BÁO CÁO THỰC TẬP-Công nghệ sản xuất Vắc-xin ăn được

Tiểu luận Công nghệ sinh học GVHD: PGS-TS. Nguyễn Bá Lộc
MỞ ĐẦU
Tiêm chủng là một trong những trang bị tối cần thiết để một đứa trẻ lớn lên an toàn
và khoẻ mạnh, tuy nhiên bất kỳ một đứa trẻ nào, (và ngay những trẻ đã lớn) đều rất “sợ”
chỉ cần nghĩ đến việc phải tiêm thuốc. Vì đường tiêm thường gây cảm giác đau cho người
sử dụng, cộng thêm số lượng virút gây bệnh nguy hiểm ngày càng nhiều kéo theo số
lượng mũi tiêm cũng tăng lên và mỗi lần tiêm vào mỗi chỗ khác nhau của cơ thể . Chưa
kể đến việc bảo quản, vận chuyển với điều kiện nghiêm ngặt đối với các Vắc-xin. Giải
quyết hết tất cả những vấn đề này các nhà khoa học của chúng ta đã tạo ra một cái gọi là
“Vắc-xin ăn”. Nó có thể dùng thay thế cho việc tiêm nhưng hiệu quả miễn dịch vẫn được
đảm bảo.
Ở nước ta, Vắc-xin ăn có lẻ là một cụm từ khá mới mẻ nhưng đối với các nước phát
triển trên thế giới thì nó không có gì xa lạ, bởi từ những năm đầu thập niên 90 người ta đã
tạo thành công những “cây Vắc-xin ăn” đầu tiên.
Tuy nhiên cho đến nay việc Nghiên cứu và phát triển Vắc-xin ăn vẫn còn đang là
một phương hướng nghiên cứu rất mới của công nghệ sinh học, đặc biệt là ở những nước
đang phát triển và những nước nghèo, nơi mà vấn đề miễn dịch thường là mối quan tâm
lớn.
Nghiên cứu và phát triển Vắc-xin ăn cần sự kết hợp đồng thời giữa lĩnh vực miễn
dịch học và thực vật học. Do vậy việc nghiên cứu, phát triển và thử nghiệm Vắc-xin ăn
thông qua cây trồng chuyển gen vẫn còn nhiều hạn chế, tuy nhiên cũng đã thu được
những nhiều thành tựu to lớn.
Qua bài tiểu luận này tôi muốn cung cấp thêm một số thông tin cơ bản về lĩnh vực
mới này, nhằm giúp những người quan tâm có thể tham khảo thêm. Chính vì vậy tôi chọn
đề tài “Công nghệ sản xuất Vắc-xin ăn được” nhằm đáp ứng những nhu cầu trên.
HV: Võ Quang Trung – TVH K20
1
Tiểu luận Công nghệ sinh học GVHD: PGS-TS. Nguyễn Bá Lộc
NỘI DUNG
I. ĐỊNH NGHĨA
1. Vắc-xin

Vắc-xin là chế phẩm có tính kháng nguyên dùng để tạo miễn dịch đặc hiệu chủ
động, nhằm tăng sức đề kháng của cơ thể đối với một (số) tác nhân gây bệnh cụ thể. Các
nghiên cứu mới còn mở ra hướng dùng vắc-xin để điều trị một số bệnh (vắc-xin liệu
pháp, một hướng trong các miễn dịch liệu pháp). Thuật ngữ vắc-xin xuất phát
từ vaccinia, loại virus gây bệnh đậu bò nhưng khi đem chủng cho người lại giúp ngừa
được bệnh đậu mùa (tiếng Latinh vacca nghĩa là "con bò cái"). Việc dùng vắc-xin để
phòng bệnh gọi chung là chủng ngừa hay tiêm phòng hoặc tiêm chủng, mặc dù vắc-xin
không những được cấy (chủng), tiêm mà còn có thể được đưa vào cơ thể qua đường
miệng.
* Cơ chế hoạt động của vắc-xin
Hệ miễn dịch nhận diện vắc-xin là vật lạ nên hủy diệt chúng và "ghi nhớ" chúng. Về
sau, khi tác nhân gây bệnh thực thụ xâm nhập cơ thể, hệ miễn dịch đã ở tư thế sẵn sàng
để tấn công tác nhân gây bệnh nhanh chóng hơn và hữu hiệu hơn (bằng cách huy động
nhiều thành phần của hệ miễn dịch, đặc biệt là đánh thức các tế bào lympho nhớ). Đây
chính là các ưu điểm của đáp ứng miễn dịch đặc hiệu.
* Các loại vắc-xin
Vắc-xin có thể là các virus hoặc vi khuẩn sống, giảm độc lực, khi đưa vào cơ thể
không gây bệnh hoặc gây bệnh rất nhẹ. Vắc-xin cũng có thể là các vi sinh vật bị bất hoạt,
chết hoặc chỉ là những sản phẩm tinh chế từ vi sinh vật.
* Ba loại vắc-xin kinh điển
Nuôi cấy virus cúm (chủng gây đại dịch năm 1918) phục vụ nghiên cứu và sản xuất
vắc-xin:
- Vắc-xin bất hoạt là các vi sinh vật độc hại bị giết bằng hóa chất hoặc bằng nhiệt.
Thí dụ: các vắc-xin chống cúm, tả, dịch hạch và viêm gan siêu vi A. Hầu hết các vắc-xin
loại này chỉ gây đáp ứng miễn dịch không hoàn toàn và ngắn hạn, cần phải tiêm nhắc
nhiều lần.
- Vắc-xin sống, giảm độc lực là các vi sinh vật được nuôi cấy dưới những điều kiện
đặc biệt nhằm làm giảm đặc tính độc hại của chúng. Vắc-xin điển hình loại này thường
gây được đáp ứng miễn dịch dài hạn và là loại vắc-xin được ưa chuộng dành cho người
HV: Võ Quang Trung – TVH K20

2
Tiểu luận Công nghệ sinh học GVHD: PGS-TS. Nguyễn Bá Lộc
lớn khỏe mạnh. Các vắc-xin ngừa bệnh sốt vàng, sởi, bệnh ban đào và quai bị đều thuộc
loại này.
Các "toxoid" là các hợp chất độc bị bất hoạt trích từ các vi sinh vật (trong trường
hợp chính các độc chất này là phương tiện gây bệnh của vi sinh vật). Thí dụ: các vắc-xin
ngừa uốn ván và bạch hầu.
- Vắc-xin sống ngừa bệnh lao không phải là dòng vi khuẩn lao gây bệnh, mà là một
dòng lân cận được gọi là BCG.
* Một số loại vắc-xin mới đang nghiên cứu
Các vắc-xin này còn được xem là vắc-xin của tương lai, có 6 hướng phát triển chính
hiện nay:
- Sử dụng các phụ gia (adjuvant) mới, nhằm gây ra loại đáp ứng miễn dịch mong
muốn. Thí dụ, chất nhôm phosphate và các oligonucleotide chứa CpG demethyl hóa đưa
vào vắc-xin khiến đáp ứng miễn dịch phát triển theo hướng dịch thể (tạo kháng thể) thay
vì tế bào.
- Vắc-xin khảm: sử dụng một sinh thể quen biết để hạn chế hiện tượng "phản tác
dụng", thí dụ dùng virus vaccinia mang một số yếu tố của virus viêm gan B hay virus dại.
- Vắc-xin polypeptidique: tăng cường tính sinh miễn dịch nhờ liên kết tốt hơn với
các phân tử MHC: peptide nhân tạo 1/2 giống virus, 1/2 kia gắn MHC; đoạn peptide mô
phỏng 1 quyết định kháng nguyên (epitope).
- Anti-idiotype: idiotype là cấu trúc không gian của kháng thể tại vị trí gắn kháng
nguyên, đặc hiệu với kháng nguyên tương ứng. Anti-idiotype là các kháng thể đặc hiệu
đối với idiotype, do đó anti-idiotype xét về mặt đặc hiệu lại tương tự với kháng nguyên.
Vậy, thay vì dùng kháng nguyên X làm vắc-xin, người ta dùng idiotype anti-anti-X.
- Vắc-xin DNA: DNA của tác nhân gây bệnh sẽ được biểu hiện bởi tế bào người
được chủng ngừa. Lợi thế của DNA là rẻ, bền, dễ sản xuất ra số lượng lớn nên thích hợp
cho những chương trình tiêm chủng rộng rãi. Ngoài ra, vắc-xin DNA còn giúp định
hướng đáp ứng miễn dịch: tác nhân gây bệnh ngoại bào được trình diện qua MHC loại II,
dẫn đến đáp ứng CD4 (dịch thể và tế bào). Khi kháng nguyên của tác nhân đó được chính

