nghiên cứu rối loạn enzyme α–galactosidase a và phân tích trình tự gen GLA trên bệnh nhân phì đại cơ tim

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



Lê Hiền Giang


NGHIÊN CỨU RỐI LOẠN ENZYME α-GALACTOSIDASE A
VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN GLA TRÊN
BỆNH NHÂN PHÌ ĐẠI CƠ TIM




LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC




Hà Nội – 2014


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN


Lê Hiền Giang

NGHIÊN CỨU RỐI LOẠN ENZYME α-GALACTOSIDASE A
VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN GLA TRÊN
BỆNH NHÂN PHÌ ĐẠI CƠ TIM

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60420121

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS.TS. Nguyễn Thị Hồng Vân
TS. Nguyễn Thị Quỳnh Thơ


Hà Nội – 2014


LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng sâu sắc, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn TS Nguyễn Thị Quỳnh
Thơ, người đã tận tình hướng dẫn, ủng hộ và hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn
này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS Nguyễn Thị Hồng Vân, chủ
nhiệm bộ môn Sinh học di truyền trường ĐH KHTN Hà Nội, người thầy đã trực
tiếp dạy dỗ, hướng dẫn tôi thực hiện đề tài này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị em labo Y sinh học di truyền, Kỹ thuật
Y học trường Đại học Y Hải Phòng đã nhiệt tình hỗ trợ, tạo mọi điều kiện cho tôi
trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện đề tài.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các anh chị, thầy cô trong nhóm thực hiện đề
tài hợp tác quốc tế: “Nghiên cứu sàng lọc bệnh lý về tích trữ ở lysosome trên bệnh
nhân gan to, lách to và phì đại cơ tim chưa rõ nguyên nhân ở Việt Nam” của trường

ĐH Y Hải Phòng; Trung tâm nghiên cứu và điều trị bệnh hiếm gặp, Bệnh viện đa
khoa Cựu chiến binh Đài Bắc, những người đã tận tình hướng dẫn kỹ thuật, giúp đỡ
vật chất và tinh thần cho tôi thực hiện đề tài.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Sinh học di truyền, trường ĐH
KHTN Hà Nội, các anh chị và các bạn cao học khoá 2012 – 2014 đã nhiệt tình giúp
đỡ và cổ vũ tinh thần để tôi hoàn thành đề tài của mình.
Cuối cùng tôi cũng xin gửi lời cảm ơn từ đáy lòng tới gia đình, bạn bè tôi,
những người luôn bên tôi, cổ vũ cho tôi trong suốt thời gian qua.

Học viên
Lê Hiền Giang




MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Tổng quan về chứng phì đại cơ tim 3
1.1.1. Lịch sử phát hiện và tần số mắc bệnh 3
1.1.2. Nguyên nhân và triệu chứng của bệnh 4
1.2. Bệnh Fabry 7
1.2.1. Lịch sử phát hiện, nguyên nhân và tần số mắc bệnh 7
1.2.2. Triệu chứng của bệnh 8
1.3. Gen GLA và Enzyme α – galactosidase A 11
1.3.1. Gen GLA 11
1.3.2. Enzyme α – galactosidase A 12
1.4. Tổng quan các nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam về đột biến gen GLA;
bệnh Fabry và bệnh phì đại cơ tim 15
1.4.1. Đột biến gen GLA 15

1.4.2. Tổng quan về bệnh Fabry và bệnh phì đại cơ tim 18
1.5. Tổng quan về siêu âm tim 22
1.6. Tổng quan về các phƣơng pháp xác định hoạt độ enzyme α – Gal A và
phân tích trình tự gen GLA 24
1.6.1. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme 24
1.6.1.1. Phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng UPLC 24
1.6.1.2. Phương pháp khối phổ hai lần (MS/MS) 24
1.6.2. Phương pháp phân tích trình tự gen GLA 26
1.6.2.1. Phương pháp PCR 26
1.6.2.2. Phương pháp điện di 26


1.6.2.3. Phương pháp xác định trình tự gen [3] 26
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 28
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 28
2.1.2. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân 28
2.2. Cỡ mẫu nghiên cứu [68] 28
2.3. Nguyên liệu 29
2.3.1. Mẫu máu 29
2.3.2. Các loại hóa chất và trang thiết bị 30
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 31
2.4.1. Phương pháp xác đinh hoạt độ enzyme α-galactosidase A 31
2.4.1.1. Tiến hành phản ứng enzyme 31
2.4.1.2. Phương pháp sắc ký lỏng kết hợp đo khối phổ 33
2.4.2. Phân tích trình tự gen GLA 34
2.4.2.1. Khuếch đại gen GLA từ mẫu máu toàn phần 34
2.4.2.2. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 37
2.4.2.3. Tách ADN từ gel Agarose 37
2.4.2.4. Định lượng ADN trong dung dịch bằng phương pháp quang phổ kế 38

2.4.2.5. Giải trình tự gen GLA 39
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41
3.1. Kết quả xác định hoạt độ enzyme α-Gal A 41
3.1.1. Hoạt độ enzyme α-Gal A 41
3.1.2. Số lượng mẫu và hoạt độ enzyme α-Gal A theo nhóm tuổi 45
3.2. Kết quả giải trình tự gen GLA 47


