PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ ADN

Giảng viên hướng dẫn: TS. Võ Văn Toàn
Giảng viên hướng dẫn: TS. Võ Văn Toàn
Học viên thực hiện: Phùng Tấn Thi
Học viên thực hiện: Phùng Tấn Thi
Lớp: Sinh học thực nghiệm khóa 12
Lớp: Sinh học thực nghiệm khóa 12
Qui Nhơn, tháng 3 năm 2011
Qui Nhơn, tháng 3 năm 2011
TIN SINH HỌC
TIN SINH HỌC


PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ AND
PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ AND
VÀ ỨNG DỤNG TRONG THỰC TẾ
VÀ ỨNG DỤNG TRONG THỰC TẾ

What is bioinformatics?
Tin sinh h c l gì?ọ à
􀂁 Bio: Sinh h c phân t (Molecular ọ ử
Biology)
􀂁 Informatics: Khoa h c tính toánọ
􀂁 Bioinformatics: Gi i quy t các b i toánả ế à
sinh h c b ng vi c s d ng các ph ngọ ằ ệ ử ụ ươ
pháp c a khoa h c tính toán.ủ ọ
Synonyms: Computational
biology,Computational molecular biology,
Biocomputing
NỘI DUNG
NỘI DUNG


NGUYÊN LÝ CỦA CÁC PHƯƠNG PHÁP
NGUYÊN LÝ CỦA CÁC PHƯƠNG PHÁP
PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN
PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN
PHƯƠNG PHÁP SANGER
PHƯƠNG PHÁP SANGER
PHƯƠNG PHÁP MAXAM-GILBERT
PHƯƠNG PHÁP MAXAM-GILBERT

PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN
PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN
TỰ ĐỘNG
TỰ ĐỘNG
HÓA HỌC/ PHẢN ỨNG CHUỖI (DÂY CHUYỀN)
HÓA HỌC/ PHẢN ỨNG CHUỖI (DÂY CHUYỀN)
POLYMERASE
POLYMERASE
THIẾT BỊ
THIẾT BỊ
CÁC PHẦN MỀM/ CÁC CSDL GEN QUỐC TẾ
CÁC PHẦN MỀM/ CÁC CSDL GEN QUỐC TẾ

CÁC ỨNG DỤNG
CÁC ỨNG DỤNG
DNA/RNA
DNA/RNA
CẤU TRÚC PHÂN TỬ CỦA ĐƯỜNG RIBOSE VÀ DEOXYRIBOSE
CẤU TRÚC PHÂN TỬ CỦA ĐƯỜNG RIBOSE VÀ DEOXYRIBOSE
Tr¹ng th¸i tù nhiªn
Tr¹ng th¸i biÕn tÝnh sîi ®¬n

Tr¹ng th¸i l¹i tÝnh
ĐỊNH NGHĨA GIẢI TRÌNH TỰ GEN
ĐỊNH NGHĨA GIẢI TRÌNH TỰ GEN
•
Là phương pháp thực nghiệm để xác định trình tự
nucleotide của một đoạn ADN
•
Xác định chính xác trật tự sắp xếp của các cặp trong một
đoạn ADN
www.accessexcellence.org/AE/AEPC/NIH/gene27.html
•
Phân tích trình tự của các đơn vị mang thông tin di truyền.

www.mwgbiotech.com/html/glossary/glossary_overview.shtm
l

LỊCH SỬ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN
LỊCH SỬ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN

