nó ở 70
0
C là 3.3 lần không hơn những loài hoang dại. Nó được
chú ý rằng mặc dù ở đây là một xu hướng chung là làm giảm tính ổn định trong
suốt quá trình xúc tác của những enzyme từ ưu nhiệt đến ưu lạnh, ở đây nó không
có sự tương tác tuyệt đối giữa sự giảm tính ổn định và tăng hoạt động ở nhiệt độ

thấp. Subtilisin ưu nhiệt, SSII, 77.4% trình tự giống với những subtilisin tự nhiên
ưu nhiệt độ thấp, S41. Mặc dù, ở đây 2 subtilisin này có đến 85 vị trí khác nhau,
11
Công nghệ Enzyme
sự thay thế 4 acid amin có khả năng tạo ra một subtilisin SSII có nhiệt độ hoạt
động thấp hơn của S41.
Tính chịu nhiệt và khả năng hoạt động của subtilisin S4 hoạt động ở nhiệt
độ thấp, từ Antarctic Bacillus TA41, vẫn được nghiên cứu tỉ mỉ với mục đích là
hiểu được những cơ chế của những enzyme này có thể làm thích nghi từ những sự
chọn lọc khác nhau. Những thư viện về đột biến được sàng lọc để nhận ra những
enzyme để mà thu được khả năng chịu nhiệt lớn hơn từ khả năng chỉ hoạt động ở
nhiệt độ thấp. Chu kỳ bán rã của 7 amino acid hay thay thế, 3-2G7, ở 60
0
C
khoảng chừng 500 lần so với những loài hoang dại và vượt trội hơn so với những
subtilisin ưu nhiệt tương đồng. Nhiệt độ hoạt động tốt nhất của 3-2G7 được thay
đổi hơn chừng 10 lần. Không giống những enzyme chịu nhiệt tự nhiên sự hoạt
động của 3-2G7 ở nhiệt độ thấp không bị tổn hại. Hiệu quả xúc tác được tăng cao
khoảng chừng 3 lần có khoảng nhiệt độ rộng hơn (10-60
0
C). Năng lượng hoạt hoá
của quá trình xúc tác không hoàn toàn giống hệt nhau từ những loại hoang dại và
sự ưu nhiệt giống nhau, subtilisin SSII, đòi hỏi phải tạo ra từ enzyme S41 nó được
giữ lại đặc tính ưu lạnh mặc dù nó được tăng thêm khả năng chịu nhiệt. Những kết
quả ở đây chứng tỏ rõ ràng rằng nó có thể tăng khả năng hoạt động ở nhiệt độ thấp
và đồng thời ổn định ở nhiệt độ cao. Từ những nghiên cứu, sự thật rằng những
enzyme thể hiện cả 2 khả năng trên không được tìm thấy ở tự nhiên hầu hết những
bản chất có khả năng từ hiệu quả của tiến hóa, hơn nữa bất kỳ những giới hạn ly
hóa có khả năng phù hợp trên những protein. Có quan sát thú vị rằng, những
protein trong tự nhiên, các serin được thống kê là không phổ biến trong những

enzyme chịu nhiệt so sánh từ một vài enzyme ưu nhiệt.
12
Công nghệ Enzyme
Một subtilisin thích nghi ở nhiệt độ lạnh được ứng dụng kiến thức khoa học
đã tạo nên một phân tử hidro ở subtilisin ưu nhiệt ổn định là subtilisin savinase
( bảng 1, vị trí điều khiển bị thay đổi từ những phần còn lại ở vùng găn kết của
subtilisin ở nhiệt độ thấp (S93). Một vùng 12 a.a (MSLGSSGESSLI) có gắn kết
dính liền của S39, từ Antarctic Bacillus TA41, được dự đoán là có tính linh động
cao và được sử dụng để thay thế tương ứng cho 12 phần còn lại
(LSLGSPSPSATL) trong savinase. Lý do căn bản tác động đến một vị trí nào đó
hoặc toàn bộ tính linh động dường như đây là đặc điểm thích nghi chính của
những enzyme ở nhiệt độ thấp chịu trách nhiệm cho những thông số nhiệt động
lực tăng lên ở nhiệt độ thấp, sự giảm bớt của entanpi hoạt hóa và tăng entropi).
Những dự đoán chuyên môn, các enzyme lai được đề cập đến nhiệt độ tối ưu và sơ
lược về pH như là savinase, có tính đăc hiệu cao với những chất nền tổng hợp, có
tính đặc trưng rộng hơn ở nhiệt độ xung quanh và tỏ ra giảm bớt ở nhiệt độ cao hơi
giống với những enzyme ở nhiệt độ thấp.
4. Ứng dụng của subtilisin trong chất tẩy rửa
Ứng dụng trong công nghiệp lớn nhất của subtilisin là trong chất tẩy rửa.
Trong những năm 1930, người ta đã sử dụng những enzym từ động vật để tẩy rửa
13
Công nghệ Enzyme
nhưng sau này chúng không còn phù hợp. Đến năm 1963, enzym alcalase
(subtilisin Carlsberg từ Bacillus licheniformis) được phát hiện, chúng hoạt động ở
pH tối ưu. Những enzym được bổ sung vào chất tẩy rửa phải có hoạt động xúc tác
phù hợp với những thành phần khác và điều kiện tẩy rửa. Các enzym này phải ổn
định ở điều kiện pH kiềm, nhiệt độ cao, và sự có mặt của các nhân tố khác như
nồng độ ion, nồng độ chất bẩn trong dung dịch, các chất hoạt hóa. Do đó chỉ có
nhóm serine proteases là phù hợp để sử dụng trong tẩy rửa, trong đó subtilisin vi
khuẩn là tốt nhất.

