Nghiên cứu thu nhận và xác định một số đặc tính enzyme chitosanase từ vi khuẩn bacillus licheniformis VKNN1

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
oOo





BÙI THỊ HƯỜNG




NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ XÁC ðỊNH MỘT SỐ
ðẶC TÍNH ENZYME CHITOSANASE TỪ VI KHUẨN
BACILLUS LICHENIFORMIS VKNN1




LUẬN VĂN THẠC SỸ







HÀ NỘI – 2014

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
oOo



BÙI THỊ HƯỜNG




NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ XÁC ðỊNH MỘT SỐ
ðẶC TÍNH ENZYME CHITOSANASE TỪ VI KHUẨN
BACILLUS LICHENIFORMIS VKNN1



CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH
MÃ SỐ : 60.54.01.04




NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS. TS NGÔ XUÂN MẠNH

HÀ NỘI – 2014

Học viện Nông Nghiệp Việt Nam - Luận văn Thạc sỹ Công nghệ sau thu hoạch
Page i

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là
trung thực và chưa hề được sử dụng.
Tôi xin cam đoan, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cảm ơn và
các thông tin trích dẫn trong luận văn này đã được ghi rõ nguồn gốc.
Hà nội, ngày 12 tháng 06 năm 2014
Học viên


Bùi Thị Hường

Học viện Nông Nghiệp Việt Nam - Luận văn Thạc sỹ Công nghệ sau thu hoạch
Page ii

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi còn
nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của nhiều tổ chức và cá nhân.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy PGS.TS Ngô Xuân Mạnh,
trưởng bộ môn Hóa sinh – Công nghệ sinh học Thực phẩm, khoa Công nghệ Thực
phẩm, trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã tận tình dìu dắt và hướng dẫn chuyên
môn cho tôi trong thời gian thực hiện và hoàn chỉnh luận văn.
Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô giáo trong khoa Công nghệ Thực
phẩm, khoa Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình tôi thực

hiện đề tài tốt nghiệp.
Đặc biệt, con xin bày tỏ tình cảm sâu sắc nhất đến bố mẹ và những người thân
trong trong gia đình đã luôn luôn quan tâm, lo lắng và tạo điều kiện tốt nhất cho con
trong quá trình học tập, để con hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này.
Mặc dù đã rất cố gắng nhưng bản luận văn này không tránh khỏi những thiếu
sót và hạn chế. Vì vậy, tôi kính mong nhận được sự quan tâm và đóng góp ý kiến
của quý thầy cô để bản luận văn này được hoàn thiện hơn.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà nội, ngày 12 tháng 06 năm 2014
Học viên


Bùi Thị Hường

Học viện Nông Nghiệp Việt Nam - Luận văn Thạc sỹ Công nghệ sau thu hoạch
Page iii

MỤC LỤC

Lời cam đoan i
Lời cảm ơn ii
Mục lục iii
Danh mục bảng vi
Danh mục hình vii
Danh mục chữ viết tắt viii
PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục đích – yêu cầu 2
1.2.1 Mục đích 2
1.2.2 Yêu cầu 2

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Khái niệm về enzyme chitosanase 3
2.2 Phân loại enzyme chitosanase 3
2.2.1 Dựa vào sự tương đồng của chuỗi amino acid 3
2.2.2 Dựa vào sự phân cắt đặc hiệu cơ chất của enzyme chitosanase 5
2.3 Một số đặc tính của enzyme chitosanase 6
2.3.1 Cấu tạo và khối lượng phân tử enzyme chitosanase 6
2.3.2 Cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase 7
2.3.3 Tính đặc hiệu cơ chất của enzyme chitosanase 8
2.3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH tới sự hoạt động của enzyme
chitosanase 9
2.3.5 Ảnh hưởng của ion kim loại và các chất phản ứng khác tới sự hoạt
động của enzyme chitosanase 10
2.4 Ứng dụng của enzyme chitosanase và chitosan oligosaccharide 12
2.4.1 Ứng dụng của enzyme chitosanase 12
2.4.2 Ứng dụng của CHOS 12

Học viện Nông Nghiệp Việt Nam - Luận văn Thạc sỹ Công nghệ sau thu hoạch
Page iv

2.5 Thu nhận và tinh sạch enzyme chitosanase 15
2.5.1 Nguồn thu nhận enzyme chitosanase đã được dùng trong sản xuất
chitosanase 15
2.5.2 Vi khuẩn Bacillus licheniformis 15
2.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase 17
2.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về enzyme chitosanase 20
2.6.1 Tình hình nghiên cứu enzyme chitosanase trên thế giới 20
2.6.2 Tình hình nghiên cứu enzyme chitosanase trong nước 21
PHẦN 3 VẬT LIỆU – NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23
3.1 Vật liệu 23

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 23
3.1.2 Môi trường nuôi cấy 23
3.1.3 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất sử dụng 23
3.1.4 Địa điểm nghiên cứu 24
3.1.5 Thời gian nghiên cứu 24
3.2 Nội dung nghiên cứu 24
3.3 Bố trí thí nghiệm 24
3.3.1 Nghiên cứu phương pháp nuôi cấy vi khuẩn Bacillus licheniformis
VKNN1 24
3.4 Phương pháp phân tích 30
3.4.1 Xác định hoạt tính enzyme chitosanase bằng phương pháp quang phổ
sử dụng acid dinitrosalicylic DNS 30
3.4.2 Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford 32
3.4.3 Tủa phân đoạn enzyme bằng amoni sunphate 33
3.4.4 Phân chia protein bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion trên cột
DEAE cellulose 33
3.5 Phương pháp thống kê và xử lý kết quả 33
PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34
4.1 Xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu vi khuẩn Bacillus licheniformis