3.2.1. Đặc điểm của 26 mẫu được giải trình tự 47
3.2.2. Kết quả nhân bản các phân đoạn gen GLA 49
3.2.2.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR 49
3.2.2.2. Kết quả đo OD sản phẩm tinh sạch 51
3.2.3. Phát hiện các đột biến trên gen GLA 51
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO 59
PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DBS
Dry Blood Spot
ERT
Enzyme replacement therapy (Liệu pháp enzyme thay thế)
Gb3
Globotriaosylceramide
HPLC
High Performance Liquid Chromatography (sắc ký lỏng hiệu năng
cao)
IS
Internal standard (nội chuẩn)
IVS
Intervening sequence (trình tự intron)
LC - MS
Liquid chromatography–mass spectrometry (sắc ký lỏng khối phổ)
LVMI
Left Ventricular Mass Idex (khối lượng cơ thất trái)
LVPWd
Left Ventricular end Diastolic Post Wall (bề dày thành sau thất trái
cuối thì tâm trương)
MS
Mass spectrometry (khối phổ)

PCR
Polymerase Chain Reaction
S
Substrate (cơ chất)
UPLC
Ultra Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng
siêu cao)
UTR
Untranslated region (vùng trình tự không mã hoá axit amin)
α-Gal A
Enzyme α –galactosidase A







DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Những dấu hiệu và triệu chứng có thể có của bệnh Fabry [38] 9
Bảng 1.2. Vị trí và độ dài exon và intron của gen GLA 11
Bảng 1.3. Kích thước của 7 exon trong gen GLA ở người và số lượng các đột
biến liên quan [23]. 18
Bảng 2.1. Các thành phần có trong dung dịch phản ứng 32
Bảng 2.2. Các thông số trong phương pháp khối phổ 33
Bảng 2.3. Trình tự và nhiệt độ bắt cặp của mồi, kích thước sản phẩm PCR 36
Bảng 2.4. Chu trình nhiệt trong phản ứng PCR 36
Bảng 2.5. Thành phần của phản ứng nhân bản. 39
Bảng 2.6. Hàm lượng ADN khuôn cho phản ứng PCR giải trình tự 39
Bảng 2.7. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR giải trình tự. 40

Bảng 3.1. Đặc điểm của 26 mẫu được giải trình tự 47
Bảng 3.2. Các chỉ số LVMI, LVPWd của người bình thường và bệnh nhân phì
đại cơ tim. 48
Bảng 3.3. Kết quả đo OD
260
; OD
280
và nồng độ ADN sản phẩm PCR của mẫu
FB01 51
Bảng 3.4. Kết quả giải trình tự 26 mẫu 52







DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Hình ảnh cơ tim bình thường (A) và cơ tim bị phì đại (B) 6
Hình 1.2. Vị trí của gen GLA trên NST X 11
Hình 1.3. Cấu trúc không gian của α-galactosidase A 12
Hình 1.4. Globotriaosylceramide và vị trí cắt của enzyme α – galactosidase A 13
Hình 1.5. Gen GLA hoạt động bình thường sinh ra α-Gal A phân cắt Gb3 14
Hình 1.6. Khiếm khuyết gen GLA gây tích đọng Gb3 trong lysosome 14
Hình 1.7. Hình ảnh siêu âm tim của bệnh nhân FB64 (trên) và FB334(dưới) 23
Hình 1.8. Hệ thống sắc ký lỏng siêu hiệu năng kết hợp đo khối phổ song song
(UPLC – MS/MS) của hãng Aligent. 25
Hình 2.1. Mẫu máu trên giấy thấm DBS 30
Hình 2.2. Cơ chất, nội chuẩn và sản phẩm trong phản ứng enzyme 32
Hình 3.1. Hoạt độ enzyme α- Gal A của bệnh nhân phì đại cơ tim 41

Hình 3.2. Hoạt độ enzyme α-Gal A của nhóm đối chứng và bệnh nhân. 43
Hình 3.3. Số lượng mẫu theo nhóm tuổi 45
Hình 3.4. Hoạt độ enzyme α-Gal A theo nhóm tuổi 46
Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của mẫu FB01 49
Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR 7 exon và intron 4 của mẫu FB26,
FB44; FB64; FB69 50
Hình 3.7. Đoạn trình tự exon 1 đột biến c.[178 C>T] ; [0], p.P60S 54
Hình 3.8. Đoạn trình tự exon 1 có đột biến 5'UTR -12 G>A 56
Hình 3.9. Đoạn trình tự exon 1 có đột biến 5'UTR -10 C>T 56
Hình 3.10. Đoạn trình tự nucleotide có đột biến IVS1+17 A>G 57

1

MỞ ĐẦU
Bệnh phì đại cơ tim (Hypertrophic cardiomyopathy - HCM) là một căn bệnh
trong đó cơ tim dày bất thường ở tâm thất trái, thất phải, mỏm tim hoặc toàn bộ cơ
tim. Phần lớn các trường hợp đều bị phì đại vách liên thất, làm tắc nghẽn đường ra
thất trái.
Hầu hết bệnh nhân mắc bệnh này đều không có triệu chứng và họ có thể sống
một cuộc sống bình thường như những người bình thường. Trên thực tế, bệnh chỉ
hay gặp ở người trẻ tuổi và vận động viên thể thao. Triệu chứng đầu tiên và cũng là
cuối cùng của bệnh phì đại cơ tim là đột tử. Tuy nhiên, ở một số ít bệnh nhân có thể
có một trong các triệu chứng sau đây: đau ngực, chóng mặt và hoa mắt, nhất là
trong lúc vận động mạnh hoặc khi thay đổi tư thế đột ngột, khó thở, thường xuyên
mệt mỏi, hay bị ngất xỉu.
Trong số các bệnh nhân phì đại cơ tim, có đến 40% chưa tìm ra nguyên nhân
gây bệnh. Gần đây, một số các biến thể không điển hình của bệnh do tích đọng các
chất tại lysosome đã được xác định và đã thu hút được sự chú ý của các bác sĩ, đặc
biệt là kiểu hình không điển hình của bệnh Fabry, với các biểu hiện phì đại cơ tim
và các triệu chứng tương tự.