cơ thể người biểu hiện, nó sẽ được trình diện qua MHC loại I, lúc này đáp ứng miễn dịch
tế bào qua CD8 được kích thích. Tuy nhiên phương pháp này là con dao hai lưỡi bởi lẽ tế
bào mang DNA lạ có nguy cơ bị nhận diện là "không ta", sinh ra bệnh tự miễn.
- Sử dụng véc-tơ tái tổ hợp – dùng các vi khuẩn thuần tính hoặc các tế bào trình diện
HV: Võ Quang Trung – TVH K20
3
Tiểu luận Công nghệ sinh học GVHD: PGS-TS. Nguyễn Bá Lộc
kháng nguyên như tế bào tua được chuyển gen để biểu hiện kháng nguyên mong muốn.
* Vắc-xin dùng để điều trị
Một trong những hướng nghiên cứu mới là miễn dịch liệu pháp, bao gồm miễn dịch
liệu pháp thụ động và chủ động (tức vắc-xin liệu pháp). Người ta hy vọng là phương
pháp này sẽ chữa được những bệnh như ung thư, AIDS và bệnh Alzheimer.
* Hạn chế của vắc-xin
Những hạn chế của vắc-xin tập trung thành hai nhóm chính: hiệu quả kém và các tai
biến đi kèm.
* Hạn chế về hiệu quả
- Một số vắc-xin rất có hiệu quả, không kể vắc-xin đậu mùa nổi tiếng, thí dụ vắc-xin
ngừa bệnh uốn ván, sởi v.v. Một số vắc-xin khác có hiệu quả vừa phải (hiệu quả
của BCG chỉ vào khoảng 50%). Ngược lại, có những bệnh đến đầu thế kỷ 21 vẫn chưa có
vắc-xin thích hợp (AIDS, sốt rét v.v.). Do vậy, vắc-xin chưa phải là vũ khí vạn năng để
đối phó với bệnh tật.
- Hiệu quả của vắc-xin cũng khó đánh giá chính xác. Kết quả nghiên cứu trên động
vật không thể áp dụng 100% cho loài người, vì những đặc điểm riêng của từng loài. Trên
lý thuyết, phương pháp duy nhất để chứng minh hiệu quả là lấy 2 nhóm người, một nhóm
được tiêm chủng, một nhóm không rồi truyền mầm bệnh cho cả hai nhóm để xem kết
quả. Dĩ nhiên phương pháp này không thể sử dụng được vì trái đạo đức. Do đó, người ta
biến hóa đi một chút, cũng chia ra 2 nhóm được chủng và không được chủng như trên
nhưng không truyền bệnh mà chỉ quan sát sự nhiễm bệnh qua các ngã thông thường. Hạn
chế của phương pháp này là nếu một vắc-xin tỏ ra có hiệu quả, người ta không thể triển
khai nghiên cứu trên quy mô rộng để tính chính xác hiệu quả vì như thế một số lớn quần

chúng sẽ bị thiệt thòi do không được bảo vệ.
Bởi vậy, khi một vắc-xin được xem là có hiệu quả, người ta đem tiêm chủng cho
mọi người và quan sát sự giảm số người mắc bệnh. Tuy nhiên, ngay cả khi một bệnh có
chiều hướng giảm xuống, người ta cũng không biết vai trò thật sự của vắc-xin, thí dụ tần
suất bệnh lao đã giảm rất nhiều, nhưng vai trò của các biện pháp vệ sinh, cách ly nguồn
lây cũng rất đáng kể. (Để hiểu rõ hơn cách đánh giá hiệu quả, xem thêm bài khoa học
thống kê.)
Tính kém hiệu quả của vắc-xin có thể biểu hiện về mặt chất (đáp ứng miễn
dịch không thích hợp) hoặc về mặt lượng (không có đáp ứng miễn dịch).
HV: Võ Quang Trung – TVH K20
4
Tiểu luận Công nghệ sinh học GVHD: PGS-TS. Nguyễn Bá Lộc
* Nguyên nhân gây kém hiệu quả về lượng:
Các "lỗ hổng" trong kho tàng miễn dịch: trên lý thuyết, các tế bào lympho B có thể
tạo ra hơn 1012 loại kháng thể đặc hiệu [1], còn lympho T có thể nhận diện trên
1015 kháng nguyên khác nhau , những con số này tuy rất lớn nhưng không phải là vô
hạn, hệ miễn dịch không thể chống lại mọi thứ.
Hiệu quả của vắc-xin còn tùy thuộc vào thời gian bảo vệ: trí nhớ miễn dịch có thể
tồn tại suốt đời nhưng sự sản xuất kháng thể thì không nếu không được tái kích thích.
Đột biến của tác nhân gây bệnh: đây là cơ chế sinh tồn của các tác nhân gây bệnh.
Đột biến đẩy hệ miễn dịch vào một cuộc rượt đuổi trường kỳ. Tiêu biểu cho cơ chế này
là HIV, virus sốt xuất huyết, virus cúm với nguy cơ đại dịch cúm gia cầm hiện nay.
* Nguyên nhân gây kém hiệu quả về chất:
Vai trò của phụ gia: để giảm tác dụng không mong muốn của vắc-xin, người ta
thường tinh lọc các chế phẩm, nhưng có những vắc-xin quá tinh khiết lại trở nên kém
hiệu quả. Đó là do hệ miễn dịch muốn được kích hoạt, phải nhận được một tín hiệu báo
nguy, tín hiệu này thường không phải là kháng nguyên dùng làm vắc-xin. Để khắc phục,
người ta dùng một số loại phụ gia trong chế phẩm vắc-xin. Thí dụ phụ gia Freund, nhôm
hyđrôxít, nhôm phosphate hoặc trộn lẫn các văc-xin với nhau.
Loại phản ứng miễn dịch và hiện tượng chuyển hướng miễn dịch: đối với các tác

nhân gây bệnh ngoại bào, đáp ứng miễn dịch dịch thể là thích hợp (loại đáp ứng này được
sự hỗ trợ của các tế bào lympho Th1). Ngược lại, đáp ứng miễn dịch tế bào (cần sự hỗ trợ
của lympho Th2) lại hữu hiệu cho các tác nhân gây bệnh nội bào. Do đó, nếu vắc-xin gây
được đáp ứng miễn dịch nhưng không đúng loại đáp ứng nên có, hiệu quả cũng không
được bảo đảm. Th1 và Th2 có xu hướng khắc chế lẫn nhau. Vắc-xin kinh điển có xu
hướng tạo đáp ứng Th1. Do đó đối với những bệnh do tác nhân nội bào như
nhiễm leishmania, miễn dịch đặc hiệu sau lành bệnh lại tốt hơn vắc-xin, vì vắc-xin lại gây
hiệu quả ngược, kiềm hãm phản ứng bảo vệ.
* Tai biến khi dùng vắc-xin
Có hai loại tai biến: nhiễm bệnh và các bệnh miễn dịch.
Nhiễm bệnh
Vắc-xin sống, giảm độc lực có thể gây bệnh cho người bị suy giảm miễn dịch.
Nguy cơ hồi phục của tác nhân vi sinh: một tác nhân bị làm giảm độc lực tìm lại
được độc tính của mình. Nguy cơ này ở vắc-xin ngừa bại liệt là 10-7, nghĩa là cứ 10 triệu
HV: Võ Quang Trung – TVH K20
5
Tiểu luận Công nghệ sinh học GVHD: PGS-TS. Nguyễn Bá Lộc
trẻ em uống vắc-xin Sabin thì có 1 em bị tai nạn loại này. Điều không may này không
ngăn cản được việc sử dụng vắc-xin này bởi lẽ tỷ lệ đó được xem là chấp nhận được.
Nguy cơ nhiễm các tác nhân gây bệnh khác vào trong chế phẩm vắc-xin. Điều này
có thể hạn chế bằng các quy trình sản xuất, bảo quản và sử dụng chặt chẽ.
Bệnh miễn dịch
Thử nghiệm vắc-xin phòng bệnh dại trên cừu cho thấy có xác suất gây EAE, một
bệnh tự miễn trên hệ thần kinh khoảng 1/3000-1/1000.Lý do có thể là vắc-xin chiết xuất
từ não chó đã mang theo cả những mẩu protein của tế bào thần kinh, khi tạo miễn dịch,
cơ thể (được tiêm)đã tạo ra cả kháng thể chống lại cấu trúc thần kinh của mình.
Vắc-xin ngừa ho gà có thể gây sốc kèm di chứng thần kinh với xác suất 10-4-10-6.
Việc tinh lọc vắc-xin này làm tăng mức an toàn nhưng một lần nữa, giảm hiệu quả.
* Chủng ngừa
- Chủng ngừa là cho vắc-xin tiếp xúc với hệ miễn dịch. Tùy bản chất ký sinh, bệnh

