BÁO CÁO THỰC TẬP-MÔI TRƯỜNG NB-VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP Tạo cây con in vitro

PHẦN 2
VẬT LIỆU - PHƯƠNG
PHÁP



20

Vật liệu – Phương pháp

2. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu
2.1.1. Đối tượng
- Hạt cây đậu phộng (Arachis hypogaea L.) được mua ở Viện nghiên cứu dầu
và cây có dầu, quận 1, Tp. Hồ Chí Minh.


Hình 2.1. Hạt đậu phộng (Arachis hypogaea L.) giống VD1
- Chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 được mua từ ngân
hàng RIKEN-BRC thông qua dự án của MEXT, Nhật Bản.
21

Vật liệu – Phương pháp

Hình 2.2. Khuẩn lạc của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC
15834
2.1.2. Môi trường nuôi cấy
Môi trường Murashige và Skoog (MS) (phụ lục1): Môi trường muối khoáng đa
lượng và vi lượng MS, bổ sung saccharose dùng để nuôi cấy mô thực vật in vitro.
- Môi trường Nutrient Broth (NB) (phụ lục1): Môi trường NB sử dụng để tăng
sinh vi khuẩn A. rhizogenes ATCC 15834
- Các tác nhân cảm ứng: nhôm clorua, natri acetate, vi khuẩn
- Tiền chất bổ sung: phenylalanine
22

Vật liệu – Phương pháp

2.1.3. Hóa chất sử dụng
2.1.3.1. Hóa chất sử dụng trong thử hoạt tính kháng oxi hóa
- Phương pháp Yen và Duh: Vitamine E (α-tocopherol), Potassium ferricyanide
(K
3
(Fe(CN)
6
)), acid tricloroacetic, NaH
2
PO
4
. 2H
2
O, Na
2
HPO
4

.12H
2
O,
FeCl
- Phương pháp DPPH: 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)
3

2.1.3.2. Hóa chất PCR (Polymerase chain reaction)
- Các hóa chất: Dream Taq DNA polymerase, Dream Taq buffer (Fermentas),
dNTPs 2mM (Fermentas), nước siêu sạch.
- Mồi sử dụng:
• Mồi khuếch đại gen rolB
Gen rolB được khuếch đại với cặp mồi rolBF và rolBR. Sản phẩm khuếch
đại được phát hiện và kết quả dương tính sẽ cho một vạch có kích thước 423 bp [22,
37].
Bảng 2.1. Đặc điểm của cặp mồi rolBF và rolBR
Mồi rolBF rolBR
Trình tự 5’-GCT CTT GAC GTG
CTA GAT TT-3’
5’-GAA GGT GCA AGC
TAC CTC TC-3’
Chiều dài (bp) 20 20
Trọng lượng phân tử (g/mol) 6114,0 6102,0
Nhiệt độ nóng chảy (G/C) 53,0 55,3
• Mồi khuếch đại gen rolC
23

Vật liệu – Phương pháp

Gen rolC được khuếch đại với cặp mồi rolCF và rolCR. Sản phẩm khuếch

đại được phát hiện và kết quả dương tính sẽ cho một vạch có kích thước 626 bp [22,
37].


Bảng 2.2. Đặc điểm của cặp mồi rolCF và rolCR
Mồi rolCF rolCR
Trình tự 5’-CTC CTG ACA
TCA AAC TCG TC-3’
5’-TGC TTC GAG TTA
TGG GTA CA-3’
Chiều dài (bp) 20 20
Trọng lượng phân tử (g/mol) 5996,9 6163,0
Nhiệt độ nóng chảy (G/C) 52,9 53,3
2.1.3.3. Hóa chất tách chiết và điện di
- Các dung môi hữu cơ: hexane, chloroform, ethyl acetate, methanol.
- Hóa chất tách chiết DNA: CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide),
phenol, chloroform, nitơ lỏng, TE (Tris – EDTA), ethanol.
- Hóa chất tách chiết plasmid: Dung dịch I gồm glucose 50 mM, Tris HCl 2,5
mM pH 8 và EDTA 10 mM pH 8. Dung dịch II gồm SDS 10% và NaOH 5N.
Dung dịch III gồm KOAc 5M và glacial acetic 0.2M.
- Hóa chất điện di: Agarose, dung dịch TAE (Tris-Acetate-EDTA), ethidium
bromide, dung dịch nạp mẫu (glycerol, bromophenol blue, xyencyanol).
24

Vật liệu – Phương pháp

2.1.4. Địa điểm thí nghiệm
- Các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học Thực
vật và chuyển hóa sinh học và Phòng thí nghiệm sinh học phân tử B, Trường
Đại học Khoa học Tư nhiên Tp. Hồ Chí Minh.

