BÁO CÁO THỰC TẬP-ĐỀ CƯƠNG AMINO ACID

1. Phần mở đầu
1.1. Tính cấp thiết của đề tài
- Nước mắm là một loại gia vò và nước chấm quen thuộc, được sử dụng rộng rãi trong
ẩm thực của các nước ở Châu Á. Ở Việt Nam, nước mắm là một phần không thể
thiếu trong bữa ăn hàng ngày của hầu hết mọi gia đình.
- Tuỳ theo từng vùng khác nhau, nước mắm sẽ được chế biến và mang những hương
vò đặc trưng riêng cho từng vùng miền. Như ở Phú Quốc, nước mắm được chế biến
từ cá cơm, tại Phan Thiết thì nước mắm được chế biến từ cá nục hoặc tại đồn bằng
sông Cửu Long thì nước mắm từ cá linh, ở một số thì nước mắm còn được làm từ con
cà cuống. Một số thương hiệu nước mắm nổi tiếng ở Việt Nam như: nước mắm Phú
Quốc, nước mắm Phan Thiết, nước mắm Nha Trang…
- Trong nước mắm thành phần chủ yếu và quyết đònh đến chất lượng. giá trò dinh
dưỡng đó chính là các acid amin như Lysine, Valine, Glutamic, Arginine,
Methionine, Tyrosine, PhenylAlanine, Threonine, Leucine, IsoLeucine…
- Hiện nay để đánh giá chất lượng và giá thành của nước mắm, chúng ta vẫn đang
dựa vào tiêu chuẩn xác đònh độ đạm tổng của nước mắm bằng phương pháp
Kjiehdahl rồi quy ra hàm lượng đạm amin. Phương pháp này có khuyết điểm là
không thể phân biệt được các loại hợp chất có chứa đạm dinh dưỡng và các hợp
chất chứa đạm không dinh dưỡng. Một số cơ sở sản xuất đã lợi dụng vào tiêu chuẩn
trên, làm tăng độ đạm bằng cách thêm urê vào nước mắm để làm giảm giá thành
sản xuất, điều đó gây ra những ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe người tiêu
dùng.
- Trước thực trạng trên, tôi thực hiện đề tài này nhằm xây dựng được phương pháp
xác đònh acid amin trong nước mắm(cụ thể là nhóm acid amin không thay thế) bằng
phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ 2 lần (LC/MS/MS) để làm cơ sở cho
phương pháp xác đònh chất lượng nước mắm bằng các chỉ tiêu về acid amin.
1.2. Tổng quan
1.2.1. Tồng quan về nước mắm
1.2.1.1. Giới thiệu về nước mắm
Nước mắm là hỗn hợp muối các acid amin được thủy phân từ protein trong thòt cá với
tác nhân là hệ enzyme có sẵn trong nội tạng cá cùng với một số vi khuẩn kỵ khí.

Tại Việt Nam, các vùng miền biển đều có làm nước mắm và có một số thương hiệu
nước mắm nổi tiếng tại Việt Nam như nước mắm Phú Quốc, nước mắm Phan Thiết,
nước mắm Nha Trang… Các loại cá biển dùng để làm nước mắm là cá cơm, cá nục, cá
linh. Tuỳ theo độ đạm trong nước mắm mà người ta phân loại nước mắm thành các cấp
độ: nước mắm đặc biệt (khoảng 40
0
đạm), nước mắm thượng hạng(35
0
đạm), hạng 1(30
0
đạm), hạng 2(25
0
đạm), hạng 3(dưới 20
0
đạm).
1.2.1.2. Thành phần của nước mắm
- Các chất đạm: chiếm chủ yếu và là thành phần quyết đònh giá trò của nước mắm.
Các chất đạm được phân thành 3 loại:
+ Đạm tổng: Là tổng số Nitơ có trong nước mắm (g/L), dùng để phân hạng nước mắm
+ Đạm amin: Là tổng lượng đạm nằm dưới dạng acid amin (g/L), quyết đònh giá trò
nước mắm
+ Đạm amoni: Lượng đạm này có trong nước mắm càng nhiều thì nước mắm càng kém
chất lượng.
Ngoài các chất đạm trên, trong nước mắm còn có các loại đạm khác như dipeptide,
tripeptide, peptone Đây là những thành phần trung gian làm cho nước mắm dễ bò hư
hỏng do hoạt động của vi sinh vật.
- Các hợp chất bay hơi: gồm nhiều nhóm và quyết đònh đến hương vò nước mắm
Hàm lượng một số chất bay hơi có trong nước mắm (mg/100g nước mắm):
+ Các hợp chất carbonyl bay hơi: 407 – 512 (VD: Formaldehyde)
+ Các acid bay hơi: 404 – 533 ( acid propionic)

