Nghiên cứu sinh tổng hợp enzym cellulase từ chủng bacillus subtilis phân lập từ đất vườn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI






NGUYỄN THỊ CÚC



NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP ENZYM CELLULASE
TỪ CHỦNG Bacillus subtilis PHÂN LẬP TỪ ðẤT VƯỜN


Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Mã số: 60.42.02.01

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS. LƯƠNG ðỨC PHẨM
TS. NGUYỄN VĂN GIANG




HÀ NỘI - 2014
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp


i

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung
thực và không trùng lặp với các đề tài khác.
Tôi cũng xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được ghi
rõ nguồn gốc.
Học viên

Nguyễn Thị Cúc











Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp


ii


LỜI CẢM ƠN

Luận văn này ñược thực hiện tại phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ Vi sinh,

Khoa Công nghệ Sinh học, trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội. ðể hoàn thành ñược
luận văn này tôi ñã nhận ñược rất nhiều sự ñộng viên, giúp ñỡ của nhiều cá nhân và
tập thể.
Trước hết, tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và kính trọng tới
PGS.TS. Lương ðức Phẩm và TS. Nguyễn Văn Giang người ñã tận tình chỉ bảo,
hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ks. Phạm
Thị Hải, ñã nhiệt tình giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu.
Tôi xin gửi lời cảm ơn Ban Giám hiệu Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội,
Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học, Ban Quản lý ðào tạo sau ñại học, các Thầy
Cô giáo trong Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Khoa Công nghệ Sinh học, ñã tạo mọi ñiều
kiện và giúp ñỡ tôi về kiến thức cũng như chuyên môn trong suốt 2 năm học tập và làm
luận văn.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc ñến gia ñình, bạn bè,
những người thân ñã luôn bên tôi, ñộng viên và khuyến khích tôi trong suốt quá trình
học tập và nghiên cứu.


Học viên


Nguyễn Thị Cúc
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp


iii


Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

iv

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iv

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH ix

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT x

PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1

1.1. Đặt vấn đề 1

1.2. Mục đích của đề tài 2

1.3. Nội dung đề tài 2

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis 3

2.1.1. Đặc điểm chung vi khuẩn Bacillus 3

2.1.2. Vi khuẩn Bacillus subtilis 4

2.1.3. Một số Bacillus thường gặp trong tự nhiên 9

2.2. Giới thiệu chung về cellulose và enzym cellulase 11

2.2.1. Cellulose 11

2.2.2. Lignocellulose 13

2.2.3. Enzym cellulase 16

2.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym cellulase ở vi
sinh vật 23

2.2.5. Một số ứng dụng của enzym cellulase 25

2.2.6. Thu nhận và tinh sạch enzym cellulase từ môi trường nuôi cấy 26

2.3. Tình hình nghiên cứu enzym cellulase 27

2.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 27

2.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 28

PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

3.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 29

3.1.1. Đối tượng nghiên cứu 29

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp


v

3.1.2. Thiết bị và dụng cụ 29

3.1.3. Hóa chất 30

3.2. Các phương pháp nghiên cứu 31

3.2.1. Phương pháp giữ giống 31

3.2.2. Xác định đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào 31

3.2.3. Phương pháp xác định chủng vi khuẩn có hoạt tính enzym cellulase
(phương pháp định tính) 31

3.2.5. Xác định sự sinh trưởng theo mật độ quang 35

3.2.6. Phương pháp xác định hoạt độ enzym cellulase - CMCase (phương
pháp định lượng) (Ghose TK, 1987) 36

3.2.7. Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh tổng hợp
enzym CMCase 37

3.2.8. Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến hoạt độ CMCase 39

3.2.9. Phương pháp tách và thu nhận enzym CMCase bằng dung môi hữu
cơ (ethanol 96

0
và aceton) 40

3.2.10. Xác định độ bền nhiệt độ của CMCase 41

3.2.11. Xác định độ bền pH của CMCase 41

PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42

4.1. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus có hoạt tính enzym CMCase 42

4.1.1. Kết quả tuyển chọn 42

4.1.2. Lựa chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính enzym CMCase 43

4.2. Phân loại 44

4.2.2. Xác định một số các phản ứng sinh hóa của chủng Bs4 44

4.3. Đường cong sinh trưởng của chủng Bacillus subtilis Bs4 45

4.4. Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh tổng hợp enzym
CMCase 46

4.4.1. Lựa chọn chất cảm ứng thích hợp 46

4.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng CMC 48

4.4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường 49

4.4.4. Ảnh hưởng của pH ban đầu 49

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp


vi

4.4.5. Ảnh hưởng của nồng độ CaCO
3
50

4.4.6. Ảnh hưởng của độ thông khí 51

4.4.7. Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh tổng hợp enzym CMCase 52

4.5. Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến hoạt độ CMCase 54

4.5.1. Nhiệt độ phản ứng thích hợp 54

4.5.2. pH phản ứng thích hợp 55

4.6. Nghiên cứu tách enzym CMCase từ dịch môi trường 57

4.7. Xác định độ bền nhiệt của CMCase 58

4.8. Xác định độ bền pH của CMCase 59

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60
Kết luận 61

Kiến nghị 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO 62

PHỤ LỤC 66



Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp


vii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Một số phản ứng sinh hoá của B. Subtilis 5

