BÁO CÁO THỰC TẬP-PHƯƠNG PHÁP TẠO HẠT NHÂN TẠO

PHƢƠNG PHÁP TẠO HẠT NHÂN TẠO

I.Đặt vấn đề

Ở một số giống thực vật, việc duy trì nòi giống theo phƣơng thức thông thƣờng là khó
khăn và tốn nhiều thời gian, số lƣơng những loài này ngày càng ít, đôi khi có những loài
đi đến tuyệt chủng do điều kiện bất lợi. để khắc phục vấn đề này và tiến xa hơn nữa là
thƣơng mại hóa, các nhà khoa học không ngừng nghiên cứu, tìm ra các phƣơng pháp mới
nhƣ nuôi cấy mô, phôi vô tính, hạt vô tính,…
trong bài này chúng ta sẽ cùng tìm hiểu về hạt nhân tạo.


II.Công nghệ tạo hạt nhân tạo

1. Khái niệm
Năm 1978, Murashige phát hiện đầu tiên về kỹ thuật hạt nhân tạo. Năm 1987,
Redenbaugh và cộng sự đã phát triển thành công kỹ thuật tạo hạt nhân tạo. Về cơ bản,
hạt nhân tạo giống hạt tự nhiên, có cấu tạo là phôi vô tính đƣợc bọc bởi lớp áo bên ngoài
là lớp gel dinh dƣỡng và có khả năng nảy mầm nhƣ hạt tự nhiên, điểm khác biệt là hạt
nhân tạo không có phôi nhũ.

Hình: Cấu tạo hạt nhân tạo
Năm 1988, McKersie và cộng sự đã tạo thành công hạt nhân tạo cây cỏ linh lăng,
65% hạt biến đổi sau bƣớc làm khô. Năm 1985, Kitto và Janick bọc hạt nhân tạo cà rốt
bằng polyxyethylene đạt tỷ lệ sống 3%. Janick (1988), tạo hạt nhân tạo thành công trên
cần tây. Gray (1987) thành công trên nho và cây cỏ nón. Năm 1988, lúa mì đƣợc tạo hạt
nhân tạo do Carman và cộng sự.

2. Mục đích
Sự biểu hiện thành công của việc tái sinh cây thông qua việc hình thành phôi
vô tính ở một loài thực vật đã mở ra một phạm vi ứng dụng mới đó là tạo hạt nhân tạo

nhằm tạo một hệ thống vận chuyển dễ dàng cho việc gieo trực tiếp phôi lên đất trồng.
Phôi vô tính đƣợc tạo thành invitro thiếu một vỏ bao ngoài và có khuynh hƣớng nảy
mầm ngay tức khắc (nếu phôi đã trƣởng thành) dƣới những điều kiện tối ƣu hoặc có thể
chuyển vào trạng thái thụ động nếu bị thiếu nƣớc(Litz và Gray, 1992). Ngƣợc lại phôi
hợp tử với vỏ bao bên ngoài có một khả năng chịu hạn rất cao (senaratna và csv,
1990;TengvàHor, 1997). Do đó, cần có một hệ thống để cảm ứng phôi vô tính sao cho nó
hoạt động giống phôi hợp tử, và từ đó có thể chịu đựng đƣợc những tổn hại ở mức tối
thiểu.




3.Ý nghĩa
Công nghệ hạt nhân tạo sử dụng phô vô tính có vai trò rất quan trọng trong việc trồng
trọt ở những loài thực vật
 Không tạo đƣợc hạt
 Hạt đƣợc tạo thành với một số lƣợng thấp
 Khả năng hạt sống sót thấp
 Việc nhân giống thực vật khó khăn và chất mầm không thể bảo quản đƣợc

4. Các nhân tố trong tạo hạt nhân tạo
4.1 phôi vô tính
a, lịch sử phát triển
-1958, Street và Reinert đã mô tả sự hình thành phôi vô tính từ các tế bào đơn của cà rốt
-1977, Murashige đƣa ra ý kiến tạo phôi vô tính có thể trở thành biện pháp vi nhân giống
-Đến nay công nghệ phôi vô tính đƣợc xem là rất có triển vọng cho nông nghiệp thế kỷ
21
b,khái niệm về phôi vô tính
Phôi vô tính hay phôi soma là các thể nhân giống (propagule) có cực tính bắt nguồn từ
các tế bào dinh dƣỡng, bao gồm cả phần mô phân sinh ngọn và mô phân sinh gốc, do đó

có thể hình thành chồi và rễ.
Không giống nhƣ các tế bào eukaryote, hầu hết các tế bào thực vật đều có khả năng phát
triển thành phôi dƣới những điều kiện xác định.Williams và Maheswaran (1986) đã cho
rằng phôi vô tính có thể đƣợc hình thành từ một tế bào đơn hay từ cả cụm tế bào phôi,
tiến trình này khác với những quá trình tự nhiên khác và đƣợc gọi là quá trình hình thành
phôi vô tính.
Phôi vô tính rất giống phôi hữu tính ở hình thái và sinh lý nhƣng không có tái tổ hợp di
truyền.do đó tất cả những cây con tái sinh bằng con đƣờng này thì có vật chất di truyền
giống hệt các tế bào sinh dƣỡng đã sinh ra chúng. Đặc tính này của phôi sinh dƣỡng
không những cho phép thực hiện sự