1870 Mischer:
1870 Mischer:
PHÁT MINH DNA
PHÁT MINH DNA

1940 Avery:
1940 Avery:
DNA LÀ “CHẤT LIỆU DI TRUYỀN”
DNA LÀ “CHẤT LIỆU DI TRUYỀN”

1953 Watson & Crick:

1953 Watson & Crick:
CẤU TRÚC XOẮN KÉP CỦA DNA
CẤU TRÚC XOẮN KÉP CỦA DNA

1965 Holley:
1965 Holley:
TRÌNH TỰ CỦA t RNA NẤM MEN
TRÌNH TỰ CỦA t RNA NẤM MEN



1977 Wu:
1977 Wu:
TRÌNH TỰ CỦA ĐẦU DÍNH DNA TRỰC KHUẨN
TRÌNH TỰ CỦA ĐẦU DÍNH DNA TRỰC KHUẨN
λ
λ

1977 Sanger:
1977 Sanger:
PHƯƠNG PHÁP DỪNG CHUỖI BẰNG
PHƯƠNG PHÁP DỪNG CHUỖI BẰNG
DIDEOXY
DIDEOXY


Maxam & Gilbert:
Maxam & Gilbert:
PHƯƠNG PHÁP PHÂN GiẢI HÓA HỌC
PHƯƠNG PHÁP PHÂN GiẢI HÓA HỌC


1980 Messing:
1980 Messing:
CHỌN LỌC DÒNG TRỰC KHUẨN M13
CHỌN LỌC DÒNG TRỰC KHUẨN M13



1986 Hood
1986 Hood
et al
et al
:
:
TỰ ĐỘNG HÓA MỘT PHẦN
TỰ ĐỘNG HÓA MỘT PHẦN

1990
1990
PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ BẰNG CHU TRÌNH NHIỆT
PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ BẰNG CHU TRÌNH NHIỆT
(PCR); CÁC ENZYME ĐƯỢC HOÀN THIỆN ĐỂ ĐỌC TRÌNH
(PCR); CÁC ENZYME ĐƯỢC HOÀN THIỆN ĐỂ ĐỌC TRÌNH
TỰ; CÁC HỆ THỐNG DÒ HUỲNH QUANG ĐƯỢC HOÀN
TỰ; CÁC HỆ THỐNG DÒ HUỲNH QUANG ĐƯỢC HOÀN
THIỆN (ĐỌC QUA ỐNG MAO DẪN)
THIỆN (ĐỌC QUA ỐNG MAO DẪN)

2002
2002

TỰ ĐỘNG HÓA PHÒNG THÍ NGHIỆM
TỰ ĐỘNG HÓA PHÒNG THÍ NGHIỆM
1
15
150
1.500
25.000
50.000
200.000
HIỆU SUẤT
BP/NGƯỜI/NĂM
53.000.000
PHÂN BỐ SỐ LƯỢNG GENOM ĐÃ ĐƯỢC GIẢI
PHÂN BỐ SỐ LƯỢNG GENOM ĐÃ ĐƯỢC GIẢI
TRÌNH TỰ HOÀN TOÀN Ở CÁC SINH VẬT
TRÌNH TỰ HOÀN TOÀN Ở CÁC SINH VẬT
Archea (16)
Archea (16)
Eukarya (20)
Eukarya (20)
Bacteria (139)
Bacteria (139)
Viruses (1500)
Viruses (1500)
NGUYÊN LÝ CỦA CÁC PHƯƠNG PHÁP
NGUYÊN LÝ CỦA CÁC PHƯƠNG PHÁP
PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN
PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN
PHƯƠNG PHÁP SANGER
PHƯƠNG PHÁP SANGER

Frederick (Fred) Sanger
PHƯƠNG PHÁP MAXAM-GILBERT
PHƯƠNG PHÁP MAXAM-GILBERT
Walter Gilbert
Walter Gilbert
PHẢN ỨNG CHUỖI/DÂY CHUYỀN
PHẢN ỨNG CHUỖI/DÂY CHUYỀN
(CỦA/BẰNG/NHỜ/DO) POLYMERASE
(CỦA/BẰNG/NHỜ/DO) POLYMERASE


Polymerase Chain Reaction (PCR)
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Kary Mullis
GIẢI NOBEL VỀ HÓA HỌC, 1993
/>Mullis, K.B. (1990) The unusual origin of the polymerase chain reaction.
Scientific American. 262 (4) 56-65.
devised by Kary Mullis c1983
POLYMERASE CHAIN REACTION - PCR
A 'licence' to do molecular biology
A key central technique that has revolutionised molecular and
consequently cell biology
Schematic illustration of PCR steps
Schematic illustration of PCR steps
Sơ đồ minh họa các buớc PCR
Sơ đồ minh họa các buớc PCR