2.2. Phương pháp
2.2.1. Tạo cây con in vitro
- Thao tác ngoài tủ cấy: Các hạt được tách vỏ, rửa sạch bằng xà phòng, sau đó
được rửa lại bằng nước cất cho sạch xà phòng. Erlen chứa hạt được đậy bằng
giấy bạc và đưa vào tủ cấy vô trùng.
- Thao tác trong tủ cấy vô trùng: Tiến hành lắc với cồn 70
o
trong khoảng 30
giây đến 1 phút. Tiếp đó, ngâm và lắc hạt trong dung dịch sodium
hypochlorite (NaOCl) 1,5% trong 7 phút. Sau đó rửa lại bằng nước cất vô
trùng 5 lần. Các hạt được cấy lên môi trường MS có bổ sung saccharose (30
g/l) và agar (7,5 g/l). Sau 5 ngày thì hạt nãy mầm với điều kiện chiếu sáng 16
giờ trong ngày, cường độ ánh sáng 2500 lux, nhiệt độ 25 – 28
o
C.
25

Vật liệu – Phương pháp


Hình 2.3. Cây đậu phộng in vitro
2.2.2. Cảm ứng tạo rễ tơ

26

Vật liệu – Phương pháp

Hình 2.4. Quy trình tạo rễ tơ
Rễ tơ được tạo ra thông qua sự chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium
rhizogenes ATCC 15834 được hoạt hóa trên môi trường lỏng NB lắc với vận tốc

100 - 130 vòng/phút trong 48 giờ ở 25
o
C vào tế bào thực vật. Vi khuẩn sau khi hoạt
hóa được cấy vào môi trường NB để tăng sinh khối. Khi A. rhizogenes phát triển
đến giữa pha tăng trưởng (mid-log phase) với OD
600
28
= 0,5 được dùng để gây nhiễm
nhằm chuyển gen. Các mẫu (tử diệp, trụ thượng diệp, trụ hạ diệp, lá, cuống lá) được
cắt và tạo vết thương được nhúng vào dịch khuẩn A. rhizogenes. Thời gian ngâm
mẫu trong dịch khuẩn là 15 phút. Sau đó, các mẫu cấy được đặt lên giấy thấm vô
trùng, để khô bề mặt và chuyển sang môi trường MS không bổ sung chất điều hòa
sinh trưởng thực vật để thực hiện quá trình đồng nuôi cấy. Quá trình đồng nuôi cấy
được thực hiện trong tối. Sau thời kỳ đồng nuôi cấy, mẫu được rửa với môi trường
MS lỏng có bổ sung cefotaxime (250 mg/l) để loại vi khuẩn trên bề mặt mẫu. Sau
khi rửa, mẫu được chuyển vào nuôi cấy trên môi trường MS rắn bổ sung cefotaxime
(250 mg/l) để loại bỏ vi khuẩn và cảm ứng tạo rễ tơ. Sau 2-3 tuần nuôi cấy, rễ tơ
được tao thành từ vết thương. [ , 61]
2.2.3. Phương pháp PCR và điện di
2.2.3.1. Phương pháp PCR
Nguyên tắc của phương pháp: Tất cả DNA polymerase khi hoạt động tổng
hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi
chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một
đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới.
Phương pháp PCR được hình thành dựa vào đặc tính đó của các DNA polymerase.
Thật vậy, nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một
trình tự DNA, ta sẽ chỉ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi. Điều đó có nghĩa là
để khuếch đại một trình tự DNA xác định, ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự
27