hông



nhân giống vô tính mà còn tạo ra những thay đổi chuyên biệt và trực tiếp để đƣa các
tính chất mong muốn vào các cá thể bằng việc chèn thêm những trình tự gen cố định
vào tế bào sinh dƣỡng. (Saiprasad, 2001).
Giống nhƣ các tế bào của mô phân sinh, các tế bào sinh phôi có các đặc tính cơ
bản nhƣ sau: tế bào nhỏ, có cùng một đƣờng kính, có hoạt động biến dƣỡng rất mạnh
mẽ, có cƣờng độ tổng hợp ribonucleic acid rất cao, có tế bào chất đậm đặc, không bào
rất nhỏ, nhân to, dễ nhận thấy, hạch nhân rất to và sậm màu, đặc biệt là các tế bào này
có một lƣợng lớn các ribosom, ty thể, lƣới nội chất nhỏ và có vách rất dày (Ammirato,
1987; Emons, 1994; Raghvan, 1983; Thorpe, 1988).
c. Sự phát sinh hình thái của phôi vô tính
Tất cả các phôi vô tính đều có cấu trúc lƣỡng cực, gồm có mô phân sinh của cả

chồi và rễ, do đó có thể hình thành một cây hoàn chỉnh trong nuôi cấy in vitro. Sự phát
sinh hình thái ở phôi vô tính rất giống so với phôi hữu tính. những phôi phát triển bình
thƣờng sẽ trải qua những giai đoạn phát triển riêng biệt nhƣ: hình cầu, hình tim, hình
thủy lôi và hình lá mầm.
╬ Cơ chế phát sinh phôi soma
Những quan sát chi tiết về quá trình phát sinh phôi phát hiện có 4 pha : 0, 1, 2
và 3, đƣợc nhận thấy trong giai đoạn đầu của tiến trình phát sinh phôi trong hệ thống
nuôi cấy nói trên (Fujimura và Komamine, 1979).
Ở pha 0, những tế bào đơn (giai đoạn 0) hình thành những cụm tế bào có khả
năng phát sinh phôi (giai đoạn 1) trên môi trƣờng có auxin. Trong suốt giai đoạn này,
những cụm tế bào hình thành từ những tế bào đơn có khả năng tạo phôi khi môi trƣờng
nuôi cấy không có auxin, để hình thành những cụm tế bào giai đoạn 1.
Sau đó, pha 1 xuất hiện khi cấy chuyển những cụm tế bào giai đoạn 1 qua môi
trƣờng không có auxin. Trong suốt pha 1, những cụm tế bào tăng sinh chậm và dƣờng
nhƣ không biệt hóa.
Sau pha 1 sự phân bào xuất hiện nhanh trên một phần của những cụm tế bào,
dẫn đến việc hình thành những tế bào phôi hình cầu. Pha này đƣợc gọi là pha 2.
22
Pha tiếp theo sau, pha 3, cây con in vitro phát triển từ những phôi hình cầu qua
phôi hình tim và phôi hình thủy lôi.
Hình 2.6 Các giai đoạn phát sinh phôi vô tính
╬ Các kiểu phát sinh phôi soma
Sự phát sinh phôi soma bất định
Các phôi vô tính có thể phát triển từ các tế bào hay các mô sẹo có liên quan của
một số loài thực vật nhiệt đới, các phôi bất định này có thể đƣợc tạo trực tiếp từ tế bào
đơn trên bề mặt của phôi non hoặc gián tiếp từ bề mặt của phôi non này. Phƣơng pháp
này đƣợc sử dụng trong chƣơng trình di truyền cải tạo giống, chẳng hạn nhƣ cứu các
phôi bị chết non do lai tạo.
Sự phát sinh đa phôi vô tính
Hiện tƣợng này xảy ra khi nuôi cấy các noãn non của thực vật hạt trần. Các

