Đánh giá sự biến đổi hoạt độ enzym của hỗn hợp Papain và Amylase dạng bột và dạng dung dịch trong điều kiện lão hóa cấp tốc

Website: Email : Tel : 0918.775.368

Mục lục
Trang
ĐặT VấN Đề
Đặt vấn đề...........................................................................1
Tổng quan...........................................................................4
1.1. Đại cơng về amylase và papain..................................................................4
1.1.1. Amylase ..............................................................................................................................................4
1.1.2. Papain .................................................................................................................................................8

1.2. Mét sè s¶n phÈm thuèc cã chứa papain và amylase.................13

Thực nghiệm và kết quả..............................................14
2.1. Nguyên liệu và phơng pháp thực nghiệm..........................................14
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu.....................................................................................................................14
2.1.2. Hoá chất và thuốc thử........................................................................................................................15
2.1.3. Dụng cụ máy móc...............................................................................................................................16
2.1.4. Phơng pháp nghiên cứu.......................................................................................................................17

2.2. Kết quả Thực nghiệm và nhận xét.........................................................25
2.2.1. Xây dựng biểu đồ mẫu định lợng protein bằng phản ứng Biuret.................................................25
2.2.2. Xác định hoạt độ Papain trong hỗn hợp bằng PP1 ..........................................................................26
2.2.3. Xác định hoạt độ papain trong các hỗn hợp bằng PP2......................................................................32
2.2.3.Xác định hoạt độ alpha amylase trong các hỗn hợp...........................................................................35

2.3. BàN LUậN..................................................................................................................42

Kết luận và đề xuất.....................................................45
3.1. Kết luận..................................................................................................................45
3.2. Đề xuất.....................................................................................................................46

Tài liệu tham khảo........................................................47

Đặt vấn đề
Papain và Amylase là những enzym đà đợc sử dụng từ lâu ở nhiều nớc trên
thế giới dới dạng các thực phẩm hoặc thuốc cổ truyền, thậm chí đà trở thành
những huyền thoại về sù tut diƯu cđa chóng. Papain cã trong níc Ðp cđa qu¶


®u ®ñ xanh ®· cøu sèng mét em bÐ ngêi ấn Độ bị ngạt thở do mắc nghẽn một
miếng thịt to ë häng. Sù tut diƯu cđa amylase lµ ë chỗ chỉ cần một thìa nớc ép
giá đỗ xanh đà làm loÃng và giảm thể tích một bát bột đà nấu chín của trẻ em
xuống còn một nửa, nhng giá trị dinh dỡng không hề thay đổi và hiệu quả hấp
thu tăng lên [14]. Trong thời gian qua nhờ thành tựu phát triển của khoa học đặc
biệt là dợc học, các nghiên cứu sâu về ứng dụng của các enzym cũng đợc phát
triển. Ngoài tác dụng thuỷ phân tinh bột và protein, hai enzym này còn có tác
dụng chống viêm, làm sạch da rất hiệu quả. Ngày nay, bên cạnh việc chiết tách,
tinh chế, ngời ta đang phải đa các chế phẩm enzym này vào những dạng bào chế
thích hợp nhằm phân liều chính xác, ổn định hoạt chất và hiện đại hoá sản
phẩm.
Papain và amylase đà đợc phối hợp thích hợp nhằm bổ trợ tiêu hoá các
thành phần hoá học trong thức ăn ở mức tối u theo nhu cầu dinh dỡng của một
số đối tợng bị rối loạn tiêu hoá, trẻ em suy dinh dỡng và những ngời lớn có
bệnh đờng tiêu hoá. Hỗn hợp này đà trở thành những sản phẩm thuốc đợc sử
dụng ở nhiều nớc trên thế giới, chiếm tỷ trọng lớn ở các nớc đang phát triển do
có tỷ lệ trẻ em suy dinh dỡng cao. Việt Nam cũng là một nớc đang phát triĨn cã
tû lƯ trỴ em SDD díi 5 ti cao, đến năm 2004 là 26,4% và số ngời có bệnh đờng tiêu hoá cũng cao, chủ yếu do viêm dạ dày, ruột. Mặt khác nớc ta có khí
hậu nhiệt đới, cây cối quanh năm xanh tốt, nguồn nguyên liệu để thu papain và
amylase rất dồi dào. Nhng hàng năm chúng ta đang phải nhập hàng triệu sản
phẩm thuốc là hỗn hợp papain và amylase từ các nớc Mỹ, Pháp, Hàn Quốc,

Nhật Bản và ấn Độ. Đó là một thực tế, nhng điều đó là không thể chấp nhận đợc
đối với ngời dợc sĩ trong điều kiện nguồn nguyên liệu để thu các sản phẩm này
ở nớc ta thuộc loại dồi dào, sẵn có.
Để góp phần nghiên cứu triển khai và biến các chế phẩm enzym papain và
amylase thành những sản phẩm thuốc có giá trị, ổn định và hiện đại, sản xuất đ-

-2-


ợc ở Việt Nam, phục vụ số khá đông những ngời bệnh đang có nhu cầu, chúng
tôi tiến hành đề tài: Đánh giá sự biến đổi hoạt độ enzym của hỗn hợp
Papain và Amylase dạng bột và dạng dung dịch trong điều kiện lÃo hoá cấp
tốc với mục tiêu: đánh giá đợc sự biến đổi hoạt tính của các enzym trong hỗn
hợp ở điều kiện nhiệt độ cao, đồng thời tìm ra những quy luật thay đổi hoạt độ
enzym. Từ đó có những biện pháp cụ thể ổn định hoạt chất và nâng cao độ ổn
định của thuốc, sớm triển khai sản xuất thuốc này thành hiện thực.