Bảng 2.2. Thành phần hóa học của một số loại phế thải nông nghiệp 14

Bảng 3.1. Các thiết bị sử dụng trong đề tài 29

Bảng 3.2. Các hoá chất sử dụng trong đề tài 30

Bảng 3.3. Phương pháp xác định hoạt tính một số enzym ngoạ
i bào
của Bacillus subtilis 35

Bảng 3.4. Lượng các chất cho vào trong quá trình thí nghiệm xác định đường
chuẩn glucose 36

Bảng 3.5. Lượng các chất cho vào trong quá trình thí nghiệm xác định hoạt

độ cellulase 37

Bảng 4.1. Đường kính VPG cơ chất CMC của 4 chủng Bs 43

Bảng 4.2. Kết quả xác định một số các phản ứng sinh hóa của chủng Bs4 44

Bảng 4.3. Ảnh hưởng của chất cảm ứng tới khả năng sinh tổng hợp CMCase
của chủng Bs4 47

Bảng 4.4. Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng CMC đến khả năng sinh
CMCase của chủng Bs4 48

Bảng 4.5. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh enzym CMCase 50

Bảng 4.6. Khả năng sinh tổng hợp enzym CMCase của chủng Bs4 trong môi
trường có CaCO
3
51

Bảng 4.7. Ảnh hưởng của độ hiếu khí lên khả năng sinh tổng hợp enzym
CMCase của chủng Bs4 52

Bảng 4.8. Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh tổng hợp enzym
CMCase của chủng Bs4 53

Bảng 4.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng thích hợp đến hoạt độ CMCase
của chủng Bs4 54

Bảng 4.10. Ảnh hưởng của pH phản ứng thích hợp đến hoạt độ CMCase của
chủng Bs4 56

Bảng 4.11. Thu nhận enzym bằng các dung môi hữu cơ 57

Bảng 4.12. Kết quả đo hoạt độ CMCase theo các dung môi hữu cơ 57

Bảng 4.13. Độ bền nhiệt của CMCase 58

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp


viii

Bảng 4.14. Độ bền pH của CMCase 59
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp


ix

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1. Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis 4

Hình 2.2. Cấu tạo phân tử cellulose 12

Hình 2.3. Cấu trúc của CMC 13

Hình 2.4. Cấu trúc của lignocellulose 14

Hình 2.5. Cấu tạo phân tử lignin 16

Hình 2.6. Cơ chế hoạt động của endoglucanase (EG) 19

Hình 2.7. Cơ chế hoạt động của exoglucanase (CBH) 20

Hình 2.8. Cơ chế hoạt động của β - glucozidase 20

Hình 2.9. Sơ đồ tác động phân giải của hệ cellulase lên phân tử cellulose
(Has G.Schlegel, 1993) 21

Hình 2.10. Mô hình phân hủy cellulose của Lutzen 22

Hình 4.1. Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào các chủng Bs có hoạt tính
enzym ngoại bào 43

Hình 4.2. Khả năng thủy phân cơ chất CMC của chủng vi khuẩn Bs4 43

Hình 4.3. Đường cong sinh trưởng của chủng vi khuẩn Bs4 ở 30
0
C 45

Hình 4.4. Ảnh hưởng của chất cảm ứng tới khả năng sinh tổng hợp CMCase
của chủng Bs4 47

Hình 4.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường đến khả năng sinh enzym
CMCase 49

Hình 4.6. Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh tổng hợp enzym
CMCase của chủng Bs4 53

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp


x



DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

CBH : Cellobiohydrolase hay Exoglucanase
CBH II : Exoglucanase II
CBHI : Exoglucanase I
CMC : Cacbon Methyl Cellulose
CMCase : Cacbon Methyl Cellulase
DNS : Acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic
EG : Endoglucanase

VddE : Thể tích dung dịch enzym thô
Vdm : thể tích dung môi
VSV : Vi sinh vật

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

1

PHẦN 1. MỞ ðẦU
1.1. ðặt vấn ñề
Vi sinh vật trong tự nhiên rất đa dạng và phong phú. Chúng có mặt khắp nơi:
trong đất, trong nước, trong không khí,…Bên cạnh tác hại gây ra như gây bệnh cho
con người, động vật, thực vật…vi sinh vật còn mang lại cho con người nguồn lợi to

lớn trong các lĩnh vực công nghiệp, nông nghiệp, công nghệ sinh học… Các chủng vi
sinh vật nói chung và vi khuẩn Bacillus nói riêng đang được ứng dụng rộng rãi trong
các ngành sản xuất là nhờ khả năng sinh các loại enzym thủy phân của chúng.