Học viện Nông Nghiệp Việt Nam - Luận văn Thạc sỹ Công nghệ sau thu hoạch
Page v

VKNN1 sinh tổng hợp cao chitosanase 34
4.1.1 Kết quả thực nghiệm thăm dò đơn yếu tố 34
4.1.2 Mô hình hóa và tối ưu hóa quá trình nuôi cấy từ vi khuẩn Bacillus
licheniformis VKNN1 36
4.1.3 Kiểm tra mô hình 41
4.1.4 Xác định đường cong động học sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus
licheniformis VKNN1 41

4.2 Xác định điều kiện thu nhận và tinh sạch chitosanase từ vi khuẩn
Bacillus licheniformis VKNN1 43
4.2.1 Tủa phân đoạn enzyme chitosanase bằng muối amoni sunphate 43
4.2.2 Phân chia enzyme chitosanase bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion 44
4.2.3 Điện di đồ enzyme chitosanase 45
4.3 Xác định một số đặc tính chitosanase thu nhận từ vi khuẩn Bacillus
licheniformis (chủng VKNN1) 46
4.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính của chitosanase 46
4.3.2 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính của enzyme chitosanase 47
4.3.3 Ảnh hưởng pH và nhiệt độ đến độ bền của enzyme chitosanase 47
4.3.3 Ảnh hưởng của một số ion kim loại đến hoạt tính của enzyme
chitosanase 48
PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50
5.1 Kết luận 50
5.2 Đề nghị 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO
51

Học viện Nông Nghiệp Việt Nam - Luận văn Thạc sỹ Công nghệ sau thu hoạch
Page vi

DANH MỤC BẢNG

STT Tên bảng Trang

2.1 Các chủng vi sinh vật đại diện cho mỗi họ enzyme 4
2.2 Phân loại Chitosanase dựa vào sự phân cắt đặc hiệu của cơ chất 5
2.3 Khối lượng phân tử của một số enzyme chitosanase 7
2.4 Cơ chất đặc hiệu của enzyme chitosanase từ Bacillus sp. KCTC
0377BP 9

2.5 Nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt động của chitosanase thu được từ
một số vi sinh vật khác nhau 10
2.6 So sánh đặc tính của một số enzyme chitosanase được sản xuất từ vi
sinh vật 11
2.6 Điều kiện nhiệt độ, pH và thời gian nuôi cấy của một số chủng vi sinh
vật sinh chitosanase 19
2.7 Sơ lược kết quả nghiên cứu về enzyme chitosanase trên thế giới 20
3.1 Ma trận thực nghiệm 26
3.2 Thành phần bản điện di theo phương pháp Schägger và Von Jagow
(1987) cho 2 bản gel 29
4.1 Các mức thí nghiệm 37
4.2 Ma trận thực nghiệm 37
4.3 Ma trận kết quả 38
4.4 Kết quả kiểm tra mô hình 41
4.5 Hoạt tính, hàm lượng protein và hoạt tính riêng của enzyme
chitosanase ở các nồng độ muối khác nhau 43
4.6 Hàm lượng protein và hoạt tính enzyme chitosanase phân chia 45
4.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính xúc tác của enzyme chitosanase 46
4.7 Ảnh hưởng của pH tới hoạt tính của enzyme chitosanase 47
4.9 Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt tính enzyme chitosanase
49


Học viện Nông Nghiệp Việt Nam - Luận văn Thạc sỹ Công nghệ sau thu hoạch
Page vii

DANH MỤC HÌNH

STT Tên hình Trang

2.1 Cấu trúc protein 3D của enzyme chitosanase thu được từ
Streptomyces sp.174 6
2.2 Cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase 8
4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình sinh tổng hợp chitosanase từ vi
khuẩn Bacillus licheniformis VKNN1 34
4.2 Ảnh hưởng của pH tới quá trình sinh tổng hợp chitosanase từ vi khuẩn
Bacillus licheniformis VKNN1 35
4.3 Ảnh hưởng của nồng độ chitosan tới quá trình sinh tổng hợp
chitosanase từ vi khuẩn Bacillus licheniformis VKNN1 35
4.4 Ảnh hưởng của các yếu tố nghiên cứu đến hoạt tính chitosanase 39
4.5 Prediction Profiler của hàm mục tiêu chitosanase 40
4.6 Đường cong sinh trưởng và hoạt tính chitosanase của vi khuẩn
Bacillus licheniformis VKNN1 42
4.7 Sắc ký đồ phân chia enzyme chitosanase 44
4.8 Điện di đồ chitosanase qua các bước làm sạch 45
4.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến độ bền của enzyme chitosanase 48



Học viện Nông Nghiệp Việt Nam - Luận văn Thạc sỹ Công nghệ sau thu hoạch
Page viii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Tên ñầy ñủ
CHOS Chitosan Oligosaccharide
DA Degree of deacetylation
DP Degree of polymerization
DNS Acid dinitro salisylic
DEAE Diethylaminoethyl