-3-


Phần I

Tổng quan
1.1. Đại cơng về amylase và papain
1.1.1. Amylase
Amylase [EC.3.2.1] thuéc nhãm enzym hydrolase cã vai trß quan träng
trong việc thuỷ phân tinh bột trong thức ăn thành các thành phần đơn giản hơn.
Amylase xúc tác sự phân giải liên kết nội phân tử trong các polysaccarid với sự
tham gia của nớc có trong dịch tiêu hoá nh nớc bọt, dịch dạ dày..., đợc mô
phỏng theo phơng trình sau:

R-R' + H-OH  RH + R'OH
Amylase cã nguån gèc ë cả động vật và thực vật. ở ngời amylase đợc sinh
ra chủ yếu ở hai tuyến: tuỵ và nớc bọt. Hiện nay, ngời ta đà biết có 6 loại
amylase, trong đó 3 loại: -amylase, -amylase, -amylase (glucoamylase) thuỷ
phân các liên kết -1,4-glucosid của tinh bột, glycogen và các polysaccharid.
Các

amylase

còn

lại:

dextrin-6-glucanhydrolase,

amylopectin-6-

glucanhydrolase và olygodextrin-6-glucanhydrolase (hay dextrinase) thuỷ phân
liên kết -1,6-glucosid trong phân tử polysaccharid. Sáu enzym amylase này
cũng có thể đợc chia thành hai nhãm: endoamylase vµ exoamylase [4]:
- Endoamylase: gåm cã α-amylase và các enzym khử nhánh. Nhóm
enzym khử nhánh đợc chia thành hai loại: khử trực tiếp là pullulanase (hay dextrin 6-glucanohydrolase); khử gián tiếp là transglucosylase (hay oligo-1,6glucosidase) và amylo-1,6-glucosidase. Các endoamylase thuỷ phân các liên kết
glucosid bên trong của chuỗi polysaccharid.

-4-


- Exoamylase:gồm -amylase và -amylase, là những enzym thuỷ phân
tinh bột từ các đầu cuối không khử của chuỗi polysaccharid.

Đặc ®iĨm cđa mét sè amylase:

 α -amylase (α−1,4−glucan−4−glucanohydrolase, EC.3.2.1.1)
α-amylase lµ enzym có khả năng thuỷ phân tinh bột, amylose
amylopectin, glycogen, dextrin, là một endoenzym, có ở nớc bọt và dịch tuỵ và
cả ở máu, tham gia thuỷ phân tiêu hoá tinh bột một phần ở miệng, phần lớn là
tiêu hoá tinh bột ở ruột non. -amylase cũng đợc phân lập từ hầu hết các động
vật, các hạt nảy mầm và một số loài nấm nh Aspergillus oryzae, hoặc từ một số
loại vi khuẩn không gây bệnh nh Bacillus subtilis.
Cơ chế tác dụng: -amylase có khả năng phân cắt các liên kết -1,4glucosid của cơ chất một cách ngẫu nhiên, tạo nên hỗn hợp gồm 70 - 90%
maltose, một lợng nhỏ D-glucose và các -dextrin giới hạn phân tử lợng thấp
(gồm 4 - 8 phân tử glucose và chứa một hoặc hơn một liên kết -1,6- glucosid).
Các liên kết -1,6-glucosid trong chuỗi polysaccharid không bị phá vỡ bởi
enzym này.
Các giai đoạn của quá trình thuỷ phân tinh bột của -amylase:
- Giai đoạn dextrin hoá:
Tinh bột

-amylase

dextrin phân tử lợng thấp (4-8 liên kết glucosid)

- Giai đoạn đờng hoá:
Dextrin

-amylase

Tổng quát :

tetra- vµ trimaltose

α-amylase
-5-

di- vµ monosaccharid


Amylose
Maltose
(di và monosaccharid)

oligosaccharid

polyglucose

maltotriose

maltotetrose

Khả năng dextrin hoá của -amylase rất cao, do đó ngời ta còn gọi amylase là amylase dextrin hoá hay amylase dịch hoá.
Tính chất: -amylase là một protein phức tạp có chứa Ca2+. -amylase
có nguồn gốc khác nhau, thờng có thành phần acid amin không hoàn toàn giống
nhau và mỗi loại -amylase từ một nguồn gốc cũng thờng có một tổ hợp các
acid amin đặc hiệu riêng. Thành phần chung của các -amylase có chứa nhiều
tyrosin, trytophan, acid glutamic và acid aspartic. Các acid amin có tính acid là
glutamic và aspartic chiếm khoảng 1/4 lợng acid amin của phân tử enzym, nhng
ngợc lại, -amylase có rất ít methionin và chỉ có 7 10 gốc cystein. Các αamylase cã ngn gèc kh¸c nhau cịng cã KLPT rÊt khác nhau: -amylase từ
tuỵ động vật có KLPT là 4500 Da, trong khi đó -amylase từ Bacillus subtilis

có tác dụng giống -amylase từ tuỵ động vật mà KLPT lại gấp đến 2 lần là
9900 Da [4], [6].
Nhìn chung, -amylase có một số đặc tính nh:
+ Protein của -amylase có tính acid yếu; dễ tan trong nớc, trong các dung
dịch muối và cồn thấp độ.
+ Điểm đẳng điện của -amylase nằm trong vïng pH 4,2 - 5,7 [3].
+ α-amylase lµ mét metaloenzym, mỗi phân tử -amylase đều có chứa 130 nguyên tử gam Ca/mol, nhng không ít hơn 1-6 nguyên tử gam Ca/mol. Ca
tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc ba của enzym, duy trì hoạt
động của enzym [4].
+ Hoạt động của -amylase đợc hoạt hoá bởi ion Cl-, bị kìm hÃm bởi các
kim loại nặng nh Cu2+, Ag+, Hg2+... pH tèi thÝch lµ 6,9 (α-amylase ®éng vËt); 4,7