Enzym là những chất xúc tác sinh học có hiệu suất xúc tác cao, đang ngày càng
được áp dụng rộng rãi trong thực tế với quy mô ngày càng lớn. Hệ enzym của Bacillus
rất phong phú và đa dạng gồm protease, amylase, glucoamylase, glucanase, cellulase,
dextranase, pectinase và chế phẩm enzym cellulase là một trong những chế phẩm
enzym có vai trò rất quan trọng trong quá trình chuyển hóa vật chất hữu cơ trong tự
nhiên. Cellulase có thể thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như thực vật, động vật và
vi sinh vật. Nhưng hiệu quả kinh tế nhất vẫn là nguồn cellulase thu được từ vi sinh vật,
phổ biến là nấm, xạ khuẩn và vi khuẩn. Mặc dù nấm sợi phân hủy rất tốt các cellulose
tự nhiên nhưng vi khuẩn lại có tốc độ sinh trưởng cao hơn so với nấm nên có ưu việt
lớn hơn.
Trong sản xuất và đời sống, enzyme nói chung và cellulase nói riêng được sử
dụng ngày càng phổ biến, sản lượng và kim ngạch mua bán các chế phẩm enzyme trên
thị trường thế giới tăng 20÷30% mỗi năm. Enzyme và những chế phẩm có liên quan
được sử dụng trong các ngành công nghiệp nhẹ, nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm
ở Việt Nam hiện nay chủ yếu được nhập khẩu từ nước ngoài với giá thành cao mặc dù
nước ta có nguồn phế phẩm nông nghiệp dùng làm nguyên liệu để sản xuất enzyme
cellulase là rất phong phú. Vì thế, việc nghiên cứu sản xuất ra các enzym từ vi sinh vật
phân lập tại Việt Nam hiện nay đang là một đòi hỏi cấp thiết. Việc tuyển chọn các vi
sinh vật có khả năng sản xuất enzym nhất là cellulase từ tự nhiên không những giúp
tận dụng các nguồn gen quý hiếm có sẵn từ tự nhiên mà còn góp phần bảo tồn gen, cải
tạo các chủng vi sinh vật công nghiệp đã bị thoái hóa giống sau một thời gian sử dụng.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

2

Xuất phát từ lý do trên và tình nghiên cứu tại Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành thực

hiện đề tài: ‘‘Nghiên cứu sinh tổng hợp enzym cellulase từ chủng Bacillus subtilis
phân lập từ ñất vườn’’.
1.2. Mục ñích của ñề tài
1. Chọn được một chủng vi khuẩn có khả năng sinh ra cellulase.
2. Thu được một chế phẩm cellulase ở quy mô phòng thí nghiệm.
1.3. Nội dung ñề tài
1. Tuyển chọn một chủng vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh enzym cellulase.
2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng tuyển chọn.
3. Khảo sát các điều kiện nuôi cấy tối ưu cho sinh tổng hợp cellulase
4. Nghiên cứu phương pháp tách chiết và thu nhận chế phẩm cellulase có hoạt
tính cao.











Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

3

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis
2.1.1. ðặc ñiểm chung vi khuẩn Bacillus

Bacillus phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong đất, nước, không khí là do chúng
có khả năng hình thành bào tử và sống kị khí tùy tiện. Phần lớn các chủng thuộc các
loài của giống này đều có khả năng sinh ra nhiều amylase và protease kiềm, có một số
chủng sinh ra cellulase.
Bacillus là vi khuẩn Gram dương (+), hình que có kích thước khác nhau (0,5-2,5)
x (l,2-10) µm. Bacillus có chùm tiêm mao giúp chúng có khả năng di động. Chúng
sống hiếu khí hay kị khí tùy tiện. Bacillus là vi khuẩn dị dưỡng hóa năng, hoại sinh thu
năng lượng nhờ oxi hóa các hợp chất hữu cơ.
Bacillus có khả năng sinh bào tử. Bào tử của vi khuẩn không phải là cơ quan
sinh sản mà là một trạng thái bảo vệ nòi giống. Nó sinh ra để chịu đựng được với
các điều kiện sống bất lợi. Đó là dạng nghỉ của tế bào và ở đó, quá trình sống bị ức
chế rất mạnh. Ở phần lớn vi khuẩn, mỗi tế bào chỉ có một bào tử. Gặp điều kiện
thuận lợi, bào tử sẽ nảy mầm. Mỗi bào tử cho ra một tế bào sinh dưỡng. Bào tử của
giống Bacilus thường có kích thước hẹp hơn kích thước của tế bào do đó khi mang bào tử
tế bào không bị biến đổi hình dạng , trong một số trường hợp tế bào vi khuẩn chỉ phình to
một ít khi chứa bào tử. Tùy loài mà bào tử có thể nằm chính tâm, lệch tâm hay gần đầu tế
bào (Lương Đức Phẩm, 2009).
Bào tử vi khuẩn có thể chịu đựng được khá cao các điều kiện bất lợi của ngoại
cảnh. Khả năng đề kháng này không giống nhau đối với tùy loài vi khuẩn. Ở nhiệt
độ 100
0
C, bào tử của vi khuẩn Bacilus cereus có thể chịu được hai phút rưỡi, của B.
sterosporus – 7 phút rưỡi, B. subtilis – 180 phút, B. mesentericus – 380 phút, và
của B. tostus – 1200 phút (Nguyễn Lân Dũng, 1989).
Đa số Bacillus sinh trưởng tốt ở pH = 7, một số Bacillus phù hợp với pH = 9 - 10
như B. alcalophillus, hay có loài phù hợp với pH = 2 - 6 như B. acidocaldrius.
Nhiều chủng Bacillus ưa nhiệt độ cao (45°C - 75°C), hay ưa lạnh (5°C - 25°C),
nhưng thường gặp Bacillus ưu ấm ở nhiệt độ 25°C - 45°C (tối thích là 35°C - 37°C).