GlcN D – Glucosamine
GlcNAc N-acetyl-D-Glucosamine



1
PHẦN 1. MỞ ðẦU

1.1 ðặt vấn ñề
Công nghệ enzyme là một trong bốn bộ phận của công nghệ sinh học. Trong
một vài thập kỷ gần đây việc nghiên cứu và ứng dụng của enzyme ngày càng được
quan tâm và chú trọng. Công nghệ enzyme đã từng bước làm thay đổi và nâng cao
chất lượng của một số quá trình công nghệ sản xuất các sản phẩm có chất lượng
trong chế biến thực phẩm cũng như trong nông nghiệp, dược phẩm, y tế
Hàng năm lượng enzyme được sản xuất ra trên thế giới đạt khoảng trên
300,000 tấn với trị giá trên 500 triệu USD và được phân bố trên các lĩnh vực khác
nhau. Tuy nhiên việc nghiên cứu tìm kiếm các loại enzyme mới, và nghiên cứu các
đặc điểm, tính chất, ứng dụng nó luôn là mục tiêu của các nhà khoa học. Một trong
số các enzyme đó là enzyme chitosanase .
Chitosanase là một enzyme ngoại bào thủy phân liên kết nội phân tử cơ chất
chitosan. Enzyme chitosanase được ứng dụng chủ yếu để sản xuất ra Chitosan
Oligosaccharides (CHOS).
Chitosan có nhiều ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp,
nông nghiệp, thực phẩm, mỹ phẩm, xử l í nước thải và bảo vệ môi trường… CHOS
được ứng dụng giống chitosan nhưng do đặc tính dễ hòa tan trong nước mà CHOS
được ứng dụng nhiều trong y học và dược phẩm: CHOS giúp kích thích tiêu hóa
thức ăn, tăng tính thèm ăn ở vật nuôi, tăng cường sức đề kháng, tăng khả năng miễn
dịch, ngăn cản sự phát triển của tế bào ung thư… [8, 48]
.
Enzyme chitosanase có thể thu nhận được từ nhiều nguồn khác nhau như vi

khuẩn, nấm, hay một số thực vật…Nhưng enzyme thu nhận từ vi khuẩn thường có
hoạt tính cao hơn cả. Hơn nữa, các vi sinh vật này lại có khả năng sinh sản, phát triển
với một tốc độ cực kỳ lớn, do đó cho phép thu được một lượng enzyme trong thời gian
ngắn một cách dễ dàng. Mặt khác, môi trường nuôi cấy lại dễ kiếm, rẻ tiền.
Trong các loại vi sinh vật thu nhận enzyme chitosanase được sử dụng hiện


2
nay, thì vi khuẩn Bacillus licheniformis có ưu điểm là sẵn có và chưa được khai thác
nhiều trong các nghiên cứu trước đây ở Việt Nam.
Trên thế giới cũng đã có khá nhiều đề tài nghiên cứu về enzyme chitosanase
được tổng hợp từ các loài vi sinh vật. Tuy nhiên, ở Việt Nam cho đến thời điểm này,
những nghiên cứu về chitosanase và các loài vi sinh vật sản sinh ra nó còn rất hạn
chế. Chính vì những lí do đó, để góp phần vào việc nghiên cứu và ứng dụng
chitosanase, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu thu nhận và xác
ñịnh một số ñặc tính enzyme chitosanase từ vi khuẩn Bacillus licheniformis
VKNN1”.
1.2. Mục ñích – yêu cầu
1.2.1. Mục ñích
Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình nuôi cấy vi khuẩn Bacillus licheniformis VKNN1
để tổng hợp enzyme chitosanase, bước đầu làm sạch và xác định một số đặc tính của
enzyme này.
1.2.2. Yêu cầu

- Xác định được các điều kiện nuôi cấy và xây dựng được quy trình nuôi cấy
tối ưu vi khuẩn Bacillus licheniformis VKNN1 có khả năng sinh tổng hợp enzyme
chitosanase cao
- Xác định được điều kiện thu nhận enzyme chitosanase thô từ vi khuẩn
Bacillus licheniformis VKNN1 đã chọn để thu nhận enzyme chitosanase chế phẩm
- Xác định được một số đặc tính của enzyme chitosanase thu nhận từ vi

khuẩn Bacillus licheniformis VKNN1.


3
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Khái niệm về enzyme chitosanase
Enzyme chitosanase có tên gọi đầy đủ theo danh pháp quốc tế là: Chitosan
N–acetylglucosaminohydrolase.
Chitosanase (EC 3.2.1.132) là enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân
chitosan bắng cách cắt đứt liên kết β–1,4–glucoside trừ liên kết giữa các
N–acetyl–D–glucosamine (GlcNAc–GlcNAc) và giải phóng ra các Chitosan
oligosaccharide.




Hoạt tính của chế phẩm enzyme đặc trưng cho khả năng xúc tác phân giải
chitosan thành các COS có phân tử thấp hơn. Hoạt tính chitosanase được biểu thị
bằng số đơn vị hoạt tính trong 1ml (hay 1g) chế phẩm [43].
2.2. Phân loại enzyme chitosanase
2.2.1. Dựa vào sự tương ñồng của chuỗi amino acid
Dưới đây là một số vị trí tác dụng của enzym chitosanase đã tìm thấy được
chia theo họ:
Chitosan + H
2
O

Chitosanase

Các Chitosan Oligosaccharide chứa các

N–acetyl–D–glucosamine, D–glucosamine



4
Bảng 2.1: Các chủng vi sinh vật ñại diện cho mỗi họ enzyme
Họ
chitosanase
Các chủng vi sinh vật sinh
chitosanase ñặc trưng cho mỗi
họ
Những ñiều lưu ý
Họ 5 Streptomyces griseus HUT 6037
Các chitosanase của nhóm này còn có khả
năng xúc tác phản ứng vận chuyển nhóm
glycoside, ngoài ra còn thủy phân được cả
carboxymethylcellulose (CMC).
Họ 8
Bacillus sp. No.7M
Bacillus circulans WL-12
PaeniBacillus fukuinensis chủng
D2
Ngoài việc thủy phân chitosan còn có nhiều
hoạt tính enzyme khác như: cellulase,
endo–xylanase
Họ 46
Streptomyces sp. chủng N174
Nocardioides sp. chủng N106