-6-


- 5,4 (α-amylase thùc vËt – mÇm lóa); 5,0 - 6,0 (α-amylase vi khn Bacillus
subtilis) [3].
+ §é bỊn nhiƯt cđa các -amylase nguồn gốc khác nhau cũng không giống
nhau, các -amylase nấm men và vi khuẩn bền với nhiệt hơn các -amylase
động vật và thực vật [4].
-amylase (1,4glucanmaltohydrolase, EC.3.2.1.2)
-amylase là enzym thuỷ phân tinh bột, hiện diện phổ biến ở thực vật, đặc
biệt là ở hạt nảy mầm. -amylase xúc tác sự thuỷ phân cắt từng phân tử maltose
khỏi đầu không khử của chuỗi polysaccarid bằng cách phân cắt liên kết -1,4glucosid.
KLPT của -amylase là 152.000 Da và 215.000 Da, bị ức chế bởi
iodoazobenzoat, iodoacetamid, ascorbat, các kim loại nặng nh Ag+, Hg2+, Cu2+,
các thuốc thử có chứa nhãm –SH. pH tèi thÝch 4,0 – 5,0 [4]. β-amylase chịu
nhiệt kém hơn -amylase nhng bền với acid hơn, bị bất hoạt ở nhiệt độ 70 oC
[4].
-amylase (glucoamylase, 1,4glucan4glucanohydrolase, EC.3.2.1.3)

-amylase là enzym này có khả năng thuỷ phân liên kết -1,4 lẫn -1,6
glucosid. Khi thuỷ phân liên kết -1,4-glucosid trong chuỗi polysaccharid,
glucoamylase tách lần lợt từng phân tử glucose ra khỏi đầu không khử của
mạch polysaccharid. Ngoài các liên kết -1,4 và -1,6 glucosid, glucoamylase
còn có khả năng thuỷ phân các liên kết -1,2 và -1,3 glucosid. Do đó,
glucoamylase có khả năng thuỷ phân hoàn toàn tinh bột, glycogen,
amylopectin, dextrin, maltose... thành glucose mà không cần có sự tham gia của
các loại amylase khác [4].

-7-


pH tèi thÝch cđa glucoamylase n»m trong vïng acid nhĐ là 4,0-5,0 và cũng
có loại glucoamylase có pH tối thích nằm trong vùng trung tính khoảng 6,0-7,5
[4].



ứng dụng:
Với vai trò là enzym có tác dụng thuỷ phân polysaccharid, amylase đà đợc

ứng dụng rất rộng rÃi trong nhiều lĩnh vực: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp
dệt may, y tế và nhiều lĩnh vực kinh tế khác. Trong công nghiệp thực phẩm để
làm lỏng tinh bột, nấu rợu bia, chế tạo bánh kẹo. Trong Y Dợc, dùng để chế tạo
glucose, dextrin uống và tiêm truyền, dùng làm thuốc chữa rối loạn tiêu hoá, bổ
trợ tiêu hoá cho nhiều đối tợng khác nhau. Đặc biệt, gần đây ngời ta dùng
amylase để hoá lỏng thức ăn nhằm tăng đậm độ dinh dỡng trên một thể tích
thức ăn cho trẻ em SDD. Ngoài ra, cũng ®· cã nh÷ng ý tëng sư dơng amylase
nh»m mơc ®Ých chống viêm và phù nề mặc dù những ý tởng đó vẫn còn phải đợc chứng minh trong thực tế.

1.1.2. Papain
Papain [EC.3.4.1.21] là một trong các enzym thuỷ phân protein có nguồn
gốc thực vật đợc nghiên cứu nhiều về tính chất và cơ chế hoạt động. Papain chủ
yếu đợc tách chiết từ nhựa quả đu đủ xanh của cây đu đủ Carica papaya L.
(Caricaceae).
a- Cấu tạo hoá học:
Papain là một endoprotease có chứa 16,1%N và 1,2%S [4]. Phân tử enzym
có 212 acid amin trong đó không chứa methionin, khối lợng phân tử 23400 Da.
Mạch polypeptid của Papain có đầu tận amin là isoleucin, đầu tận carboxyl là
asparagin, phân tử có 3 liên kết disulfua (SS) đợc tạo bởi 6 gốc cystein vµ mét

-8-


nhóm SH (sulfhydryl) tự do ở vị trí 25, các liên kết này không có chức năng
sinh học, chỉ làm tăng tính bền vững của cấu trúc [4].
Thành phần chính của papain cha hoạt hoá là hỗn hợp protein cystein
disulfid. Khi hoạt hoá papain bằng KCN sẽ giải phóng ra nhóm thiol của phân
tử enzym và -thiocyanatalanin do sự tơng tác giữa cyanid và cystein. Sau đó,
-thiocyanatalanin khép vòng tạo thành -iminothiazolidin. Khi có không khí,
cơ chế trên xảy ra theo chiều ngợc lại tạo thành sản phẩm không hoạt hoá. Quá
trình hoạt hoá papain không làm thay đổi cấu trúc không gian của nó [4].
N+H3

papa
in

CN

papa

in

SSCH2CH

SH + S

COO

N+H3

CH2CH

CN
hoạt hoá

Papain
hoạt động

COO
thiocyanatalanin
O2
HCNH2
S
H2C

NH
CH

COO
iminothiazolidin

Hình1: Sơ đồ cơ chế hoạt hoá papain bằng cyanid
b- Cấu trúc không gian của papain:
Phân tử papain có dạng hình cầu với kích thớc của các trục chính trong cấu
o

trúc không gian 3 chiều là: 36ì48ì36 A , mạch polypeptid chính bị gấp khúc
thành hai phần riêng biệt tạo nên một hốc đặc biệt. Trung tâm hoạt động nằm

-9-


tại bề mặt của khe này, nhóm sulfhydryl hoạt động của cystein 25 nằm bên
trái khe và nhóm histidin 159 nằm bên phải khe. Phần có cấu trúc xoắn
chiếm khoảng 20% toàn bộ acid amin có trong phân tử [4].
c- Hoạt tính enzym và cơ chế tác dụng:
Đặc điểm quan trọng nhất của papain là khả năng thuỷ phân protein đến
tận acid amin. Papain thuỷ phân protein thành các polypeptid và các acid amin,
đóng vai trò vừa nh một endopetidase vừa nh một exopeptidase [4].
Các endopeptidase thuỷ phân proein chủ yếu thành peptid:
R