Bệnh Fabry là một bệnh di truyền liên quan đến gen GLA mã hóa enzyme
lysosome α –galactosidase A (α – Gal A) trên NST X gây tích đọng các chất trong
lysosome. Bệnh được phát hiện năm 1898 bởi hai nhà da liễu học hoạt động độc lập
là Johannes Fabry người Đức, và William Anderson người Anh do đó bệnh còn
được gọi là bệnh Anderson – Fabry.
Khi enzyme α –galactosidase A bị thiếu một phần hoặc hoàn toàn dẫn đến việc
không chuyển hóa được các glycosphingolipid mà chủ yếu là globotriaosylceramide
(Gb3 hoặc GL-3). Gb3 không được chuyển hóa sẽ tích đọng tại các tế bào mạch
máu, gây tắc nghẽn quá trình vận chuyển máu. Gb3 cũng tích đọng ở các tế bào
thần kinh, tế bào tim, và các loại khác nhau của tế bào thận. Sự rối loạn chức năng

2

tế bào hoặc sự chết tế bào dẫn đến những đáp ứng chuyển hóa của các mô như phì
đại, viêm, xơ và xơ cứng.
Biến thể tim của bệnh Fabry không điển hình có thể chỉ là phì đại thất trái,
loạn nhịp tim, hoặc bệnh cơ tim phì đại trong những thập kỷ thứ 5 thứ đến thứ 8 của
cuộc sống. Những biểu hiện kiểu hình không đầy đủ này được đặc trưng bởi sự khởi
phát muộn và tiến triển chậm của bệnh, các biểu hiện suy cơ quan xuất hiện khi
bệnh nhân đã lớn tuổi. Điều này mở ra một hướng nghiên cứu mới về một trong
những nguyên nhân gây bệnh phì đại cơ tim.
Ở Việt Nam, hiện chưa có công trình nghiên cứu nào về mối quan hệ giữa
enzyme α –galactosidase A, gen GLA và bệnh phì đại cơ tim. Điều này có thể gây
khó khăn trong việc xác định chính xác nguyên nhân gây bệnh phì đại cơ tim và đưa
ra đúng phác đồ điều trị.
Do đó chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu rối loạn enzyme α –
galactosidase A và phân tích trình tự gen GLA trên bệnh nhân phì đại cơ tim”
Đề tài không chỉ mang ý nghĩa khoa học mà còn có ý nghĩa thực tiễn y học
trong điều trị bệnh phì đại cơ tim.
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

1. Phân tích rối loạn enzyme α –galactosidase A ở bệnh nhân phì đại cơ tim.
2. Phân tích trình tự gen GLA của một số mẫu có hoạt độ enzyme α –
galactosidase A giảm mạnh.







3

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về chứng phì đại cơ tim
1.1.1. Lịch sử phát hiện và tần số mắc bệnh
Trong thập kỉ qua, những tiến bộ quan trọng đã nâng cao hiểu biết của chúng
ta về cơ sơ phân tử của bệnh tim mạch. Khi cấu trúc xoắn kép của ADN được mô tả
lần đầu vào năm 1953 bởi Watson và Crick trong tạp chí Nature, không ai có thể dự
đoán những tác động to lớn mà mà phát hiện này đem lại trong việc thiết lập các
nghiên cứu về di truyền người. Phát hiện này cũng với lý thuyết về di truyền
Mendel là hai mốc quan trọng trong sự phát triển của lĩnh vực di truyền phân tử tim
mạch. Ngoài ra những tiến bộ công nghệ gần đây đã thúc đẩy mạnh mẽ những
nghiên cứu di truyền phân tử tim mạch. Ngày nay, di truyền phân tử tim mạch được
đặc trưng bởi sự tích hợp của nghiên cứu trong phòng thí nghiệm công nghệ cao và
y học lâm sàng. Di truyền học phân tử đã xác định lại nguyên nhân và tiêu chuẩn
chẩn đoán của nhiều bệnh, từ đó đem đến những phác đồ điều trị mới cho một số
bệnh tim mạch. Các rối loạn tim mạch đầu tiên được xác định cơ sở di truyền là
bệnh phì đại cơ tim [49].
Bệnh phì đại cơ tim do Lord Brock lần đầu tiên phát hiện ra vào năm 1957
[36, 37].

Năm 1958, Donald Teare đã lần đầu tiên mô tả lâm sàng và bệnh lý của 9 bệnh
nhân phì đại cơ tim bị chết đột tử. Ngay từ đầu, phì đại cơ tim được gắn với đột tử
do tim (Sudden Cardiac Death – SCD) ở thanh thiếu niên. Ngoài ra, người ta nghi
nhận sự xuất hiện của các gia đình phì đại cơ tim, khuynh hướng gia đình của đột tử
do tim khi hoạt động gắng sức và ngất báo hiệu [50].
Năm 1964, Braunwald đã mô tả một cách toàn diện về phì đại cơ tim, quá
trình tiến triển bệnh, tình trạng phì đại vách ngăn, lộn xộn của sợi cơ.
Năm 1979, sự ra đời của siêu âm 2D đã hỗ trợ rất nhiều trong chẩn đoán phì
đại cơ tim.