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

4

Vi khuẩn thuộc giống Bacillus đã và đang ngày càng trở thành những vi sinh vật
hàng đầu về mặt ứng dụng do chúng có tiềm năng lớn về các enzym ngoại bào. Các
ứng dụng của chúng bao gồm hàng loạt lĩnh vực từ sản xuất thực phẩm thủ công
truyền thống đến công nghệ lên men hiện đại, xử lý môi trường ô nhiễm, v.v…
2.1.2. Vi khuẩn Bacillus subtilis
2.1.2.1. Lịch sử phát hiện
Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa năm 1941 bởi tổ chức y
học Nazi của Đức. Lúc đầu được sử dụng chủ yếu là để phòng bệnh lỵ cho các binh sĩ
Đức chiến đấu ở Bắc Phi.
Việc điều trị phải đợi đến những năm 1949 - 1957, khi Henrry và các cộng sự
tách được chủng thuần khiết của Bacillus subtilis. Từ đó “subtilis therapy” có nghĩa là
"thuốc subtilis" ra đời trị các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy trong
rối loạn tiêu hoá. Ngày nay, vi khuẩn này đã trở nên rất phổ biến, được sử dụng rộng
rãi trong y học, chăn nuôi, thực phẩm…
2.1.2.2. ðặc ñiểm phân loại
Theo phân loại của Bergey (1994) Bacillus subtilis thuộc:
Bộ: Eubacteriales
Họ: Bacillaceae
Giống: Bacillus
Loài: Bacillus subtilis

Hình 2.1. Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis
2.1.2.3. ðặc ñiểm phân bố:
Loài B. subtilis rất hay gặp trong đất, đặc biệt ở cỏ khô. Vì vậy, nó được gọi là trực
khuẩn cỏ khô (Lương Đức Phẩm, 2009). Chúng cư trú trong đất, thông thường đất
trồng trọt chứa khoảng 10 – 10
8

CFU/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, vùng
đất hoang thì vi khuẩn B. subtilis rất hiếm. Nước và bùn cửa sông cũng như ở nước
biển cũng có mặt bào tử và tế bào B.subtilis.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

5

2.1.2.4. ðặc ñiểm hình thái
Bacillus subtilis là trực khuẩn, Gram (+), có khả năng sinh catalase, hiếu khí hay kị
khí tùy tiện. Thường được tìm thấy trong đất có bào tử có khả năng chịu nhiệt, tia bức
xạ, chất sát khuẩn, chất hút ẩm (M. Paul và ctv., 2006)
B. subtilis có khuẩn lạc khô, vô màu hay có màu xám nhạt, trắng, hơi nhăn hay tạo
ra lớp màng mịn, lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn, mép lồi lõm nhiều hay ít, bám
chặt vào môi trường thạch. Trực khuẩn ngắn nhỏ kích thước từ (3-5 x 0,6)µm, nhiều
khi nối lại thành sợi dài, ngắn khác nhau có thể đứng riêng rẽ (hình 2.1). Bào tử chịu
được nhiệt khá cao, có hình bầu dục 0,9 – 0,6µm, phân bố không theo nguyên tắc chặt
chẽ nào (lệch tâm hoặc gần tâm nhưng không chính tâm) (Lương ðức Phẩm, 2005).
2.1.2.5. ðặc ñiểm sinh hoá
Trong môi trường lỏng sinh khối tạo màng mỏng có lớp bao phủ. Do bào tử B.
subtilis chịu nhiệt cao thanh trùng không chết nên phát triển trong một số thực
phẩm hộp gây hư hỏng và tạo mùi khó chịu. B. subtilis sinh acid từ xylose,
arabinose, glucose, sucrose và manitol nhưng không tạo khí (sử dụng nguồn nitơ
là muối amonium). Có khả năng phân giải nitrat, sinh nitrit từ nitrat. Trong điều
kiện kỵ khí, không sinh khí từ môi trường lỏng chứa nitrat.
Bảng 2.1. Một số phản ứng sinh hoá của B. Subtilis
Phản ứng sinh hóa Kết quả
Sinh Indol -
MR (Methyl - Red) +
VP (Voges Proskauer) +

Sử dụng citrat +
Khử Nitrat +
Saccharose +
Manitol +
Glucose +
Lactose -
Maltose +
(Theo Nguyễn Lân Dũng, 1976)
(Giải thích: (+) : có phản ứng; (-): không có phản ứng)
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