khối mô có khả năng tạo phôi cao khi đƣợc cấy chuyền sang môi trƣờng mới sẽ phát
triển và tăng trƣởng thành phôi. Mô có khả năng phát triển thành phôi có thể đƣợc
phân biệt với mô không có khả năng phát triển thành phôi do màu trắng của phôi và
hoá đỏ khi nhuộm bằng acetocarmine. Dƣới ánh đèn tử ngoại các tế bào phôi có thể
phát huỳnh quang màu xanh lá cây.
Sự phát sinh phôi soma do cảm ứng
Hiện tƣợng này do sự nuôi cấy lỏng các tế bào và mô sẹo sau khi các mô này
chịu các xử lý đặc biệt đem lại sự cảm ứng khả năng tạo phôi. Ngƣời ta đã thực hiện
nhiều nghiên cứu trên nhiều loại thực vật ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau để quan
sát khả năng tạo thành mô sẹo.
23
d. Những nhân tố ảnh hưởng đến sự hình thành phôi vô tính
Việc cảm ứng tạo phôi vô tính là một trong những công việc khá mới mẻ và rất
khó khăn. Để đạt đƣợc hiệu quả cao và thành công, việc tìm hiểu các điều kiện sinh lý,
hóa học tác động đến sự hình thành phôi là một công việc rất quan trọng.
╬ Mẫu cấy
Mỗi loại mẫu cấy có những khả năng cảm ứng tạo phôi khác nhau. Sự lựa chọn
mẫu cấy rất khắc khe, ví dụ, nhiều loài một lá mầm đòi hỏi mẫu cấy phải ở một giai
đoạn cụ thể nào đó của hợp tử phôi non thì mới hình thành mô sẹo từ đó tạo phôi vô
tính. Những bộ phận thích hợp đƣợc sử dụng để nuôi cấy tạo phôi Asparagus
officinalis, Lilium nhƣ chồi đỉnh, cuống lá, lóng thân, mầm, phôi chƣa trƣởng thành,
còn những bộ phận khác thì hiệu quả tạo phôi rất thấp (Hisato Kunitake, 1998).
╬ Môi trƣờng nuôi cấy
Gần 70% nghiên cứu thành công đều nhờ vào sử dụng môi trƣờng MS với hàm
lƣợng muối khoáng cơ bản (Ammirato, 1983; Litz và Gray, 1992; Thorpe, 1988). Lý
do vì môi trƣờng này có chứa hàm lƣợng muối nitrat và ammonia cao. Tỉ lệ giữa muối
nitrat và ammonia trong môi trƣờng rất quan trọng trong việc cảm ứng tạo phôi
(Niedz, 1993, 1994). Polyamine trong môi trƣờng dinh dƣỡng có hiệu quả kích thích
đến việc hình thành phôi vô tính (Minocha và Minocha, 1995). Những chất hữu cơ
khác nhƣ nƣớc dừa, casein thủy phân, tinh chất mạch nha (malt extract)… ở những

nồng độ khác nhau cũng đƣợc sử dụng và đã cho thấy có nhiều ảnh hƣởng đến cảm
ứng tạo phôi ở một số loài thực vật. Bên cạnh đó cũng đã có những đề nghị về vai trò
của nitrogen, amino acid, amid, cũng nhƣ của kali, photphat đến sự hình thành phôi(
Tisserat và cộng sự, 1979; Ammirato, 1983).
╬ Nguồn cacbohydrate
Sucrose là một nguồn cacbon chính trong môi trƣờng nuôi cấy. Tuy nhiên trong
một vài trƣờng hợp, galactose (Cabasson và cộng sự, 1997), lactose (Jumin và Nato,
1995), maltose (Dhir và Yavada, 1995), glucose và fructose (Canhoto và Cruz, 1994)
24
và manitol (Kunitake và cộng sự, 1991) khi kết hợp với sucrose đã đẩy mạnh sự cảm
ứng tạo phôi cũng nhƣ sự phát sinh hình thái bình thƣờng của phôi.
╬ Chất điều hòa tăng trƣởng
Chất điều hòa tăng trƣởng đƣợc chia làm 5 nhóm chính là auxin, cytokinin, acid
abscisic, gibberellin, ethylen. Các chất điều hòa tăng trƣởng là tối cần thiết cho việc
cảm ứng tạo phôi và mỗi chất điều hòa tăng trƣởng thì lại có những tác dụng lên việc
tạo phôi khác nhau trên những loài thực vật khác nhau và ở những nồng độ khác nhau.
Quá trình cảm ứng hình thành phôi vô tính ở những loài thực vật khác nhau cho thấy
có 3 kiểu ảnh hƣởng của chất điều hòa tăng trƣởng đối với phôi:
1)
Sự hiện diện của chất điều hòa tăng trƣởng là cần thiết trong tất cả các giai
đoạn phát triển cuả phôi
2)
Chất điều hòa tăng trƣởng cần thiết trong giai đoạn cảm ứng, tuy nhiên, sang
đến giai đoạn phát triển cao hơn thì các chất điều hòa này cẩn phải đƣợc loại
bỏ
3)
Sự hình thành phôi vô tính chỉ xuất hiện khi có sự có mặt của chất điều hòa
tăng trƣởng, nhƣng khi phôi vô tính phát triển sau giai đoạn hình cầu thì sự
có mặt của chất điều hòa không còn tác dụng nữa.
Chất điều hòa tăng trƣởng là auxin, thƣờng là 2,4-D và NAA đƣợc sử dụng