+ Các amin bay hơi: 9,5 - 11,3 (isopropylamine)
- Các chất vô cơ: NaCl chiếm nhiều nhất(250 – 280 g/L) và một số chất khoáng khác
như Ca, Mg, S, P, I.
- Các vitamin: B1. B2. B12. PP
1.2.1.3. Các hệ enzym trong sản xuất nước mắm:
Gồm 3 hệ lớn:
- Hệ Metalo-protease( hay còn gọi là Aminodipeptidase):
Hệ enzyme này có trong nội tạng cá, chòu được nồng độ muối cao, hoạt động mạnh
trong thời gian đầu lên men nước mắm, giảm dần ở tháng thứ 3 về sau. Hệ enzyme có
hoạt tính mạnh, có khả năng thủy phân rộng rãi đối với các nhóm peptide khác nhau.
Nhóm enzyme này là nhóm enzyme trung tính, pH
opt
= 5-7, pI = 4-5, ổn đònh với ion
Ca
2+
và Mg
2+
và mất hoạt tính khi có các ion Zn
2+
, Pb
2+
, Hg
2+
.
- Hệ enzyme serine – protease:
Điển hình là enzyme trypsine, có nhiều trong nội tạng cá. Ở giai đoạn đầu, hệ enzyme
này hoạt động yếu, tới tháng thứ 2 hoạt động mạnh tới cực đại, và tới tháng thứ 3 bắt
đầu giảm dần khi protein trong nước mắm phân giải gần như hoàn toàn. Hệ enzyme
này hoạt động ở pH = 5-10, pH
opr

= 9
- Hệ enzyme acid – protease:
Có trong nội tạng cá. Hệ enzyme này dễ bò ức chế bởi nồng độ muối khoảng 15% nên
chỉ hoạt động trong thời gian đầu của quá trình thủy phân. Hệ này chỉ đóng vai trò thứ
yếu trong quá trình sản xuất nước mắm.
1.2.1.4. Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng nước mắm
Hiện nay các nhà sản xuất nước mắm tại Viện Nam đều áp dụng tiêu chuẩn TCVN
5107:2003 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn của Bộ Khoa Học và Công nghệ ban hành. Tiêu
chuẩn này có các quy đònh về hoá học như hàm lượng nitơ tổng, hàm lượng nitơ amin,
hàm lượng muối… Các chỉ tiêu về vi sinh như tổng số vi sinh vật hiếu khí, số khuẩn lạc
E.coli, Coliform…
1.2.2. Tổng quan về Acid Amin [1]
1.2.2.1 Giới thiêụ chung về acid amin:
- Acid amin là 1 loai hợp chất hữu cơ có chứa nhóm amino -NH
2

và nhóm cacboxyl –
COOH trong phân tử.
-Tuỳ theo vò trí cuả nhóm -NH
2

so với –COOH mà có các α ,β… acid amin.
- Các α- acid amin là đơn vò cơ sở câú tạo nên cấu trúc cuả protein của cơ thể sống.
Công thức cấu tạo tổng quát cuả α-acid amin là:
- R-CH-COOH
NH
2
Protein có trên 20 loại acid amin khác nhau tham gia vào cấu trúc của nó, các acid amin
chỉ khác nhau ở gốc R. Các tính chất lý học như khả năng tan trong nước , hoạt động hóa