Vật liệu – Phương pháp

đó đủ để tạo các mồi bổ sung chuyên biệt; các mồi này gọi là mồi xuôi và mồi
ngược.[2]
2.2.3.2. Điện di
Nguyên tắc của phương pháp
2
: Phương pháp điện di dựa vào đặc tính cấu rúc
của các nucleic acid. Đó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên bề mặt nên
khi chịu tác động của một điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện
trường. Tính linh động của phân tử trong gel phụ thuộc vào hai chỉ tiêu: khối lượng
phân tử nucleotide hay cặp nucleotide và nồng độ các chất cấu thành gel.[ ]
Mục tiêu của điện di
2.2.4. Phương pháp tách chiết hợp chất
: Phân tích và kiểm tra kích thước của sản phẩm khuếch
đại PCR.
2.2.4.1. Điều chế các loại cao
Mỗi loài cây đều chứa nhiều loại hợp chất hữu cơ, từ loại không phân cực đến
loại rất phân cực, vì thế dung môi được sử dụng điều chế cao có độ phân cực tăng
dần [5].
Xử lý nguyên liệu: Rễ tơ sau 25 ngày nuôi cấy trong môi trường lỏng lắc được
rửa sạch môi trường nuôi cấy, ghi nhận trọng lượng tươi.
Quy trình điều chế cao xử dụng máy Soxhlet:






Rễ tơ tươi

Methanol
Sấy khô ở 40
o
C tới khối
lượng không đổi
Xay nhuyễn
Bột khô
Tận trích với các dung môi khác
nhau trong dụng cụ Soxhlet
Cô cạn dung môi ở 40
o
C
Hexane
Chloroform
Ethyl acetate
28

Vật liệu – Phương pháp








Sơ đồ 2.1. Sơ đồ điều chế cao
Các loại cao thu nhận được được dùng để khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa
và định tính stilbene.
2.2.4.2. Phương pháp tách chiết rễ tươi và dung dịch môi trường nuôi cấy.

Sinh khối rễ tơ tươi
5
: mẫu được ngâm đông lạnh trong nitơ lỏng, rồi nghiền
giã cho thật mịn trước khi được ngâm trong dung môi methanol trong 30 phút trước
khi lọc, dịch lọc đem xác định hàm lượng hợp chất.[ ]
Dung dịch môi trường nuôi cấy rễ tơ
2.2.5. Xác định hoạt tính kháng oxi hóa
: hòa dung môi ethyl acetate vào dịch
môi trường, hỗn hợp dung môi và dịch môi trường được trộn đều trong 30 phút, sau
đó hổn hợp được lắng, thu lấy phân đoạn ethyl acetate để xác định hàm lượng.
2.2.5.1. Phương pháp thử năng lực khử (Phương pháp Yen và Duh)
Năng lực khử của một chất là khả năng chất đó cho điện tử khi tham gia
phản ứng oxy hóa khử. Do đó, năng lực khử cũng biểu hiện khả năng kháng oxy
hóa của một chất. Trong phương pháp của Yen và Duh (1993) [59], chất khử sẽ
khử potassium ferricyanide (K
3
(Fe(CN)
6
)) thành potassium ferrocyanide
(K
4
(Fe(CN)
6
)), hay nói cách khác ion Fe
3+
trong phân tử potassium ferricyanide bị
29

Vật liệu – Phương pháp

khử thành ion Fe
2+
X + K
trong phân tử potassium ferrocyanide. Phương trình phản ứng
như sau:
3
(Fe(CN)
6
) K
4
(Fe(CN)
6
hay X + (Fe(CN)
)
6
)
3-
(Fe(CN)
6
)
Sau đó bổ sung Fe
4-

3+
phản ứng với ion ferrocyanide tạo thành một phức hợp
ferric ferrocyanide màu xanh (Prussian Blue) có công thức Fe
4
(Fe(CN)
6
)

3
. Cường
độ màu tỉ lệ với hàm lượng ion ferrocyanide, tức là tỉ lệ với khả năng khử của hợp
chất thử nghiệm. 4Fe
3+
+ 3(Fe(CN)
6
)
4-
Fe
4
(Fe(CN)
6
)
3
2.2.5.2. Phương pháp bắt gốc tự do sử dụng DPPH

Màu xanh
DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) (hình 2.5 ) được đặc trưng bởi gốc tự
do ổn định. Gốc tự do này bền do được an định bởi các hiệu ứng điện tử và hiệu
ứng lập thể nội phân tử tạo ra, do đó các phân tử này không thể kết hợp tạo thành
nhị phân tử. DPPH có màu tím đặc trưng. Đỉnh hấp thu của dung dịch DPPH trong
dung môi methanol là 515 - 517 nm. Khi DPPH phản ứng với hợp chất có thể cho
phân tử hydrogen, thì màu tím đ ặc trưng của DPPH giảm xuống [39]. Vì vậy,
phương pháp này dùng để sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất thu nhận
được trong nhiều nghiên cứu.