R

R

(-NH-CH-CO-NH-CH-CO-)n + (HOH)

R

(-NH-CH-COOH)i + (H2N-CH-CO-)k

i+k=n

Các exopeptidase thuỷ phân các peptid thành amino acid:
R

R

R

(-NH-CH-CO-NH-CH-CO-)n + (HOH)

R

(NH2-CH-COOH)n' + (H2N-CH-CO-)k'

n' + k' = n

So víi c¸c protease cã ngn gèc động vật và vi sinh vật khác, papain có
khả năng thuỷ phân sâu hơn, vì vậy nó đợc dùng để thuỷ phân tiếp các liên kết
peptid còn lại sau khi đà thuỷ phân bằng pepsin, trypsin hay chymotrysin.
Tính đặc hiệu cơ chất của papain rất rộng, papain có khả năng phân huỷ
hầu hết các liên kết peptid trừ các liên kết với prolin và với các acid glutamic có
nhóm carboxyl tự do.
d- Sự hoạt hoá papain:
Papain cần có nhóm sulfhydryl tự do để thể hiện hoạt tính xúc tác. Do
trung tâm hoạt động của papain có nhóm cystein 25 và nitrogen bậc 3 của
histidin 159 có tính khử nên các chất đóng vai trò hoạt hoá papain là các chất cã
tÝnh khö yÕu nh: cystein, glutathion acid, hydrocyanid, hydrosulfid,
natrithiosulfat... trong đó cystein thờng đợc dùng nhiều nhất. Khi có mặt của

một trong các chất hoạt hoá này thì nhóm -SH ở trung tâm hoạt động của papain
đợc phục hồi và làm tăng hoạt tính của papain. Sự hoạt hoá càng đợc tăng cờng

-10-


khi có sự hiện diện của các chất có khả năng liên kết với kim loại nặng nh
EDTA. Vì vậy, để thu đợc hoạt tính enzym tối u nhất ngời ta thờng dùng hỗn
hợp cystein và EDTA, trong đó cystein đóng vai trò chất hoạt hoá papain, còn
EDTA đóng vai trò liên kết tạo phức với ion kim loại nặng có trong dung dịch
enzym.
Cơ chế của sự hoạt hoá papain:
HCN, H2S,...
PaSSPa

I2, O2,...

(bất hoạt)


2 PaSH
(hoạt động)

2+



PaS + SPa

2+

(hoạt động)

{2 PaS}Me2+
(bất hoạt)

e- Sự ức chế papain:
Papain bị kìm hÃm (ức chế) bất thuận nghịch bởi các chất oxy hoá nh: O2,
ozon, H2O2, Iodid acetat, iodid acetamid, thuỷ ngân chlobenzoat, cystin và một
số dẫn chất disulfid khác. Các chất này ức chế hoạt tÝnh cđa papain b»ng ph¶n
øng víi nhãm –SH ë trung tâm hoạt động của papain và do vậy mà làm thay
đổi cấu trúc tâm hoạt động của nó [4].
Papain bị ức chế thuận nghịch bởi không khí, cystein ở nồng độ thấp, các
ion kim loại nặng nh Cd2+, Zn2+, Fe2+, Cu2+, Hg2+, Pb2+ [4],[3].
f- Các yếu tố ảnh hởng đến hoạt tính enzym:

Nhiệt độ: Papain là enzym chịu đợc nhiệt độ tơng đối cao và độ bền
chịu nhiệt của nó phụ thuộc vào dạng chế phẩm. ở dạng nhựa khô papain không
bị biến tính trong 3 giờ ở 100oC. Còn ở dạng dung dịch papain bị mất hoạt tính
sau 30 phút ở 82,5oC và nếu tăng nhiệt độ cao hơn (> 100oC) thì nó sẽ bị mất

-11-


hoàn toàn hoạt tính kể cả khi thêm một lợng lớn chất hoạt hoá vào dung dịch do
cấu trúc trung tâm hoạt động của enzym đà bị phá huỷ hoàn toàn.
Papain trong dung dịch NaCl giữ ở 4oC bền trong nhiều tháng. Trong dung
dịch dẫn xuất thuỷ ngân, papain cũng không mất hoạt tính trong nhiều tháng.
Papain dạng ổn định ở trạng thái khô có thể chịu nhiệt độ sấy ở 115oC trong thời
gian 2 giờ mà hoạt tính vẫn duy trì đợc 90% [4].

Papain ở dạng tinh sạch và ở dạng tinh thể có độ bền nhiệt thấp hơn papain
ë trong nhùa mđ, do trong nhùa mđ cßn chøa các protein khác có tác dụng bảo
vệ nó [4].
Khi thuỷ phân các protein khác nhau, tuỳ thuộc vào cơ chất mà nhiệt độ
phản ứng thích hợp (nhiệt độ tối u) cho papain cũng khác nhau. Đối với cơ chất
casein, nhiệt độ phản ứng tối u là 37oC [4].
pH: Papain hoạt động ở khoảng pH tơng đối rộng từ 4,5 - 8,5 và hầu
nh bền ở khoảng pH này, nhng lại dễ biến tính trong môi trờng acid có pH < 4,5
hoặc trong môi trờng kiềm mạnh có pH > 12. Đặc biệt papain dạng ổn định có
thể chịu đợc ë pH = 1,5 vµ pH = 8,5 trong 90 phút.
Tuỳ thuộc vào bản chất của cơ chất mà pH tối u của papain sẽ khác nhau,
chẳng hạn papain phản øng víi casein ë pH tèi u lµ 7 - 7,5; víi albumin ë pH tèi
u lµ 4,5 - 7,1 vµ víi gelatin ë pH tèi u lµ 5,2 - 6,0 và 6,4. Điểm đẳng điện của
papain là pI = 9 [4].
g- Công dụng:
Papain có tác dụng làm mềm thịt, thuỷ phân protein làm trong đồ uống,
làm mềm và sạch da. Trong Y Dợc, papain là enzym đợc dùng để phòng chống
dính, làm tróc vẩy và xử lý làm sạch vết thơng [9]; chế phẩm uống papain có tác
dụng tiêu hoá protein có trong thức ăn và có tác dụng chống viêm phi steroid
(theo cơ chế enzym).