Amycolatopsis sp. chủng CsO–2
Streptomyces coelicolor A3
Streptomyces coelicolor A3
Bacillus subtilis
Bacillus amyloliquefaciens
Bacillus KF
Bacillus KFB–C044, ( sinh
Chitosanase chịu nhiệt)
Bacillus sp. chủng CK4
Chlorella virus PBCV–1
Chlorella virus CVK2
Bacillus ehimensis
Bacillus coagulans
Burkholderia gladioli
Bacillus circulans MH–K1
Hầu hết các enzyme nghiên cứu đều thuộ
c
họ 46
Họ 75
Fusarium solani
Aspergillus oryzae
Aspergillus fumigatus
Metarhizium anisopliae
Tất cả các emzyme chitosanase thuộc họ 75
đều là những enzyme từ nấm. Nhìn chung sự
sinh tổng hợp chitosanase từ vi khuẩn cao hơn
của nấm mốc nhưng hoạt tính lại thấp hơn.
Họ 80
Matsuebacter chitosanotabidus

Sphingobacterium multivorum

Các enzyme này mới được tinh sạch và theo
các kết quả phân tích trong phòng thí
nghiệm thì các vị trí cắt của enzyme thuộc
họ 80 này có những trình tự bảo thủ như của
enzyme chitosanase thuộc họ 40
Nguồn: [44]


5
2.2.2. Dựa vào sự phân cắt ñặc hiệu cơ chất của enzyme chitosanase
Chitosanase có khả năng nhận dạng liên kết đặc trưng trong chuỗi chitosan để
tiến hành phân cắt. Vị trí đó là liên kết β–1,4 glucoside giữa các phân tử
D–Glucosamine hoặc giữa D–Glucosamine và N–acetyl–D–Glucosamine.
Tuy nhiên không phải bất kỳ enzyme chitosanase nào cũng tấn công vào bất
kỳ vị trí liên kết này, mà có một số chitosanase chỉ có khả năng tấn công vào vị trí
β–1,4 glucoside giữa hai D–Glucosamine, còn một số chitosanase lại có khả năng
tấn công vào liên kết này giữa hai D–Glucosamine và giữa D–Glucosamine với
phần N–acetyl–D–Glucosamine còn lại. Dưới đây là một số vị trí tác dụng của
enzym chitosanase đã tìm thấy được chia theo họ.
Các liên kết đặc hiệu cho nhận của các enzyme chitinolytic và chitosanolytic
đã được điều tra bằng cách sử dụng cơ chất thông thường là acetylated chitosan
20–30%.
Dựa theo sự phân cắt đặc hiệu của cơ chất chitosanase thì enzyme chitosanase
được phân thành ba loại khác biệt theo đề nghị của Fukamizo và CS [ 12].
Bảng 2.2: Phân loại Chitosanase dựa vào sự phân cắt ñặc hiệu của cơ chất
Chitosanase

Kiểu phân cắt

Type I
– Bacillus pumilus BN–262
– Penicillium islandicum Streptomyces sp. N174

Type II
– Bacillus sp. No 7–M


Type III
– Streptomyces griseus HUT 6037
–Bacillus circulans MH–K1
–Nocardia orientalis
– Bacillus circulans WL–12

: GlcNAc : GlcN
Nguồn: [44]


6
Chitosanase loại I: Bao gồm các enzyme chitosanase cắt các liên kết
GlcNAc–GLcN và GlcN–GlcN.
Chitosanase loại II: Bao gồm các enzyme chitosanase cắt các liên kết
GlcN–GLcN
Chitosanase loại III: Bao gồm các enzyme chitosanase cắt các liên kết
GlcN–GLcNAc và GlcN–GlcN.
2.3. Một số ñặc tính của enzyme chitosanase
2.3.1. Cấu tạo và khối lượng phân tử enzyme chitosanase
Chitosanase hầu hết là các enzyme ngoại bào, có cấu tạo đơn phân tử, thủy phân
liên kết β–1,4 glucoside giữa gốc Glucosamine và N–acetyl–D–glucosamine trong
chuỗi N–acetylate Chitosan. Chitosanase có khả năng tấn công chitosan nhưng

không có khả năng tấn công chitin.

Hình 2.1: Cấu trúc protein 3D của enzyme chitosanase
thu ñược từ Streptomyces sp.174

Chitosanase cũng giống như mọi enzyme khác đều có bản chất là protein.
Chúng có khối lượng phân tử khoảng từ 30–70kDa và kích thước mỗi loại enzyme
chitosanase thu được từ các nguồn khác nhau thì khác nhau. Khối lượng phân tử của
enzyme chitosanase thu được từ một số loài vi sinh vật khác nhau được trình bày ở
bảng 2.3.