From:
From:

Recombinant DNA
Recombinant DNA
by Watson,
by Watson,
Gilman, Witkowski & Zoller
Gilman, Witkowski & Zoller
Target Amplification
Target Amplification
MỤC TIÊU KHUẾCH ĐẠI
MỤC TIÊU KHUẾCH ĐẠI
No. of No. Amplicon
Cycles Copies of Target
1 2
2 4
3 8
4 16
5 32
6 64
20 1,048,576
30 1,073,741,824
1 cycle = 2 Amplicon
2 cycle = 4 Amplicon
3 cycle = 8 Amplicon
4 cycle = 16 Amplicon
5 cycle = 32 Amplicon
6 cycle = 64 Amplicon
7 cycle = 128 Amplicon
CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
TRÌNH TỰ GENE

TRÌNH TỰ GENE
1. Phương pháp Maxam-Gilbert (hoá học)
Phương pháp được phát minh đầu tiên nhưng đến
nay ít được sử dụng, chỉ dùng cho
“footprinting”
2. Phương pháp Sanger (enzyme)
Sử dụng DNA polymerase, primer, dNTP và một
lượng nhỏ ddNTP (để kết thúc chuỗi)
5’-
Xử lý bằng hoá
chất cắt đặc
hiệu tại một
base nào đó
4 ống
G-rxn
A>G
-rxn
T>C
-rxn
C-rxn
5’-
5’-
5’-
C
Khi phản ứng kết thúc mỗi sợi chỉ
được cắt 1 lần
ddNTP Reaction Mix
PHƯƠNG PHÁP MAXAM-GILBERT
Sợi đánh dấu (P32)
C

C
Trình tự được đọc trực tiếp
autoradiograph of dried
sequencing gel
C T A G
3’
G
C
A
T
T
C
C
A
T
A
G
G
5’
D a v o s th y phân c tr ng phân t DNA c n ự à ự ủ đặ ư ử ầ
xác nh trình t b ng ph ng pháp hóa h c.đị ự ằ ươ ọ
- Tr c h t DNA c ánh d u b ng P32 m t u. ướ ế đượ đ ấ ằ ở ộ đầ
- Sau ó, chúng c chia th nh đ đượ à n m phân o n, ă đ ạ
m i phân o n c x lí v i ỗ đ ạ đượ ử ớ m t ch t hóa h c ộ ấ ọ
chuyên bi t (có kh n ng bi n i c hi u 1 lo i ệ ả ă ế đổ đặ ệ ạ
nucleotide) → phân c t DNA ngay t i v trí có ắ ạ ị
nucleotide b bi n i.ị ế đổ
K t qu :ế ả
K t qu :ế ả t o ra 5 t p h p, m i t p h p l các ạ ậ ợ ỗ ậ ợ à
oligonuclotide có kích th c khác nhau nh ng ướ ư

u k t thúc t i cùng m t lo i nucleotide.đề ế ạ ộ ạ
Ti n h nh i n di trên gel polyacrilamide, v trí các ế à đệ ị
oligonucleotide t ng ng v i kích th c c a ươ ứ ớ ướ ủ
chúng.
Hóa ch t ấ Base b nh h ngị ả ưở
Dimethyl sulfate pH 8 G
Piperidine formate pH 2 A+G
Hydrazine A+T
Hydrazine + 1,5 M NaCl C
Nhi t đ cao (900C), 1,2 M ệ ộ
NaOH
A>C
Các hóa ch t s d ng trong x lí các ấ ử ụ ử
base chuyên bi tệ
5’-
DNA
Polymerase
+dNTPs
+ one of:
primer
4 tubes
ddCTP
ddTTP
ddATP
ddGTP
5’-
5’-
5’-
C
C