-12-


1.2. Một số sản phẩm thuốc có chứa papain và amylase
Hiện nay các chế phẩm enzym đang đợc sử dụng ë ViƯt Nam vÉn chđ u
lµ nhËp cđa níc ngoµi. Mét sè chÕ phÈm chøa Papain vµ Amylase sư dơng với
mục đích điều trị rối loạn tiêu hoá thông dụng nh [8]:
-

Pantyrase,

Panthicone,

Panticone

F,

Dailase,

Gastal, Korzym, Pandual, Panwoodi, Sancase, Stilase,
Topase F, Hanolase...(Dạng viên nén hoặc viên nang) (Hàn Quốc).
- Gaszym (Viên nén, viên nang) (Thái Lan).
- Panzytrat, Pancurmen, Pangrol, Nezym forte (Đức).
- Viên nÐn sđi bät Pepfiz, Papaynol (siro, viªn nÐn, viªn nhƯn),
Neopetine (dạng thuốc giọt và dạng viên nang) (ấn Độ).
- Viên bọc đờng Pancrelase (Pháp - Đức).
- Creon, Pancreflash (viên nén bọc) (Pháp).
- Festale N (Roussel VN).
- Neo-Panpur (Hungari).
- AlPAMylase (viên nang) và alpamylase trẻ em (dạng dung
dịch): lần đầu tiên đợc sản xuất tại Việt Nam, tại công ty Dợc khoa - Trờng Đại
học Dợc Hà Nội.
Các sản phẩm này đà đợc sản xuất và đợc phép lu hành cho mục đích
phòng và chữa bệnh, nhng những công trình nghiên cứu hỗ trợ thêm nhằm đảm
bảo chất lợng thuốc tốt trong các quá trình sản xuất và phân phối lu thông vẫn
cần đợc tiếp tục. Đánh giá sự biến đổi hoạt tính của hỗn hợp papain và alpha
amylase trong các dạng thuốc ở những điều kiện nhất định vẫn là cần thiết để có
cơ sở đảm bảo và nâng cao độ ổn định của thuốc, phục vụ tốt cho công tác
phòng và chữa bệnh.

-13-


Phần II

Thực nghiệm và kết quả
2.1. Nguyên liệu và phơng pháp thực nghiệm

2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu
2.1.1.1. Chế phẩm enzym
- Chế phẩm papain đạt tiêu chuẩn IP 96.
- Chế phẩm alpha amylase đạt tiêu chuẩn IP 96.
2.1.1.2. Hỗn hợp các chế phẩm
a) Hỗn hợp bột papain và alpha amylase (PA B):
PA B1
Alpha amylase IP 96
Papain IP 96
Dimethicone IP 96
Lactose

PA B2
100 mg
100 mg
30 mg
v® 500 mg

Alpha amylase (fungal) IP 96 100 mg
Papain IP 96
100 mg

Simethicon DĐVN III
30 mg
Calci tribasic phosphat
vđ 500 mg

b) Hỗn hợp dung dịch papain và alpha amylase (PA D):
PA D1

PA D2

Alpha amylase IP 96
200 mg
Papain IP 96
100 mg
Tinh dÇu Dill IP 96
20 mg
Tinh dÇu Anise IP 96
20 mg
Tinh dầu Caraway IP 96 20 mg
Nớc cất
vđ 10 ml

Alpha amylase (fungal) IP 96 200 mg
Papain IP 96
100 mg
Tinh dÇu håi DĐVN III
30 mg
Tinh dầu cam DĐVN III
30 mg
Saccarose DĐVN III

200 mg
Hỗn hợp Nipazin/Nipazon
(tỷ lệ 9/2)
0,2 mg
Nớc cất
vđ 10 ml

Trong ®ã:

-14-


- Hỗn hợp PA B1 và PA D1 đợc nghiên cứu và sản xuất bởi hÃng
Raptakos ấn Độ, đà đợc phép nhập khẩu và lu hành ở Việt Nam.
- Hỗn hợp PA B2 và PA D2 đợc nghiên cứu chế tạo tại bộ môn Hoá sinh
Trờng Đại học Dợc Hà Nội.

2.1.2. Hoá chất và thuốc thử
Cơ chất:
- Dung dịch casein 4%: Hoà tan 4,0g casein tinh khiết víi 90ml níc (60oC,
30phót), chØnh ®Õn pH 7,0 b»ng dung dịch NaOH 1N, thêm nớc vừa đủ 100ml
(pha trớc khi dùng).
- Dung dịch casein 0,6%: Cân chính xác khoảng 0,6g casein tinh khiết cho
vào cốc có mỏ. Thêm dung dịch đệm phosphat pH 7,2 vừa đủ 100ml. Đun cách
thuỷ trong 60 phót, võa ®un võa khy. Sau ®ã läc qua gạc.
- Dung dịch tinh bột 1: Cân chính xác khoảng 1,0g tinh bột khô (sấy
chân không ở 60oC, 5 mmHg trong 4 giờ) vào cốc có mỏ dung tích 100ml.
Thêm khoảng 5ml nớc, khuấy đều, sau đó thêm 50ml nớc sôi để hồ hoá. Đun
nóng trong 5 phút, làm lạnh đến khoảng 20oC, thêm 5g NaCl. Chuyển toàn lợng
dung dịch vào bình định mức, thêm nớc vừa đủ 100ml. Pha loÃng 10ml dung

dịch này với dung dịch đệm acetat pH 5,0 thành 100ml dung dịch cơ chất tinh
bột.
Hoá chất và thuốc thử:
- Dung dịch cystein hydroclorid 5%: Hoà tan 5,0g cystein hydroclorid
trong 90ml níc cÊt, chØnh pH ®Õn 7,0 bằng dung dịch NaOH 1N, thêm nớc vừa
đủ 100ml (pha trớc khi dùng).
- Dung dịch cystein 0,04M: Hoà tan 0,49g cystein vào 90ml dung dịch
đệm pH 7,2, sau đó thêm dung dịch đệm pH 7,2 vừa đủ 100ml (pha trớc khi
dùng).
- Dung dịch đệm phosphat pH 7,2:

-15-


Na2HPO4.12H2O.........................................55,132g.
Acid citric.....................................................4,853g.
Nớc cất vừa đủ.............................................1000ml.
- Dung dịch đệm acetat pH 5,0: Hoà tan 6,8g natri acetat và 2,5ml acid
acetic băng vào khoảng 400ml nớc cất, sau đó thêm nớc vừa đủ 500ml. Điều
chỉnh đến pH 5,0 nếu cần.
- Dung dịch Iod 0,1N: Hoµ tan 7g Iod vµ 18g Kali Iodid vào 50ml nớc cất.
Thêm 3 giọt acid hydroclorid và pha loÃng với nớc thành 500ml.
- Dung dịch Iod 0,02N: Pha loÃng 10ml dung dịch Iod 0,1N bằng nớc cất
thành 50ml.
- Dung dịch acid trichloroacetic 10%
Acid trichloroacetic...........................................10g.
Nớc cất vừa đủ...............................................100ml.
- Thuốc thư Gornall:
Hoµ tan 1,5g CuSO4.5H2O vµ 6,0g Natri Kali Tartrat trong 500ml nớc cất.
Thêm 300ml dung dịch NaOH 10% (30g Natri hydroxyd trong 300ml nớc cất).

Vừa thêm vừa lắc đều. Thêm 1g KI rồi hoàn thành 1000ml bằng nớc cất. Lắc
kỹ, bảo quản trong lọ nút kín.
- Dung dịch NaOH 1N và 0,1N.
- Dung dịch phenolphtalein 0.1% trong cồn.
- Dung dịch formaldehyd (TT).

2.1.3. Dụng cụ máy móc
- Tủ ấm.
- Máy điều nhiệt Cliffton Peu - 2.
- Máy li tâm Hettich 13 - 12.
- Máy đo quang (UV - VIS) Heios.

-16-


2.1.4. Phơng pháp nghiên cứu
2.1.4.1. Điều kiện lÃo hoá cấp tèc cho c¸c chÕ phÈm enzym
- Bng thÝ nghiƯm LHCT chứa mẫu nghiên cứu là một tủ ấm riêng biệt,
đóng kín, đặt cố định và để liên tục ở nhiệt ®é 50 oC trong st thêi gian thÝ
nghiƯm: 10 tn (70 ngày).
- Các mẫu nghiên cứu PA B1, PA B2, PA D1, PA D2 đựng trong chai thuỷ
tinh màu nâu, nắp kín, đợc đặt trong buồng thí nghiệm LHCT trong suốt thời
gian nghiên cứu. Định kỳ 7 ngày (1 tuần) 1 lần lấy mẫu xác định hoạt độ enzym
theo các phơng pháp xác định hoạt độ enzym và đánh giá sự biến đổi hoạt độ
các enzym trên các biểu đồ riêng biệt thông qua theo dõi phần trăm (%) hoạt độ
enzym (HđE) còn lại và tốc độ (v) giảm HđE theo tuần (HđE/t) cho mỗi hỗn
hợp enzym.
2.1.4.2. Kỹ thuật định lợng protein bằng phản ứng Biuret [10]
ã Nguyên tắc: Protein có liên kết peptid cho tác dụng với CuSO4 và NaOH
tạo thành phức màu tím hồng. Đo quang phổ hấp thụ so với biểu đồ mẫu để

định lợng protein.
ã Xây dựng biểu đồ mẫu để định lợng protein bằng phản ứng Biuret:
Cân 1,00g Albumin bò tinh khiết, hoà tan với dung dịch NaCl 0,9% vừa
đủ để có dung dịch 1%. Từ dung dịch này ta thực hiện phản ứng theo b¶ng sau:
Thc thư
Dd albumin 1% (ml)
Dd NaCl 0,9% (ml)
Thc thư Gornall (ml)

1
2
3
4
0,1 0,2 0,3 0,4
0,9 0,8 0,7 0,6
4
4
4
4

èng nghiÖm
5
6
7
8
9
0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
0,5 0,4 0,3 0,2 0,1
4
4

4
4
4

10
1
0
4

Lắc đều, để 30 phút ở nhiệt độ phòng, đo quang ở bớc sóng = 530nm.
Từ kết quả đo quang phổ hấp thụ thu đợc của các dung dịch dựng biểu đồ
nồng độ protein (mg/ml) – mËt ®é quang (D).

-17-


2.1.4.3. Phơng pháp xác định hoạt độ Papain
a) Phơng pháp 1 (PP1): Xác định hoạt độ papain dựa theo nguyên tắc
của phản ứng Biuret.
ã Nguyên tắc: Cơ chất protein đợc ủ với enzym ở điều kiện thích hợp trong
thời gian nhất định. Lợng protein còn lại đợc xác định bằng cách cho tủa với
acid trichloroacetic, tủa này phản ứng với thuốc thử Gornall tạo phức màu tím
hồng. Đo quang phổ hÊp thơ ë bíc sãng λ = 530nm, cuvet 1cm.
• Tiến hành:
- Pha chế phẩm enzym đến nồng độ thích hợp bằng dung dịch đệm
phosphat pH = 7,2.
- Xác định khả năng thuỷ phân protein của papain:
Tiến hành phản ứng theo bảng sau:
Thuốc thử (ml)