sinh của tác nhân gây bệnh cũng như của chế phẩm vắc-xin mà người ta dùng các
phương pháp khác nhau nhằm đạt hiệu quả cao nhất.
- Chủng là cách tạo một vết rạch trên da (cho rớm máu) rồi cho tiếp xúc với vắc-xin.
Phương pháp này trước đây được dùng cho vắc-xin đậu mùa và lao.
- Tiêm dưới da, trong da v.v. là phương pháp phổ thông nhất hiện nay, kể cả vắc-xin
BCG phòng lao. Không được tiêm vào mạch máu.
- Uống vắc-xin là phương pháp dùng cho vắc-xin Sabin ngừa bệnh bại liệt.
* Đánh giá hiệu quả và theo dõi
Trong một số trường hợp, thí dụ sau khi tiêm vắc-xin ngừa viêm gan siêu vi B,
người ta còn làm xét nghiệm huyết thanh tìm hiệu giá kháng thể qua đó đánh giá hiệu quả
của vắc-xin trên cơ thể người được tiêm (có tạo được đáp ứng miễn dịch hữu hiệu
không).
* Triển khai
Tổ chức Sức khỏe Thế giới (WHO) đã hỗ trợ nhiều chương trình tiêm chủng mở
rộng trên phạm vi toàn cầu trong kế hoạch chăm sóc sức khỏe ban đầu. Trong khuôn khổ
các chương trình này, người ta đã đề xuất các lịch tiêm chủng đối với một số bệnh truyền
nhiễm nguy hiểm thường gặp.
Một trong những mục tiêu của y sinh học hiện nay là đẩy mạnh nghiên cứu nhằm
tìm ra các vắc-xin mới, hiệu quả với giá thành phù hợp cho mục tiêu phổ cập cho mọi
HV: Võ Quang Trung – TVH K20
6
Tiểu luận Công nghệ sinh học GVHD: PGS-TS. Nguyễn Bá Lộc
người, nhất là đối với những bệnh gây chết người nhiều như sốt rét hay những bệnh nan y
như ung thư, AIDS.
Hiện nay, Việt Nam đã sản xuất được 9/10 vaccine phục vụ chương trình tiêm
chủng mở rộng và được UNICEF công nhận là quốc gia thứ hai thanh toán xong bệnh bại
liệt. Nhưng ở nước ta, vaccine ăn được vẫn là vấn đề khá mới mẻ và chưa có tài liệu nào
đề cập sâu về loại vaccine này. Bên cạnh đó, cùng với sự phát triển của công nghệ sinh
học thực vật trên thế giới, các nhà khoa học Việt Nam đã đạt được nhiều thành công
trong việc nâng cao giá trị và phẩm chất cây bằng nhiều phương pháp khác nhau như

chuyển gen Bt kháng sâu vào bông, gen kháng đạo ôn vào lúa Tuy nhiên, chưa có báo
cáo nào về nghiên cứu sản xuất kháng nguyên trong thực vật, nhất là cây ăn được.
2. Vắc-xin ăn được
Vắc-xin ăn được còn là Vắc-xin tiểu phần bao gồm một hoặc nhiều chuổi polypeptit
của protein kháng nguyên trong vi sinh vật gây bệnh. Người ta chọn lọc những gen mã
hoá cho các thành phần này, đưa vào vectơ, dựa vào hệ thống di truyền thực vật để
khuyếch đại gen và biểu hiện thành công kháng nguyên protein mong muốn trong các bộ
phận ăn được của thực vật, loại văccine này được cơ thể chấp nhận và nó bền vững trong
dịch tiêu hoá đi qua đường tiêu hoá mà không bị phân huỷ.
Vắc-xin ăn được có hoạt tính tương tự như Vắc-xin thông thưòng, chỉ khác là Vắc-
xin này được thực vật sản xuất trong những phần ăn được như lá, củ, quả, hạt. Nổ lực sản
xuất Vắc-xin đầu tiên từ thực vật được ghi nhận vào năm 1990 khi công trình nghiên cứu
biểu hiện protein kháng nguyên bề mặt A của vi khuẩn Streptococus mutans ở cây thuốc
lá.
II. CƠ SỞ KHOA HỌC
Với các tiến bộ khoa học hiện nay trong việc tạo cây trồng chuyển gen cho phép tạo
cây trồng chuyển gen có chứa Vắc-xin ăn được với các bước:
- Chọn lựa và nhân bản đoạn gen kháng nguyên của vi khuẩn và vi rút gây bệnh.
- Thử nghiệm thành công các vectơ biểu hiện gen tái tổ hợp.
- Chuyển thành công gen kháng nguyên vào nhiều loài đối tượng thực vật.
- Gia tăng tốc độ và khối lượng protein tái tổ hợp được được sản sinh trong cây
trồng .
Vắc-xin ăn được có những ưu điểm nổi trội:
- Dể dàng tăng qui mô sản xuất và dể thu sinh khối.
HV: Võ Quang Trung – TVH K20
7
Tiểu luận Công nghệ sinh học GVHD: PGS-TS. Nguyễn Bá Lộc
- Tính ổn định cao,dễ bảo quản và sử dụng
Các kháng nguyên biểu hiện trong thực vật ổn định ngay ở nhiệt độ phòng do chúng
được sản xuất và được bao bọc bởi các mô thực vật mà cụ thể là chúng được định vị

trong lưới nội chất, thể Golgi hoặc bề mặt tế bào. Nhờ tính ổn định này mà chúng trở nên
dể dàng bảo quản và sử dụng (ngay trong thực vật) mà không cần giữ lạnh như các Vắc-
xin tiêm. Trong quá trình sản xuất Vắc-xin ăn được người ta chỉ cần vận chuyển và sử
dụng ngay bộ phận thực vật chứa Vắc-xin đó
 Tính ăn được:
Loại Vắc-xin trong thực vật này được chính mô trong thực vật bao bọc, hạn
chế được sự phân huỷ của dịch tiêu hoá ở đường ruột và ổn định, bền vững trong cơ thể
nên Vắc-xin này có thể ăn tươi (quả, lá) hoặc nấu chín (hạt, củ). Nhiều nghiên cứu cho
thấy nhiều kháng nguyên Vắc-xin được biểu hiện hiệu quả ở rau diếp cá (lá), khoai tây
(củ), cà chua (quả) và ngô (hạt).
 Tính An toàn:
Vì Vắc-xin được sản xuất trong thực vật là Vắc-xin dưới đơn vị sử dụng gen mã hoá
cho một phần protein vỏ virus mà không cần đến virus sống như Vắc-xin giảm độc lực
hay virus chết như Vắc-xin bất hoạt. Do đó Vắc-xin này không trở lại thành virus gây
bệnh cho người và động vật, đồng thời nó cũng tránh được nguy cơ nhiễm mầm bệnh
tiềm tàng từ Vắc-xin. Do đó, không cần tách chiết và tinh sạch kháng nguyên Vắc-xin
 Vắc-xin ăn được kích thích sản xuất kháng thể của hệ thống miễn dịch hiệu
quả hơn Vắc-xin tiêm
Ta biết rằng hầu hết các vi sinh vật gây bệnh đều xâm nhập vào cơ thể qua bề mặt
nhầy trong đường tiêu hoá, hô hấp và đường tiết niệu. Khi Vắc-xin ăn vào cơ thể theo
đường miệng nó sẽ cảm ứng hệ thống miển dịch thể dịch sản xuất các kháng thể chống
lại vi sinh vật gây bệnh, tiếp đó hệ thống thể dịch lại tác động vào hệ thống miển dịch của
tế bào, tạo ra các globulin miển dịch tăng cường khả năng bảo vệ sớm và hiệu quả cho cơ
thể. Khi tiêu hoá Vắc-xin ăn được, kháng nguyên được giải phong trong ruột non.
Những nghiên cứu bảo vệ kháng nguyên làm Vắc-xin ăn được trước tác động của
dịch tiêu hoá, đặc biệt của cơ thể con người khẳng định giá trị thực tiễn của Vắc-xin ăn
được sản xuất nhờ thực vật chuyển gen
Với những ưu điểm nỗi bật của Vắc-xin ăn thì việc sản xuất Vắc-xin ăn đuợc xem là
hệ thống sản xuất Vắc-xin lý tưởng đơn giản và giá thành thấp đã thành công và được
HV: Võ Quang Trung – TVH K20

8
Tiểu luận Công nghệ sinh học GVHD: PGS-TS. Nguyễn Bá Lộc
đăng kí bảo hộ sáng chế. Sau đó nhiều thành công khác về Vắc-xin thực vật cũng đựoc
công bố trên nhiều loài cây khác nhau như thuốc lá, rau diếp, cà chua, khoai tây…Số
lượng nghiên cứu về Vắc-xin ăn được đựơc gia tăng đã chứng tỏ tính ưu việt của thực vật
như một hệ thống biểu hiện hiệu quả cao, chi phí sản xuất thấp, an toàn về mặt sinh học,
sử dụng và bảo quản dể dàng không cần giữ lạnh
III. NGUYÊN LÝ SẢN XUẤT VắC-XIN ĂN ĐƯỢC
Quy trình sản xuất vaccie ăn được:
- Lựa chọn gen cần được biểu hiện (gen quan tâm) và đưa vào một vector thích hợp.
- Lựa chọn đối tượng thực vật thích hợp để chuyển gen;
- Chuyển vector tái tổ hợp mang gen quan tâm vào thực vật đã lựa chọn bằng các
phương pháp chuyển gen khác nhau;
- Kiểm tra biểu hiện của gen quan tâm trong những bộ phận ăn được của thực vật;
- Thử nghiệm khả năng đáp ứng miễn dịch của Vắc-xin sản xuất từ thực vật;
- Sử dụng Vắc-xin đã thử nghiệm thành công bằng cách ăn tươi dưới dạng thức ăn
đã chế biến.
HV: Võ Quang Trung – TVH K20
Gen lấy từ nguồn bệnh người được
chuyển vào vi khuẩn gây nhiễm thực vật
Vi khuẩn được nhiễm vào các
mẫu lá khoai tây
mầm tạo đựoc từ các mẫu lá
mang gen bệnh người
Khi ăn khoai
tây gây ra
phản ứng miễn
dịch mầm
bệnh
9