trong hơn 50% và 25% trƣờng hợp cảm ứng tạo phôi (Evans và cộng sự, 1983; Litz và
Gray, 1992). Có những sự khác biệt ở mức tế bào và mức độ phôi trong hoạt động
phân chia tế bào của các tế bào phôi vô tính và tế bào mô sẹo, cũng nhƣ là những sự
khác biệt trong sự phát triển hình thái của phôi vô tính đƣợc cảm ứng trên những chất
auxin khác nhau ( Rodrigeuz và Wetztein, 1998). Auxin đƣợc chứng tỏ cho thấy có
một tác dụng tích cực khi đƣợc sử dụng kết hợp với cytokinin và TDZ. Tuy nhiên ở
nồng độ auxin cao thƣờng hạn chế sự phát triển của phôi vô tính trong những giai đoạn
đầu tiên của sự phát triển phôi.
Cytokinin cũng có những tác dụng tƣơng đối lên sự hình thành phôi, nhƣng nó
không có những tác dụng đáng kể. Mặc dù vậy, sự kết hợp của cả auxin và cytokinin
cho thấy nhiều thuận lợi để đạt đƣợc hiệu quả cảm ứng phôi tối đa trên một số loài
(Cruz và cộng sự, 1990; Nishi, 1997). Tuy nhiên hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu sự
25
dụng TDZ, chất điều hòa tăng trƣởng thuộc nhóm cytokinin, nhằm mục đích cảm ứng
tạo phôi vô tính ở một số thực vật hai lá mầm (Murthy và cộng sự, 1998). Vì vậy trong
những năm gần đây việc sử dụng TDZ đã trở nên phổ biến.
Môi trƣờng không có hormone thƣờng đƣợc sử dụng cho sự phát triển của phôi
vô tính từ dạng hình cầu cho tới khi phát triển thành cây con. Đôi khi, những nồng độ
thấp của hormone trong môi trƣờng cần cho sự biểu hiện hoặc trong môi trƣờng cần
cho sự phát triển thì có thể có lợi, thậm chí là bắt buộc phải có, tùy theo loài, để kích
thích sự phát triển bình thƣờng của phôi.
Tóm lại, để cảm ứng tạo một cấu trúc lƣỡng cực cần phải có tín hiệu của một
loại hormone. Ngƣợc lại, để cảm ứng tạo cơ quan thì phải có hai tín hiệu hormone
khác nhau: đầu tiên là tạo chồi, sau đó tạo rễ, sử dụng hai môi trƣờng khác nhau. Để
những tế bào phôi phát triển bình thƣờng thành những cây con thì cần một môi trƣờng
khác, có hoặc không có hormone.
╬ Thời gian xử lý
Khoảng thời gian mẫu cấy đƣợc xử lý với chất điều hòa tăng trƣởng là một
nhân tố quan trọng trong việc cảm ứng cũng nhƣ hình thành phôi vô tính một cách
bình thƣờng. Khi mẫu cấy đƣợc chuyển sang môi trƣờng không có nhân tố tăng

trƣởng, một khoảng thời gian tối thiểu là 8 ngày rất cần thiết cho việc cảm ứng hình
thành phôi với một hiệu quả rất cao mà không cần quan tâm đến dạng chất điều hòa
tăng trƣởng đã sử dụng.
╬ Sự tƣơng quan gữa độ tuổi của mẫu cấy và sucrose
Thƣờng thì độ tuổi (Wetzstein và cộng sự, 1989) hay giai đoạn phát triển của
mẫu cấy (Karunaratne và cộng sự, 1991) là một nhân tố quan trọng trong cảm ứng tạo
phôi. Do đó, sự phát triển tối đa hay độ tuổi sinh lý của mẫu cấy là một nhân tố chủ
yếu trongcảm ứng tạo phôi có hiệu quả ở một số loài thực vật. Hơn nữa, nguồn dinh
dƣỡng cơ bản cần thiết (sucrose/cacbonhydrate) cho các loại mô thì khác nhau đáng kể
tùy vào độ tuồi phát triển (Monnier, 1990). Bên cạnh đó, sự ảnh hƣởng của các chất
kích thích tăng trƣởng khác nhau đến các loại mô khác nhau thì phụ thuộc nhiều vào
nồgn độ sucrose có trong môi trƣờng nuôi cấy (Thompson và Thorpe, 1987). Một
26
nồng độ sucrose cao (4-6%) đƣợc bổ sung ở giai đoạn cảm ứng và phát triển của phôi
thì rất có lợi cho việc tạo phôi ở một số loài thực vật.
╬ Nồng độ của môi trƣờng
Nồng độ của các thành phần trong môi trƣờng cơ bản có ảnh hƣởng đến việc
cảm ứng tạo phôi vô tính. Hầu hết các nghiên cứu tạo phôi trên môi trƣờng MS đều
cho hiệu quả tạo phôi cao. Nồng độ môi trƣờng càng loãng thì khả năng tạo phôi càng
kém.
╬ Trạng thái vật lý của môi trƣờng
Sự tạo thành phôi vô tính thƣờng đƣợc cảm ứng trên môi trƣờng bán rắn. Tuy
nhiên, trạng thái của môi trƣờng (bán rắn hay lỏng) thì rất quan trọng trong việc duy trì
và làm tăng cƣờng sự phát triển của phôi vô tính. Sự cảm ứng tạo phôi vô tính của
Gossypium klotzschiapum trên môi trƣờng MS lỏng có bổ sung vitamin B, có chứa các
chất điều hòa tăng trƣởng cho thấy đạt hiệu quả cao (Yuqiang Sun và cộng sự, 2003).
Ở Lilium longiflorum, kết quả tƣơng tự cũng đƣợc phát hiện (Tribulato và cộng sự,
1997; Duong Tan Nhut và cộng sự, 2002).
╬Kiểu gen
Một vấn đề thƣờng gặp trong cảm ứng tạo phôi nữa là sự phụ thuộc rất lớn vào