học, khả năng tạo liên kết hiđro của acid amin cũng phụ thuộc vào bản chất hóa học của
gốc R đó.
1.2.2.2. Phân loại các acid amin:
- Dựa vào đặc tính mạch bên ngoài , ngươì ta phân chia các acid amin thường gặp thành
1 số nhóm chính sau:
• Nhóm 1: Acid amin mạch thẳng :
1.1: Acid monoaminmonocacboxylic:
Tên gọi Công thức câú tạo Kí hiệu viết tắt
Glycine
CH
2
H
2
N
COOH
Gly
Alanine
COOH
CHH
2
N
CH3
Ala
Leucine
COOH
CHH
2
N
CH
2

CH
CH
3
CH
3
Leu
Isoleucine

COOH
CHH
2
N
CH
C
2
H
5
CH
3
Ile
Valine

COOH
CHH
2
N
CH
CH
3
CH

3
Valin
Serine

HC
COOH
NH
2
CH
2
OH
Ser
Threonine
CHHC
COOH
NH
2
OH
CH
3
Thr
1.2: Acid monoamindicacboxylic

Tên gọi Công thức cấu tạo Kí kiệu viết tắt
Aspartic acid
HC
COOH
NH
2
CH

2
COOH
Asp
Glutamic acid
CH
2
HC
COOH
NH
2
CH
2
COOH
Glu
1.3:Acid điaminmonocacboxylic


Tên gọi

Công thức cấu tạo Kí hiệu viết tắt
Lysine
HC
COOH
NH
2
(CH
2
)
4
NH

2
Lys
Arginine
HC
COOH
NH
2
(CH
2
)
3
N C
NH
NH
2
H
Arg
1.4: Acid amin chứa S

Tên gọi Công thức cấu taọ Kí hiệu viết tắt
Cysteine
HC
COOH
NH
2
CH
2
SH
Cys
Cystine

HC
COOH
NH
2
CH
2
S
CH
CH
2
S
HOOC
H
2
N
Methionine
HC
COOH
NH
2
CH
2
S CH
3
Met
• Nhóm2: Acid amin vòng thơm:

Tên gọi Công thức câú taọ Kí hiêụ viết tắt
Phenylalanine

HC
COOH
NH
2
CH
2
Phe
Tyrosine
HC
COOH
NH
2
CH
2
OH
Tyr
• Nhóm3: Acid amin dò vòng:

Tên gọi Công thức câú tạo Kí hiệu viết tắt
Tryptophane
N
H
CH
2
CH
COOH
NH
2
Trp
Histidine

N
HN
CH
2
CH
COOH
NH
2
His
Proline
HN
HOOC
Pro
• Nhóm 4: Amit của acid amin
Tên gọi Công thức cấu taọ Kí hiệu viết tắt
Asparagine
HC
COOH
NH
2
CH
2
C NH
2
O
Asn
glutamine
HC
COOH
NH

2
CH
2
C NH
2
O
CH
2
Gln
- Ngoài ra người ta còn phân loại các acid amin theo quan điểm dinh dưỡng thành 2
nhóm:
+ Nhóm các acid amin không thay thế (cơ thể người không tự tổng hợp được): Valine,
Methionine, Lysine, leucine, Isoleucine, Tryptophane, Threonine, Phenylalanine. Ngoài
ra ở trẻ em thêm 2 acid amin là: Histidine và Arginine.
+ Nhóm các acid amin có thể thay thế: Alanine, Glycine, Glutamic Acid, Aspartic acid,
Tyrosine, Asparagine, Cysteine, Cystine, Serine, Proline.
1.2.2.3. Các tính chất chung cuả các Acid Amin:
a. Tính tan:
Bảng tính tan cuả các acid amin trong nước ở 25
o
C
Acid amin S(g/l) Acid amin S(g/l)
Alanine 167.2 Leucine 21.7
Arginine 855.6 Lysine 739.0
Asparagine 28.5 Methionine 56.2
Aspartic acid 5.0 Phenylalanine 27.6
Cysteine - Proline 1620.0
Glutamine 7.2(37
o
C) Serine 422.0

