BÀI BÁO CÁO THỰC TẬP-NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG VÀ NACL TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN VANG VẢI THIỀU

Khoá luận tốt nghiệp
Lời cảm ơn
Nghiên cứu khoa học là một công việc cần thiết của thế hệ trẻ, đặc biệt với mỗi
sinh viên. Để đạt đợc mục đích và hoàn thành nội dung của đề tài không thể tự bản
thân mỗi sinh viên thực hiện, mà cần có sự tạo điều kiện của nhà trờng, của khoa và
sự hớng dẫn tận tình của các thầy, cô giáo.
Bằng tấm lòng thành kính em xin đợc bày tỏ tấm lòng biết ơn sâu sắc tới
Thạc sỹ Nguyễn Khắc Thanh, TS. Đinh Thị Kim Nhung đã tận tình hớng dẫn và
giúp đỡ em hoàn thành khoá luận này.
Qua đây em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy, các cô trong bộ
môn vi sinh cùng các thầy cô trong Khoa Sinh - KTNN đã chỉ bảo em tận tình trong
quá trình học tập và nghiên cứu.
Em rất mong sự cổ vũ và những ý kiến đóng góp để khoá luận này hoàn thiện
hơn.

Hà nội ngày 22 tháng 4 năm 2005
Sinh viên:
Phạm Thị Hải
K27 A- Sinh KTNN
Phần 1
Đặt vấn đề
1.1.Lí do chọn đề tài
Ngời ta đã biết làm rợu vang từ 3000 năm trớc công nguyên. Đến thời Trung
cổ, nhu cầu về rợu vang 150 l/đầu ngời/năm[2] .Hàng năm trên thế giới sản xuất
khoảng 18 tỷ lít rợu vang. Trong đó 1/3 của Pháp và Angiêri[14].
Đa số rợu vang (Wine, win ) trên thế giới đợc sản xuất từ nho, vì vậy từ rợu
vang gần đây đồng nghĩa với rợu nho [2]. Theo thời gian và kỹ thuật sản xuất rợu
vang ngày càng phong phú và hoàn thiện. Mỗi nớc khác nhau có phơng thức sản
Phạm Thị Hải Lớp: K27A Sinh KTNN
1
Khoá luận tốt nghiệp

xuất khác nhau và hàng trăm loại rợu vang ra đời (độ rợu 9% - 14% ): Chianti,
chablis, rợu Rhine, Granache rose, Burskendy, sautesne, Zinfandet,[2].
Thực chất của rợu vang bắt nguồn từ sự biến đổi tự nhiên của các loại hoa
quả có đờng, do hệ enzim có trong một loại vi sinh vật là nấm men Sacharomyces
mà chủ yếu là loài: Sacharomyces cerevisiae, ngoài ra còn có các phụ phẩm khác:
các chất thơm, tanin, axít hữu cơ, vitamin, chất khoáng, muối và các este. Do đó, rợu
vang không chỉ có đặc điểm nổi bật là gây say êm dịu mà còn có giá trị dinh dỡng
cao, kích thích tiêu hoá, thần kinh, tim mạch. Việt Nam là một nớc nhiệt đới khí hậu
nóng ẩm, hoa quả nhiều về số
lợng, phong phú về chủng loại, thuận lợi cho sản xuất rợu vang từ các nguồn nguyên
liệu khác nhau nh: Dâu, dứa, vải, táo, chuối, mơ trong đó phổ biến nhất là vang vải
vì vang vải đã đợc sản xuất ở một số nớc nh: Florida (Mỹ ), Trung Quốc [12, 17].
Bên cạnh đó, quả vải giá thành thấp lại rất đa dạng, phong phú. Tổng số diện tích
trồng khoảng 28.000 ha, sản lợng cho thu hoạch khoảng 36.000 tấn/ năm. Nơi có
diện tích trồng và thu hoạch nhiều nhất là Lục Ngạn (Bắc Giang ) và Thanh Hà (Hng
Yên ) [12, 17]. Quả vải dùng chủ yếu để ăn (chiếm khoảng 30% - 35% sản lợng quả
cho thu hoạch, số còn lại buộc phải sấy khô hoặc bán thẩm lậu qua biên giới Việt
Trung. Việc chế biến quả vải thiều ở dạng nớc giải khát đóng hộp cũng chỉ đáp ứng
một phần nhỏ sản lợng thu hoạch hàng năm và sản phẩm rất khó đợc thị trờng chấp
nhận [12, 17].
Ngành sản xuất rợu vang ở Việt Nam thực sự phát triển từ những năm 80 của
thế kỷ XX đợc đánh dấu bằng sự xuất hiện của vang Thăng Long, sau đó là một số
cơ sở sản xuất khác hiện lên: vang Gia Lâm, vang Thanh Ba, vang Đà Lạt, nhng lại
thiếu nguồn nguyên liệu. Do đó theo chúng tôi, việc nghiên cứu sử dụng quả vải
thiều để sản xuất rợu vang là rất cần thiết và phù hợp với thực tiễn ở Việt Nam.
Chúng tôi tiến hành lựa chọn và nghiên cứu đề tài:
Nghiên cứu ảnh hởng của hàm lợng đờng và NaCl trong qúa trình lên men
vang vải thiều (Litchi chinensis sonn ).
1.2. Mục đích nghiên cứu
- Từ nguồn nguyên liệu vài thiều phân lập và tuyển chọn chủng nấm men có khả