C
In the ddGTP reaction there is a
random chance a ddGTP will be
incorporated across from a C
C T A G
ddNTP Reaction Mix
5’
C
G
T
A
A
G
G
T
A
T
C
C
3’
PHƯƠNG PHÁP
PHƯƠNG PHÁP


SANGER
SANGER
End labeled
Sequence is complementary
to the strand (sự đứng) being sequenced!
autoradiograph of dried

sequencing gel
D a v o s t ng h p nh enzyme DNA ự à ự ổ ợ ờ
polymerase m ch b sung cho trình t DNA ạ ổ ự
m ch n c n xac nh trình t .ạ đơ ầ đị ự
S d ng 4 lo i nucleotide thông th ng + 4 ử ụ ạ ườ
dideoxynucleotide.
Dideoxynucleotide l deoxynucleotide, à
nhóm 3 OH c thay th b ng H2’ đượ ế ằ
Khi các Dideoxynucleotide b t c p b sung ắ ặ ổ
v i nucleotide t ng ng trên m ch g c thì ớ ươ ứ ạ ố
ph n ng t ng h p ng ng l i do không t o ả ứ ổ ợ ừ ạ ạ
c liên k t phosphodister.đượ ế
DNA Sequencing sau khi t¹o dßng
DNA Sequencing sau khi t¹o dßng
ph©n tö
ph©n tö
Plasmid (or phage)
with cloned DNA
fragment
Primer Binding sites
Cloned
fragment
Primer
Dideoxy-Nucleotides
Dideoxy-Nucleotides
O
(P)-(P)-(P)-
H
Base
dNTP ddNTP

O
(P)-(P)-(P)-
H
H
Base
If a ddNTP is added to
a growing DNA chain,
the sequence is
terminated, because
another base can not
be added
OH
H
P
O
OH
OH
HO
O
O
CH
2
NH
2
N
N
N
N
Sugar
Base

Phosphate
3’
5’
2’
1’4’
Dideoxynucleotides
Dideoxynucleotides

DNA Sequencing using the Sanger
DNA Sequencing using the Sanger
method involves the use of 2’3’-
method involves the use of 2’3’-
dideoxynucleotide triphosphates in
dideoxynucleotide triphosphates in
addition to regular 2’-
addition to regular 2’-
deoxynucleotide triphosphates
deoxynucleotide triphosphates

Because 2’3’-dideoxynucleotide
Because 2’3’-dideoxynucleotide
triphosphates lack a 3’ hydroxyl
triphosphates lack a 3’ hydroxyl
group, and DNA polymerization
group, and DNA polymerization
occurs only in the 3’ direction,
occurs only in the 3’ direction,
once 2’3’-dideoxynucleotide
once 2’3’-dideoxynucleotide
triphosphates are incorporated (lk

triphosphates are incorporated (lk
chặt), primer extension stops
chặt), primer extension stops
H
2’3’-dideoxynucleotide
monophosphate
2’-
dideoxynucleotide
monophosphate
S
U
G
A
R
-
P
H
O
S
P
H
A
T
E

B
A
C
K
B

O
N
E
H
P
O
HO
O
O
CH
2
HOH
P
O
O
HO
O
O
CH
2
H
P
O
OH
HO
O
O
CH
2
NH

2
N
N
N
N
O
O
NH
2
N
NH
N
N
N
O
NH
2
N
B



A



S

E



S
2 3’ ’
2 3’ ’
dideoxy-
dideoxy-
nucleotides
nucleotides
Terminate
Terminate
DNA
DNA
Replicaton
Replicaton
(gi i h n sao ớ ạ
(gi i h n sao ớ ạ
b n AND)ả
b n AND)ả
O
H
P
O
HO
O
O
CH
2

HO
O
H
2
N
N
H
N
N
N
H
H OH
P
O
OH
O
O
CH
2
C
H
3
O
O
H
N
N
OH
H
P

HO
O
O
CH
2
H
O
N
O
H
2
N
N
H
2
O
2
’
3
’
d
i
d
e
o
x
y
n
u
c

l
e
o
t
i
d
e