Glutamic acid 8.5 Threonine 13.2
Glycine 249.9 Tryptophan 13.6
Histidine - Tyrosine 0.4
Isoleucine 34.5 Valine 58.1
b. Tính phân cực:
-Tính phân cực của acid amin trung hòa điện nằm giữa tính phân cực cuả acid amin không
tan trong nước và tính phân cực cuả acid amin mang điện.
-Tính phân cực của Ser vàThr là do nhóm –OH trong phân tử có khả năng tạo liên kết
hiđro liên phân tử với nứơc.
-Tyr có chứa 1 nhóm –OH phenol có khả năng ion hóa .Nó ion hoá trong môi trường kiềm
yếu, vì thế Tyr cũng được coi là 1 acid amin phân cực.Tuy nhiên dựa vào khã năng tan
trong nước của Tyr tại pH trung tính thì nó được xem như là acid amin không tan trong
nước.
- Các acid amin không phân cực như: Gly, Ala, Val, Leu, Ileu, Pro, Trp, Met, Tyr, Phe
- Các acid amin phân cực trong nước như: Thr, Glu, His, Ser, Asp, Gln, Lys, Arg, Cys,
Asn
c. Tính quang hoạt:
- Trừ Gly , các α-C củả các acid amin còn lạiđều là C bất đối. Nghóa lànó liên kết với 4
nhóm khác nhau.Vì trung tâm bất đối này nên các acid amin này có tính quang hoạt,
chúng làm xoay mặt phẳng đường đi của ánh sáng phân cực.Ngoài Cα bất đối thì Cβ
của Ile và Thr cũng bất đối.Vì thế Ile, Met có thể tồn tại 4 đồng phân quang học.
- Tất cả các protein được tìm thấytrong tự nhiên là L-acid amin.
COOH HOOC
H C NH
2
NH
2
C H
R R
D-acid amin L-acid amin

Cách gọi tên khoa học này dựa trên sự sắp xếp D, L của Glyxeranđehit và không dựa trên
nguyên tắc làm xoay mặt phẳng đường đi ánh sáng phân cực . Có nghóa là: L- cáchsắp xếp
này không liên quan tới việc làm xoay mặt phẳng ánh sáng phân cực sang trái như trong
trường hợp của L- Glycalaldehyde. Mặc dù vậy nhưng hầu hếtcác L-acid amin đều làm
xoay mặt phẳng ánh sáng phân cực sang trái
1.2.2.4. Vai trò của acid amin
Các Acid amin là đơn vò cơ bản tạo nên các protein trong cơ thể sống, nói cách khác các
acid amin là các “viên gạch” tạo nên các phân tử protein.
Trong các loại acid amin thì acid amin thay thế cơ thể có thể tự tổng hợp khi không được
cung cấp đủ khẩu phần thức ăn. Còn các loại acid amin không thay thế thì cơ thể không
thể tự sinh tổng hợp được mà phải bắt buộc bổ sung từ khẩu phần ăn hàng ngày. Các acid
amin không thay thế giúp kích thích cơ thể phát triển. Nếu thiếu 1 trong các loại acid
amin không thay thế có thể dẫn đến một số bệnh nguy hiểm .
Vd:
Thiếu Lysine: cơ thể sẽ hấp thu Canxi không tốt làm xương mau chóng bò thoái hoá.
Thiếu Methionine: Ở nam giới sẽ thiếu hormone sinh dục testosterone.
Thiếu Leucine: Việc điều hoà hàm lượng đường trong máu sẽ bò rối loạn.
1.2.3 Tổng quan về các phương pháp phân tích acid amin
1.2.3.1. Phương pháp sắc ký giấy.
Phương pháp sắc ký giấy nhuộm màu với thuốc thử Ninhydrin dùng để đònh tính, và bán
đònh lượng các acid amin từ dòch thủy phân protein. Đây là phương pháp cổ điển dùng
trong kiểm nghiệm thực phẩm. Hệ dung môi phân tách thường được sử dụng là :
Phenol:H
2
O, hoặc n-butanol:acetic acid: H
2
O. Tùy theo hệ dung môi các acid amin có thứ
tự và giá trò R
f
khác nhau.