Hình 2.5. Cấu trúc DPPH ở trạng thái tự do (có màu tím đặc trưng)
30

Vật liệu – Phương pháp


Hình 2.6. Cấu trúc DPPH mất gốc tự do (có màu vàng)
2.2.6. Định lượng hợp chất nhóm stilbene
2.2.6.1. Bán định lượng bằng phương pháp phổ tử ngoại
Nguyên tắc: Mỗi hợp chất có màu đều có phổ đồ đặc trưng ở độ dài sóng
hấp thu chuyên biệt, chẳng hạn như trans – resveratrol được hấp thu mạnh nhất ở
bước sóng 308 nm [10,43] , trans – pterostilbene có phổ đồ đặc trưng ở độ dài sóng
hấp thu 308 nm [43]. Do đó, khi đo mật độ quang ở bước sóng đặc trưng cho chất
chuẩn có nồng độ khác nhau sẽ có một đường chuẩn tuyến tính của mật độ quang
với nồng độ chất chuẩn đó. Từ đó, với bất kỳ hổn hợp nào có chứa hợp chất này, chỉ
cần xác định mật độ quang của nó ở bước sóng hấp thu đặc trưng đó, nồng độ hợp
chất có trong dung dịch đem đo sẽ được xác định. Hàm lượng stilbene được suy ra
dựa vào đường cong phổ hấp thu ở bước sóng 308 nm của resveratrol chuẩn.
Resveratrol được xem là đại diện của nhóm stilbene trong rễ cây đậu phộng [13].
Các bước tiến hành:
Xây dựng đường chuẩn:
Resveratrol được cân chính xác và được hòa tan trong dung môi methanol để
đạt nồng độ 1 mg/ml, sau đó được pha loãng thành các dung dịch có nồng độ từ
0,005 mg/ml đến 0,030 mg/ml. Đo mật độ quang của các dung dịch được pha ở
bước sóng 308 nm; trong đó, dung môi methanol có giá trị ABS = 0.
31

Vật liệu – Phương pháp

Bảng 2.3. Độ hấp thu ở 308 nm của các nồng độ resveratrol khác nhau.
Nồng độ resveratrol
(mg/ml)
0,000 0,005 0,010 00015 0,020 0,025 0,030

OD
0,000
±0,000
308
0,4757
±0,0016
0,9957
±0,060
1,5340
±0,0025
2,3090
±0,062
2,8979
±0,073
3,2561
±0,021


Biểu đồ 2.1. Đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa resveratrol và
độ hấp thụ
Định lượng hợp chất có trong dịch được tách chiết: Pha loãng dung dịch có
chứa hợp chất cần định lượng cho đến khi mật độ quang của chúng nằm trong
khoảng giới hạn các mật độ quang có trong đường chuẩn. Dựa vào phương trình
đường chuẩn y = 113,7x – 0,068 với y là giá trị OD và x là nồng độ resveratrol
(mg/ml), suy ra nồng độ hợp chất tương ứng trong dung dịch đem đo, từ đó quy về
hàm lượng hợp chất có trong hỗn hợp ban đầu.
y = 113,7x - 0,068
R² = 0,994
500
.000

.500
1.000
1.500
2.000
2.500
3.000
3.500
4.000
0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035
OD 308nm
Nồng độ resveratrol (mg/ml)
32

Vật liệu – Phương pháp

2.2.6.2. Định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC)
Trong luận văn này, phương pháp HPLC-UV được gửi phân tích tại phòng thí
nghiệm phân tích trung tâm thuộc Trường ĐH Khoa học tự nhiên, TP. HCM.
2.2.7. Phương pháp xử lý thống kê
Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần với số mẫu trên mỗi nghiệm thức từ 30-35
mẫu. Số liệu thu được từ kết quả của các thí nghiệm được xử lý thống kê bằng phần
mềm Microsoft Excel 2007, SPSS 16.0 phân nhóm các giá trị bằng phương pháp
Duncan và so sánh các giá trị bằng phương pháp Dunnett. Kết quả được trình bày ở
dạng: trung bình ± sai số (Mean ± SE).
2.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm
Phương pháp nghiên cứu chung gồm có khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến
quá trình cảm ứng tạo rễ tơ. Sau đó kiểm tra sự chuyển gen tạo rễ tơ của vi khuẩn
Agrobacterium rhizogenes sang bộ gen của thực vật bằng phương pháp PCR. Tiếp
theo là sàng lọc loại cao chứa nhóm stilbene và có hoạt tính kháng oxi hóa. Cuối
cùng, khảo sát các yếu tố góp phần tăng sinh hàm lượng các hợp chất thuộc nhóm