4

Phì đại cơ tim là căn bệnh di truyền về tim khá phổ biến với tỉ lệ 1/500 dân và
có thể xảy ra ở cả nam và nữ, ở mọi lứa tuổi và sắc tộc [12, 13].
Bệnh phì đại cơ tim là bệnh phổ biến thứ hai trong nhóm bệnh về cơ tim,
chiếm 35 – 40% bệnh tim mạch ở trẻ em. Bệnh phì đại cơ tim ảnh hưởng đến
500000 người ở Mỹ, trong đó trẻ em dưới 12 tuổi chiếm 10%. Các khiếm khuyết về
gen gây bệnh có thể di truyền, và người ta ước tính rằng 50 – 60 % trẻ em mắc phì
đại cơ tim có người thân bị bệnh, mặc dù họ có thể không được chẩn đoán hoặc có
không có triệu chứng [77].
Hiện nay đột tử có liên quan đến phì đại cơ tim chiếm 1 – 2% ở trẻ em và
thanh thiếu niên, chiếm 0,5 – 1% ở người lớn [8].
Các đột biến gây bệnh, biểu hiện bệnh và tiên lượng bệnh đều rất đa dạng và
không đồng nhất. Các thống kê cho thấy đây là một trong những nguyên nhân phổ
biến gây đột tử ở người trẻ tuổi (đặc biệt là các vận động viên) [7, 12, 13, 36].
1.1.2. Nguyên nhân và triệu chứng của bệnh
Từ năm 1989 hàng loạt các đột biến ở các gen gây phì đại cơ tim đã được tìm
thấy. Đến năm 2011 người ta đã tìm thấy hơn 11 gen mã hoá protein sarcomer cơ
tim với hơn 1400 đột biến liên quan đến phì đại cơ tim. Ngoài ra còn nhiều đột biến
ở các gen không mã hoá protein sarcomer cơ tim cũng có thể gây bệnh [14].

Đột biến ở gen mã hoá protein sarcomer trong cơ tim (chủ yếu là myosin và
troponin) chiếm khoảng 60% các trường hợp phì đại cơ tim, 40% còn lại là do các
đột biến gen khác hoặc chưa rõ nguyên nhân [8].
Gần 20 năm trước, người ta xác định được đột biến liên quan đến gen MYH7
mã hoá β-myosin chuỗi nặng là cơ sở gây bệnh phì đại cơ tim. Từ đó đến nay, hàng
trăm đột biến nằm rải rác trong ít nhất 27 gen có liên quan đến bệnh phì đại cơ tim
được tìm thấy [36].
Theo những thống kê trong 20 năm qua, bệnh phì đại cơ tim là một bệnh tim
mạch có tính chất gia đình phổ biến và có sự đa dạng về mặt di truyền. Đại đa số

5

các đột biến gây bệnh làm thay đổi tính chất vật lý và chức năng của protein là đột
biến nhầm nghĩa, trong đó 1 axit amin này được thay thế bằng 1 axit amin khác.
Ngoài ra, có thể có đột biến gây ảnh hưởng đến nhiều axit amin trong 1 protein (đột
biến dịch khung đọc), kết quả là dẫn đến nhiều sản phẩm rất khác nhau và thường
gây ra nhiều hậu quả lâm sàng hơn [14].
Ngoài những nguyên nhân do đột biến các gen mã hoá cho protein cơ tim,
những nguyên nhân khác cũng đang được nghiên cứu tìm hiểu. Ưu điểm của những
xét nghiệm di truyền là xác định được nguyên nhân cụ thể ở những bệnh nhân phì
đại cơ tim có phải do gen mã hoá protein cơ tim gây nên hay là do những gen khác.
Những bệnh về tim liên quan đến sự trao đổi chất ở cơ tim thường được chẩn đoán
lâm sàng sai. Ví dụ một loại rối loạn tích đọng lysosome do gen trội liên kết với
NST X, lysosome liên quan đến protein màng (LAMP2- bệnh Danon); bệnh Fabry,
một bệnh do đột biến lặn ở gen GLA nằm trên NST X, gen này mã hoá cho enzyme
α-galactosidase A. Sự thiếu hụt enzyme này dẫn đến sự lắng đọng
glycosphingolipid trong tế bào [14, 56].
Theo thông kê, đột biến gen GLA ở bệnh nhân Fabry có thể chiếm tới 5% số
bệnh nhân phì đại cơ tim [8].
Chẩn đoán phân biệt giữa phì đại cơ tim do đột biến protein cơ tim với các

dạng đột biến khác là rất quan trọng trong điều trị. Ví dụ chẩn đoán đúng bệnh
Fabry sẽ đưa ra được liệu pháp điều trị hiệu quả như bổ sung enzyme tái tổ hợp α-
galactosidase A, điều này có thể làm giảm bớt hiện tượng phì đại cơ tim và cải thiện
chức năng tim cũng như khả năng gắng sức của bệnh nhân [14].
Phì đại cơ tim do sự phát triển, sắp xếp của các sợi cơ diễn ra không bình
thường dẫn đến thành tim dày lên (hình 1.1). Sự dày lên thường diễn ra ở tâm thất
trái (khoang chính của tim thực hiện chức năng bơm máu), đặc biệt là vách ngăn
giữa tâm thất trái và tâm thất phải. Sự dày lên làm kích thước của khoang bơm máu
giảm xuống. Nó cũng làm tim ngăn cản việc tim nghỉ giữa các lần đập và bơm máu,
từ đó có thể làm hạn chế việc bơm máu [37, 76].