năng lên men vang vải thiều.
- Nghiên cứu ảnh hởng hàm lợng đờng, KH
2
PO
4
, NaCl, pH, men giống và nhiệt
độ để lựa chọn mức thích hợp cuả các nhân tố này tới quá trình lên men vang vải
thiều với quy mô phòng thí nghiệm.
- Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vang từ quả vải thiều.
1.3. Nhiệm vụ
Giúp sinh viên biết phơng pháp sản xuất rợu vang ở Việt Nam tận dụng nguồn
nguyên liệu sẵn có
1.4. ý nghĩa lý luận và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Phạm Thị Hải Lớp: K27A Sinh KTNN
2
Khoá luận tốt nghiệp
Nghiên cứu nhằm đi sâu tìm hiểu đặc điểm hình thái, đặc tính sinh lý, sinh
hoá của chủng nấm men Sacharomyces cerevisiae H
7
và C
13
có khả năng lên men
vang vải thiều. Từ đó tìm hiểu quá trình sản xuất vang vải thiều trên quy mô phòng
thí nghiệm để ứng dụng sản xuất vang trong gia đình tận dụng nguồn nguyên liệu
sẵn có ở Việt Nam.
Phạm Thị Hải Lớp: K27A Sinh KTNN
3
Khoá luận tốt nghiệp
Phần 2
Tổng quan tài liệu