6

B. subtilis có tập tính “ăn lẫn nhau” (cannibalism). Chúng dùng cách này như
một phương pháp đơn giản để thoát khỏi những trường hợp điều kiện sống giới hạn.
B. subtilis có khả năng sinh tổng hợp hơn 20 loại kháng sinh khác nhau như: Subtilin,
subtilosin A, sublancin, chlorotetain, mycobacillin, rhizocticins, difficidin,
bacillanene…, những chất này có thể gọi chung là bacteriocin (Nguyễn Lân Dũng,
1989).
2.1.2.6. Bào tử và khả năng tạo bào tử
 Cấu tạo bào tử
Ngoài cùng của bào tử là một lớp màng nhầy, dưới lớp màng là vỏ. Vỏ bào tử có
nhiều lớp. Đây là những lớp có tác dụng ngăn chặn sự thẩm thấu của nước và các chất
hoà tan trong nước. Dưới lớp vỏ là lớp màng trong của bào tử và trong cùng là một
khối tế bào chất đồng nhất. Trong các bào tử tự do không tồn tại sự trao đổi chất, vì
vậy có thể giữ ở trạng thái tiềm sinh trong nhiều năm (Lê Đỗ Mai Phương, 2004).
Bào tử khác tế bào sinh dưỡng về cấu trúc, thành phần hoá học và tính chất sinh
lý.
Bào tử B. subilis có dạng ellip đến hình cầu, kích thước chiều rộng 0,6 – 0,9 µm,
chiều dài 1,0 – 1,5 µm, nằm giữa hay trong khoảng trung tâm đến gần cuối tế bào,

phần lớn được tạo thành ở 8 giờ. Mỗi cá thể chỉ tạo một bào tử, bào tử có khả năng
chịu nhiệt, tia bức xạ, chất sát khuẩn, chịu khô hạn (Trần Đỗ Quyên, 2004).
 Khả năng tạo bào tử
Theo đa số các nhà nghiên cứu cho rằng bào tử là một hình thức sống tiềm sinh
(cryptobiosis, latent life) của vi khuẩn. Bào tử giúp cho vi khuẩn vượt qua những điều
kiện bất lợi của ngoại cảnh. Bào tử thường được sinh ra trong khó khăn như thiếu thức
ăn, nhiệt độ và pH không thích hợp, môi trường tích lũy nhiều sản phẩm trao đổi chất
có hại…(Nguyễn Lân Dũng, 1989). Tuy nhiên, B. subtilis cũng có khả năng hình thành
bào tử theo chu trình phát triển tự nhiên (Tô Minh Châu, 2000). Sự tạo bào tử diễn ra
gồm nhiều giai đoạn, tổng cộng gần 8 giờ để hoàn tất. Lúc đầu lớp nguyên sinh chất
trong tế bào được sử dụng. Tế bào chất và nhân tập trung lại ở một vị trí nhất định
trong tế bào. Vị trí này thường được gọi là vùng bào sinh (hoặc bào nguyên đới). Tế
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

7

bào chất tiếp tục cô đặc lại và sau đó tế bào hình thành một vách ngăn và bắt đầu phân
chia thành hai phần. Phần nhỏ hơn của tế bào được gọi là các tiền bào tử (forespore) và
phần lớn hơn được gọi là tế bào mẹ. Tiền bào tử bắt đầu được bao bọc dần bởi các lớp
màng. Tiền bào tử phát triển và trở thành bào tử. Khi bào tử trưởng thành, tế bào sinh
dưỡng tự phân giải và bào tử được giải phóng khỏi tế bào mẹ. Khi gặp điều kiện thuận
lợi, bào tử sẽ nảy mầm và phát triển thành một tế bào mới có sức sống mạnh mẽ hơn
(Nguyễn Lân Dũng, 1989).
2.1.2.7. Khả năng sinh enzym của Bacilus subtilis
B. subtilis có khả năng sản sinh ra nhiều loại enzym ngoại bào có hoạt tính cao
như: amylase, protease và cellulase…
 Khái niệm về enzym ngoại bào
Enzym ngoại bào là những enzym được tạo ra trong tế bào vi sinh vật, sau đó tiết
vào môi trường xung quanh để phân hủy các cơ chất có cấu tạo cao phân tử, biến các
cơ chất này thành những chất có phân tử thấp, mà vi sinh vật có thể đồng hóa được

(Lương Đức Phẩm, 1979).
 Enzym protease
Protease là nhóm enzym thủy phân các liên kết peptit (- CO-NH -) trong phân tử
protein hoặc các polypeptit. Protease có thể chia thành: proteinase và peptidase.
Proteinase thủy phân protein thành polypeptit, pepton. Chúng có tính đặc hiệu
tương đối rộng. Tiếp theo đó là sự phân hủy các peptit có phân tử nhỏ này (pepton,
polypeptit) thành các axit amin tự do dưới tác dụng của peptidase. Các peptitdase có
tính đặc hiệu hơn, chúng chỉ tác dụng lên các liên kết peptit ở những vị trí nhất định.
Protease của vi khuẩn hoạt động chủ yếu ở vùng pH 7 – 9.
Protease nói chung được dùng để nâng cao giá trị dinh dưỡng của thịt cá, thủy
phân protein của sữa để chế những món ăn kiêng đặc biệt và được dùng trong thuộc
da, chế bột giặt, phim ảnh, tơ sợi, len dạ, cũng như dùng trong y học. Protease vi sinh
vật có thể sử dụng với amylase trong sản xuất thức ăn gia súc.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