6


Hình 1.1. Hình ảnh cơ tim bình thường (A) và cơ tim bị phì đại (B)
Tuổi khởi phát, sự phát triển bệnh, biểu hiện lâm sàng rất khác nhau. Hầu hết
những người phì đại cơ tim có thể không có triệu chứng, nhưng nó có thể biểu hiện
bất ngờ vào bất kỳ lứa tuổi nào [8].
Về triệu chứng của bệnh, rất nhiều bệnh nhân không có triệu chứng. Họ cũng
có thể thấy khó thở và tức ngực. Những dấu hiệu khác thường là choáng váng khi
có những hoạt động vật lý, tim đập nhanh chóng và có cảm giác như có gì đó đè
nặng ở ngực, cảm thấy mệt mỏi, đặc biệt là với các hoạt động nặng.
Trong một số trường hợp, triệu chứng đầu tiên và cũng là cuối cùng của bệnh
phì đại cơ tim là đột tử gây ra do tim đập hỗn loạn. Khoang chứa tim hẹp nên khi
tim đập hỗn loạn và nhanh làm cho máu không được bơm đi. Thay vì phải đập, tim
chỉ rung lên. Theo sự tiến triển của bệnh, bệnh nhân cũng có thể bị suy tim kèm
theo nhiều triệu chứng khác [37].
Trẻ em dưới 1 tuổi có thể có triệu chứng suy tim sung huyết trong khi trẻ lớn
hơn có thể không có triệu chứng. Các triệu chứng khởi phát xuất hiện theo sự phát
triển của cơ thể, các biểu hiện bệnh thường biểu hiện ở cuối thời thơ ấu và đầu thời

7

kỳ thiếu niên. Tập thể dục và lao động nặng có thể làm các triệu chứng biểu hiện rõ
hơn.
Mức độ nghiêm trọng của bệnh phụ thuộc vào vị trí cơ tim phì đại, và liệu nó
có ảnh hưởng đến việc bơm máu hay không. Các triệu chứng ở trẻ em thường gặp là
khó thở (thở rất nhanh khi tập thể dục), đau thắt ngực, choáng váng hoặc chóng mặt,
ngất, đánh trống ngực, loạn nhịp tim. Các triệu chứng ở trẻ sơ sinh có thể khó khăn
hơn để phát hiện bao gồm khó thở, phát triển kém, ra mồ hôi nhiều, hay khóc và
kích động khi ăn được cho là do đau ngực [77].
Do những biểu hiện lâm sàng phức tạp, nguyên nhân gây bệnh đa dạng nên đã
gây nhiều khó khăn cho các bác sĩ trong việc tiên lượng và chẩn đoán bệnh [12].
1.2. Bệnh Fabry
1.2.1. Lịch sử phát hiện, nguyên nhân và tần số mắc bệnh
Một trong những căn bệnh tích đọng các chất trong lysosome phổ biến nhất là
bệnh Fabry. Bệnh gây nên do đột biến gen lặn ở gen GLA khiến cho enzyme α-Gal
A không được tổng hợp, tổng hợp thiếu hoặc sai hỏng về chức năng.
Bệnh Fabry hay còn gọi là bệnh Andeson-Fabry, được mô tả đầu tiên vào năm
1898 bởi hai nhà khoa học hoạt động độc lập là Johannes Fabry người Đức và
William Anderson người Anh. Năm 1947 nguyên nhân gây bệnh được xác định là
do chất béo lắng đọng trong các mạch máu của cơ thể. Năm 1963, chất béo lắng
đọng được xác định là globotriaosylceramide (Gb3) và đến năm 1967 người ta xác
định được enzyme α-Gal A chính là tác nhân gây tích đọng Gb3. Năm 1986, gen
GLA mã hoá cho enzyme α-Gal A được xác định [75].
Từ đó đến nay người ta đã xác định được hàng trăm đột biến trên gen GLA gây
nên bệnh Fabry, kèm theo đó là các kiểu hình khác nhau của bệnh. Phần lớn các
bệnh nhân bị bệnh Fabry có một đột biến điểm duy nhất trong gen GLA của họ.
Tỉ lệ ước chừng của bệnh Fabry là 1/40000 nam giới và căn bệnh này được
tìm thấy ở tất cả các sắc tộc [27].