loại cây trồng và kiểu gen. Kiểu gen có một ảnh hƣởng to lớn trong việc cảm ứng tạo
phôi của hầu hết các loài thực vật. Không phải tất cả các thực vật đều có khả năng cảm
ứng tạo phôi. Đối với những cây tự thụ phấn, những giống cây khác nhau thì khả năng
phát sinh phôi vô tính cũng có thể khác nhau.
Đã có các thí nghiệm khác nhau tiến hành trên các loài có kiểu gen khác nhau để
khảo sát khả năng hình thành phôi vô tính. Chẳng hạn nhƣ ở cây Asparagus, ngƣời ta
đã quan sát khả năng tạo phôi vô tính trên các giống có kiểu gen khác nhau (Hisato và
Masahiro, 1998). Delbreil và Julien (1994) đã mô tả những khác biệt quan sát đƣợc từ
tần suất tạo phôi từ chồi dỉnh của 12 giống Asparagus có các kiểu gen khác nhau.
Những khác biệt về tần suất hình thành phôi ở các loài đa bội ( lƣỡng bội, tứ bội) cũng
đã đƣợc phát hiện ( Kunitake và cộng sự, 1992). Haensch và cộng sự (1996) đã quan
27
sát khả năng hình thành phôi vô tính và tái sinh cây ở những giống Lilium có kiểu gen
khác nhau.
╬ Cƣờng độ chiếu sáng
Các nhân tố khác trong môi trƣờng nuôi cấy nhƣ là cƣờng độ ánh sáng cũng có
ảnh hƣởng đến việc cảm ừng tạo thành phôi vô tính. Các nghiên cứu cũng đã baó cáo
về những ảnh hƣởng khác nhau của chế độ sáng và tối. Nhìn chung, chế độ tối đã cho
thấy có những ảnh hƣởng tốt hơn trong giai đoạn cảm ứng. Ở một số loài thực vật, sự
cảm ứng cần có những điều kiện ủ trong tối. Những điều kiện trong tối có thể đƣợc tạo
bằng cách bao môi trƣờng nuôi cấy bằng những tấm nhôm mỏng hoặc đặt chúng trong
hộp carton. Những nghiện cứu tạo phôi vô tính ở loài Gossypium kltzschianum và
L.longiflorum đạt đƣợc kết quả tốt khi nuôi cấy trong tối (Yuqiang Sun và cộng sự,
2003; Tribulato, 1997).
e. Những vấn đề thường gặp trong quá trình phát sinh phôi vô tính
Một vài vấn đề thƣờng gặp trong quá trình phát sinh phôi vô tính ở vài loại thực
vật là sự xuất hiện những phôi dị thƣờng. Các lá mầm có thể bị xoắn lại, mô phân sinh
chồi có thể có hình dạng không bình thƣờng hoặc có thể thiếu. Những trƣờng hợp này
cần phải có những thao tác phụ để thúc đẩy sự xuất hiện bình thƣờng và sự phát triển
của phôi bằng cách sử dụng nồng độ từ thấp đến vừa phải các chất điều hòa tăng