ống cơ chất

ống thử

ống chứng

Dd casein 0,6%
Acid trichloroacetic 10%
Dd đệm pH 7,2
Cystein 0,04M
Dd enzym 1%

2,0
2,5
1,5
0,5
0

2,0
0
1,5
0,5
0,5

0
2,5
1,5
0,5
0,5

Lắc đều, ñ Êm 37oC trong 60 phót. Sau thêi gian ñ ấm, cho vào ống thử 2,5
ml acid trichloroacetic 10%. Lắc kỹ, để ở nhiệt độ phòng 10 phút, đem ly tâm
lấy tủa. Hoà tan tủa với 4,0 ml thuốc thử Gornall, lắc kỹ, để ổn định ở nhiệt độ
phòng 30 phút. Đo mật độ quang ở bớc sóng = 530nm, cuvet 1cm.
ã Cách tính kết quả:
Đơn vị hoạt độ papain (HđP): Katal (K) và nanoKatal (nK), 1nK=10-9K.
Katal là số mol cơ chất bị thuỷ phân bởi 1 mg enzym trong 1 giây.
Hoạt độ papain đợc tính theo công thøc:

-18-


HđP =
Trong đó: A
B

A ì B ì 106 ì 209
(nanoKatal)
(236 × 10 2 ) × T × m

: Lỵng protein (mg) bị thuỷ phân (xác định theo biểu đồ).
: Độ pha lo·ng cđa dung dÞch chÕ phÈm enzym.

23600 : Träng lợng phân tử gam của casein (g).
209

: Số liên kết peptid cđa mét ph©n tư casein.

T

: Thêi gian thủ ph©n (giây).

m

: Lợng chế phẩm enzym đem thử (mg).

Hoạt độ papain theo % (hoạt độ protease tơng đối) đợc tính theo công
thức:
Dcơ chất Dthử Dchứng
HđP (%) =

Dcơ chất

ì 100%

Trong đó: Dcơ chất : Mật độ quang của ống cơ chất.
Dthử

: Mật độ quang của ống thử.

Dchứng : Mật độ quang của ống chứng.
b)Phơng pháp 2 (PP2): Xác định hoạt độ papain theo IP 96 [11]
ã Nguyên tắc: Dới t¸c dơng cđa Papain ë 60oC trong thêi gian thÝch hợp,
cơ chất casein bị thuỷ phân hoàn toàn giải phóng các acid amin. Định lợng các
acid amin sinh ra sau phản ứng, từ đó suy ra hoạt độ papain.
ã Tiến hành:
- Pha dung dịch thử:
+ Từ hỗn hợp PA dạng bột: Cân chính xác lợng bột chế phẩm chứa
khoảng 0,5g bột Papain cho vào cốc có mỏ, thêm 10ml dung dÞch cystein

-19-


hydroclorid, trộn đều. Chuyển hỗn hợp này vào bình định mức 100ml, tráng cốc
bằng nớc cất, thêm nớc vừa đủ. Lắc đều. Lọc lấy dịch lọc.
+ Từ hỗn hợp PA dạng dung dịch: Lấy chính xác 10ml chế phẩm cho
vào bình định mức 50ml, thêm 10ml dung dịch cystein hydroclorid, lắc đều,
thêm nớc vừa đủ.
- Lấy chính xác 15ml dung dịch casein và 30ml nớc vào một bình nón
dung tích 100ml. Để ổn định ở nhiệt độ 60oC 0,1 trong bình cách thuỷ.
- Thêm 5,0ml dung dịch thử, duy trì hỗn hợp ở 60oC trong 30 phút.
- Làm lạnh nhanh đến nhiệt độ phòng.
Song song làm một mẫu trắng với 5,0ml dung dịch thử đà đun sôi 5 phút
và để nguội tới nhiệt độ phòng (huỷ enzym).
- Thêm vào mỗi bình 2 3 giọt dung dịch phenolphtalein 0,1% và 10ml
dung dịch formaldehyd (TT) đà đợc trung hoà bằng NaOH 0,1N với chỉ thị là
dung dịch phenolphtalein 0,1%.
- Chuẩn ®é b»ng dung dÞch NaOH 0,1N cho ®Õn khi cã màu hồng nhạt
xuất hiện.
ã Cách tính kết quả: Sự chênh lƯch thĨ tÝch dung dÞch NaOH 0,1N dïng
cho mÉu thư và mẫu trắng là hoạt độ thuỷ phân protein (hoạt độ papain) có
trong 5,0ml dung dịch thử.
Hoạt độ papain có trong mỗi ml dung dịch chế phẩm đợc tính theo công
thức:
HđP / ml =

(a b) ì F ì 50
5 ì10

Hoạt độ papain của mỗi gam bột chế phẩm đợc tính theo công thức:

HđP / g =

(a b) × F ×100
5 ×M t

-20-


Trong đó:

a : Số ml dung dịch NaOH 0,1N dùng cho mÉu thư.
b : Sè ml dung dÞch NaOH 0,1N dïng cho mÉu tr¾ng.
F : HƯ sè hiƯu chØnh cđa NaOH.
Mt : Khối lợng bột thuốc đem thử (g).

2.1.4.4. Xác định hoạt độ Amlylase theo IP 96 [11]
ã Nguyên tắc: Cơ chất tinh bột đợc ủ với dịch amylase ở các nồng độ khác
nhau ở 40oC trong một thời gian nhất định. Bằng cách lên màu với thuốc thử Iod
của tinh bột d sau phản ứng xác định đợc lợng enzym đà thuỷ phân hết cơ chất
tinh bột. Từ đó suy ra hoạt độ amylase.
ã Tiến hành:
- Pha dung dịch thử:
+ Từ hỗn hợp PA dạng bột: Cân chính xác một lợng bột hỗn hợp PA
chứa khoảng 0,025g bột alpha amylase vào bình định mức 100ml, thêm dung
dịch đệm acetat pH 5,0 vừa đủ, trộn đều. Lọc lấy dịch lọc. Lấy chính xác 2ml
dung dịch này vào bình định mức 50ml, thêm dung dịch đệm acetat pH 5,0 vừa
đủ, lắc đều.
+ Từ hỗn hợp PA dạng dung dịch: Lấy chính xác 1ml chế phẩm cho vào
bình định mức 100ml, thêm dung dịch đệm acetat pH 5,0 vừa đủ, lắc đều. Lấy