stilbene.
2.3.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cảm ứng tạo rễ tơ
2.3.1.1. Khảo sát loại mô thích hợp để tạo rễ tơ
Hầu hết các mô và cơ quan thực vật gồm trục hạ diệp, lá, trục thượng diệp,
cuống lá được xâm nhiễm đều có thể được chuyển gen bởi A. rhizogenes dẫn đến
cảm ứng hình thành rễ tơ. Tuy nhiên, hiệu quả chuyển gen thì phụ thuộc vào sự
tương tác giữa vi khuẩn A. rhizogenes với từng loại mô, từng loại tế bào [55]. Vì
vậy, thí nghiệm được thực hiện nhằm xác định nguồn nguyên liệu đầu phù hợp để
cảm ứng tạo rễ tơ. Lá, cuống lá, trụ thượng diệp, tử diệp, trụ hạ diệp của cây 20
ngày tuổi được cắt và tạo vết thương được sử dụng làm nguồn nguyên liệu ban đầu
để khảo sát sự tạo rễ tơ sau khi xâm nhiễm với vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes.
33

Vật liệu – Phương pháp

Thời gian nhúng mẫu trong dung dịch vi khuẩn là 15 phút và thời gian đồng nuôi
cấy là 72 giờ [28,32].
Chỉ tiêu theo dõi là phần trăm mẫu cảm ứng tạo rễ tơ và số rễ tơ tạo ra trên
mỗi mẫu sau 14 - 21 ngày nuôi cấy. Mẫu đối chứng là các khúc cắt được nuôi cấy
không được gây nhiễm với vi khuẩn, cũng được nuôi cấy trên trên các môi trường
tương tự. Số mẫu thực hiện trên cảm ứng ở mỗi loại bộ phận là 30 – 45 mẫu.
2.3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy lên quá trình cảm
ứng tạo rễ tơ
Một trong những yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gene từ
Agrobacterium vào tế bào thực vật là thời gian đồng nuôi cấy [55]. Thí nghiệm
được tiến hành nhằm tìm thời gian đồng nuôi cấy cho hiệu suất chuyển gen tạo rễ tơ
cao nhất. Sau khi tiến hành khảo sát loại mô, ta chọn được nguồn vật liệu đầu phù
hợp cho sự cảm ứng tạo rễ tơ ở đậu phộng. Mẫu sau khi được nhúng trong dịch
khuẩn 15 phút, được chuyển sang giấy thấm vô trùng để giảm độ ẩm trên bề mặt
mẫu và sau đó chuyển lên môi trường MS không có chất điều hòa sinh trư ởng để

đồng nuôi cấy. Thời gian đồng nuôi cấy được bố trí lần lượt: 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ,
96 giờ, 120 giờ. Chỉ tiêu theo dõi là phần trăm mẫu cảm ứng ra rễ tơ. Số mẫu trên
mỗi nghiệm thức là 45 mẫu. Lặp lại 3 lần.
2.3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm mẫu trong dịch khuẩn đến
việc hình thành rễ tơ
Trong các nghiên cứu về cảm ứng tạo rễ tơ, mỗi tác giả sử dụng một thời
gian nhúng mẫu trong dung dịch vi khuẩn đã hoạt hóa. Vì vậy, thí nghiệm này được
tiến hành nhằm tìm thời gian nhúng mẫu trong dịch khuẩn thích hợp tạo rễ tơ nhiều
nhất. Thời gian nhúng mẫu trong dung dịch vi khuẩn lần lượt: 5, 10, 15, 20, 25, 30
phút. Chỉ tiêu theo dõi là phần trăm mẫu cảm ứng tạo rễ tơ.
34