Hình 1: Quy trình sản
xuất vaccine ăn được
Tiểu luận Công nghệ sinh học GVHD: PGS-TS. Nguyễn Bá Lộc
Thiết kế vector biểu hiện
Điểm quan trọng nhất trong thiết kế
vector biểu hiện là promoter, đây phải là
promoter khoẻ, có ái lực mạnh với RNA-
polymerase của vật chủ và hoạt động của
promoter được điều hoà một cách dễ dàng.
Trong nhiều nghiên cứu gần đây, với mục
đích biểu hiện kháng nguyên Vắc-xin trong
các bộ phận ăn được của thực vật, người ta đã
thiết kế promoter đặc hiệu mô thực vật, ví dụ
promoter đặc hiệu mô củ hoặc mô hạt thì
protein sẽ được sản xuất trong củ hoặc hạt.
Hình 1.1 :Tạo thực vật chuyển gen bằng phương pháp
chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium
HV: Võ Quang Trung – TVH K20
10
Tiểu luận Công nghệ sinh học GVHD: PGS-TS. Nguyễn Bá Lộc
IV. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN VÀO THỰC VẬT
Các phương pháp biểu hiện gen dựa trên thực vật đã được phát triển từ cuối những
năm 1970 đầu 1980. Hiện nay, có thể xếp những phương pháp này vào hai nhóm chính
sau: Chuyển gen ổn định tức là gen quan tâm được bảo tồn qua nhiều thế hệ do gắn vào
hệ gen vật chủ (chuyển gen vào nhân hoặc plastid) và biểu hiện gen tạm thời dựa trên
Agrobacterium và vector virus thực vật, theo nguyên tắc có thể sử dụng bất kỳ phương
pháp chuyển gen vào thực vật nào cũng có thể tạo ra thực vật chứa Vắc-xin ăn được, tuy
nhiên hiện nay người ta chỉ mới tạo thành công Vắc-xin ăn nhờ súng bắn gen và nhờ vi
khuẩn Agrobacterium.
1. Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium

Cây chuyển gen đầu tiên đã được tạo ra năm 1983 sử dụng vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens. Đây là loại vi khuẩn sống trong đất, gây bệnh cho cây bằng cách gắn các
đoạn gen vào hệ gen của tế bào chủ và sinh ra u nhờ một loại plasmid của vi khuẩn này,
plasmid Ti. Người ta đã lợi dụng đặc điểm của vi khuẩn Agrobacterium để chuyển gen
mong muốn vào thực vật, trong đó plasmid Ti bị bất hoạt, nó chỉ còn khả năng gắn DNA
vào tế bào và mất khả năng gây bệnh.
Trong sản xuất Vắc-xin ăn được, người ta thiết kế một vector gồm hai gen: Một gen
mã hoá cho kháng nguyên virus và một gen kháng kháng sinh. Do đó, trong môi trường
có kháng sinh, những tế bào thực vật không mang gen chuyển sẽ bị chết, trái lại tế bào
mang gen sẽ hình thành callus, từ đó tạo thành cây hoàn chỉnh.
Phương pháp này có một số bất lợi: plasmid Ti gắn gen ngẫu nhiên vào hệ gen thực
vật, làm tăng tính không đồng đều về mức độ biểu hiện kháng nguyên trong cây chuyển
gen. Ngoài ra cách gắn gen này có thể phá vỡ biểu hiện gen dẫn đến sinh trưởng bất
thường của cây chuyển gen.
Mặc dù hệ thống chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium là có hiệu quả đối với
một số loài nhưng không phải tất cả thực vật có thể được biến nạp bằng con đường này.
Ðặc biệt, lớp một lá mầm bao gồm các cây ngũ cốc chính trên thế giới như lúa, lúa mì và
ngô là không được biến nạp dễ dàng nhờ A. tumefaciens.
Ðể khai thác và sử dụng A. tumefaciens như là một vector chuyển gen các nhà khoa
học đã loại bỏ các gen gây khối u và gen mã hoá opine của T - DNA và thay thế vào đó là
các marker chọn lọc, trong khi vẫn duy trì các vùng bờ phải và bờ trái của T-DNA và các
gen vir. Gen chuyển được xen vào giữa các vùng bờ của T-DNA. Nó sẽ được chuyển vào
HV: Võ Quang Trung – TVH K20
11
Tiểu luận Công nghệ sinh học GVHD: PGS-TS. Nguyễn Bá Lộc
tế bào và trở nên hợp nhất với nhiễm sắc thể tế bào thực vật.
Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium đã được kiểm tra đối với sự
xâm nhập bền vững, sự biểu hiện và sự di truyền của các gen chuyển đặc biệt.
Tuy nhiên, một vài yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp là loại mô được biến
nạp, giai đoạn phát triển của mô, mức độ khởi đầu của vi khuẩn A. tumefaciens sử dụng,

môi trường để nuôi cấy mô sau khi biến nạp, marker được sử dụng để chọn lọc thể biến
nạp, loại vector sử dụng và kiểu gen của thực vật.
2. Chuyển gen ổn định:
 Chuyển gen vào nhân
Là phương pháp chuyển gen ổn định do gắn gen quan tâm vào nhiễm sắc thể thực
vật được ứng dụng phổ biến trong sản xuất protein chức năng. Ngoài ra, có thể đưa gen
vào lục lạp. Lục lạp là cơ quan tử của thực vật có nguồn gốc từ vi khuẩn cộng sinh trong
thực vật và có cơ thể di truyền rất giống với các plasmid vi khuẩn. Người ta tính rằng
trong tế bào lá trưởng thành có tới 100 lục lạp, mỗi lục lạp có chưa 100 bản sao DNA
vòng, vì thế mức độ biểu hiện gen rất cao, có thể tới 35% protein tổng số. Tuy nhiên,
protein được biểu hiện thường không có chức năng đầy đủ do bộ máy di truyền của lục
lạp ở mức độ cơ quan tử nên khó có thể đảm bảo các biến đổi sau dịch mã.
 Chuyển gen trực tiếp vào protoplast
Ðể DNA dễ xâm nhập được vào tế bào thực vật, phải loại bỏ vách tế bào tạo
protoplast. Protoplast có thể được duy trì trong môi trường nuôi cấy như các tế bào sinh
trưởng một cách độc lập hoặc với một môi trường đặc hiệu, vách tế bào có thể được tạo
thành và toàn bộ các cây có thể được tái sinh từ các tế bào này. Quá trình chuyển gen như
thế này được thực hiện một cách trực tiếp bằng một cơ chế vật lý đơn giản, không cần có
vector.
Ðể nâng cao hiệu quả biến nạp, người ta đã đã xử lý protoplast với PGE
(polyethylene glycol) hoặc bằng xung điện.
Phương pháp chuyển gen này rất có hiệu quả, đặc biệt đối với những loài thực vật
mà phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium không thể thực hiện được.
Với phương pháp này, các nhà khoa học đã chuyển gen thành công vào một số loài cây
một lá mầm như loài lúa phụ Japonica (Datta, 1990), ngô (Doon, 1990), lúa mì (Vassil,
1992).
 Chuyển gen bằng kỹ thuật xung điện
HV: Võ Quang Trung – TVH K20
12
Tiểu luận Công nghệ sinh học GVHD: PGS-TS. Nguyễn Bá Lộc

Kỹ thuật xung điện (electroporation) là một phương pháp cơ học được sử dụng để
đưa các phân tử phân cực vào trong tế bào chủ qua màng tế bào. Trong phương pháp này,
một xung điện cao thế trong khoảnh
khắc (vài phần nghìn giây) có khả
năng làm rối loạn cấu trúc màng kép
phospholipid (hình 2.14), tạo ra các lỗ
thủng tạm thời cho phép các phân tử
DNA ngoại lai từ môi trường xâm
nhập vào bên trong tế bào.
Nhiều kỹ thuật nghiên cứu trong
sinh học phân tử yêu cầu đưa gen hoặc protein ngoại lai vào trong tế bào chủ. Vì lớp
phospholipid kép của màng sinh chất có một đầu ưa nước phía ngoài và một đầu ưa nước
phía trong , nên bất kỳ phân tử phân cực nào, bao gồm cả DNA và protein, đều không có
khả năng đi qua màng một cách tự do
Sơ đồ bên cho thấy các thành phần hóa học của màng sinh chất. Các đầu ưa nước
phân cực hướng về phía ngoài trong khi các đuôi
kỵ nước hướng về phía trong và tương tác với
đuôi kỵ nước khác để cùng bám giữ màng. Các
phân tử phân cực không thể đi qua màng này nếu
như không có sự hỗ trợ bên ngoài.
Nhiều phương pháp đã được phát triển để
vượt qua rào cản này, cho phép đưa DNA và các
phân tử khác vào trong tế bào đã được nghiên cứu. Một trong những phương pháp này là
kỹ thuật xung điện.
Kỹ thuật xung điện dựa trên trạng thái tương đối
yếu của các tương tác kỵ nước của phospholipid kép
và khả năng tập hợp lại một cách tự động của nó sau
khi bị rối loạn (Purves, 2001). Vì vậy, một xung điện
chớp nhoáng có thể gây ra rối loạn ở các vị trí của
màng một cách nhất thời, làm cho các phân tử phân