trƣởng trong môi trƣờng, sử dụng acid abscisic hoặc những cách xử lý thẩm lọc cao,
hay bằng những phƣơng pháp vật lý khác nhƣ sự sấy khô (Ammirato, 1983; Parrott,
1988).
Những thực vật đƣợc tái sinh từ nuôi cấy mô sẹo và huyền phù tế bào có thể bị
biến dị về hình thái hoặc biến dị ở phần sinh dƣỡng. Tuy nhiên, những trƣờng hợp đó
ít xuất hiện ở những cây đƣợc tái sinh bởi sự phát sinh phôi vô tính hơn là những cây
đƣợc tái sinh từ sự phát sinh cơ quan (Ammirato, 1987; Reisch, 1983). Nếu những cây
đƣợc sử dụng với mục đích nhân lên, thì việc kiểm tra lại kiểu di truyền là rất quan
trọng bằng cách tiến hành kiểm tra độ hữu thụ và chỉ số di truyền cho nhửng đặc điểm
tiêu biểu. Nếu những cây đƣợc sử dụng với mục đích sản xuất thì những kiểu biến dị
nên đƣợc bỏ đi.
28
Hình 2.7 Phôi có hình dạng dị thƣờng
Một điều đáng chú ý nữa là sự phát sinh phôi vô tính và sự phát sinh cơ quan
thì không loại trừ nhau. Ví dụ, cỏ ba lá có thể đƣợc tái sinh từ phôi vô tính (Phillips và
Collins, 1984). Tuy nhiên khi nuôi cấy trên môi trƣờng thuận lợi cho sự phát triển chồi
thì cũng tạo ra phôi vô tính, sau đó nuôi cấy trên môi trƣờng thuận lợi cho sự nhân lên
của chồi thì đã tạo ra nhiều cây tái sinh hơn so với khi nuôi cấy bình thƣờng.
Vì vậy những phƣơng pháp làm cho phát sinh phôi và làm tái sinh cơ quan
đƣợc kết hợp để làm tối ƣu hóa khả năng tái sinh cây. Thật thú vị khi trên cùng môi
trƣờng thuận lợi cho sự phát triển sinh cực chồi của những phôi vô tính cũng là môi
trƣờng thích hợp để tái sinh những hợp tử phôi lai khác loài. Từ đó cho thấy đã có một
vài đặc điểm tƣơng tự giữa phôi hợp tử và phôi vô tính
f. Ứng dụng của việc tạo phôi vô tính
Phôi vô tính giúp cho công tác vi nhân giống và sản xuất với số lƣợng lớn thực
vật bằng bioreactor, và đồng thời mở ra một hƣớng mới trong công nghệ tạo hạt nhân
tạo. phôi vô tính còn là nguyên liệu cho việc chuyển gen ở thực vật, công nghệ nuôi
cấy tế bào trần. Áp dụng công nghệ đông lạnh phôi vô tính là một phƣơng pháp rất
hiệu quả trong việc bảo quản phôi mầm trong một thời gian dài. Quá trình tạo thành
phôi vô tính còn giúp ích cho việc nghiên cứu tính toàn thể, cũng nhƣ tìm hiểu cơ chế

biệt hóa ở tế bào thực vật. Việc tạo thành công phôi vô tính ở một số loài thực vật, cả
hạt trần lẫn hạt kín, cây một lá mầm và hai lá mầm, đã mở ra nhiều triển vọng mới cho
29
nền công nghệ sinh học thực vật, tuy nhiên đây là một công việc khó khăn và khá mới
mẻ.
Hình 2.8 Chồi lan Hồ Điệp tái sinh từ phôi
f. Một số thành tựu tạo phôi vô tính
Phôi vô tính đã đƣợc nghiên cứu trên hơn 130 loài, bao gồm các loài ngũ cốc,
các loài cỏ, cây họ đậu và các cây có quả hình nón (Ammirato, 1983; Wann,1988).
Trong đó, việc nghiên cứu tạo phôi Lan cũng rất đƣợc các nhà khoa học quan tâm.
╬ Tạo phôi thông qua nuôi cấy protocorm lan Hồ Điệp (Jen Tsung Chen và
Wei Chin Chang, Đài Loan):
Jen-Tsung Chen và Wei-Chin Chang là 2 nhà nghiên cứu lan nổi tiếng ở châu
Á. Hai ông tiến hành nuôi cấy Protocorm lan Hồ Điệp trên môi trƣờng ½ MS không
bổ sung chất điều hoà sinh trƣởng. Sau 45 ngày nuôi cấy, 28.1% mẫu cấy hình thành
phôi, trung bình 1 mẫu hình thành 1 phôi.
Khi nuôi cấy thử nghiệm Protocorm lan Hồ Điệp trên môi trƣờng MS bổ sung
TDZ (0.45M, 4.54M, 13.62M), hai ông thấy rằng TDZ có ảnh hƣởng trực tiếp đến sự
hình thành phôi vô tính. Trong đó, môi trƣờng bổ sung TDZ nồng độ 13.62M cho hiệu
quả tạo phôi cao nhất: gần 100% mẫu protocorm hình thành phôi (45NSC). Trung bình
30
13.5 phôi/mẫu cấy… Ngƣợc lại, khi bổ sung thêm NAA (nồng độ 0.54M và 57.37M)
sẽ ức chế sự tạo phôi.
╬ Phƣơng pháp nuôi cấy tạo phôi lan Hồ Điệp từ cuống hoa (Ken Tokuhara và
Masahiro, Nhật Bản)
Theo báo cáo của hai nhà khoa học ngƣời Nhật này, khi nuôi cấy mẫu cuống
hoa trên môi trƣờng New Dogashima (NDM) có chứa (NAA 0,5µM + BA 4,4µM +
sucrose 29,2 mM) thì mô sẹo phát sinh phôi (embryo callus) sẽ đƣợc tạo thành sau 7
tháng nuôi cấy, với tỉ lệ 73% mẫu cấy hình thành embryo callus.
╬ Tác động của điều kiện nuôi cấy và cơ quan nuôi cấy lên sự hình thành

phôi soma lan Oncidium (Jen-Tsung Chen và Wei-Chin Chang):
Theo báo cáo của tác giả, sự hình thành phôi có liên quan đến vị trí mẫu cấy:
những mảnh có vị trí ở phía đầu lá có khả năng tạo phôi cao hơn là ở những vị trí khác
và môi trƣờng tốt nhất cho việc tạo phôi lan Oncidium là: môi trƣờng 1/2MS (chứa
85mg/l KH2PO4) bổ sung 10-20 g/l sucrose, 170mg/l NaH2PO4 và 0,5 mg/l peptone.
╬ Phƣơng pháp nuôi cấy tạo phôi lan Hồ Điệp từ mô sẹo (Nguyễn Bá Hùng ,
Hồng Ngọc Trâm, 2005).
Phôi vô tính sẽ hình thành khi nuôi cấy mô sẹo trên môi trƣờng MS bổ sung
NAA 0.5 mg/l + BA 2 mg/l + đƣờng 30g/l sau 11 tuần nuôi cấy