8

 Enzym amylase
Amylase là các enzym xúc tác cho quá trình thủy phân tinh bột và các polyose
tương tự như dextrin, glucogen.
Ở vi khuẩn Bacillus enzym chủ yếu trong nhóm này là α-amylase
α-amylase có khả năng thủy phân tinh bột mạnh và tạo thành những dextrin cao
phân tử tạo màu với iot, α-amylase vi khuẩn được ổn định bằng ion canxi. Phạm vi pH
tác dụng tối thích là khoảng 6,5 – 7, α-amylase vi khuẩn bền vững với nhiệt độ cao và
có thể giữ được hoạt tính ở cả nhiệt độ trên 70
0
C. Nó có thể dịch hóa tinh bột nhanh ở
75
0
C và thậm chí ở cả 100

0
C.
α-amylase xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết α-1,4 glucozit nội mạch ở bất
kỳ vị trí nào bên trong phân tử tinh bột với cơ chất là amylose.
Với những tính chất này mà α-amylase của vi khuẩn được dùng để dịch hóa tinh
bột, làm giảm độ nhớt của dịch hồ và chủ yếu trong chế biến dextrin. Nó cũng được
dùng phối hợp với glucoamylase sản xuất đường mật ngô và sôcôla, trong sản xuất bia,
với hỗn hợp đường để sản xuất thức ăn trẻ con, để sản xuất nước quả và được ứng
dụng rộng rãi trong y học.
 Enzym cellulase
Cellulase là một phức hệ enzym phức tạp xúc tác cho sự thủy phân cellulose thành
cellobiose, rồi sau đó tiếp tục thủy phân tới glucose.

Cellulose cellobiose glucose
Việc nghiên cứu quá trình thủy phân cellulose đến glucose bằng enzym, cũng như
việc nghiên cứu sản xuất ra chế phẩm cellulase có hoạt tính cao là một công việc có
nhiều ý nghĩa về mặt lý thuyết và mặt thực tế sản xuất.
cellulase cellobiase
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

9

2.1.3. Một số Bacillus thường gặp trong tự nhiên
2.1.3.1. Bacillus mesentericus
B. mesentericus rất giống B. subtilis, được gọi là trực khuẩn khoai tây. Khuẩn lạc
mọc ăn sâu và bám chặt vào môi trường thạch, bề mặt nhăn nhúm, khô, không mọc lan
ra môi trường, màu xám nhạt – trắng hay hơi vàng, cũng có khi có màu kem hay vàng
nâu. Thường gặp B. mesentericus rubber có khuẩn lạc nhuộm màu hồng, B.
mesentericus niger màu đen (Nguyễn Lân Dũng, 1983).
Tế bào hình que mảnh, dài ngắn khác nhau (3 - 10) x (0,5 - 0,6) µm, đứng riêng

rẽ hoặc xếp hàng thành chuỗi dài. Bào tử hình ovan dài (0,5 – 0,9 µm), nằm ở bất kỳ
trong tế bào và tế bào không phình to khi có bào tử.
Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng là 36 - 45
o
C, tối ưu 50 – 55
o
C, pH = 4,5 – 5,0
B. mesentericus ngừng phát triển.
B. mesentericus có hoạt tính enzym thủy phân ngoại bào cao hơn B. subtilis,
nhưng lên men đường lại kém hơn.
B. mesentericus và B. subtilis rất phổ biến trong tự nhiên, chúng lây nhiễm làm
hư hỏng thực phẩm, nhất là các loại thực phẩm chứa nitơ và các sản phẩm giàu đường
(bánh kẹo, hoa quả…). Ngoài ra chúng còn sinh một loại hợp chất có tính kháng một
số vi khuẩn khác gọi là bacterioxin, ở B. subtilis gọi là subtilin hay inrutin A, B.
2.1.3.2. Bacillus cereus
Tế bào dày, kích thước 1 - 1,5 x 3 – 5 µm, đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi,
thành sợi. Bào tử bầu dục (0,9 x 1,2 – 1,5 µm), nằm lệch tâm.
Tế bào chất dạng hạt hoặc dạng chứa không bào (Nguyễn Lân Dũng, 1983).
Khuẩn lạc phẳng, với bề mặt hơi xù xì (dạng bột, dạng hạt nhỏ), hơi lõm, đục,
mép lồi lõm.
Bào tử của nó phát tán khắp nơi, trong đất, không khí… thường sinh sôi và nảy
nở trên thực phẩm và có thể sinh ra độc tố gây ngộ độc thực phẩm. Nó còn được áp
dụng để sản xuất thuốc kháng sinh (Lương Đức Phẩm, 2006).