7
Bảng 2.3: Khối lượng phân tử của một số enzyme chitosanase
Chitosanase
Khối lượng phân tử
(kDa)
Bacillus cereus 47
Bacillus circulans

31
Bacillus megaterium P1

43
Bacillus sp.

41
Bacillus sp. KCTC 0377BP

45

Sphingomonas sp.CJ–5

45
Streptomyces griceus HUT 6037 34
B. subtilis TKU007. 25
Bacillus cereus D–11 20–50
Serratia marcescens TKU011 21
Pseudomonas sp. TKU015 68
Nguồn: [24, 14, 37, 38, 12, 34, 22, 42]
2.3.2. Cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase
Fukamizo và cs. (1999) đã xác định được các sản phẩm dị vòng thu được từ quá
trình thuỷ phân chitosan đều là dạng α, điều đó cho thấy rằng chitosanase là một
enzyme chuyển hoá.
Cùng với những kết quả thu được khi quan sát dạng tinh thể học và các vùng biến đổi
cho phép chúng ta kết luận rằng đầu Glu22 hoạt động như là nơi cho proton, trong khi đầu
Asp4 hoạt hoá 1 phân tử nước sau đó tấn công vào vị trí C–1 của phân tử đường khử tại vị
trí xúc tác.
Cơ chế chuyển hoá này được duy trì liên tục trên thực tế là nhờ 2 đầu xúc tác có
khoảng cách 13.8Å, cao hơn những enzyme chuyển hoá khác gần 10Å [12].
Cơ chế xúc tác của chitosanase được thể hiện trong hình sau:


8

Hình 2.2: Cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase
Sản phẩm phản ứng của enzyme chitosanase được nghiên cứu bằng cách sử dụng
dung dịch chitosan và một vài CHOS làm cơ chất. Phương pháp sắc kí lớp mỏng (TLC)
(thin–layer chromatography) cho thấy rằng enzyme chitosanase đã giải phóng ra CHOS từ
chitosan, phần lớn là các CHOS dài hơn (GlcN)
2
bằng cách phân cắt nội phân tử. Enzyme
này không thể thuỷ phân được (GlcN)
2
hoặc (GlcN)
3
. Còn (GlcN)
4
và (GlcN)
5
thì bền với
hoạt tính xúc tác của enzyme này. Tuy nhiên, chitosan oligosaccharide (GlcN)
6
và (GlcN)
7

được thuỷ phân hoàn toàn sau 15h ủ. (GlcN)
6
chủ yếu được phân cắt thành (GlcN)
3
+
(GlcN)
3
và (GlcN)
2

+ (GlcN)
4
nhưng (GlcN)
2
+ (GlcN)
4
thì ít hơn nhiều. [Rồi sau đó,
(GlcN)
4
→ (GlcN)
2
+ (GlcN)
2
]. Nó cũng cho thấy rằng (GlcN)
7
được phân cắt thành
(GlcN)
3
+ (GlcN)
4
. Kết quả này chỉ ra rằng để phản ứng xảy ra nhanh, cơ chất chitosan nên
có chiều dài chuỗi phân tử bằng hoặc dài hơn (GlcN)
6
, sự phân cắt liên kết glycoside xảy
ra tốt nhất tại trung tâm của mối liên kết hexameric và sinh ra (GlcN)
3
là sản phẩm chủ yếu.
Thực tế, enzyme chitosanase thể hiện hoạt tính đối với chitosan cao hơn so với các
oligosaccharide mạch ngắn hơn [43].
2.3.3. Tính ñặc hiệu cơ chất của enzyme chitosanase

Trong số các cơ chất được thử nghiệm như: Chitosan, CHOS, dịch keo chitin,
carboxymethyl cellulose (CMC) và peptidoglucan thì enzyme chitosanase thường thể hiện
hoạt tính cao nhất đối với cơ chất chitosan hoà tan (Bảng 2.4).
Mặc dù đã kéo dài phản ứng enzyme qua đêm nhưng nó vẫn không thể thuỷ phân
được (GlcNAc)
6
, chitin tinh thể và peptidoglycan nhưng nó lại có khả năng thuỷ phân
được dung dịch keo chitin và CMC. Độ bền của (GlcNAc)
6
đối với hoạt động của enzyme


9
chitosanase cho thấy rằng enzyme này không có hoạt tính chitinase. Hoạt tính chitinase là
khả năng phân cắt liên kết β–1,4 giữa GlcNAc – GlcNAc. Hoạt tính nhỏ đối với cơ chất
keo chitin có thể được giải thích là do enzyme chitosanase phân cắt β–1,4 của GlcN –
GlcN, GlcN – GlcNAc và GlcNAc – GlcN, chúng được tìm thấy trong dung dịch keo
chitin với DDA 10%.
Bảng 2.4: Cơ chất ñặc hiệu của enzyme chitosanase
từ Bacillus sp. KCTC 0377BP
Cơ chất Hoạt tính tương ñối (%)
 Chitosan oligosaccharide
Chitobiose………………………….
Chitotriose………………………….
Chitotetraose………………………
Chitopentaose………………………
Chitohexaose……………………….
Chitoheptaose………………………

–

–
15.0
16.8
20.0
23.8
 Chitosan hoà tan 100
 Dịch keo chitin 2.8
 CMC 2.5
 Peptidoglycan –
 Tinh bột hoà tan –
Nguồn: [38]
Như đã nói ở trên, chitosan có tính đa dạng hoá học trong DDA của chúng. Tính đa
dạng của chitosan có thể tác động đến tính nhạy cảm của enzyme chitosanase. Khi hoạt
tính tương đối của chitosanase đối với cơ chất chitosan được thử nghiệm với các mức độ
DDA khác nhau, người ta nhận thấy hoạt tính của chitosanase tăng lên cùng với sự tăng
của giá trị DDA của chitosan.
2.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ và pH tới sự hoạt ñộng của enzyme chitosanase
Nhìn chung, vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác thường tăng lên theo nhiệt độ
nhưng chỉ tăng lên trong một giới hạn xác định mà ở đó phân tử enzyme vẫn còn bền và
chưa bị biến tính. Nhiệt độ thích hợp cho sự hoạt động của mỗi enzyme thường tương đối
rộng. Đối với chitosanase, người ta đã nghiên cứu và cho thấy rằng chúng có thể hoạt động


10

trong khoảng 30 – 70
0
C và đa số đều hoạt động tốt nhất trong khoảng nhiệt độ 50 – 60
0
C.