Vật liệu – Phương pháp

2.3.2. Chứng minh sự chuyển gen rolB, rolC thành công và khảo sát khả
năng sinh trưởng rễ tơ trong môi trường lỏng lắc
2.3.2.1. Kiểm tra sự chuyển gen
Kiểu hình rễ tơ là sự biểu hiện của việc tái tổ hợp các gen từ T-DNA (chẳng
hạn rol và aux) của Ri plasmid vào trong tế bào thực vật. Do đó, kiểm tra chuyển
gen thành công có 2 cách: phương pháp trực tiếp phát hiện thông qua T-DNA hoặc
gián tiếp phát hiện thông qua opine. Phương pháp trực tiếp thường được sử dụng
hơn vì trong m ột số trường hợp opine tại ra không bền. Để phát hiện T-DNA,
phương pháp PCR hay Northern Blot thường được sử dụng [61]. Trong đó, phương
pháp PCR sử dụng các cặp mồi của các gen rolA, rolB, rolC, rolD và aux1 để kiểm
tra sự chuyển gen vào tế bào.[49]
Thí nghiệm được tiến hành gồm các bước: tách chiết Ri – plasmid của
Agrobacterium rhizogenes sử dụng làm chứng dương; tách chiết DNA bộ gen của
rễ cây đậu phộng in vitro để làm mẫu đối chứng; tách chiết DNA bộ gen của rễ tơ
được cảm ứng từ mẫu lá, trụ hạ diệp, trụ thượng diệp, tử diệp, cuống lá để kiểm tra;
thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi của gen rolB, rol C; điện di xem sản phẩm

PCR.
DNA bộ gen đâu phộng được tách chiết theo phương pháp CTAB của
Stewart và Via (1993) [
Tách DNA bộ gen thực vật
52] đã được thay đổi một số điểm nhằm kiểm tra sự chuyển
gen tự nhiên từ A. rhizogenes vào thực vật.
35

Vật liệu – Phương pháp


Sơ đồ 2.2. Quy trình tách chiết DNA bộ gen thực vật
Vi khuẩn A. rhizogenes phát triển đến giữa pha tăng trưởng (OD = 0,5 - 1)
được thu nhận sinh khối để tách plasmid theo quy trình của Curier và Nester (1976)
[
Tách plasmid của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
19] và Shoja [49]
Cân 0,1 g mẫu
Cho vào cối nghiền với nitơ lỏng
CTAB (1 ml)
Ủ 1 giờ, 65
o
C, lắc liên tục trong khi ủ
Ly tâm 13000 rpm /5 phút
Dịch nổi
Tủa protein với phenol:chloroform (1:1) 500µl
Ly tâm 13000 rpm/5 phút
Thu pha trên
1 ml EtOH 100% lạnh, ủ 0
o

C qua đêm
Ly tâm 13000 rpm/ 20 phút 4
o
C
Tủa DNA
Ethanol 80
o
lạnh
Ly tâm 13000 rpm/ 3 phút
Bỏ dịch, phơi khô ở 37
o
C
20 µl TE
DNA bộ gen, bảo quản ở -20
o
C



36

Vật liệu – Phương pháp


Sơ đồ 2.3. Quy trình tách chiết DNA plasmid
Chứng minh sự hiện diện của gen chuyển bằng PCR:
10-15 ml dịch khuẩn A. rhizogenes
Ly tâm 6000 rpm/15 phút
Thu tủa vào eppendolf 1,5 ml
Sinh khối giữ trong gel lạnh

100 µl dung dịch I. Votex kĩ
100 µl TE 0,1X, để lạnh
200 µl dung dịch II, đảo nhẹ
600 µl phenol:chloroform (1:1), đảo nhẹ
100 µl dung dịch III đảo nhẹ
Ly tâm 13000 rpm/5 phút, thu dịch nổi
Dịch nổi
200 µl phenol:chlorofrom (1:1), đảo nhẹ
Ly tâm 13000 rpm /10 phút 4
o
C, thu pha trên
Dịch biến tính
1 ml EtOH 100% lạnh, ủ -20
o
C qua đêm
Ly tâm 13000 rpm/20 phút -4
o
C
Tủa DNA
Phơi mẫu, hòa tan tủa vào 20 µl TE 0,1X
Thêm 1 µl Rnase 1 mg/ml, ủ 37
o
C trong 1 giờ
DNA plasmid
37

Vật liệu – Phương pháp

Bảng 2.4. Thành phần của phản ứng PCR
Thành phần phản ứng:

Thành phần Thể tích phản ứng (µl)
dNTP 2 mM
Mồi xuôi, 10 pmol/µl
Mồi ngược, 10 pmol/µl
DEPC-H
2
1,5
1
1
17,75
1,5
1,25
1
25
O
Dream Taq buffer
Dream Taq DNA polymerase, 1 U/µl
DNA khuôn
Tổng thể tích phản ứng
Lần lượt đặt phản ứng cho các cặp mồi của gen rolB và rolC.
Bảng 2.5: Chương trình khuếch đại cặp mồi RolBF-RolBR, rolCF-rolCR
Các bước khuếch đại Nhiệt độ (
o
Thời gian (phút) C) Số chu kỳ
Biến tính ban đầu 95,0 5:00
Biến tính
Bắt cặp
Kéo dài
94,0
54,0