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

10

2.1.3.3. Bacillus pumilus
Bào tử phát tán rộng khắp mọi nơi, Bacillus pumilus có mặt trong đất nhiều hơn

Bacillus subtilis. Khuẩn lạc nhỏ xung quanh viền mờ lan không ranh giới. Tế bào của
nó gần giống với tế bào của Bacillus subtilis (Cao Thị Hạnh, 2007)
2.1.3.4. Bacillus megaterium
Ở ống giống non, tế bào khá dày, chiều ngang 1,2 - 1,5 µm, đôi khi tới 2 µm,
chiều dài từ 3 đến 10 - 12 µm. Các tế bào đứng riêng rẽ hay xếp thành chuỗi. Ở các
giống nuôi già, tế bào ngắn hơn, có vẻ tròn, đôi khi có hình thoi với đầu hẹp lại. Tế
bào chứa nhiều hạt nhỏ và nhiều chất dinh dưỡng dự trữ (các hạt mỡ và glycogen).
Bào tử hình ovan hay hình bầu dục kéo dài có kích thước 0,7 – 1,0 x 1,5 µm, nằm lệch
tâm thường theo chiều ngang hay chiều xiên của tế bào (Nguyễn Lân Dũng, 1983).
Khuẩn lạc hình tròn hoặc hơi lượn sóng giống như giọt nến trắng, lồi, nhẵn,
thường có viền quanh khuẩn lạc hoặc vòng đồng tâm trên bề mặt, màu trắng sữa, màu
kem, có khi màu nâu nhạt, có ánh mỡ hay đục.
2.1.3.5. Bacillus polymyxa
Khuẩn lạc không màu, phẳng hoặc lồi, trơn và nhầy, đôi khi có mép có thùy
(Nguyễn Thị Huyền Thu, 2007). Tế bào có kích thước (0,6 – 1,0 x 2,0 – 7,0 µm), đứng
riêng rẽ hay xếp thành đôi, thành chuỗi ngắn. Khi hình thành bào tử tế bào sẽ phồng
lên hình quả chanh. Bào tử hình bầu dục kéo dài khoảng (1,7 – 2,6 µm), trên bề mặt
cắt ngang như hình sao, nằm giữa tế bào.
B. polymyxa chúng thường sinh trưởng phát triển trên thực phẩm đang bị hỏng.
Vì vậy người ta thường phân lập chúng từ thực phẩm. Chúng là nguồn để sản xuất
kháng sinh polymyxin.
2.1.3.6. Bacillus aslersporus
Khuẩn lạc của B. aslersporus nhỏ, màu trắng hay màu lục nhạt, phẳng, mềm,
nhày, đồng nhất. Trực khuẩn dài (1,0 – 1,2 x 3 – 7 µm) đứng riêng rẽ hoặc xếp thành
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

11

từng đôi. Bào tử hình trụ kích thước (1,0 x 1,5 - 2 µm), nằm giữa tế bào. Khi hình
thành bào tử, tế bào phồng lên một chút trông giống như vi khuẩn Clostridium.

2.1.3.7. Bacillus brevis
Khuẩn lạc B. brevis có màu trắng, đôi khi có màu vàng, lồi hoặc phẳng, lấp lánh,
mép răng cưa, giống như mỡ đặc. B. brevis là trực khuẩn có kích thước (0,7 - 1,0 x 3 -
5 µm), đứng riêng rẽ, đôi khi xếp thành chuỗi. Bào tử hình bầu dục (0,8 – 1,0 µm),
nằm ở cuối tế bào, làm cho đầu tế bào hơi phồng to lên (Lương Đức Phẩm, 2009).
Các chủng của loài này được dùng trong sản xuất enzym α-acetolactat
decarbocylase. Enzym này được dùng làm ‘‘chín’’ bia nhanh trong lên men phụ.
2.2. Giới thiệu chung về cellulose và enzym cellulase
2.2.1. Cellulose
Cellulose là polysaccarit chủ yếu của thành phần tế bào thực vật. Trong bông nó
chiếm trên 90%, còn trong gỗ khoảng 40 - 50% cellulose trọng lượng khô. Ngoài ra,
người ta còn thấy chúng có nhiều ở tế bào một số loài VSV, chúng tồn tại ở dạng sợi
(Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Cellulose có hình sợi dài, được trùng hợp từ các gốc D-glucose tương ứng với
phân tử lượng là 15.000. Trong nước lạnh, nó không hòa tan mà chỉ trương phồng lên.
Khi đun sôi với acid sulfuric loãng, cellulose sẽ chuyển thành glucose còn khi thủy
phân trong điều kiện nhẹ nhàng sẽ tạo thành disacarit cellobiose. Cellulose cũng bị
thủy phân bởi enzym cellulase do vi sinh vật tiết ra và sản phẩm là cellobiose .
Các gốc D-glucose liên kết với nhau bởi liên kết 1,4- glucoside. Tinh bột cũng
được cấu tạo bởi các glucose này và bằng liên kết 1,4- glucoside. Điểm khác biệt là
tinh bột chứa các gốc glucose phân nhánh còn cellulose chứa các glucose không phân
nhánh. Các gốc glucose trong cellulose thường lệch một góc 180
o
và có dạng như một
chiếc ghế bành. Cellulose thường chứa 10.000-14.000 gốc đường và được cấu tạo như
sau:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