Nhưng nhiệt độ mà ứng với hoạt tính enzyme cao nhất thường chỉ tồn tại một điểm và
nhiệt độ đó là nhiệt độ tối ưu của enzyme (t
opt
). Nhiệt độ tối ưu của chitosanase thu được từ
các nguồn khác nhau thì cũng khác nhau và t
opt
thường không cố định mà có thể thay đổi
tuỳ theo cơ chất, pH môi trường, thời gian phản ứng…
– ðộ bền pH và pH tối ưu cho sự hoạt ñộng của enzyme chitosanase
Giá trị pH của môi trường ảnh hưởng rõ rệt đến phản ứng enzyme vì nó ảnh
hưởng đến mức độ ion hoá cơ chất, enzyme và độ bền của protein enzyme. Đa số các
enzyme bền trong giới hạn pH giữa 5 đến 9. Đối với enzyme chitosanase, pH thích hợp
cho hoạt động của chúng thường vào khoảng 4.0 – 8.0. Tuy nhiên, pH tối ưu (pH
opt
) cho
hoạt động của chitosanase thu được từ các nguồn khác nhau là khác nhau.
Bảng 2.5: Nhiệt ñộ và pH tối ưu cho hoạt ñộng của chitosanase thu ñược
từ một số vi sinh vật khác nhau
Vi sinh vật pH tối ưu Nhiệt ñộ tối ưu (
0
C)
Bacillus sp. KCTC 0377BP 5.0 60
Bacillus cereus 5.8 54
Streptomyces griceus HUT 6037 5.7 60
Streptomyces N174 5.5 65
Sphingomonas sp. CJ–5 6.5 56
Nguồn: [32, 22, 14, 34]
Như vậy, enzyme chitosanase có thể được phân loại vào nhóm enzyme có tính acid và
tính chịu nhiệt ôn hoà.
2.3.5. Ảnh hưởng của ion kim loại và các chất phản ứng khác tới sự hoạt ñộng

của enzyme chitosanase
Theo các tài liệu nghiên cứu về vấn đề này, các ion như Mg2+, Mn2+ có khả năng
làm tăng hoạt tính của enzyme chitosanase, trong khi đó các ion Hg2+, Cu2+, Co2+, Zn2+
và Ag+ lại có thể ức chế hoạt tính của enzyme này. Fe3+ kích thích hoạt tính chitinase
nhưng lại ức chế mạnh hoạt tính chitosanase. Các ion kim loại khác không gây ảnh hưởng
đến hoạt động của enzyme này. Hoạt tính của enzyme chitosanase giảm khoảng 50% nếu
thêm KCl 0.4M hoặc NaCl 0.4M vào hỗn hợp phản ứng.


11
Bảng 2.6: So sánh ñặc tính của một số enzyme chitosanase ñược sản xuất từ vi sinh vật
Vi sinh vật
Khối
lượng
phân tử
(kDa)
a
Kiểu
hoạt
ñộng
(b)
pH
opt
Hoạt
tính
riêng
(U/mg)
Cơ chất ñặc hiệu
(%DDA)
Sản phẩm

cuối cùng(
c)
Bacillus sp. strain KCTC 0377BP 45 Endo 4.0-6.0 1,700 Chitosan(40-100), CMC (2,5) G3 – G7
Aspergillus oryza IAM 2660
40 Endo 5.5 17.2 Chitosan (70-100) Oligomer
135 Exo 5.5 38.8 Chitosan (90-100) G1
Nocardia orientalis IFO 12806 97 Exo 5.5 35.8 Chitosan (100) G1
Acinetobacter sp. strain CHB101
37 Endo 5-9 334 Chitosan (70-90) G2, G3
30 Endo 5-9 800 Glycol chitosan
Enterobacter sp. strain G-1 50 Exo 7.0 5.84 Chitosan (80) G2
Myxobacter strain AL-1 31 Endo 5.0 ND
(d)

CMC, Chitosan ND
Matsuebacter chitosanotabidus 3001 34 Endo 4.0 250 Chitosan (90) G1-G3
B. cereus S1 45 Endo 6.0 196 Chitosan, CMC (21,6) G2-G4
B. megaterium P1 chitosanase Acetyl 43 Endo 4.5-6.5 154.8 Chitosan (81), CMC (0,4) Oligomer
Bacillus sp. strain KFB – C108 48 Endo 6.5 110 Chitosan G3-G5
Nguồn: [43]
Chú thích:
(a)
Được xác định bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide (SDS – PAGE)
(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) với enzyme tinh sạch
(b)
Exo: kiểu phân cắt ngoài; Endo: kiểu phân cắt trong
(c)
Sản phẩm cuối cùng khi sử dụng chitosan làm cơ chất
(d)
ND (not determined): không xác định được