2.1. Khái quát chung về rợu vang
2.1.1. Các loại rợu vang
Rợu vang là loại nớc thơm ngon giàu chất bổ dỡng với độ cồn nhẹ và hơng
thơm trái cây còn giữ lại đợc trong rợu [1]. Rợu vang theo đúng nghĩa là rợu lên men
từ nớc ép quả nho (không chng cất ). Gần đây, ngời ta mở rộng khái niệm rợu vang
để chỉ các loại rợu lên men từ các loại hoa quả khác nhau nh: mơ, dứa, táo, vải, xoài,
nhãn. Sự đa dạng về các loại rợu vang đang là kết quả của sự biến đổi sinh hoá khi
lên men. Trong rợu vang ngời ta còn chia thành hai loại chính: Rợu vang không gaz
và rợu vang có gaz. Trong hai loại chính này rợu vang lại đợc chia thành nhiều loại
theo màu sắc, theo hàm lợng đờng có trong rợu hoặc theo độ cồn.
Theo màu sắc có vang trắng, vang đỏ (màu đỏ Bordaux). Theo hàm lợng đờng
có trong rợu vang thì có vang chát hay vang khô (ít đờng ) và vang ngọt (nhiều đờng
), vang nửa khô[13]. Vang khô thờng uống giữa bữa ăn, vừa ăn, vừa uống. Vang ngọt
dùng sau bữa ăn, vang nửa khô (vang Vermouth ) có mùi rất thơm (chứa 21% độ rợu
) dùng để khai vị. Champagne là loại rợu vang có qúa trình lên men phụ sinh CO
2
,
nên khi uống thờng có bọt và đợc dùng nhiều trong đại tiệc, phụ nữ thờng a thích
loại vang này[2].
2.1.2. Nguyên liệu sản xuất rợu vang
Việt Nam là một nớc nhiệt đới gió mùa không thuận lợi cho nho phát triển,
nhng lại là xứ sở của nhiều loại hoa thơm, quả ngọt bốn mùa. Tất cả các loại quả nếu
chứa đờng, prôtêin, muối khoáng và không chứa chất độc hại với nấm men đều có
thể chế biến lên men rợu vang. Nh vậy, nguồn nguyên liệu sản xuất rợu vang chủ
yếu là các loại quả trồng (mận, mơ, táo, dâu, dứa, chuối, vải, nhãn).
Nói chung thành phần hoá học của quả có ảnh hởng rất lớn đến chất lợng rợu
vang. Điều kiện khí hậu, đất đai, nông hoá thổ nhỡng, kỹ thuật canh tác cũng ảnh h-
ởng lớn đến chất lợng rợu vang, bởi chúng ảnh hởng tới sự có mặt của các hợp chất
hữu cơ có mặt trong quả.
Phạm Thị Hải Lớp: K27A Sinh KTNN

4
Khoá luận tốt nghiệp
Bảng 1. Thành phần hoá học của các loại quả. [7, 16].
Tên quả Thành phần hoá học
Nớc Đờng Axít tổng số Pectin Talin
Nho ngọt
Dâu
Vải
Dứa
Mơ
73,1
84,74
84,28
54,3
73,8
9,88
9,19
1610,39
3,9
9,0
0,56
0,49
5,16 0,01
0,6
1,1
0,92
0,31
0,25
-
-

0,07
0,035
0,83
-
-
2.1.3.Tàng trữ rợu vang
Vang truyền thống đợc tàng trữ từ 1ữ5 năm hoặc nhiều năm, hàng thế kỷ
hoặc lâu hơn nữa. Trong thời gian này xảy ra sự oxi hoá khử màu tím sang màu đỏ
tía. Vang trắng trở nên vàng, thậm chí đỏ nâu. Thành phần axít tăng, độ cồn giảm,
este và hơng vị tăng lên. [13], [14]. Cho nên, công nghệ cổ truyền ngời ta cho rằng
cần tránh can thiệp nhân tạo khi bắt buộc điều chỉnh ở mức độ tối thiểu một số chỉ
tiêu lý hoá. Ngợc lại trong thực tế cơ chế thị trờng đã thúc đẩy nhà sản xuất phải xử
lý tăng tốc độ tàng trữ bằng các phơng pháp công nghệ học, ly tâm, nạp khí CO
2
,
làm lạnh.
2.2. Nấm men trong sản xuất rợu vang
Nấm men đóng vai trò quyết định trong sản xuất rợu vang vì quá trình trao
đổi chất của tế bào nấm men là quá trình chuyển hoá nguyên liệu thành sản phẩm.
Nấm men sản xuất rợu vang gồm nấm men thuần chủng và nấm men tự nhiên.
2.2.1. Sơ lợc về nấm men
Nấm men (yeast) là tên chung để chỉ nhóm nấm có cấu tạo đơn bào, thờng
sinh sản bằng nảy chồi . Từ năm 1680 Levenhuc đã quan sát thấy Nấm men, và từ
1857 Pasteur đã nghiên cứu khá tỉ mỉ về men rợu. Nấm men phân bố rộng rãi trong
tự nhiên. (Trong đất, trong nớc, trong không khí, trong lơng thực, thực phẩm, trong
hoa quả). Nhiều loài nấm men có khả năng lên men rợu do đó từ lâu con ngời đã
biết sử dụng nấm men để nấu rợu, bia, sản xuất cồn. Nấm men sinh sản theo lối nảy
chồi, sinh sản nhanh chóng, sinh khối của nấm men giàu prôtêin vitamin. Vì vậy
chúng còn đợc sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp sản xuất thức ăn bổ
sung cho ngời, gia súc và gia cầm. Nấm men còn đợc sử dụng làm nở bột mì, gây h-