cực có thể đi qua, nhưng sau đó màng có thế đóng kín
lại nhanh chóng và tế bào không bị ảnh hưởng gì cả.
HV: Võ Quang Trung – TVH K20
13
Hình 2.14:Sơ đồ màng
phospholipid kép
Hình 2.15: Cuvette nhựa có điện cực
Hình 2.16 :Máy xung gen (Gene pulser)
(Hãng Biorad)
Tiểu luận Công nghệ sinh học GVHD: PGS-TS. Nguyễn Bá Lộc
Các tế bào chủ và DNA ngoại lai được tạo thành dịch huyền phù và cho vào trong
một cuvette nhựa có điện cực (hình 2.15)
Ðể tạo ra xung điện cao thế trong một thời
gian ngắn người ta sử dụng một thiết bị gọi là
máy xung gen (gene pulser). (hình 2.16)
Quá trình cơ bản diễn ra bên trong máy này
có thể được trình bày bằng sơ đồ (hình 2.17)
Sơ đồ này cho thấy mạch điện cơ bản cung
cấp điện cho kỹ thuật xung điện. Khi công tắc thứ
nhất đóng, tụ điện nạp điện vào và tích một điện
áp cao. Khi công tắc thứ hai đóng, điện áp này
phóng qua dịch huyền phù tế bào. Một xung điện
cần thiết cho kỹ thuật này thường là khoảng
10.000-100.000 V/cm (thay đổi tùy theo kích
thước của tế bào) trong vài phần triệu giây đến
một phần ngàn giây. Xung điện này làm rối loạn
phospholipid kép của màng tế bào và tạo ra các lỗ
tạm thời. Khả năng điện qua màng tế bào cùng
lúc tăng lên 0,5-1,0V vì vậy các phân tử đã được
nạp điện này đi qua màng tế bào thông qua các lỗ

bằng cách thức tương tự như điện di (Hình 2.18).
Lối DNA đi vào tế bào không thể quan sát
thấy dưới kính hiển vi, nhưng hình vẽ này cho
thấy khái niệm cơ bản của sự tạo thành các lỗ trên
màng mà DNA có thể đi qua.
Khi các ion đã nạp điện và các phân tử đi qua các lỗ, màng tế bào phóng điện và các
lỗ này đóng lại một cách nhanh chóng và phospolipid kép phục hồi lại cấu trúc cũ
(Weaver, 1995). Lúc này các phân tử mong muốn đã ở trong tế bào và chúng được sử
dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
HV: Võ Quang Trung – TVH K20
14
Hình 2.17: Sơ đồ bố trí mạch cơ bản của
máy xung điện
Hình 2.18: Sơ đồ plasmid chứa DNA

ngoại lai đi qua các lỗ tạm thời
trên màng bào chất
Tiểu luận Công nghệ sinh học GVHD: PGS-TS. Nguyễn Bá Lộc
Phương pháp này có thể sử dụng đối với gần như tất cả các loại tế bào của các loài.
Lúc đầu phương pháp này được sử dụng để chuyển gen vào các tế bào động vật có vú, về
sau cho cả tế bào thực vật ở dạng protoplast Với một số cây một lá mầm quan trọng
(loài lúa phụ Japonica, ngô, lúa mì) mà không thể thực hiện được bằng phương pháp
chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium thì người ta đã thành công với phương pháp
này. Hiệu quả biến nạp cao. Trong một nghiên cứu ở E.coli, 80% số tế bào nhận được
DNA ngoại lai (Miller và Nickoloff, 1995). Lượng DNA ngoại lai cần thiết là ít hơn so
với các phương pháp khác (Withers, 1995). Phương pháp này có thể thực hiện với các mô
in vivo còn nguyên vẹn (Weaver, 1995). Ðoạn DNA ngoại lai được biến nạp có kích
thước lớn. Tuy nhiên nếu các xung điện có cường độ và chiều dài không đúng thì một số
lỗ của tế bào sẽ trở nên quá lớn hoặc bị
hỏng không thể đóng lại sau khi tế bào

phóng điện, làm cho tế bào bị tổn
thương hoặc bị thủng (Weaver, 1995).
Một hạn chế nữa là sự vận chuyển DNA
ngoại lai vào và ra khỏi tế bào trong suốt
thời gian điện biến nạp là tương đối
không đặc hiệu. Ðiều này dẫn đến kết
quả là không cân bằng ion mà sau đó sẽ
làm rối loạn chức năng của tế bào và tế
bào chết (Weaver, 1995).
Kỹ thuật xung điện được sử dụng
rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau
của sinh học phân tử và y học. Các ứng
dụng của kỹ thuật xung điện bao gồm:
Biến nạp DNA: các gen đặc hiệu có thể được tạo dòng trong plamid và sau đó
plasmid này được đưa vào tế bào chủ để nghiên cứu cấu trúc và chức năng của gen và
protein.
- Dung hợp tế bào đã kích thích: sự tạo thành các lỗ thủng trên màng xảy ra do xung
điện chớp nhoáng tạo ra cho thấy đã kích thích sự dung hợp tế bào (Weber và Berrg,
1995).
3.Chuyển gen bằng súng bắn gen
HV: Võ Quang Trung – TVH K20
15
Tiểu luận Công nghệ sinh học GVHD: PGS-TS. Nguyễn Bá Lộc
Súng bắn gen (Gene gun) là một thiết bị sử dụng để
đưa thông tin di truyền vào tế bào, được thiết kế đầu tiên
cho biến nạp DNA ngoại lai vào tế bào thực vật và được
phát triển vào đầu thập niên 1980 do các nhà thực vật học ở
Ðại học Corrnell cùng với các nhà nghiên cứu ở Corrnell
Nanofabrication Facility, Newyork, USA. Súng bắn gen
được bán trên thị trường vào năm 1990. Ðạn sử dụng cho

loại súng này là các hạt kim loại nặng cơ bản được bao bọc
DNA. Tên chính xác và đầy đủ của súng bắn gen là hệ
thống phân phối hạt biolistics (biolistic particle delivery
system) và kỹ thuật này thường được gọi một cách đơn giản là biolistics (sự kết hợp giữa
hai thuật ngữ biology (sinh học) và ballistics (sự bắn tung)). Mặc dù có nhiều thiết kế kỹ
thuật khác nhau nhưng nguyên lý chung của phương pháp này là sử dụng áp lực xung của
khí helium để gai tốc các hạt.
Súng bắn gen bao gồm hai buồng bằng
thép không gỉ, kích thước 6“x7“x10“ nối với
hai bơm chân không. DNA ngoại lai được gắn
vào các hạt tungsten có đường kính rất nhỏ,
khoảng 1μm (các kim loại nặng khác như
vàng và bạc cũng được sử dụng nhưng không
thường xuyên do giá cả đắt). Các hạt này
được đặt trên một cái đĩa ở mặt bên trong của
súng. Sự bùng nổ khí helium ở 1000psi làm
cho cái đĩa bắn về phía trước với tốc độ 1300
food/s, tương đương với tốc độ khi một viên
đạn rời khỏi nòng súng. Một tấm chắn làm
dừng đĩa lại và các hạt vàng hay tungsten
được phóng về phía các tế bào đích. Chúng xuyên qua vách tế bào và phóng thích các
phân tử DNA (Hình 2.21). Súng bắn gen sử dụng kỹ thuật DNA tái tổ hợp để hợp nhất sự
biểu hiện các gen đã phân phối. Các tế bào biến đổi di truyền có thể được sử dụng để tạo
thực vật bao gồm cả sự sửa đổi di truyền mong muốn ở trong tất cả các tế bào của chúng
(Voiland, 1999).
HV: Võ Quang Trung – TVH K20
16
Hình 2.21:Sơ đồ nguyên lý hoạt động của súng
bắn gen
Súng bắn gen

Tiểu luận Công nghệ sinh học GVHD: PGS-TS. Nguyễn Bá Lộc
Mục tiêu của súng bắn gen thường là callus của các tế bào thực vật giống nhau
sinh trưởng trong môi trường gel trên đĩa petri. Sau khi các hạt tungsten đã va chạm vào
đĩa, gel và callus bị phá vỡ nhiều. Tuy nhiên một số tế bào không bị phá vỡ khi va chạm
mạnh và đã tiếp nhận các hạt tungsten được bao bọc DNA và cuối cùng các phân tử DNA
ngoại lai đã xâm nhập và hợp nhất vào nhiễm sắc thể thực vật. Các tế bào từ đĩa petri
được tập hợp lại và chọn lọc các tế bào đã hợp nhất thành công và biểu hiện DNA ngoại
lai bằng các kỹ thuật hóa sinh hiện đại như sử dụng gen chọn lọc nối tiếp và Northern
blots.
Các tế bào đơn đã chọn lọc từ callus có thể được xử lý với một số hormone thực vật
như auxin, gibberelin và mỗi một tế bào có thể phân chia, biệt hóa thành các tế bào mô,
cơ quan, tế bào chuyên hóa của toàn bộ cây. Cây mới có nguồn gốc từ một tế bào nảy
mầm thành công có thể mang các đặc tính di truyền mới.
Phương pháp này có ưu điểm là thao tác dễ dàng, có thể chuyển gen vào nhiều
loại tế bào và mô, các tế bào được biến nạp có tỉ lệ sống sót cao, cho phép đưa các gen
vào tế bào ở vị trí mong muốn Do vậy nó được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực.
4. Kỹ thuật calcium phosphate
Kỹ thuật calcium phosphate (calcium phosphate technique) đã được phát triển đầu
tiên là để xác định sự lây nhiễm của DNA
virus (Graham,1973) và hiện nay được sử
dụng rông rãi để thử nghiệm hoạt động biến
nạp của DNA virus cũng như DNA tách chiết
từ các tế bào eukaryote (Wigler, 1978;
Graham, 1979; Pellicer, 1980).
Kỹ thuật này yêu cầu ủ các tế bào nhận
với các chất đồng kết tủa DNA và calcium
phosphat (Hình 2.23). Kết tủa này bám vào tế
bào và sau đó sẽ hấp thụ vào tế bào qua quá trình ẩm bào (Loyter, 1982). Trong tế bào,
các phân tử DNA ngoại lai nằm trong không bào được tạo thành do ẩm bào và lysosome
thứ hai nhưng rất ít DNA đi đến nhân và hợp nhất vào genome chủ