12

2.4. Ứng dụng của enzyme chitosanase và chitosan oligosaccharide
2.4.1. Ứng dụng của enzyme chitosanase
Cho đến nay, ứng dụng lớn nhất và chủ yếu nhất của enzyme chitosanase là để sản
xuất CHOS từ chitosan. Sản xuất CHOS từ chitosan bằng phương pháp enzyme có những
ưu điểm vượt trội so với phương pháp hoá học. Phương pháp enzyme là phương pháp sản
xuất rất nhanh chóng, rẻ tiền, mang lại lợi ích kinh tế rất lớn, do enzyme chitosanase được
phân lập từ những nguồn vi sinh vật rất phong phú trong tự nhiên.
Hơn nữa, nếu kiểm soát được sự hoạt động của enzyme chitosanase (nhiệt độ, pH, thời
gian…) sẽ tạo ra được các chitosan oligosaccharide theo mong muốn. Điều này có ý nghĩa
quan trọng khi sản xuất CHOS ở quy mô công nghiệp. Từ đó, CHOS với những đặc tính
ưu việt được ứng dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như đã trình bày ở trên [20].
2.4.2. Ứng dụng của CHOS
Chitosan Oligosaccharide (CHOS) là sản phẩm thủy phân chitosan, nó có
khả năng tan được trong nước. Tên hóa học 2–amino–A–1,4–glucose polymer và
công thức phân tử (C
6
H
11
O
4
N)
n
£. CHOS là một loại Oligosaccharide thu được từ
sản phẩm thủy phân chitin hoặc chitosan bằng hóa chất hay enzyme. Phương pháp
hóa học sử dụng acid thủy phân cho năng suất thấp lại tốn kém nên phương pháp
được sử dụng chủ yếu là enzyme chitosanase. Enzyme chitosanase phân cắt liên kết

β–1,4–glycoside của chitosan tạo ra CHOS. Do đó cấu tạo của CHOS là một chuỗi
phân tử được cấu tạo bởi một số đơn vị D–glucosamine (GlcN) (thường là từ 2 đến
10 đơn vị GlcN). Chiều dài chuỗi phân tử và mức độ deacetyl (DDA) được coi là 2
yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của CHOS. CHOS dài hơn
hexamer có khả năng ức chế vi sinh vật, chống ưng thư, tăng cường miễn dịch tốt
hơn so với các CHOS ngắn. Sự tăng mức độ deacetyl làm tăng hoạt tính sinh học
của CHOS. Bởi vậy, kiểm soát chặt chẽ chiều dài chuỗi phân tử và DDA là điều
kiện tiên quyết để sản xuất CHOS có giá trị cao [18].
2.4.2.1. Sản phẩm Prebiotic
Choi et al (2006) cũng nghiên cứu sử dụng CHOS vào sữa cho thấy CHOS có
thể sử dụng trong các sản phẩm sữa thương mại có lợi cho sức khỏe mà rất ít ảnh


13

hưởng tới các đặc tính vật lý và cảm quan của sản phẩm.
CHOS là chất có khả năng ngăn chặn sự tích lũy các chất béo bên trong các
cơ quan cỏ thể sinh vật, đặc biệt là ở trong thận của những người sau khi uống rượu.
Quan trọng hơn CHOS ngăn chặn những tác động xấu của rượu lên gan ngăn chặn
những ảnh hưởng xấu đến các bệnh về gan cho những người nghiện rượu.
Không giống với chitosan, CHOS dễ đồng hóa bên trong cỏ thể và bên cạnh
đó nó có thể làm tăng sự đồng hóa của một số nguyên tố vi lượng như sắt, Canxi,
Ứng dụng của Oligosaccharide cho phép giải quyết một số vấn đề về dinh dưỡng
liên quan đến thiếu hụt một số nguyên tố vi lượng. Nó loại bỏ một cách hoàn toàn
Cholesterol và lipoprotein mật độ thấp từ mạch máu. Bởi vậy việc bổ sung CHOS
vào cơ thể của các bệnh nhân bị bệnh béo phì thì có kết quả tốt. CHOS là cation
dương vì vậy nó có thể liên kết với các ion Cl

có trong mạch máu rồi thải ra ngoài
làm giảm huyết áp.

CHOS có nhiều đặc điểm nổi bật hơn so với chitin và chitosan. Tỉ lệ hấp thụ
Chitosan Oligosaccharide trong cơ thể người là 100%, hoạt tính và chức năng sinh
học của nó cao hơn chitosan rất nhiều. Do vậy nên đưa vào cơ thể hàng ngày để duy
trì sức khỏe.
CHOS còn có thể sử dụng để ức chế sự tiêu hóa các chất béo và nó đóng vai
trò như một tác nhân vận chuyển và nó được sử dụng như là tác nhân làm giảm
Cholesterol. CHOS phá vỡ khối mỡ thể hiện là nó có thể cản trở sự hấp thụ chất béo
bằng cánh tạo keo với chất béo trong ruột non.
Có nhiều nghiên cứu đã chứng minh CHOS có chức năng tăng cường hệ
thống miễn dịch, ngăn cản sự phát triển của tế bào ung thư, tạo thành các kháng thể
trong gan và lá lách, kích thích sự tiêu hóa Canxi và các chất khoáng, kích thích sản
sinh ra các tế bào vi khuẩn có thể chữa bệnh như: Vi khuẩn lactic, làm giảm chất
béo trong máu, giảm huyết áp và lượng đường trong máu, điều chỉnh Cholesterol,
giảm cân và ngăn ngừa các bệnh ở người trưởng thành Ngoài ra CHOS còn được
ứng dụng để cầm máu, chữa bỏng da, băng bó vết thương [16].