1.2.3.2. Phương pháp sắc ký bản mỏng
Các thuốc thử dùng để phân tách acid amin thường dùng: Ninhydrin, 2,4 – dinitrophenyl
(DNP), 5 – dimethylaminonaphthalene – 1 – sulfonyl (dansyl)…
Một số dung môi dùng để phân tách acid amin:
- Acetone:H
2
O:Acetic acid:Formic Acid
- Ethanol:H
2
O:dimethylamine
- Chloroform:Methanol
- n – butanol:acetic acid:H
2
O
1.2.3.3. Phương pháp sắc ký khí (GC)
Phương pháp sắc ký khí là một kỹ thuật phân tích acid amin có rất nhiều ưu điểm: độ
nhạy cao, khả năng phân tách rất tốt. Tuy nhiên hạn chế lớn nhất của phương pháp này
là phải tạo dẫn xuất dễ bay hơi để phân tích với một số phản ứng tạo dẫn xuất thông
dụng như heptafluorobutyryl, trifluoroacetyl… có thời gian xử lý mẫu lâu.
1.2.3.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao(HPLC)
Các phương pháp phân tích acid amin bằng sắc ký lỏng truyền thống:
- Tạo dẫn xuất tiền cột(Pre-column): Tạo dẫn xuất và phân tích bằng cột pha đảo
(RP). Các chất tạo dẫn xuất thường là o-phthaldialdehyde(OPA), 9 –
flourenylmethyl chloroformate(FMOC – Cl), isothiocynate(PITC), 1 –
dimethylaminonaphathalene – 5 – sulphonyl chloride (dansyl – Cl). Ưu điểm của
phương pháp này việc tạo dẫn xuất đơn giản, và thời gian phân tích nhanh. Khuyết
điểm của phương pháp này là độ tái lập của việc phân tích các mẫu thực phẩm thấp,
nguyên nhân là vì chưa loại bỏ việc tương tác nền của mẫu thực phẩm. Ví dụ như
Cystine(Cys) nhiều lúc không phát hiện được khi tạo dẫn xuất với OPA. Trong khi
đó với PITC thì độ tái lập và độ tuyến tính thấp.

- Tạo dẫn xuất hậu cột(Post – column): Tạo dẫn xuất và phân tích bằng cột trao đổi
ion. Chất tạo dẫn xuất thường dùng là ninhydrin, OPA . Phương pháp này rất thích
hợp cho các mẫu thực phẩm và có nền mẫu phức tạp. Ưu điểm của phương pháp là
loại bỏ được hiệu ứng nền mẫu trước khi tạo dẫn xuất, độ lập lại cao, độ tuyến tính
cao. Khuyết điểm của phương pháp này là sự phức tạp của quá trình tạo dẫn xuất
sau cột, và thời gian phân tích trên máy dài ( 1- 2h) , và nồng độ acid amin trong
dòch phân tích phải lớn (LOD = 10 – 50 pmol/mL cho mỗi acid amin)
Hiện nay có một phương pháp được áp dụng để phân tích các acid amin là phương pháp
sắc ký lỏng ghép khối phố một lần hoặc nhiều lần ( LC/MS, LC/MS
n
). Phương pháp
này có các ưu điểm: độ nhạy rất cao, độ lập lại, độ tuyến cao, và không cần tạo dẫn
xuất, thời gian phân tích cũng ngắn hơn. Ngoài ra phương pháp này còn đònh danh rất
tốt dựa trên phổ khối lượng đặc trưng của từng acid amin. Khuyết điểm của phương
pháp này là giá thành thiết bò cao, và nồng độ mẫu phân tích phải rất nhỏ.
2. Luận điểm mới của đề tài
- Hiện nay ở Việt Nam chưa có những nghiên cứu hoặc có quy trình đònh lượng acid
amin trong nền mẫu nước mắm từ đó làm cơ sở để đưa ra chỉ tiêu mới cho chất lượng
của nước mắm.
- Phương pháp đònh lượng acid amin bằng sắc ký lỏng ghép khối phổ làm tăng độ nhạy
của giới hạn phát hiện, đònh danh chính xác các hợp chất acid amin và rút ngắn thời
gian phân tích so với việc phân tích các acid amin bằng các phương pháp khác.