12

Hình 2.2. Cấu tạo phân tử cellulose
Trọng lượng phân tử của cellulose khoảng từ 50000-2500000 Dalton. Các phân
tử cellulose kết hợp với nhau nhờ lực hút Van der war và liên kết hydro.
Các phân tử cellulose tạo nên sợi sơ cấp có đường kính khoảng 3nm. Các sợi sơ
cấp kết hợp với nhau tạo thành vi sợi. Trong điều kiện tự nhiên, các vi sợi thường
không đồng nhất, chúng thường tồn tại 2 vùng:
- Vùng kết tinh: Các mạch cellulose liên kết với nhau theo một trật tự đều đặn
nhờ liên kết hydro nối nhóm hydroxyl thứ nhất của mạch này với nhóm hydroxyl ở
mạch cacbon của mạch khác. Ở vùng này cellulose rất bền vững dưới tác động của
điều kiện bên ngoài. Enzym cellulase chỉ có tác dụng ở bề mặt hệ sợi ở vùng này.
- Vùng vô định hình: Các mạch liên kết với nhau nhờ lực Vander War. Ở vùng
này cellulose có cấu trúc không chặt và dễ bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài. Khi
gặp nước, chúng dễ bị trương phồng lên, enzym cellulase rất dễ tác động, làm thay đổi
toàn bộ cấu trúc của chúng.
Chiều dài phân tử cellulose trong vùng vô định hình thường lớn gấp hàng chục
lần so với chiều dài của phân tử cellulose kết tinh. Các cây gỗ lâu năm thường chứa
lượng cellulose kết tinh nhiều, các cây thảo mộc ngược lại, chứa nhiều cellulose vô
định hình.
Trong phân tử cellulose có nhiều liên kết hydroxyl tồn tại dưới dạng tự do,
hydrogen của chúng dễ bị thay thế bởi một số gốc hoá học như metyl hoặc gốc acetyl
tạo nên các dẫn xuất ete hoặc este của cellulose. Một trong những dẫn xuất được ứng

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

13

dụng rất nhiều là CMC (Cacborxyl Methyl Cellulose), trong đó một số nhóm hydroxyl
của cellulose được thay thế bằng gốc –OCH2COOH.
Hình 2.3. Cấu trúc của CMC
Trong thiên nhiên, khi thực vật và vi sinh vật có chứa cellulose bị chết, cellulose
của chúng chỉ bị phân hủy bởi cả một tập đoàn vi sinh vật. Các loài VSV sẽ thay phiên
nhau thủy phân cellulose để tạo ra mùn và từ đó các thành phần cấu tạo của cellulose
lại được đi vào các con đường chuyển hóa trong chu trình chuyển hóa vật chất hữu cơ
của thiên nhiên.
Trong thực vật, cellulose thường tồn tại một lượng rất lớn. Số lượng cellulose
thường không đều ở các cơ quan khác nhau trong thực vật. Người ta thấy rằng, lượng
cellulose ít nhất ở lá và nhiều nhất ở thân cây.
Ở VSV cấu trúc của cellulose không bền và không theo một trật tự như ở thực
vật. Ở đó, cellulose thường thuộc loại vô định hình. Chính vì thế việc phân hủy chúng
thường rất dễ thực hiện.
Cellulose được bao quanh bởi phân tử hemicelluloses và lignin nên được gọi là
lignocellulose.
2.2.2. Lignocellulose
Trong tự nhiên phế liệu chứa lignocellulose là nguồn chất hữu cơ thay thế được tạo
ra trong quá trình quang hóa ở thực vật. Lignocellulose là thành phần chủ yếu của gỗ,
giấy và bột giấy. Lignocellulose chiếm khoảng 60% toàn bộ phế liệu từ gỗ được sản
xuất trên trái đất.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

14

Lignocellulose có cấu trúc vững chắc, dày đặc rất khó để phân cắt. Tuy nhiên nó
là nguồn giàu carbon và năng lượng hóa học, do đó việc tận dụng nguồn phế liệu
ligno-cellulose là vấn đề rất cần thiết để duy trì vòng tuần hoàn cacbon toàn cầu. Về

mặt hóa học, chúng gồm 2 polymer cellulose và hemicellulose và một polymer có cấu
trúc 3 chiều lignin. Cellulose được bao quanh bởi phân tử hemicellulose và lignin.






Hình 2.4. Cấu trúc của lignocellulose
Lignocellulose là thành phần cơ bản của tế bào thực vật, vì vậy nó có mặt trong
mọi loại rau quả cũng như trong các loại mùn cưa, thân cây gỗ mềm, rơm rạ của lúa và
lúa mì… được cấu tạo chủ yếu từ cellulose, hemicellulose và lignin, một lượng nhỏ
pectin, protein, các chất trích ly và tro. Thành phần các chất này khác nhau tùy theo
loại cây (bảng 2.2).
Bảng 2.2. Thành phần hóa học của một số loại phế thải nông nghiệp
Vật liệu lignocellulose Cellulose (%) Hemicelluloses (%) Lignin (%)
Rơm 38,2 24,7 23,4
Bã mía 50,0 30,0 18,0
Mùn cưa 41,9 21,6 27,1
(Theo Fred J. Stutzenberger, 1972)