ơng cho nớc chấm, sản xuất một số dợc phẩm khác. Tuy nhiên bên cạnh đó có một
số nấm men có hại cho ngời và gia súc, làm h hỏng lơng thực, thực phẩm [3].
2.2.2. Hình thái, kích thớc và cấu tạo của tế bào nấm men Sacharomyces
cerevisiae
Hình thái: Đa số nấm men có hình ovan, hình trứng. Hình dạng và kích thớc
điển hình của tế bào nấm men chỉ tạo đợc trong điều kiện nhất định. Nếu thay đổi
thì hình dạng tế bào cũng thay đổi.
Phạm Thị Hải Lớp: K27A Sinh KTNN
5
Khoá luận tốt nghiệp
Kích thớc của tế bào nấm men vào khoảng 4- 10 àm x 2- 8àm. Tế bào
nấm men lớn gấp 10 lần tế bào vi khuẩn, cấu tạo tế bào nấm men phức tạp hơn tế
bào vi khuẩn. Về mặt hoá học, có sự phân bố rõ ràng, tế bào nấm men
Sacharomyces cerevisiae đợc bao bởi lớp thành tế bào.
Cấu tạo chủ yếu của thành tế bào là Hêmixenlulô chiếm 70% trọng lợng khô
(trong đó 31% manan, 29% glucan ). Ngoài ra còn chứa 1%- 3% kitin, 6% - 10%
prôtêin, 8% - 8,5% lipit, 7% chất khoáng. Thành tế bào có cấu tạo nhiều lớp là cơ
quan bảo vệ và duy trì hình dạng tế bào. Thành tế bào nấm men có khả năng kết
dính, có ý nghĩa lớn trong công nghiệp sản xuất rợu vang và bia. Bên ngoài chất
nguyên sinh là màng sinh chất (màng chất nguyên sinh ) có chức năng quan trọng là
hấp phụ các chất dinh dỡng và thải các các sản phẩm trao đổi chất. Màng chất
nguyên sinh là lipoprotêin chứa nhiều hợp chất canxi. Màng chất nguyên sinh ăn sâu
vào trong tạo thành mạng lới nội chất gồm 2 lớp và dày khoảng 30- 40A
0
và có ty
thể. Ty thể của nấm men có dạng hình hạt và có thể thay đổi tuỳ thuộc điều kiện của
môi trờng cũng nh trạng thái sinh lý của tế bào, kích thớc khoảng 0,2 0,6 cm, ty
thể có màng trong suốt, mỏng (60 80 A
0
), có tính thấm cao, màng ty thể có cấu