Cho đến nay, đây là kỹ thuật vô cùng có giá trị đối với các nghiên cứu chuyển gen
vào các tế bào soma nuôi cấy và đang được sử dụng nhiều để chuyển các dòng genome
vào tế bào đích. Tỉ lệ các tế bào được biến nạp ổn định của kỹ thuật này là tương đương
HV: Võ Quang Trung – TVH K20
17
Hình 2.23: Phức hợp DNA-calcium
phosphat
Tiểu luận Công nghệ sinh học GVHD: PGS-TS. Nguyễn Bá Lộc
với phương pháp vi tiêm nhưng khác với vi tiêm là nhiều tế bào được biến nạp cùng một
lần. Phương pháp này được sử dụng phổ biến bởi vì đơn giản protocol dễ thực hiện, ít
tốn kém, số tế bào chết sau biến nạp không đáng kể, sự biểu hiện gen có thể là nhất thời
hoặc ổn định và quan trọng trong việc thiết kế vector virus tái tổ hợp. Tuy nhiên hiệu quả
biến nạp và mức độ biểu hiện của gen chuyển thấp.
5. Chuyển gen qua liposome
Vào thập niên 1980, liposome
nhân tạo đã được sử dụng để đưa DNA
vào tế bào. Lipid với toàn bộ lưới tích
điện dương ở pH sinh lý là thành phần
lipid tổng hợp phổ biến nhất của
liposome được phát triển cho
chuyển gen (Hình 2.24). Thường
thì lipid cation được trộn với một
lipid trung tính như L-dioleoyl
phosphatidyl-ethanolamine
(DOPE) (Hình 2.25). Phần cation
của phân tử lipid kết hợp với DNA
tích điện âm và kết quả là chứa đầy DNA trong phức hợp liposome-DNA (Hình 2.26).
Ðối với các tế bào nuôi cấy, toàn bộ lưới tích điện dương của phức hợp liposome-DNA
nói chung là gây ra hiệu quả chuyển gen cao hơn bởi vì nó cho phép phức hợp này kết
hợp với màng tế bào tích điện âm bền hơn. Nhờ cơ chế nhập bào, các phức hợp xuất hiện

trong endosome và sau đó đi vào nhân. Chưa rõ DNA được phóng thích từ endosome và
đi qua màng nhân như thế nào. DOPE được xem là một lipid kích thích sự dung hợp và
vai trò của nó là phóng thích các phức hợp này từ endosome cũng như làm cho sự dung
hợp của màng tế bào phía ngoài với phức hợp liposome-DNA xảy ra dễ dàng. Trong
phương pháp này, các đại phân tử trước hết được đưa vào trong các túi phospholipid. Các
loại túi khác nhau đã được mô tả, nhưng túi một lớp mỏng là thích hợp nhất cho chuyển
gen vì chúng có tỉ lệ khoảng trống chứa nước ở bên trong tương đối cao đối với mỗi đơn
vị lipid và bởi vì chúng có tỉ lệ phân phối cao hơn. Sự dung hợp của liposome với màng
plasma là một sự kiện hiếm. Hiệu quả biến nạp của phương pháp này thấp hơn so với
phương pháp vi tiêm vào tiền nhân. Các nổ lực nghiên cứu đang được tiến hành để tìm ra
HV: Võ Quang Trung – TVH K20
18
Hình 2.25: Cấu trúc của DOPE (L-diolecyl
phosphatidylethanolamine)
Hình 2.26: Phức hợp liposome-DNA
Hình 2.24: Cấu trúc tổng quát của lipid cation
tổng hợp
Tiểu luận Công nghệ sinh học GVHD: PGS-TS. Nguyễn Bá Lộc
các điều kiện thí nghiệm mà có thể làm tăng sự phóng thích các phân tử đã kết nang từ
con đường ẩm bào.
Liposome đã được sử dụng để đưa protein, lipid và các phân tử nhỏ vào nhiều loại
tế bào nuôi cấy, tuy nhiên hiệu quả thấp hơn vi tiêm đối với RNA hoặc protein. Cũng như
thế, chuyển gen qua liposome và sự biểu hiện của gen chuyển là không vượt qua được
các phương pháp chuyển gen thông thường (như hệ thống virus), sự biểu hiện gen chuyển
thường nhất thời, sự ức chế bởi các thành phần của huyết thanh có thể xảy ra. Bên cạnh
đó, kỹ thuật này có nhiều ưu điểm là gen chuyển sẽ không hợp nhất vào genome chủ, có
hiệu quả tốt đối với cả tế bào in vitro và in vivo, có thể mang được các DNA có kích
thước rất lớn, độ tinh khiết cao, không gây miễn dịch, có thể sử dụng với các tế bào mà
biến nạp bằng kỹ thuật calcium phosphat không có hiệu quả
V. ĐỊNH HƯỚNG VÀ THÀNH TỰU

1. Trên thế giới:
Những thành công của các nhóm nghiên cứu trên thế giới đã chứng tỏ việc sản xuất
và đưa sản phẩm Vắc-xin trong thực vật ra thị trường sẽ trở thành hiện thực trong một
tương lai không xa. Những tiến bộ mà các nhà công nghệ sinh học thực vật trên thế giới
đã đạt được tập trung vào một số vấn đề sau:
*Tăng cường mức độ biểu hiện kháng nguyên
Ở phần trên, chúng ta đã biết nhiều kĩ thuật được sử dụng để cải biến di truyền thực
vật, tuy nhiên hầu hết các báo cáo hiện nay về sản xuất Vắc-xin ăn được đều liên quan
đến phương pháp chuyển gen bằng Agrobacterium và promoter phổ biến nhất trong thiết
kế gen biểu hiện là CaMV 35S (promoter của vi khuẩn khảm súp lơ), một promoter khoẻ
cho phép biểu hiện gen ở mức độ cao.
Bên cạnh đó, nhiều hệ thống vector khác cũng được sử dụng để biểu hiện kháng
nguyên. Việc nghiên cứu sản xuất kháng nguyên dưới đơn vị B của độc tố kém bền nhiệt
(LT-B) ở E. coli, được điều khiển bằng promoter đặc hiệu vị trí (đặc hiệu hạt), làm bằng
mức độ biểu hiện LT-B tới 1,8% protein hoà tan tổng số. Đồng thời, việc áp dụng hai
phương pháp lai tạo giống ngô khác nhau đã nâng thành phần kháng nguyên gấp 5 và 10
lần. Chikwamba và đồng tác giả cũng biểu hiện LT-B thành công ở ngô, đây cũng là báo
cáo đầu tiên sử dụng súng bắn gen để sản xuất Vắc-xin trong thực vật.
Tuy nhiên hiện nay mức độ biểu hiện kháng nguyên ở thực vật còn thấp là trở ngại
chính trong việc phát triển Vắc-xin này. Trong nỗ lực tìm kiếm giải pháp cho vấn đề này,
HV: Võ Quang Trung – TVH K20
19
Tiểu luận Công nghệ sinh học GVHD: PGS-TS. Nguyễn Bá Lộc
Gleba và đồng tác giả (2005) thuộc công ty Genetics (Đức) đã công bố phương pháp mới
nâng cao mức độ biểu hiện của kháng nguyên Vắc-xin trong thực vật. Phương pháp này,
gọi là “magnifection” đã kết hợp được những ưu điểm của ba hệ thống sinh học là tính
hiệu quả và khả năng lây nhiễm hệ thống của Agrobacterium, tốc độ và mức độ biểu hiện
cao của virus, khả năng cải biến sau dịch mã và giá thành sản xuất thấp của thực vật.
Nguyên tắc của phương pháp này là lợi dụng sự lây nhiễm của Agrobacterium để vận
chuyển và phát tán vector virus vào thực vật, sau đó vector mang gen quan tâm này sẽ