8

1.2.2. Triệu chứng của bệnh
Kiểu hình lâm sàng của bệnh Fabry có thể rất khác nhau, ở cả nam và nữ, giữa
những người trong cùng một gia đình, hay giữa các bệnh nhân không cùng một gia
đình nhưng mang những đột biến giống nhau [23].
Thiếu một phần hoặc hoàn toàn enzyme α-Gal A dẫn đến việc không chuyển
hóa được glycosphingolipids. Việc tăng tích lũy Gb3 xảy ra trong các tế bào nội mô
mạch máu, tế bào thần kinh, tế bào tim, và các loại khác nhau của tế bào thận. Rối
loạn chức năng và/ hoặc chết tế bào dẫn đến sự đáp ứng chuyển hóa của các mô
như phì đại, viêm, xơ và xơ cứng. Sự tăng lên âm thầm của bệnh giai đoạn đầu dẫn
đến những triệu chứng ban đầu trong thời thơ ấu, hoặc thanh thiếu niên và sau này
nghiêm trọng ở tim, thận hay biến chứng mạch máu não. Nếu người đồng hợp tử
(hoặc bệnh nhân nam) không được điều trị tuổi thọ sẽ bị rút ngắn đáng kể, chỉ sống
được 40 – 50 tuổi. Mặc dù bản chất liên quan đến NST X, nhưng do sự bất hoạt của
1 NST X trong quá trình phát triển phôi, phần lớn những phụ nữ dị hợp tử cũng bị
bệnh tật đáng kể và có thể tử vong sớm. Phụ nữ cũng có thể bị ảnh hưởng nghiêm
trọng như nam giới, tuy nhiên họ cũng có thể không có triệu chứng của các mô học
liên quan.
Biểu hiện triệu chứng và diễn biến lâm sàng của bệnh Fabry thay đổi theo tuổi.
Các triệu chứng khởi phát thường xuất hiện ở nam sớm hơn ở nữ. Bệnh thể điển
hình (cổ điển) thường xuất hiện từ khi còn là đứa trẻ dẫn tới sự tiến triển bệnh ra
vùng ngoại vi và tự điều khiển hệ thống thần kinh. Các dấu hiệu hoặc triệu chứng
ban đầu khác bao gồm angiokeratomas, mờ mắt, mệt mỏi, lười vận động. Sự lắng
đọng thêm chất nền ở những cơ quan cụ thể dẫn đến những tiến triển của bệnh, cuối
cùng dẫn đến biến chứng đe dọa tính mạng ở tuổi trưởng thành, đặc biệt liên quan
đến thận, tim và hệ thống thần kinh trung ương. Thận rối loạn chức năng do xơ hóa
cầu thận, teo ống thận, xơ hóa mô kẽ trở nên rõ ràng ở tuổi từ 30 – 40 (ở phụ nữ
biểu hiện muộn hơn) và bệnh nhân có thể bị thận ở giai đoạn cuối của bệnh. Biến

chứng tim mạch gồm loạn nhịp tim, phì đại thất trái, suy tim, thiếu máu cục bộ cơ

9

tim, hoặc nhồi máu cơ tim. Cơn thiếu máu và đột quỵ là những biểu hiện muộn và
cũng là nguyên nhân gây tử vong sớm ở những bệnh nhân Fabry [38].
Bảng 1.1. Những dấu hiệu và triệu chứng có thể có của bệnh Fabry [38]
Cơ quan
Dấu hiệu/ triệu chứng
Tổng quan
Giảm chất lượng cuộc sống do một nhóm các triệu chứng và
tiên lượng.
Hệ thống thần kinh
Acroparesthesias (hội chứng liên quan đến các dị cảm như
ngứa ran, tê và tê cứng ở tay, chân)
Các cơn đau, đột quỵ
Thiếu máu não thoáng qua
Nghẽn mạch
Da
Angiokeratomas (những tổn thương trên da, đường kính
khoảng 1 -3mm, có thể phẳng hoặc nổi cục nhỏ, gây nên do
sự tổn thương hoặc giãn nở vĩnh viễn của các mao mạch)
Tăng tiết mồ hôi/ ít hoặc không tiết mồ hôi
Dạ dày – ruột
Buồn nôn
Tiêu chảy
Đầy bụng sau ăn và đau
Ăn mau no
Khó tăng cân
Thận

Albumin niệu vi lượng (thận rò rỉ một lượng nhỏ albumin
vào nước tiểu)
Giảm khả năng điều khiển .
Tăng bài tiết Gb – 3 qua nước tiểu
Giảm GFR (mức lọc máu cầu thận), giai đoạn cuối bệnh
thận.
Tim
Chứng nhịp loạn tim
Phì đại cơ tim đặc biệt là phì đại thất trái
Suy mạch

10

Nhồi máu cơ tim
Điện tâm đồ bất thường
Bệnh van tim (suy van hai lá)
Tai – Mũi – Họng
Mất thính giác, điếc đột ngột
Ù tai
Chóng mặt
Phổi
Ho
Khó thở, thở khò khè
Không chịu được tập thể dục
Xương
Thiếu xương, loãng xương.

Ngoài những bệnh nhân thể điển hình, một số lượng đáng kể những bệnh nhân
có kiểu hình được mô tả ở dạng không điển hình, hay còn được gọi là thể tim hoặc
thể thận. Những biểu hiện kiểu hình không đầy đủ này được đặc trưng bởi sự khởi

đầu muộn và tiến triển chậm của bệnh, các biểu hiện suy cơ quan xuất hiện khi bệnh
nhân đã lớn tuổi (sống được thời gian dài) [23]. Một trong những triệu chứng
thường thấy nhất ở những bệnh nhân Fabry thể không điển hình là chứng phì đại cơ
tim.
Ở những bệnh nhân Fabry có những biểu hiện phì đại cơ thất trái giống như
biểu hiện phì đại cơ tim. Bệnh cơ tim của bệnh nhân Fabry được báo cáo là đến 6%
nam giới và 12 % nữ giới có hiện tượng phì đại cơ tim khởi phát muộn. Đặc biệt,
tim có thể là cơ quan duy nhất có liên quan ở bệnh nhân nam giới (hoặc đồng hợp tử
gen bệnh) hay ở nữ giới mang gen bệnh, trong khi các hoạt động enzyme gần như
bình thường và thiếu các biểu hiện lâm sàng khác. Điều này gây khó khăn trong
việc chẩn đoán bệnh. Do đó cần có thêm các nghiên cứu sinh hoá và phân tích di
truyền để đưa đến kết luận chính xác [48].