tạo 2 lớp, lớp trong hình thành nếp gấp hoặc ống nhỏ hình răng lợc. Lớp ngoài đợc
cấu tạo bằng nhiều đơn vị hình thái. Ty thể đợc cấu tạo chủ yếu bằng hợp chất
prôtêin, lipit trong đó chiếm một lợng lớn nuclêoprôtêin, photpholipit. Số lợng ty thể
trong tế bào nấm men từ 10 đến 20. Chúng tham gia vào quá trình sinh trởng của tế
bào, sự hình thành và nảy mầm của bào tử. [1, 3, 9 ].
Trong tế bào nấm men có chứa một hoặc một hệ thống không bào đợc hình
thành từ thể glogi hay mạng lới nội chất, không bào có tính chất thẩm thấu cao và là
nơi tích luỹ các sản phẩm của trao đổi chất. Không bào chứa một hệ thống keo,
trong đó gồm các điện tử, enzim, protit, hiđrat cacbon, các muối canxi, photpho,
kali, axit nuclêic. Hình dạng của không bào thờng thay đổi do sự co rút của chất
nguyên sinh. Trong không bào thờng xảy ra các phản ứng oxi hoá - khử nhờ vào hệ
thống enzim xitocromoxidaza trong không bào. Một dạng dự trữ của tế bào là
glucogen trong môi trờng giàu hiđrat cacbon, glicogen của tế bào nấm men đợc tích
luỹ khá nhiều.
Khác với tế bào vi khuẩn, tế bào nấm men có nhân thật, nhân có hình tròn,
hình ôvan nằm gần không bào trung tâm có kích thớc 1- 2,4 àm. Nhân tế bào đợc
bao bọc bởi 2 lớp màng tế bào, mỗi màng có cấu trúc nh màng cơ sở, gồm 3 lớp
phân tử, những lớp này đợc liên hệ với nhau ở gần lỗ màng nhân. Lỗ màng nhân
tham gia việc kiểm tra quá trình trao đổi chất tế bào. [6, 9].
2.2.3. Sinh sản của tế bào nấm men
Nấm men có nhiều hình thức sinh sản (sinh sản vô tính, sinh sản hữu tính,).
Bình thờng tế bào nấm men sinh sản nảy chồi khi gặp điều kiện không thuận
lợi một số có thể sinh sản theo cách tạo bào tử. [1, 12 ].
Phạm Thị Hải Lớp: K27A Sinh KTNN
6
Khoá luận tốt nghiệp
Sinh sản vô tính: Sinh sản nảy chồi là hình thức sinh sản phổ biến nhất. Khi tế
bào phát triển đến mức độ nhất định thì cơ thể của nó đâm ra một chồi nhỏ gọi là
mầm (hay chồi ). Mầm sinh ra ở vị trí lệch tâm trên đầu của tế bào mẹ. Cùng một
lúc tế bào mẹ có thể đâm ra nhiều những chồi ở nhiều phía khác nhau. ở mỗi chồi sẽ

nhận đợc một phần chất nhân và chất nguyên sinh ở tế bào mẹ. Sau khi nảy mầm tế
bào con có thể tách khỏi tế bào mẹ sống độc lập, cũng có thể không tách khỏi tế bào
mẹ mà tiếp tục nảy mầm tạo ra một lớp tế bào nấm men giống hình cành cây. Trong
điều kiện thuận lợi một tế bào đợc hình thành điều chỉnh và tách khỏi tế bào mẹ với
thời gian 20- 30 phút.
Nấm men còn có khả năng hình thành bào tử. Bào tử túi đợc sinh ra trong
những túi nhỏ gọi là túi nang. Mỗi túi nang chứa từ 1 8 bào tử. (Thờng từ 4 bào
tử ). Nấm men đợc tạo thành từ 1 tế bào riêng rẽ không qua tiếp hợp. Bào tử túi gặp
điều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành tế bào nấm men. Tế bào này sinh sản theo lối
nảy chồi (Lodder.J.1971 ).
Sinh sản hữu tính là hình thức hợp nhất 2 tế bào nấm men thành hợp tử. Tế
bào này phát triển thành túi trong đó có giảm nhiễm để hình thành các bào tử. Nhờ
kính hiển vi điện tử khoa học đã thấy đợc sự khác nhau về thời gian hình thành thoi
vô sắc trong sinh sản vô tính ở nấm men phân đôi và nấm men nảy chồi.
Nấm men sinh sản vô tính bằng nảy chồi hoặc phân đôi. Giữa quá trình này
có thể sinh sản hữu tính.
2.2.4. Nấm men thuần chủng
Trong thiên nhiên tồn tại một số lợng lớn các chủng nấm men khác nhau, chúng
có những đặc tính đặc biệt và đợc sử dụng trong sản xuất. Tế bào nấm men có thể
tìm thấy ở khắp mọi nơi đặc biệt trên bề mặt trái cây. Tuy nhiên trên bề mặt trái cây
tồn tại cả những nấm men dại, vi khuẩn, nấm mốc. Để tránh ảnh hởng cuả nấm dại,
vi khuẩn, nấm mốc, mà ngày nay xu thế lên men với chủng thuần khiết đang đợc
phổ biến rộng rãi.
Nấm men thuần chủng là nấm men đợc phát triển từ cùng một tế bào đã đợc
phân lập và tuyển chọn trên môi trờng Hansen.
Nấm men đợc phổ biến và sử dụng nhiều trong sản xuất là loài Sacharomyces
cerevisiae loài này đôi khi đợc gọi là Sacharomyces ellípsoideus hoặc
Sacharomyces vini nhng những tên này đợc coi là lỗi thời, nó đợc đặt tên bởi Hoyer
(1837 ), đợc mô tả từ đầu bởi Schwann trong cùng một năm.
* Một số chủng hay dùng trong sản xuất rợu vang:

Sacharomyces vini trớc đây gọi là Sacharomyces cerevisiae vaxini nấm men
này chiếm tới 80% Saccharomyces. Trong khi lên men loại này có khả năng lên men
glucza, fructoza, mantoza, glactoza, lactoza, peptoza, dextrin.
Saccharomyces oriformis đợc tách từ nớc nho lên men tự nhiên, đặc biệt loại
này chịu đợc đờng cao, tạo độ rợu cao (10% V) trong qúa trình lên men. Trong quá
Phạm Thị Hải Lớp: K27A Sinh KTNN
7
Khoá luận tốt nghiệp
trình lên men giống nhau tạo thành màng trên bề mặt dịch quả, có khả năng lên men
glucoza, fructoza, mantoza.
Saccharomyces cerevisiae dùng sản xuất bánh mỳ, bia rợu vang, trớc đây gọi
là Saccharomyces ellipsoides khi lên men đạt 10 20% V cồn.
* Khả năng lên men đờng của Saccharomyces
Sự lên men rợu xảy ra qua một số giai đoạn trong thời kỳ đầu khi môi trờng
còn chứa nhiều hàm lợng oxy đã hoà tan, nấm men chủ yếu oxy hoá đờng đến CO
2
và H
2
O, và sinh sôi nảy nở một cách mạnh mẽ. Năng lợng của sự lên men không
đảm bảo cho mức độ phát triển cao của tế bào thời kỳ này. Trong giai đoạn cuối
cùng của sự lên men, vì đờng còn lại ít trong môi trờng nấm men sẽ sử dụng các
glicogen đã đợc tích luỹ trong đó, do đó hàm lợng glicogen trong tế bào giảm dần.
Tốc độ lên men của các chủng Saccharomyces lên men rợu bia là khác nhau
đối với mỗi loại đờng. Tốc độ lên men đờng glucoza và fructoza nhanh hơn
xaccaroza. Tốc độ lên men đợc xác định lợng CO
2
bay ra từ một thể tích môi trờng
nhất định trong một đơn vị thời gian (Nelte và cộng sự, 1976 ).
* Có nhiều ý kiến khác nhau về việc sử dụng chủng nấm men thuần chủng
cho sản xuất rợu vang [7]. Nhng chỉ từ khi có những hãng rợu sản xuất đợc vang