tiến hành sao chép, nhân lên và lây nhiễm cho toàn bộ tế bào.
Sử dụng phương pháp này trên cây thuốc lá Nicotiana benthamiana và củ cải đỏ ăn
được, nhóm nghiên cứu trên đã thu kết quả rất khả quan. Tốc độ sản xuất kháng nguyên
rất nhanh, vài mg-g trong 3-4 tuần, có thể tăng sản lượng tới 100kg/năm. Mức độ biểu
hiện rất cao, đạt 5g protein tái tổ hợp trên 1kg lá tươi tương đương 80% protein hoà tan
tổng số, gấp hơn 10 lần so với các phương pháp biểu hiện thông thường. Nhóm tác giả
cũng chỉ ra hạn chế của phương pháp này như biểu hiện hạn chế các oligopeptide đa
thành phần. Tuy nhiên với những ưu điểm vượt trội, phương pháp này tỏ ra rất hiệu quả
và có tiềm năng ứng dụng cao để sản xuất kháng nguyên Vắc-xin thực vật giá rẻ an toàn
về mặt sinh học.
Tregoning và cộng sự (2004) đã biểu hiện kháng nguyên Vắc-xin mức độ cao trong
lục lạp thuốc lá với kháng nguyên mô hình là Tet C (kháng nguyên vi khuẩn uốn ván).
Trong nghiên cứu này, tác giả đã thu được mức độ biểu hiện khác nhau khi thay đổi hai
yếu tố duy trì tính ổn định của promoter (vùng điều khiển gen) là cách sử dụng mã bộ ba
(codon usage) và vùng trình tự không dịch mã 5’ (5’ UTR). Ví dụ, khi tăng gấp đôi các
codon giàu A-T trong gen, mức độ biểu hiện cũng tăng gấp đôi từ 10 đến 20% protein
hoà tan tổng số. Hoặc khi thay đổi 5’ UTR từ rbcl UTR thành T 7gen 10 5’ UTR cũng
làm tăng gấp đôi mức biểu hiện của kháng nguyên TetC. Như vậy, có thể thấy phát hiện
này rất quan trọng trong việc chuẩn hoá các đặc điểm của cây chuyển gen vì mức độ biểu
hiện gen chuyển qua cao có thể gây hại cho cây.
*Lựa chọn đối tượng thực vật
Đến năm 2000 đã có 5 kháng nguyên được biểu hiện thành công ở rau quả. Trong
đó dưới đơn vị B của nội độc tố kém bền nhiệt ở E. coli (LT-B), dưới đơn vị B của độc tố
tả (CL-B), protein vỏ capsid virus Norwalk và kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B
đều được sản xuất ở khoai tây. Riêng protein G của virus dại được biểu hiện ở cà chua.
HV: Võ Quang Trung – TVH K20
20
Tiểu luận Công nghệ sinh học GVHD: PGS-TS. Nguyễn Bá Lộc
Năm 2005, trong một báo cáo mới nhất về Vắc-xin ăn được trong thực vật, đã có
những phân tích sâu sắc về các đối tượng thực vật được sử dụng để sản xuất Vắc-xin, đặc

biệt là viêm gan siêu vi B. 4 tiêu chuẩn đối với hệ thống thực vật đáp ứng mục đích này,
đó là:
- Mức độ biểu hiện cao
- Mức độ kháng nguyên đồng đều trong mô thực vật
- Nguyên liệu thực vật phải ăn được
- Kháng nguyên ổn định ở nhiệt độ phòng và có thể bảo quản lâu dài.
Nhiều nghiên cứư cho thấy, hạt ngô hội tụ 4 tiêu chuẩn trên của hệ thống biểu hiện
hiệu quả cao, đây cũng là đối tượng mà nhóm ông quan tâm để sản xuất kháng nguyên
Vắc-xin viêm gan B. Năm 2003, họ đã biểu hiện thành công dưới đơn vị B của độc tố
kém bền nhiệt ở E.coli (LT-B). Họ thấy rằng phôi mầm của hạt ngô chuyển gen tập
chung lượng kháng nguyên cao nhất, gấp 6 lần so với bộ phận khác và những nhân này
tương ứng với một liều mg kháng nguyên. Sau đó, năm 2005 nhóm này lại biểu hiện
thành công kháng nguyên bề mặt chính của virus viêm gan B trong hạt ngô. Mức độ biểu
hiện gen trong hạt thu được từ cây chuyển gen thế hệ thứ nhất là 0,2% protein hoà tan
tổng số, trong đó kháng nguyên tập trung tới 20% trong các phôi mầm của hạt.
Korban và đồng tác giả đã biểu hiện kháng nguyên Vắc-xin dưới đơn vị virus RSV
ở cà chua, đây là virus gây bệnh đường hô hấp nghiêm trọng ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ. Các
thiết kế gen (một loại mang promoter CaMV 35 S và một loại mang promoter đặc hiệu
quả E-8) chứa gen mã hoá cho kháng nguyên RVS-F được chuyển vào cà chua thông qua
phương pháp chuyển gen bằng Agrobacterium. Sử dụng promoter đặc hiệu quả cho phép
biểu hiện protein chỉ ở trong quả của tất cả các cây chuyển gen. Protein này tạo đáp ứng
miễn dịch khi được thử nghiệm ở chuột.
* Thử nghiệm khả năng đáp ứng miễn dịch của Vắc-xin ăn được
Hầu hết Vắc-xin ăn được ở thực vật đã thử nghiệm ở động vật và giai đoạn 1 ở
người. Một trong những nguyên nhân ảnh hưởng đến việc thử nghiệm quy mô lớn ở
người là do sự ngại rằng Vắc-xin ăn được bị phân huỷ bởi dịch tiêu hoá trong đường ruột.
Do đó, khó có thể thu được kết quả chính xác do không có phản ứng sinh kháng thể hoặc
kháng thể rất ít, không đủ gây đáp ứng miễn dịch. Đồng thời Vắc-xin ăn được không biểu
hiện đồng nhất trong các mô thực vật cũng gây khó khăn trong việc xác định liều lượng
để thử nghiệm.

HV: Võ Quang Trung – TVH K20
21
Tiểu luận Công nghệ sinh học GVHD: PGS-TS. Nguyễn Bá Lộc
Thử nghiệm lâm sàng đầu tiên ở người được ghi nhận vào năm 1997 bởi nhóm
nghiên cứu của Arntzen và được sự chấp nhận của Cơ quan quản lí dược phẩm và thực
phẩm Hoa Kì. Trong thử nghiệm Vắc-xin dưới đơn vị độc tố E.coli LT-B này, 11 người
đã ăn sống 50-100g khoai tây chuyển gen. Kết quả cho thấy 10/11 người kiểm tra đều tạo
kháng thể chống lại LT-B, lượng kháng thể này tương ứng với kháng thể đo được ở
những người niễm E. coli nồng độ 10
6
. Như vậy, protein LT-B này trong các mô thực vật
ăn được không bị phân huỷ trong đường tiêu hoá và có khả năng đáp ứng miễn dịch ở
người.
Hiện nay, Thanavala và đồng tác giả (2005) đang thử nghiệm giai đoạn I và II Vắc-
xin viêm gan B ở khoai tây. Khi ăn 2 đến 3 liều, mỗi liều 100g khoai tây sống tương
đương 1mg kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B, 33 người kiểm tra có phản ứng tạo
kháng thể với nồng độ 10 mIU/mL.
Thành công đầu tiên về biểu hiện gen mã hoá cho kháng nguyên vỏ virus
Staphyloccocus mutants vào năm 1990 đã mở ra hướng mới sản xuất Vắc-xin ăn được
trong thực vật, thu hút sự quan tâm đặc biệt của nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới,
trong đó hai nhóm nghiên cứu với nhiều đóng góp quan trọng là nhóm của Arntzen tại
viện nghiên cứu thực vật Boyce Thomson, thuộc trường đại học Cornell, Hoa Kỳ và tại
ProdiGene một công ty tư nhân về công nghệ sinh học thực vật của Hoa Kỳ. Có thể nói
nhóm nghiên cứu của Mason là nhóm tiên phong trong lĩnh vực Vắc-xin trong thực vật
với việc biểu hiện thành công kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B (HbsAg) ở thuốc lá
năm 1992 . Nhóm này đã có những đóng góp to lớn trong sự phát triển của Vắc-xin ăn
được như đóng góp về mặt cơ sở, nguyên lý khoa học, lựa chọn đối tượng sản xuất Vắc-
xin như khoai tây, chuối; thử nghiệm Vắc-xin này ở người và động vật, tiến tới đưa sản
phẩm thực vật mang Vắc-xin đến mọi người. Hiện nay, nhóm này đang thực hiện dự án
chuyển giao công nghệ và trao đổi thông tin về Vắc-xin ăn được với các nhà khoa học ở