11

1.3. Gen GLA và Enzyme α – galactosidase A
1.3.1. Gen GLA
Gen GLA là gen mã hoá cho enzyme α – galactosidase A nằm trên cánh dài
của NST X, ở vùng Xq22.1 (hình 1.2). Chính xác hơn, gen GLA nằm từ cặp base
101 408 012 đến cặp base 101 397 790 trên NST X. Nó bao gồm 7 exon với độ dài
mỗi exon khoảng 92 đến 219 bp (bảng 1.2). Vùng mang mã gồm 1290 bp và mã
hóa cho 1 chuỗi polypeptid có 429 amino acid, với 31 axit amin đầu tiên là một
chuỗi tín hiệu.
Hình 1.2. Vị trí của gen GLA trên NST X
(Nguồn: Genetics Home Reference)
Bảng 1.2. Vị trí và độ dài exon và intron của gen GLA
Exon / Intron
Vị trí bắt đầu

Vị trí kết thúc
Độ dài (bp)
Exon 1
101 407 925
101 407 710
216
Intron 1
101 407 709
101 403 986
3724
Exon 2
101 403 985
101 403 811
175
Intron 2
101 403 810
101 401 810
2001
Exon 3
101 401 809
101 401 632
178
Intron 3
101 401 631
101 400 758
874
Exon 4
101 400 757
101 400 666
92

Intron 4
101 400 665
101 398 947
1719
Exon 5
101 398 946
101 398 785
162
Intron 5
101 398 784
101 398 568
217
Exon 6
101 398 567
101 398 370
198
Intron 6
101 398 369
101 398 100
270
Exon 7
101 398 099
101 397 803
297

12

1.3.2. Enzyme α – galactosidase A
Enzyme α – galactosidase A (hay còn được gọi là α – Gal A; GLA và α –
GAL) được mã hóa bởi gen GLA. Enzyme α- Gal A là một glycoprotein homodimer

bao gồm hai tiểu đơn vị khoảng 50-kDa. Mỗi monomer có hai miền, một miền chứa
vị trí hoạt động và một miền đầu C chứa 8 sợi β đối song (hình 1.3) [61].
Các phân tích cấu trúc cho thấy, một phần đầu N của glycoprotein liên kết với
cacbohydrate, chiếm khoảng 5-15% khối lượng của α-Gal A, có tới hơn 70
glycoform với 23 cấu trúc lõi carbohydrate khác nhau. Các thành phần carbohydrate
của glycoprotein là cần thiết để phân tử được đưa vào lysosome thông qua con
đường thụ thể mannose-6-phosphate [65].

Hình 1.3. Cấu trúc không gian của α-galactosidase A
Cấu trúc không gian của α-galactosidase A được mô tả bởi các sợi ribbon có màu
sắc khác nhau. Từ sợi màu xanh đến mầu đỏ tương ứng từ đầu N đến đầu C. Vị trí
hoạt động được xác định bằng sự xúc tác cho ra sản phẩm galactose. Mỗi đơn phân
trong cấu trúc phức hợp gồm 2 vùng, một vùng (β/ α)
8
có vị trí hoạt động (từ màu
xanh đến màu vàng) cộng thêm một đầu C đối song với vùng β (từ vàng đến
đỏ)[65].

13

Enzyme α – galactosidase A có chức năng loại bỏ các nhóm α-galactose đầu
cuối từ các chất nền như các sphingolipid, glycoprotein và glycolipid trong đó chủ
yếu là globotriaosylceramide (Gb3 hoặc GL-3), một phân tử bao gồm 3 đường liên
kết với một chất béo (hình 1.4). Phân tử Gb3 được giải phóng trong quá trình tái chế
(recycling) các tế bào hồng cầu già và các tế bào khác [23, 61, 65].
Hình 1.4. Globotriaosylceramide và vị trí cắt của enzyme α – galactosidase A
(nguồn:
Sự phân cắt các đại phân tử, bao gồm cả glycopeptide và glycolipid xảy ra
trong lysosome dưới tác dụng của các enzyme dị hoá. Ví dụ các glycosidase tách
những oligosaccharide từ glycoprotein và glycolipid thành các phần nhỏ hơn cho tế

bào sử dụng. Ở người, các sai hỏng ở các enzyme trong lysosome gây bệnh tích
đọng các chất trong lysosome (lysosomal storage diseases - LSDs). Ở nhóm bệnh
này, sự khiếm khuyết của gen dẫn đến sự thiếu hụt hoặc mất chức năng của các
enzyme dẫn đến tích tụ các chất trong mô. Các triệu chứng bệnh cụ thể phụ thuộc
vào số lượng, hoạt động của các enzyme [65].
Enzyme α – galactosidase A cũng là một lysosome enzyme. Hoạt động bình
thường của gen GLA và enzyme α – Gal A trong tế bào được nêu trong hình 1.5.


14


Hình 1.5. Gen GLA hoạt động bình thường sinh ra α-Gal A phân cắt Gb3 [76].
Sự thay đổi trong gen GLA tạo ra những enzyme α – galactosidase A bất
thường hoặc hàm lượng enzyme suy giảm. Điều này dẫn đến sự phân cắt Gb3
không hiệu quả. Kết quả là, chất này tích tụ trong các tế bào của cơ thể, đặc biệt là
các tế bào mạch máu ở da và các tế bào trong thận, tim và hệ thần kinh (Hình 1.6).
Tùy theo mức độ tích tụ và cơ quan nơi Gb3 tích tụ sẽ có những triệu chứng khác
nhau. Một trong những biểu hiện thường thấy nhất là chứng phì đại cơ tim [76].