4.2 Tạo vỏ bọc bằng sodium alginate
Có rất nhiều tác nhân tạo gel đƣợc sử dụng làm vỏ bọc cho phôi.Đó có thể là
agar, alginate, polyco 2133 (Bordon Co.), carboxyl methyl cellulose, carrageenan, gelrite
(Kelko. Co.), guargum, sodium pectate, tragacanth gum, dextran, xanthan gum … những
hợp chất này sẽ đông lại thành gel khi đƣợc cho vào môi trƣờng có chất điện phân thích
hợp nhƣ đồng sulphate, calcium chloride hoặc ammonium chloride nhờ vào những liên
kết ion. Phƣơng pháp đƣợc sử dụng rộng rãi nhất để tạo vỏ bọc cho phôi đó là sử dụng
sodium alginate (Bajaj, 1995; Jeon và csv, 1986; Redenbaugh và csv, 1993).
Alginate đƣợc sử dụng nhiều do nó có những đặc tính rất thuận lợi nhƣ tính
dính vừa phải, không gây độc cho phôi sinh dƣỡng, có các đặc tính tƣơng hợp sinh học,
khả năng tạo thành gel nhanh, rẻ tiền, để đƣợc lâu, độ cứng của gel vừa phải để có thể
vừa tạo thuận lợi cho sự hô hấp của phôi và vừa bảo vệ đƣợc phôi khỏi những tổn thƣơng
bên ngoài.

Hình : Công thức hoá học của alginate
Alginate, chất hữu cơ mạch thẳng, kỵ nƣớc. Nguyên tắc chính trong quá trình tạo
vỏ bọc alginate đó là sodium alginate chứa phôi sẽ tạo thành từng hạt nhỏ, tròn và cứng
khi nhỏ vào trong hỗn hợp NaCl
2

.2H
2
O nhờ vào sự trao đổi ion giữa ion Na
+
có trong
hỗn hợp sodium alginate với Ca
2+
có trong hỗn hợp CaCl
2
.2H
2
O. Vỏ bọc cứng nhiều hay
ít là phụ thuộc vào số lƣợng ion Na
+
trao đổi với ion Ca
2+
.
Do đó nồng độ của hai tác nhân tạo gel, sodium alginate và CaCl2.2H2O, và thời
gian cho việc tạo liên kết ion phải thật tối ƣu để có thể tạo thành vỏ bọc ở một độ cứng
thích hợp nhất. Không nhƣ phôi hợp tử, phôi vô tính thiếu lớp nội nhũ chứa chất dinh
dƣỡng bên ngoài nuôi phôi, do đó bằng việc thêm vào chất nền gel những chất dinh
dƣỡng, chất điều hòa tăng trƣởng, carbohydrate sẽ tạo một nội nhũ nhân tạo thích hợp tối
đa cho tăng trƣởng và sống sót của phôi (Gray, 1990; Gray và Purohit, 1991;
Redenbaugh và Walker, 1990). Ngoài ra nhằm tránh cho phôi bị mất nƣớc, hay các tổn
thƣơng cơ học, tăng sức đề kháng cho phôi ngƣời ta có thể thêm vào chất nền gel chất
kháng sinh, thuốc trừ nấm, trừ sâu, vi sinh vật.
Mặc dù việc tạo hạt nhân tạo từ cách bọc phôi vô tính bằng sodium alginate cho
thấy có một số thành công nhất định trong việc tái sinh cây con, vẫn còn nhiều vấn đề
khó khăn khi sử dụng vỏ bao alginate này, chất dinh dƣỡng có thể bị mất đi khỏi vỏ bao
(Redenbaugh và csv, 1987), sự trao đổi khí kém (Redenbaugh và csv, 1993)… Đã có một

số đề nghị cho rằng, việc thêm vào than hoạt tính sẽ giúp nâng cao khả năng sống sót,
h
h
phát triển của phôi vô tính hơn. Nguyên nhân là do than hoạt tính tăng cƣờng khả năng
hô hấp của phôi, và nó giữ lại những chất dinh dƣỡng nhiều hơn trong vỏ bọc, phóng
thích chúng rất chậm dùng cho sự phát triển của phôi.

5 Quy trình tạo hạt nhân tạo







Hình 2-5: Các dạng phôi soma

Phôi hình cầu Phôi hình tim



Phôi hình thuỷ lôi Phôi hình lá mầm


Bƣớc 1: Chuẩn bị nguyên liệu tạo hạt nhân tạo

╬Với nguyên liệu là chồi (shootbud)

Dùng dao cắt những chồi (shootbud) có kích thƣớc 2-3 mm từ cây nuôi cấy in vitro.