3. Mục tiêu nghiên cứu
- Xây dựng được quy trình đònh lượng các acid amin không thay thế trong nước mắm
bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ 2 lần (LC/MS/MS):
+ Đưa ra được khoảng tuyến tính, các giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn
đònh lượng (LOQ) của phương pháp
+ Đưa ra được hiệu suất thu hồi của phương pháp (H%)
+ Đưa ra được độ không đảm bảm đo của phương pháp

4. Nội dung nghiên cứu
- Bước 1: Khảo sát các phương pháp xử lý, tách chiết acid amin trong nền mẫu, xác
đònh các thông số tối ưu
- Bước 2: Khảo sát các thông số sắc ký lỏng và xác đònh các thông số tối ưu
- Bước 3: Khảo sát các thông số trên khối phổ và xác đònh các thông số tối ưu
- Bước 4: Thẩm đònh quy trình đònh lượng các acid amin bằng các phương pháp thống
kê
- Bước 5: Kết quả và bàn luận
- Bước 6: Kết luận
Chương 5: Phương pháp thực hiện
5.1. Nguyên liệu
5.1.1. Chất chuẩn
Các loại acid amin Hãng sản xuất Mã số Nồng độ
l-alanine 89,09
ammonium cloride 53,49
l-arginine 174,2
l-aspartic acid 133,1
l-cystine 240,3
l-glutaminc acid 147,1
glycine 75,07
l-histidine 155,2
l-isoleucine 131,2
l-leucine 131,2
l-lysine 146,2
l-methionine 149,2
l-phenylalanine 165,2
l-proline 115.1
l-serine 105,1
l-threonine 119,1
l-tyrosine 181,2

l-valine 117,2
Fluka AAS18
109K8709
µmol/ml (±4%)
2,50
2,50
2,50
2,50
1,25
2,50
2,50
2,50
2,50
2,50
2,50
2,50
2,50
2,50
2,50
2,50
2,50
2,50
5.1.2. Đối tượng nghiên cứu
- Nước mắm Nam Ngư do công ty Masan sản xuất.
Thành phần:
- Cá cơm
- Nước
- Muối
- Đường
- Chất điều vò: Monosodium Glutamate (621), Disodium Guanylate (627), Disodium