chính xác 2ml dung dịch này pha loÃng bằng dung dịch đệm acetat pH 5,0
thành 50ml dung dịch thử.
- Cho vào 6 ống nghiệm có nắp mỗi ống chính xác 5ml dung dịch cơ chất
tinh bột. Đặt các ống nghiệm vào bình cách thuỷ duy trì ở nhiệt độ 40oC 0,1.
- Khi nhiệt độ của dung dịch trong các ống nghiệm đạt tới 40 oC, thêm
chính xác 0,55; 0,60; 0,65; 0,70; 0,75; 0,80 ml dung dịch thử vào từng èng
nghiƯm riªng biƯt. TÝnh thêi gian tõ lóc cho dung dịch thử vào cơ chất. Trộn
đều, đặt các ống nghiệm vào bình cách thuỷ.

-21-


- Sau đúng 60 phút, lấy các ống nghiệm ra và làm nguội nhanh đến nhiệt
độ phòng.
- Thêm vào mỗi ống nghiệm 0,05ml dung dịch Iod 0,02N, trộn đều để lên
màu.
- Xác định ống có chứa lợng dung dịch thử nhỏ nhất không có màu xanh
hay tím nhạt, tính hoạt độ enzym theo ống này. (Trong trờng hợp tất cả các ống
đều không lên màu hoặc đều lên màu thì cần phải điều chỉnh lại độ pha loÃng
của dung dịch thử cho phù hợp).
ã Cách tính kết quả: Hoạt độ alpha amylase trong 1ml chế phẩm dạng
dung dịch hoặc trong 1g chế phẩm dạng bột là lợng tinh bột tính bằng gam bị
thuỷ phân bởi 1ml chế phẩm dạng dung dịch hoặc 1g chế phẩm dạng bột trong
1 giờ ở 40oC, đợc tính theo công thức sau:
Hoạt độ alpha amylase trong 1ml chế phẩm dạng dung dịch:
25ìM tinh bột

HđA / ml =

2ìVmin

Hoạt độ alpha amylase trong 1g chế phẩm dạng bột:
HđA / g =

25ì M tinh bột
2ì Vmin ì M t

Trong đó:
Mtinh bột : Khối lợng tinh bột khô đà cân để pha dung dịch cơ
chất tinh bột (g).
Vmin

: ThĨ tÝch dung dÞch thư nhá nhÊt trong èng nghiệm
không có màu xanh hay tím nhạt (ml).

Mt

: Khối lợng bét ®em thư (g).

-22-


2.1.4.5. Phơng pháp xử lý thống kê y học các mẫu nghiên cứu [10]
a) Tính độ lệch tiêu chuẩn
Độ lệch tiêu chuẩn là sự biến đổi của những kết quả riêng biệt xung quanh
trị số trung bình M. Công thức tính độ lệch tiêu chuẩn :

(X
n

=

1

i

M)

2

n1

Trong đó: Xi : kết quả đo lần thứ i (i = 1,2,3,,n).
M : giá trị trung bình của các kết quả giữa các lần đo.
n : số lần đo.
Nh vậy ta có kết quả của mẫu nghiên cứu là: M .
b) Tính độ tin cậy t, ngẫu xuất thống kê p
Cách tính trị số t so sánh sự chênh lệch của hai số trung bình:
- Tính khoảng lệch tiêu chuẩn chung cho hai số trung bình theo công thức:

(X
1,2 = ∑

− M1 ) + ∑ ( X 2 − M 2 )
2

1

2

n1 + n 2 − 2

- TÝnh sai số tiêu chuẩn chênh lệch giữa hai số trung bình:
m M1 − M 2 = δ 1,2

n1 + n 2
n1 ì n 2

- Tính trị số t:
t=

Trong đó: X1, X2

M1 − M 2
m M1 − M 2

: KÕt qu¶ cđa mẫu 1 và mẫu 2.

M1, M2 : Trị số trung bình của kết quả mẫu 1 và mẫu 2.
n1, n2

: Số lần đo của mẫu 1 và mẫu 2.

Sau ®ã xem ngÉu xt p (tra b¶ng t [10], víi độ tự do n1 + n2 2).
2.1.4.6. Phơng pháp tính tuổi thọ thuốc theo nguyên tắc Vanhoff [1]

-23-


Tth = K ì Tct

Trong đó: Tth: Tuổi thọ thuốc ë ®iỊu kiƯn thêng.
Tct: Ti thä thc ë ®iỊu kiƯn LHCT.

K=A

To
10

A là hệ số nhiệt độ của tốc độ phản ứng (thờng là 2).
To = To lÃo hoá - To bảo quản bình thờng.

-24-


2.2. Kết quả Thực nghiệm và nhận xét

2.2.1. Xây dựng biểu đồ mẫu định lợng protein bằng phản ứng
Biuret
Đo mật ®é quang (D) theo nång ®é protein thu ®ỵc kÕt quả nh sau:
Nồng độ protein
(mg/ml)

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Mật độ quang D

0,053

0,115

0,157

0,203

0,273

0,313

0,386

0,419

0,468

0,535

Tính các hệ số protein Ki là tỷ lệ giữa nồng độ protein (mg/ml) và độ
hấp thụ quang (D):
K =

Nồng độ protein (mg/ml)
D

 TÝnh hƯ sè K trung b×nh (KTB):

10

K TB =

∑K
i =1

10

i

= 18,77

Công thức tính nồng độ protein (Cprotein)theo mật độ quang (D):
Cprotein = KTB ì D

()

Từ các kết quả trên, thiết lập và vẽ biểu đồ mẫu biểu diễn ®é hÊp thô
quang (D) theo nång ®é protein (mg/ml):

-25-