╬Với nguyên liệu là phôi vô tính



Dùng dao tách rời các phôi hình tim.

Bƣớc 2. Dùng pince cấy gắp các phôi/chồi cho vào môi trƣờng tạo vỏ alginate.
Bƣớc 3 Dùng pipette 10ml hút môi trƣờng alginate có chứa chồi/phôi nhỏ vào dung dịch
CaCl
2
.2H
2
O 100mM trong 15 phút.



Bƣớc 4.Dùng pince gắp hạt vào đĩa petri có chứa nƣớc cất vô trùng để làm sạch lƣợng
CaCl2.H2O còn sót lại.


Bƣớc 5. Cấy hạt nhân tạo vào môi trƣờng nuôi cấy (MS không bổ sung các chất điều hòa
sinh trƣởng).

Hình : Quy trình tạo hạt nhân tạo




2

III. Ứng dụng trong thực tế:
Mỗi năm nƣớc ta sản xuất hơn 10 triệu củ khoai tây giống, trong đó Đà Lạt chiếm
quá nửa bởi có điều kiện khí hậu, đất đai phù hợp.
Tuy nhiên, năng suất khoai tây thấp, chất lƣợng củ giống còn kém và tỉ lệ củ mang
mầm bệnh khá cao bởi chƣa có quy trình sản xuất tiên tiến. Để nâng cao chất lƣợng củ
giống, chúng tôi tiến hành nghiên cứu, sản xuất “hạt” khoai tây nhân tạo; đồng thời kích
thích sinh trƣởng bằng kỹ thuật bức xạ hạt nhân”.


Hạt khoai tây nhân tạo





Ruộng khoai tây ở Lý Nhân (Hà Nam)
“Hạt” khoai tây nhân tạo còn có ƣu điểm khó bị tổn thƣơng khi vận chuyển vì có
một lớp da bao bọc bên ngoài, có thể cất giữ khá lâu ở nhiệt độ thấp (4-6oC).
Năng suất tăng từ 1 đến 2 lần
Trồng khoai tây bằng “hạt” nhân tạo sạch bệnh, chất lƣợng cao, giá thành hạ… là
hƣớng đi mới mở ra nhiều triển vọng cho nông dân và các cơ sở sản xuất, nhất là ở

những vùng chuyên canh khoai tây để chế biến khoai sấy khô xuất khẩu.
Việc chiếu xạ bằng gamma tuy đã tạo điều kiện thuận lợi để “hạt” khoai tây tồn
tại ở môi trƣờng bên ngoài với điều kiện thiên nhiên khắc nghiệt, nhƣng cũng cần một số
biện pháp bổ trợ bởi “hạt” mỏng manh, dễ bị mất nƣớc và là miếng mồi béo bở của vi
sinh vật.
Trƣớc khi mang “hạt” ra trồng cần xử lý lạnh từ 4 - 6
o
C trong vòng một tuần, sốc
nhiệt 38
o
C trong vòng hai ngày hoặc xử lý bằng một số loại axit và chất bảo vệ thực vật.


III. Ưu nhược điểm hạt nhân tạo
Ưu điểm
- Phôi phát triển nhanh, số lƣợng nhiều, có thể hạ thấp giá thành và tiết kiệm sức
lao động.
- Cây trồng đời sau mang ƣu thế của giống cây cố định, không hề thay đổi.

- Dễ dàng sử dụng trong quá trình vận chuyển, lƣu trữ và trồng.
- Thời gian bảo quản lâu hơn, khả năng phát triển hạt giống vẫn còn tốt cho khoảng
thời gian dài hơn.
- Sản phẩm đồng nhất về mặt di truyền
- Ứng dụng quy mô lớn, thích hợp cho độc canh quy mô lớn.
- Bảo tồn giống cây, để tránh sự tuyệt chủng của các loài có nguy cơ tuyệt chủng
- Tạo điều kiện nghiên cứu về chức năng vỏ hạt, hình thành nội nhũ trong phát triển
của phôi và nảy mầm hạt giống.
- Tăng năng suất cây trồng
-
Nhược điểm

- Hạn chế khi sử dụng vỏ bao alginat: chất dinh dƣỡng có thể đi ra khỏi vỏ bao, sự
trao đổi khí kém
- Khả năng sống sót và phát triển của phôi vô tính thấp.
- Để thƣơng mại hóa hạt nhân tạo thì trƣớc tiên đòi hỏi quá trình tạo phôi vô tính
trên các đối tƣợng thực vật đó phải cho ra những phôi phát triển bình thƣờng, có
kiểu hình đồng nhất
- Khả năng tái ính một số loài thực vật từ phôi vô tính và sự thích hợp khí hậu sau
đó của cây còn gặp nhiều khó khăn

- />soma-va-tao-hat-nhan-tao-o-cay-lan-588.html
- />phoi-cay-lan-vanda-va-khao-sat-434.html