Inosinate(631).
- Chất bảo quản: Potassium Sorbate(202), Sodium Benzoate(211)
- Chất ổn đònh xanthan gum (415)
- Màu tổng hợp brown HT (155), màu tự nhiên caramel (150a)
5.2. Dụng cụ, Trang thiết bò, hoá chất
5.2.1. Dụng cụ
- ng nghiệm có nắp
- ng nhựa ly tâm có nắp
- Pipet bầu 10mL, 5mL, 2mL, 1mL
- Mircopipet 2-20 µL, 20 – 200 µL, 200 - 1000 µL
- ng đong 20 mL, 50 mL, 500 mL, 1000 mL
- Bình cô quay 100 mL
- Bình đònh mức 50 mL, 10 mL
- Becher 100 mL
- Cột SPE Strata SCX
- Giấy lọc
- Syringe 3 mL
- Syringe Filter 0,45 µm
- Vial 1,5mL có nắp
5.2.2. Trang thiết bò
- Bộ cô quay chân không Buchi R-210
- Bộ Vacumn Maninfold
- Máy cất nước 2 lần
- Cân phân tích 4 số lẻ (độ nhạy 0,1 mg) Satorius
- Máy ly tâm
- Hệ máy sắc ký lỏng hiệu năng cao: Hiệu Shimadzu
+ Bơm LC – 20AD XR
+ Autosampler SIL – 20AD XR
+ Degasser DGU – 20 A5
+ Interface CBM – 20A

+ Cột sắc ký phân tích : Cột trao đổi cation Primesep 100 (250 x 4,6 mm)
- Đầu dò khối phổ 2 lần(MS/MS) AB Sciex TripleQuad 5500
5.2.3. Hoá chất
- Methanol, J.T Baker, HPLC grade
- Acetonitrile, J.T Baker, HPLC grade
- Trifluoroacetic acid, Merck, AR grade
- K
4
[Fe(CN)
6
].3H
2
O, Merck, AR grade
- ZnSO
4
7H
2
O, Merck, AR grade
- NaHCO
3,
Merck, AR grade
- Nước cất 2 lần
5.3. Phương thức nghiên cứu
Khảo sát các quy trình chiết acid amin trong nước mắm
Chọn lựa các điều kiện sắc ký
Chọn lựa các điều kiện khối phổ
Thẩm đònh quy trình đònh lượng acid amin trong nước mắm
5.3.1. Khảo sát các quy trình chiết acid amin trong nước mắm [2]
Quy trình 1:
Trộn đều, hoà tan

Lọc tủa
Cô quay chân không
2 mL nước mắm
Hòa tan
30 mL
nước cất
Qua cột SPE SCX (đã được hoạt hóa)
Rửa giải
Acetonitrile/H
2
O
= 30/70 ,
TFA = 0,05%
Đònh mức 50 mL
Lọc Filter 0,45 µm vào vial
Phân tích trên máy LC/MS/MS
Acetonitrile/H
2
O
= 30/70 ,
TFA = 0,05%
Thuyết minh quy trình 1:
- Dùng pipette hút 2 mL mẫu nước mắm cần phân tích vào ống nghiệm.
- Bổ sung 30 mL Methanol vào ống nghiệm, lắc đều, hoà tan mẫu.
- Lọc dòch hỗn hợp qua giấy lọc thô vào một bình cô quay 100 mL
- Cô quay mẫu bằng máy cô quay chân không (t
0
= 30
0
C) cho đến cạn

- Thêm vào bình sau khi cô quay 30 mL nước cất, hoà tan đều mẫu.
- Cho toàn bộ dung dòch mẫu qua cột SPE SCX (Strong cation exchange) đã được
hoạt hoá bằng methanol
- Rửa giải mẫu bằng 6 mL pha động chạy máy là Acetonitrile/H
2
O = 30/70, bổ sung
TFA 0,05%
- Đònh mức tới 50 mL bằng pha động bằng pha động Acetonitrile/H
2
O = 30/70, bổ
sung TFA 0,05%.
- Lọc dung dòch qua filter 0,45 µm vào vial.
- Phân tích mẫu trên máy LC/MS/MS
Quy trình 2:
Trộn đều, hoà tan
Trộn đều, hoà tan
Đònh mức 50 mL
1 mL nước mắm
Ly tâm lấy dòch trong
30 mL
nước cất
Lọc Filter 0,45 µm vào vial
Phân tích trên máy LC/MS/MS
4 mL Thuốc
thử Carrez
nước cất
Thuyết minh quy trình 2:
- Dùng pipette hút 1 mL mẫu nước mắm cần phân tích vào ống nhựa ly tâm
- Bổ sung 30 mL nước cất vào ống nhựa, lắc đều, hoà tan mẫu.
- Cho vào thêm 4 mL dung dòch thuốc thử Carrez : 2 mL Carrez I ( dung dòch Kali