Hình 1.6. Khiếm khuyết gen GLA gây tích đọng Gb3 trong lysosome [76].

15

1.4. Tổng quan các nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam về đột biến gen
GLA; bệnh Fabry và bệnh phì đại cơ tim
1.4.1. Đột biến gen GLA
Sau khi xác định gen GLA mã hoá cho enzyme α – Gal A vào năm 1986, hàng
loạt các đột biến gen GLA gây nên bệnh Fabry đã được các nhà khoa học tìm ra.
Năm 1989, Bernstein và cộng sự đã xác định một đột biến thay thế

Tryp356Arg, đây là kết quả của đột biến điểm C thành T tại nucleotide 1066 [15].
Năm 1990, nhóm nghiên cứu của Sakuraba đã xác định một đột biến thay thế G
thành A ở exon 6 (codon 301) của gen GLA ở một bệnh nhân Fabry thể không điển
hình với biểu hiện bệnh tim khởi phát muộn. Năm 1996 người ta cũng phát hiện
một đột biến tương tự ở một người đàn ông 45 tuổi, nhưng người này chỉ có triệu
chứng của bệnh thận là biểu hiện duy nhất [64].
Năm 1991 Yokoi và cộng sự đã xác định một đột biến G thành A tại vị trí cắt
nối acceptor ở intron 3. Đột biến này dẫn đến việc xoá exon 4 và làm dịch khung
đọc do xuất hiện bộ ba kết thúc tại exon 5 [71].
Năm 1992, Nhóm nghiên cứu của Ishii đã xác định một đột biến thay thế 835C-
G trong exon 6 của gen GLA dẫn đến sự thay thế Gln279Glu ở một bệnh nhân Nhật
Bản 60 tuổi và cháu trai 39 tuổi. Hai người có các biểu hiện phì đại thành tâm thất
trái và vách gian tâm thất, hoạt độ enzyme α – Gal A rất thấp, không có dấu hiệu
đặc trưng khác của bệnh Fabry. Người ông qua đời vì suy tim ở tuổi 64 [35].
Năm 1994, Eng và Desnick xem xét và lập bảng 15 đột biến sắp xếp lại gen
GLA, 3 sai sót trong tổng hợp GLA mRNA, và 31 đột biến điểm GLA gây bệnh
Fabry [26].
Năm 1996, Blanch và cộng sự đã khuếch đại các exon 7 của gen GLA và ranh
giới với các intron từ mỗi thành viên trong 9 gia tộc và phân tích thay đổi trình tự
của gen bằng phương pháp SSCP (Single- Strand Conformation Polymorphism).

16

Bằng phương pháp này họ đã phát hiện ra các đột biến trên 9 bệnh nhân bị Fabry
thể điển hình. Các đột biến đều đã được công bố trước đó [16].
Cũng trong năm 1996, Germain và cộng sự sử dụng phương pháp FAMA
(Fluorescence-assisted mismatch analysis) để sàng lọc nhanh các gen GLA ở những
bệnh nhân Fabry. Đột biến đã được tìm thấy ở các thành viên trong 9 gia tộc khác
nhau. Trong đó có 7 thay đổi trình tự chưa được mô tả trước đó, 3 đột biến làm
chấm dứt sớm chuỗi polypeptide, 1 đột biến vị trí cắt nối và 3 đột biến nhầm nghĩa

[28].
Năm 1997, Christine M. Eng và cộng sự đã phát hiện 35 đột biến gen GLA ở
các bệnh nhân Fabry thể tim và thể điển hình. Các loại đột biến gồm đột biến vô
nghĩa, nhầm nghĩa, vị trí cắt nối, đột biến chèn hoặc mất một vài nucleotide, trong
đó các đột biến xuất hiện ở exon 7 nhiều nhất [19].
Năm 2000, Kase và cộng sự mô tả đột biến Q279E gây ra các biến thể tim của
bệnh Fabry. Khi so các tế bào hoạt động bình thường với các nguyên bào sợi của
bệnh nhân bị đột biến, họ nhận thấy tế bào đột biến Q279E chỉ tạo ra một lượng nhỏ
enzyme α – Gal A. Các tác giả nhận định rằng, protein đột biến có lẽ giảm ở lưới
nội chất của tế bào [40].
Năm 2003, nhóm nghiên cứu của Yasuda đã xác định được 2 đột biến lệch
khung mới là 1277delAA và 1284delACTT xảy ra ở đoạn cuối trình tự mã hoá đầu
3’ và làm mất các tín hiệu kết thúc. Việc xoá 2 cặp nu cũng làm thay đổi trình tự
poly A. Cả hai đột biến tạo ra các sản phẩm phiên mã có độ dài đoạn trình tự đầu 3’
khác nhau, một số bị kéo dài thêm khoảng 1 kb [70].
Cũng trong năm 2003, Lai và cộng sự đã chỉ ra rằng hầu hết các đột biến ở gen
GLA đã được xác định ở những bệnh nhân bệnh Fabry chỉ bằng giải trình tự gen, và
do đó một số các đột biến cắt nối được phân loại sai là đột biến nhầm nghĩa. Để xác
định được các sai sót cắt nối gây ra bởi đột biến. Nhóm tác giả đã tiến hành tìm
kiếm các đột biến đã được công bố có vị trí gần vị trí cắt nối, bao gồm cả đột biến