14

2.4.2.2. Trong công nghệ thực phẩm
CHOS được dùng trong các quá trình xử l í sản phẩm, để bảo quản rau quả,
một số loại trái cây tươi (cà chua, dâu tây, cam, bưởi ). Tạo gel, tạo độ mịn, bề dày
cho sản phẩm, đặc biệt hơn CHOS có thể hút nước trong các sản phẩm nhằm tránh
một số quá trình lên men xảy ra trong khi bảo quản. Màng mỏng chitosan trên bề
mặt có tác dụng ức chế hô hấp, giữ lại khí cacbonic, giảm thiểu lượng ethylene, diệt
được một số loại nấm và kìm hãm quá trình biến màu của quả trong khi bảo quản,
vận chuyển tiêu thụ.
Nghiên cứu của Wenshui & Xia (2010) cũng sử dụng CHOS trong bảo quản
nước táo đã kéo dài thời gian bảo quản ở 37
0

C từ 9 ngày đến 70 ngày với nồng độ
CHOS là 4g/l [22].
Chitosan tạo ra bột Chitofood thay thế hàn the độc hại nhưng đảm bảo sản
phẩm vẫn dai, ngon. Phụ gia này được dùng trong chế biến bảo quản các sản phẩm
từ nhóm thịt (giò, chả, thịt hộp, nem), thực phẩm tươi sống, thịt nguội, đồ uống,
nước giải khát, sản phẩm sữa
CHOS là chất dinh dưỡng có lợi cho sức khỏe. những nghiên cứu đã cho thấy
rằng CHOS có khả năng liên kết với các chất béo và cholesterol, làm giảm
cholesterol trong máu có tác dụng tốt đối với những người bị cao huyết áp, những
người béo. CHOS có cấu trúc dạng sợi và có các thuộc tính giống như các cấu trúc
dạng sợi như Cellulose nên có thể dùng cho những người ăn kiêng, thay thế thức ăn
chứa nhiều calo.
Sử dụng bao bì làm từ chitosan để bảo quản thực phẩm. Từ trước đến nay,
việc bảo quản các loại thực phẩm tươi sống giàu đạm, dễ hư hỏng như thịt, cá trong
điều kiện khí hậu nóng ẩm của nước ta là một trong những vấn đề đã và đang được
các nhà sản xuất, chế biến và các nhà khoa học quan tâm, nên sau khi vỏ bọc chitosan
từ vỏ tôm được hoàn thành, các nhà nghiên cứu đã nghĩ ngay đến việc dùng màng
bọc chitosan từ vỏ tôm nay để làm vỏ bọc xúc xích để có tác dụng kéo dài thời gian
sử dụng mà không độc hại, an toàn cho người sử dụng, không làm mất màu, mùi vị
dặc trưng của nguyên liệu xúc xích.


15

2.4.2.3. Trong nông nghiệp
CHOS được sản xuất dưới hai dạng rắn và lỏng. Trong thành phần của nó
chứa Cacbon và giàu Nitơ vì vậy nó trở thành nguồn cung cấp các chất này cho cây
trồng. Nó có thể được dùng như một chất kích thích sinh trưởng được bón cho cây
trồng để cải thiện lượng rau, hoa, quả và nó có thể ngăn chặn sự nhiễm sâu bệnh,
sinh ra các chất kháng khuẩn trong đất và làm phân bón sinh học. Sản xuất phân

bón và chất trừ sâu sinh học từ CHOS đang là lĩnh vực mới mẻ trong tương lai.
Qua nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan và các nguyên tố vi lượng lên một số
chỉ tiêu sinh lí, sinh hóa của mạ ở nhiệt độ thấp, kết quả cho thấy hàm lượng diệp
lục tổng số và hàm lượng nitơ tăng, đồng thời các enzyme như amylase, catalase,
peroxidase cũng tăng lên và chitosan còn góp phần cải tạo đất khô cằn, bạc màu,
giữ ẩm cho cây trồng [47].
2.5. Thu nhận và tinh sạch enzyme chitosanase
2.5.1. Nguồn thu nhận enzyme chitosanase ñã ñược dùng trong sản xuất
chitosanase
Enzyme chitosanase được tìm thấy từ nhiều loài sinh vật khác nhau. Người ta
thường thu nhận enzyme chitosanase từ các loài vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, virus,
xạ khuẩn), tế bào thực vật (lúa, đại mạch nảy mầm, chè, đu đủ, đậu tương, thầu
dầu…), tế bào động vật (dạ dày, tụy tạng, tim, gan…).Tuy nhiên, hiện nay nguồn
cung cấp enzyme chitosanase chủ yếu là từ vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm. Nguồn vi
sinh vật này chủ yếu được phân lập từ đất, nơi có xác của các loài giáp xác (tôm,
cua…) phân hủy. Dựa theo nguyên tắc ở đâu có cơ chất, thì ở đó có vi sinh vật phân
giải cơ chất đó.
2.5.2. Vi khuẩn Bacillus licheniformis
2.5.2.1. ðặc ñiểm hình thái của vi khuẩn Bacillus licheniformis
Vi khuẩn Bacillus licheniformis là trực khuẩn gram dương, sinh bào tử hình ô van
không phình, thuộc nhóm hai theo phân loại của Pries và CS [45]. Các tế bào vi khuẩn này
đứng riêng rẽ hoặc có thể sắp xếp với nhau tạo thành chuỗi. Tế bào vi khuẩn ngắn, nhỏ có