ferrocyanur: (K
4
[Fe(CN)
6
].3H
2
O)) 15% và 2 mL Carrez II (dung dòch kẽm sulfat
(ZnSO
4.
7H
2
O)) 23%. Lắc đều.
- Đònh mức tới 50 mL bằng nước cất.
- Ly tâm ở 5000 vòng/phút.
- Đem dòch trong sau ly tâm lọc dung dòch qua filter 0,45 µm vào vial.
- Phân tích mẫu trên máy LC/MS/MS
5.3.2. Khảo sát các điều kiện sắc ký
5.3.2.1. Các thông số cố đònh:
- Hệ pha động :
Pha động A: Acetonitrile:H
2
O = 30:70, bổ sung TFA = 0,05%
Pha động B: Acetonitrile:H
2
O = 30:70, bổ sung TFA = 0,3%
- Tốc độ dòng: 1 mL/phút
- Cột phân tích: Cột Primesep 100: 250x 4,5 mm, đường kính hạt 5µm
5.3.2.2. Các thông số khảo sát:
Chúng ta khảo sát các chương trình gradient nồng độ:
Bảng 5.1 : Chương trình 1:

Thời gian(Phút) Sự kiện Nồng độ
0.01 Dòng A 100
0.01 Dòng B 0
20.00 Dòng A 0
20.00 Dòng B 100
20.01 Dòng A 100
20.01 Dòng B 0
30.00 Dòng A 100
30.00 Dòng B 0
30.00 Ngưng chương trình
Bảng 5.2 : Chương trình 2:
Thời gian(Phút) Sự kiện Nồng độ
0.01 Dòng A 100
0.01 Dòng B 0
25.00 Dòng A 0
25.00 Dòng B 100
25.01 Dòng A 100
25.01 Dòng B 0
35.00 Dòng A 100
35.00 Dòng B 0
35.00 Ngưng chương trình
Bảng 5.3 : Chương trình 3:
Thời gian(Phút) Sự kiện Nồng độ
0.01 Dòng A 100
0.01 Dòng B 0
30.00 Dòng A 0
30.00 Dòng B 100
30.01 Dòng A 100
30.01 Dòng B 0
40.00 Dòng A 100

40.00 Dòng B 0
40.00 Ngưng chương trình
5.3.3. Khảo sát các thông số khối phổ [2],[3]
5.3.3.1. Các thông số cố đònh:
- Chế độ chạy: ESI (+)
- Kiểu chạy: MRM (Multiple reaction monitoring)
- Curtain Gas: 12
- CAD: Medium
- Hiệu điện thế: 5500 mV
- Nhiệt độ: 600
0
C
- Gas source 1: 10
- Gas source 2: 17
Bảng 5.4: Các thông số về phổ khối lượng
ID Q1(m/z) Q3(m/z) Dwell time
Arg 175 156 200
Arg 175 70 200
His 156 137 200
His 156 110 200
Leu 132 113 200
Leu 132 86 200
Ile 132 113 200
Ile 132 86 200
Lys 147 128 200
Lys 147 101 200
Met 150 131 200
Met 150 104 200
Phe 166 147 200
Phe 166 120 200

Thr 120 101 200
Thr 120 74 200
Val 118 99 200
Val 118 72 200
5.3.3.2. Các thông số khảo sát
- Collison Energy (CE)
- Declusion Potential (DP)
5.4. Thẩm đònh quy trình đònh lượng
- Khảo sát giới hạn phát hiện LOD, giới hạn đònh lượng LOQ.
- Khảo sát độ tuyến tính và độ lập lại
- Khảo sát hiệu suất thu hồi
- Xác đònh độ đúng, độ lặp lại, độ không đảm bảo đo