những nước đang phát triển. Dự án trị giá 58000 USD, kéo dài trong 3 năm do
Rockefeller Foundation tài trợ, thực hiện đầu tiên với CINESTAV - một tổ chức y tế
chính phủ Mexico nhằm mục đích sản xuất Vắc-xin HIV ăn được giá rẻ trong chuối và có
thể sử dụng trên toàn thế giới để chống lại HIV/AIDS.
Hiện nay nhóm nghiên cứu của Arntzen đang triển khai dự án sản xuất Vắc-xin
trong chuối. Họ hi vọng chuối sẽ là nguồn cung cấp chính Vắc-xin ăn được, dễ ăn và giá
thành rẻ. Thứ ba là tăng cường tính bền vững của Vắc-xin với dịch tiêu hoá trong đường
HV: Võ Quang Trung – TVH K20
22
Tiểu luận Công nghệ sinh học GVHD: PGS-TS. Nguyễn Bá Lộc
ruột người và động vật. Ngoài ra, việc xác định liều lượng thực vật mang Vắc-xin rất
quan trọng khi thử nghiệm và đưa sản phẩm ra thị trường.
Nhóm của Streatfield và đồng tác giả (2003) mặc dù khởi đầu muộn hơn nhưng đã
có những đóng góp đáng kể trong việc sản xuất Vắc-xin ăn được. Hiện nay nhóm này
đang tham gia vào các dự án Vắc-xin dựa trên thực vật của công ty ProdiGene, chủ yếu
trên cây ngô, một đối tượng nghiên cứu được xem là lý tưởng cho sản xuất Vắc-xin ăn
được. Nhóm đã xây dựng thành công hệ thống sản xuất Vắc-xin viêm gan B ở ngô. có thể
sử dụng dưới dạng bánh snack (ngô qua chế biến được nghiền thành bột).
Các Vắc-xin sản xuất trong thực vật đã nâng cao giá trị cây trồng, nhất là cây
chuyển gen do chúng được trồng và chế biến trên quy mô lớn, đáp ứng nhu cầu thuốc và
sinh dược phẩm. Vắc-xin ăn được đã mở ra một kỉ nguyên mới của nông nghiệp, được
các nhà khoa học gọi là “biofarming”, trong đó các cây nông nghiệp được cải biến chất
lượng (tăng cường giá trị dinh dưỡng, làm thuốc), trồng trong các khu vực đặc biệt và sử
dụng đặc biệt như các “nhà máy” sản xuất Vắc-xin và các tác nhân kháng khuẩn khác.
Như vậy, những vấn đề còn tồn tại trong sản xuất Vắc-xin ăn được từ thực vật đã
mở ra những hướng nghiên cứu quan trọng cho các nhà khoa học trên con đường tìm
kiếm một Vắc-xin giá rẻ, cung cấp đến mọi nơi trên thế giới, đặc biệt ở những nước đang
phát triển. Và rõ ràng lĩnh vực mới đầy tiềm năng này đang bước vào giai đoạn phát triển
sôi động, đòi hỏi sự hợp tác của nhiều nhà khoa học trên thế giới cùng giải quyết những
khó khăn này. Trong đó, việc chuyển giao công nghệ sản xuất Vắc-xin ăn được đến các

nước đang phát triển rất cần thiết vì đây; là những quốc gia thực sự cần loại Vắc-xin này.
* Một số thành tựu Vắc-xin ăn được
1. Vắc-xin từ khoai tây chuyển gien
Loại khoai tây chuyển đổi gien (GM), chứa vắc-xin ngừa viêm gan B, đã thúc
đẩy thành công khả năng miễn dịch trong các cuộc thử nghiệm lâm sàng đầu tiên.
Trong nghiên cứu, hơn 60% tình nguyện viên ăn khoai tây GM, tương đương ba
liều vắc xin. Kết quả là cơ thể họ tạo thêm một lượng lớn kháng thể chống lại virus. Tình
HV: Võ Quang Trung – TVH K20
Khoai tây chứa vắc-
xin.
23
Tiểu luận Công nghệ sinh học GVHD: PGS-TS. Nguyễn Bá Lộc
nguyện viên ăn khoai tây bình thường không sinh thêm kháng thể. Tuy nhiên, do những
người ăn sống khoai tây GM đã được tiêm vắc-xin viêm gan B thông thường nên vắc-xin
khoai tây chỉ tăng cường khả năng miễn dịch của họ.
Để tạo vắc-xin trong khoai tây, nhóm nghiên cứu do Charles Arntzen thuộc ĐH
Arizona (Mỹ) đứng đầu đã bổ sung vào cây khoai tây thông thường một protein của virus
viêm gan B. Khi con người ăn khoai tây này, protein sẽ giúp hệ miễn dịch nhận ra và tiêu
diệt mọi virus viêm gan B trong tương lai.
Theo Arntzen, biến thực phẩm thành nguồn vắc-xin rẻ tiền rất hữu ích đối với các
nước nghèo vì không phải bỏ ra nhiều chi phí bảo quản lạnh hoặc mua kim tiêm. Tuy
nhiên, điều không may là các nhà phát triển dược phẩm đang từ bỏ việc bào chế vắc-xin
trong các loại thực phẩm cơ bản chẳng hạn như chuối, cà chua và khoai tây. Nguyên
nhân là họ lo ngại khả năng thực phẩm chứa vắc-xin có thể bị lẫn vào thực phẩm trong
siêu thị hoặc cửa hàng. Nếu điều này xảy ra, hậu quả sẽ khôn lường.
Thay vào đó, các nhà bào chế thuốc đang tập trung vào sản xuất vắc-xin trong lá
cây ăn được song thực vật đó không được bán làm thực phẩm. Nhóm nghiên cứu của
Arntzen đang điều tra một số thực vật và hứa hẹn nhất là Nicotiana benthamiana, họ
hàng của cây thuốc lá. Lá được thu hoạch, rửa sạch, nghiền rồi ướp lạnh-sấy khô để bảo
quản trước khi đóng vào các viên con nhộng.

Ướp lạnh- sấy khô có nghĩa là vắc-xin tồn tại trong thời tiết nóng, không cần bảo
quản lạnh giống như vắc-xin thông thường. Ngoài ra, đóng vắc-xin thành viên con nhộng
đảm bảo liều lượng thống nhất.
2. Gạo chứa Vắc-xin chống dịch tả
Nhóm nghiên cứu do giáo sư Hiroshi Kiyono thuộc khoa nghiên cứu miễn dịch,
Trường đại học Tokyo đứng đầu, đã công bố việc phát triển một loại gạo có chứa
Vắc-xin chữa bệnh dịch tả.
Tiến bộ này có thể sẽ giảm bớt khó khăn cho việc phân
phối Vắc-xin ở những quốc gia đang phát triển trong thời gian
sắp tới.
Các loại Vắc-xin tiêm thông thường không tạo được
phản ứng miễn nhiễm ở những nơi có màng nhầy trong cơ
thể. Do vậy loại Vắc-xin mới này sẽ có tác dụng tốt trong việc
chống lại tác nhân gây nhiễm thông thường qua màng nhầy,
HV: Võ Quang Trung – TVH K20
24
Với một bát cơm từ lúa chuyển
gien, vừa no bụng lại vừa trị
được bệnh.
Tiểu luận Công nghệ sinh học GVHD: PGS-TS. Nguyễn Bá Lộc
ví dụ virus dịch tả, E. coli, virus gây suy giảm hệ miễn dịch ở người, virus cúm và SARS.
Các nhà nghiên cứu Nhật Bản đã có thể tạo ra phản ứng miễn nhiễm ở chuột, đồng thời
tránh phản ứng dị ứng với chính loại gạo này.
Ngoài ra, loại gạo chuyển hoá gen này có thể được trữ ở nhiệt độ thông thường mà không
gặp nguy cơ nhiễm khuẩn.
Mặc dù thế, việc sử dụng loại gạo được biến đổi để tạo nên phản ứng Vắc-xin
không có nghĩa rằng đây là loại Vắc-xin ăn được. Các nhà khoa học không muốn công
chúng nghĩ rằng ăn gạo này sẽ được chủng ngừa.
Thay vào đó, Vắc-xin này sẽ được cung cấp dưới dạng viên nhộng hoặc viên nén có
chứa bột gạo và được xem là thuốc chứ không phải thực phẩm.

3. Thuốc lá chuyển gen có chứa vắc-xin chống dịch hạch
Nguyên nhân gây bệnh dịch hạch là loại vi khuẩn có tên Yersinia pestis, hiện nay
bệnh dịch này vẫn có nguy cơ xảy ra ở 1 số vùng ở châu Phi, châu Á, châu Mỹ và Liên
Xô cũ, đặc biệt là những nơi con người sống gần với các loài gặm nhấm. Y. pestis nguy
hiểm nhất khi bị hít vào trong phổi, vì nó có thể phá hủy phổi của người bệnh, dẫn đế n
cái chết.
Kháng sinh có thể được sử dụng để chữa bệnh dịch hạch, nhưng các biện pháp chữa
trị chỉ có hiệu quả nếu bệnh được phát hiện sớm. Một vài chủng Y. pestis có thể kháng
thuốc kháng sinh, nên các nhà khoa học phải tìm kiếm các biện pháp sản xuất hàng loạt
các loại vắc-xin mới. Luca Santi và Hugh S. Mason đã khám phá ra loại vắc-xin phòng
bệnh dịch hạch trong lá cây thuốc lá. Trong một nghiên cứu gần đây, các nhà khoa học đã
phân tích sự biểu thị của 2 prôtêin của Y.pestis trên cây trồng: kháng nguyên F1, tạo
thành 1 phần của vỏ bao ngoài tế bào Y.pestis, kháng nguyên V, có tham gia vào quá
trình gây bệnh, và hỗn hợp của F1 và V. Các gen của 2 kháng nguyên này được đưa vào
tế bào cây thuốc lá bằng khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Sau đó các prôtêin được tạo
thành được phân tích tính kháng nguyên và thử nghiệm trên chuột bạch.
Các nhà nghiên cứu thấy rằng: 1) cả 3 loại kháng nguyên trên đều biểu lộ ở mức độ
cao trên lá cây thuốc lá; 2) cả 3 loại prôtêin đều tạo ra phản ứng miễn dịch ở chuột thí
nghiệm; 3) sau khi xịt liều Y pestsis có chứa 100% độc tố vào chuột, những con chuột
được sử dụng vắc-xin có tỉ lệ sống rất cao sau 21 ngày, trong khi những con chuột giả
miễn dịch (sham-immunized) đều chết sau 6 ngày.
4. Vắc-xin giúp ngăn ngừa ung thư:
HV: Võ Quang Trung – TVH K20
25