72,0
0:30
0:30
1:00
35
Kết thúc 72,0
4,0
5:00
∞

38

Vật liệu – Phương pháp

Sản phẩm khuếch đại PCR sẽ được phân tích và kiểm tra kích thước bằng
phương pháp điện di trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X. Gel sau đó sẽ được
ngâm với dung dịch ethidium bromide và xem dưới đèn UV. Kích thước các đoạn
được khuếch đại được xác định thông qua thang DNA.
2.3.2.2. Xây dựng đường cong tăng trưởng của rễ tơ trong điều kiện nuôi cấy
lỏng lắc
Rễ tơ được tạo ra từ mẫu lá, được cắt và chuyển sang nuôi cấy trên môi
trường MS lỏng có bổ sung saccharose 30 g/l, không có chất điều hòa sinh trư ởng
thực vật, lắc với vận tốc 100 – 130 vòng/phút, đ ể kiểm tra sự tăng sinh theo thời
gian nuôi cấy. Đo sự tăng trưởng của rễ tơ trong 30 ngày, 3 ngày đo một lần. Chỉ
tiêu theo dõi là trọng lượng tươi rễ tơ. Trọng lượng tươi ban đầu khoảng 0,3 – 0,4 g.
2.3.3. Chứng minh sự hiện diện của nhóm stilbene, đánh giá hoạt tính
kháng oxi hóa của các loại cao từ rễ tơ cây đậu phộng
2.3.3.1. Chứng minh sự hiện diện của hợp chất nhóm stilbene trong các loại
cao sử dụng phương pháp sắc ký bản mỏng
Sắc ký bản mỏng là phương pháp định tính để xác định các chất trong cao có

chứa chất hợp chất đang quan tâm [5]. Thí nghiệm này tiến hành để xác định xem
cao nào chứa hợp chất nhóm stilbene.
Tiến hành: Chấm dung dịch methanol có hòa tan các loại cao (cao hexan, cao
chloroform, cao ethyl acetate, cao methanol) lên bản silica gel, sấy khô. Hệ dung
môi giải ly là chloroform: ethyl acetate: formic acid (5:4:1) [45] nhưng do điều kiện
phòng thí nghiệm chúng tôi sử dụng acetic acid thay thế cho formic acid và chất
chuẩn là resveratrol. Kết quả ghi nhận được khi quan sát dưới đèn UV (254 nm).
2.3.3.2. Đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa của các loại cao
Phương pháp Yen và Duh:
Phương pháp tiến hành 46: Dựa theo quy trình của Sanja và cộng sự (2009) [ ]
39

Vật liệu – Phương pháp

Hút lần lượt 1 ml dung dịch Vitamin E 0,5 mg/ml, chất thử nghiệm (cao
methanol, cao ethyl acetate, cao chloroform, cao hexane) nồng độ 0,5 mg/ml, dung
môi tách chất thử nghiệm (chứng âm) vào từng ống nghiệm riêng biệt.
Hút 2,5 ml dung dịch đệm phosphate 0,2 M pH = 6,6 cho vào từng ống
nghiệm trên, lắc đều.
Hút 2,5 ml dung dịch K
3
(Fe(CN)
6
) 1% cho vào từng ống nghiệm trên.
Hổn hợp phản ứng được đặt trong bể ổn nhiệt ở 50
o
C, trong 20 phút.
Sau khi làm nguội, hút 2,5 ml trichloroacetic acid 1% cho vào từng ống
nghiệm trên.
Ly tâm các dung dịch trên ở điều kiện 7000 vòng trong 2 phút, thu dịch nổi

Hút 1 ml dịch nổi vào từng ống nghiệm sạch riêng biệt, thêm 2 ml nước cất,
0,5 ml dung dịch FeCl
3
1%.
Lắc đều hỗn hợp trong vòng 5 phút. Ghi nhận kết quả độ hấp thu ở bước
sóng 700 nm.
Phương pháp DPPH:
Phương pháp tiến hành:
Cân mỗi loại cao và resveratrol chuẩn, hòa tan trong dung môi methanol để
đạt nồng độ 1 mg/ml.
Pha loãng cao và resveratrol bằng dung môi methanol tuyệt đối ở các nồng
độ liên tiếp.
Hút 0,5 ml mỗi cao và resveratrol đã đư ợc pha loãng vào mỗi ống nghiệm
riêng lẽ. Thêm lần lượt vào mỗi ống nghiệm 3 ml methanol tuyệt đối.
Thêm vào 0,5 ml dung dịch DPPH được pha trong methanol tuyệt đối ở nồng
độ 0,6 mM.
40