Sutilisin sử dụng trong tẩy rửa thu nhận từ Bacillus licheniformis, B.lentus,
B.alcalophilus hay B.amyloliquefaciens (SubtilisinBPN’). Chúng có các đặc điểm
chung sau:
(1) Hoạt động mạnh ở pH của chất tẩy rửa.
(2) Ổn định trong điều kiện có mặt các chất khác.
(3) Biểu hiện mạnh với những cơ chất đặc trưng, khả năng thủy phân
protein tốt.
Các enzym được thu nhận từ vi khuẩn chủ yếu bằng phương pháp lên men,
kỹ thuật tái tổ hợp. Các nhà khoa học đã nghiên cứu và tìm ra các nguồn thu nhận
proteases, phương pháp thu nhận khác nhau.
Trong chất tẩy rửa còn có các chất tẩy màu, chúng gây trở ngại cho hoạt
động xúc tác của subtilisin bằng cách oxy hóa các cấu tử ở gần trung tâm hoạt
động của subtilisin là methionine và cystein. Chúng ta có thể khắc phục bằng cách
là phát sinh đột biến lên những vị trí đó để thay các cấu tử nhạy đó bằng các cấu tử
khác mà không ảnh hưởng đến hoạt động xúc tác ví dụ như serine hay alanin thay
vào vị trí của methionin.
Protease đầu tiên được sử dụng là subtilisin Carlsberg thu nhận từ Bacillus
licheniformis, là một chuỗi polypeptide đơn gồm 275 axit amin và subtilisin BPN’
cũng gồm 275 axit amin, chúng có cấu trúc 3 chiều tương đối giống nhau nhưng
đặc tính động học khác nhau. Ngoài ra, subtilisin từ B. lentus cũng được sử dụng
thường xuyên với pH hoạt động (9-12) cao hơn so với Carlsberg hay BPN’,
subtilisin này có 269 axit amin với khoảng 60% có trình tự giống với các enzym
khác. Tất cả các enzym subtilisin sử dụng trong chất tẩy rửa có trọng lượng phân
tử khoảng 27 kDa.
5. Những ứng dụng khác của subtilisin
Subtilisin BPN’ là một trong những enzym protease được sử dụng trong
quá trình tổng hợp chuỗi peptide khi được hòa tan trong quá trình ly lâm mạnh với
dung môi hữu cơ như N,N-dimethylformamide(DMF). Ví dụ, ở 50% DMF tốc độ
thủy phân cơ chất không thay đổi. Phân tích tinh thể bằng tia X cho thấy rằng
vòng imidazol của histidine 64 được sử dụng theo kiểu quay vòng luân phiên, hai

phân tử nước có vai trò duy trì sự ổn định của trung tâm hoạt động, với sự mất đi
liên kết LBHB giữa histidine 64 và aspartate 32.
Bên cạnh đó, subtilisin thu nhận từ B.lentus cũng được sử dụng trong quá
trình tổng hợp peptide và glycopeptide. Sự kết hợp của các phát sinh đột biến trực
14
Công nghệ Enzyme
tiếp và sự biến đổi hóa học với nhóm prosthetic phân cực nhằm làm tăng tốc độ
của trung tâm hoạt động và biểu hiện trên các cơ chất đặc trưng. Những vùng phân
cực hay sự biến đổi hóa học được xem như có lợi trong quá trình tổng hợp peptide
và glycopeptide với số lượng nhiều. Để nâng cao hiệu quả tổng hợp peptide của
subtilisin, một phương pháp có thể được sử dụng là quá trình glycosylat hóa các
vùng đặc trưng của trung tâm hoạt động. Subtiliusin glycosylat hóa từ B.lentus có
hoạt động esterase cao và amidase giảm, điều này sẽ tạo thuận lợi cho quá trình
hình thành liên kết amide hơn là sự thủy phân.
Ngoài ra, subtilisin còn được ứng dụng vào lĩnh vực tổng hợp hóa học, ví
dụ như subtilisin từ B.subtilis là một hydrolase xúc tác cho phản ưng sau:
Arylsulfinamides (R – S(O) – NH
2
) được sinh ra ở pH trung tính, nó có vai trò
trong quá trình tổng hợp amines.
6. Kết luận
Subtilisin vi khuẩn có vai trò quan trọng trong chất tẩy rửa và một số ứng
dụng khác, những vấn đề liên quan đến subtilisin được trình bày ở trên giúp chúng
ta hiểu rõ về cấu trúc và chức năng của serine proteases, chúng có trọng lượng
phân tử khoảng 27 kDa, hỗ trợ cho các phương pháp sinh học phân tử. Ngoài ra,
chúng ta còn biết được nguồn và phương pháp thu nhận các enzyn đó. Do đó,
chúng ta cần phải cải tiến các phương pháp điều chỉnh sản phâm phù hợp với yêu
cầu của người tiêu dùng.
15