Vật liệu – Phương pháp

Lắc đều hỗn hợp, ủ tối trong 30 phút ở nhiệt độ phòng.
Sau đó, đem các dung dịch đo độ hấp thu ở bước sóng 516 nm.
Song song với tiến trình như trên, th ực hiện với một ống nghiệm khác gồm
3,5 ml methanol tuyệt đối được bổ sung 0,5 ml DPPH 0,6 mM, được sử dùng làm
chứng âm.
Khả năng làm mất màu DPPH của mỗi mẫu được tính theo công thức sau[12,
27]:
% mất màu của DPPH (%DC) = [(A
B
– A

C
)/A
B
] x 100
Trong đó: Mức độ làm mất màu DPPH ở tại nồng độ C nhất định tương ứng
với khả năng bắt gốc tự do của chất đó tại nồng độ C (khác không). Giá trị nồng độ
ức chế 50% (IC
50
) được tính thông quá việc nội suy thông qua phương trình đư ờng
thẳng.
A
B
: giá trị OD của chứng âm ([chất thử nghiệm] = không)
A
C
: giá trị OD tại một nồng độ C nhất định (khác không)
Bố trí thí nghiệm
Mỗi loại cao và mỗi hợp chất có khả năng kháng oxi hóa khác nhau. Vì v ậy,
tùy thuộc vào khả năng kháng oxi hóa của từng loại cao, thí nghiệm khảo sát dãy
các nồng độ cao khác nhau để xác định giá trị IC
50
của mỗi loại cao. Thí nghiệm
được thực hiện với mục tiêu so sánh hoạt tính kháng oxi hóa giữa các loại cao và
resveratrol chuẩn.
41

Vật liệu – Phương pháp

2.3.4. Thử nghiệm tăng sinh hàm lượng stilbene trong nuôi cấy rễ tơ bằng
phương pháp bổ sung tiền chất và chất cảm ứ ng

2.3.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung phenylalanine lên sự sinh tổng
hợp stilbene trong rễ tơ cây đậu phộng
Phenylalanine là tiền chất trong con đường sinh tổng hợp stilbene.
Phenylalanine trong môi trường nuôi cấy ban đầu được bổ sung ở các nồng độ khác
nhau: 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 mM. Chỉ tiêu theo dõi là hàm lư ợng stilbene trong
sinh khối rễ tơ và trong dung dịch môi trường sau 21 ngày nuôi cấy.
2.3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ natri acetate lên sự sinh tổng hợp
stilbene
Natri acetate được bổ sung vào môi trường nuôi cấy rễ tơ đậu phộng ở nồng
độ 5, 10, 20 mM vào ngày thứ 19 của quá trình nuôi cấy lỏng lắc. Sau 2 ngày bổ
sung, khảo sát hàm lượng stilbene trong sinh khối rễ tơ và trong môi trường nuôi
cấy [38]. Mẫu đối chứng là rễ tơ không có bổ sung natri acetate.
2.3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhôm clorua lên sự sinh tổng hợp stilbene
Nhôm clorua được bổ sung vào môi trường nuôi cấy rễ tơ ở các nồng độ 0,3;
0,6; 0,9; 1,2 mM vào ngày thứ 19 của quá trình nuôi cấy lỏng lắc. Sau 2 ngày bổ
sung, khảo sát hàm lượng stilbene trong môi trường nuôi cấy và trong sinh khối rễ
tơ.
2.3.4.4. Khảo sát ảnh hưởng của vi khuẩn lên sự sinh tổng hợp stilbene
Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 được bổ sung vào môi
trường nuôi cấy rễ tơ ở các nồng độ: 0,5x10
9
; 1,5x10
9
; 2,5x10
9
; 3,5x10
9
tế bào vào
ngày thứ 19 của quá trình nuôi cấy lỏng lắc. Sau 2 ngày bổ sung, khảo sát hàm
lượng stilbene trong dung dịch môi trường và trong sinh khối rễ tơ.