ngon từ giống thuần chủng thì vấn đề này mới đợc quan tâm, phát triển.
Nấm men sử dụng rộng rãi trong sản xuất là giống Saccharomyces
cerevisiae. Chúng có sự luân phiên thế hệ n và 2n. Thành phần hoá học của nấm
men dao động mạnh phụ thuộc vào dạng của chúng và môi trờng nuôi cấy. Trung
bình nấm men chứa 75% nớc, 25% chất khô.
Theo quan điểm kinh tế, ngời ta chia nấm men ra thành các chủng nh sau:
+ Chủng lên men với hiệu suất cồn cao, ở thời gian tối u sản xuất thì đạt
20,5% V cồn.
+ Chủng lên men trong thời gian ngắn, sản sinh 8 12% V cồn, thậm chí ở
nhiệt độ thấp 4 10
0
c không bị kìm hãm.
+ Chủng chịu đợc nông độ đờng cao, lên men đợc rợu vang gần 30% đờng
với hàm lợng cồn 10 -13% V.
2.3. Các biến động sinh lý, sinh hoá vi sinh khi lên men rợu vang, khả năng lên
men đờng của Saccharomyces cerevisiae
Quá trình sản xuất rợu vang bắt đầu bằng công đoạn: đầu tiên nấm men sinh
sản trong môi trờng dịch quả. Lúc đầu cần nhiều oxy kích thích sinh trởng của nấm
men. Sau đó tạo điều kiện lên men rợu etylic yếm khí nhanh chóng, chiếm toàn bộ
khoảng không cho quá trình lên men tạo thành CO
2
và rợu etylic xảy ra mạnh mẽ, sự
lên men rợu etylic đợc biểu diễn theo phơng trình sau: [1, 12].
C
6
H
12
O
6
2C

2
H
5
OH + 2CO
2
+ Q
Năng lợng sinh ra phục vụ cho hoạt động sống của tế bào nấm men và tích
luỹ trong sản phẩm rợu. Quá trình lên men rợu xảy ra qua 5 giai đoạn:
Phạm Thị Hải Lớp: K27A Sinh KTNN
8
Khoá luận tốt nghiệp
Giai đoạn 1: Giai đoạn hoạt hoá phân tử glucoza gồm 3 phản ứng. Phân tử
glucoza nhở enzim: hexotrinaza chuyển một gốc photphat từ ATP sang tạo
ra glucoza 6 - là dạng hoạt động.
ch
2
oh
oh
oh
oh
oh
O
ATP
ADP
m
g
2
+
oh
oh

oh
oh
O
ch
2
O
p
O
Glucoza 6 - bị tác dụng của enzim iromeza chuyển thành fructoza 6 - có cấu
tạo kém bền vững hơn.
O
ch
2
o
p
o
oh
oh
oh
oh
izomera
O
ch
2
o
p
o
oh
oh
oh

ch
2
oh
Fructoza 6 bị photphoril hoá 2 lần nhờ enzim photphorictokinaza với sự
tham gia của phân tử ATP lần 2 tạo ra fructoza 1,6 đi photphoglyxeric
O
ch
2
o
p
o
oh
oh
ch
2
oh
ATP
ADP
O
ch
2
o
p
oh
oh
F.6.P
F.1.6.Đ.P
o
ch
2

o
p
o
* Giai đoạn 2: Giai đoạn cắt mạch.
Fructo 1,6 đi dễ dàng biến đổi thành 3 Photphoglyxeralđehyt và
đioxyhiđrooxy axeton photphat nhờ xúc tác của enzim aldolaza.
Phạm Thị Hải Lớp: K27A Sinh KTNN
9
Khoá luận tốt nghiệp
O
ch
2
o
p
o
oh
oh
oh
ch
2
o
o
p
C
o
ch
2
oh
ch
2

o
p
C
o
ch
2
oh
ch
2
o
o
p
+
ch
oh
cho
F.1.6.Đ.P
D.A.P
A.3.P.G
ch
2
o
p
o
ở giai đoạn này dới tác dụng của trioza photphatizomericeza có thể
chuyển hoá lẫn nhau.
Đioxyaxeton photphat alđehyt 3 photphoglyxeric.
* Giai đoạn 3: Oxy hoá
Dới tác dụng của enzim alđehyt photphoglyxeriđehyđrogenaz mà alđehyt
3 photphoglyxeric bị oxy hoá thành axit 1,3 đi phophoglixeric.

cho
ch
2
o h
ch
2
o
p
o
na d
+
+
h
3
p o
4
coo
o
p
o
p
ch
oh
ch
2
o
o
p
o
p

+
A.3.P.G
A.1.3.Đ.P.G
nadh
2
Axit này chuyển gốc photphat cao năng cho ADP thành ATP. Phản ứng này
có ý nghĩa hơn vì năng lợng giải phóng cho quá trình oxy hoá đợc tích luỹ trong các
phân tử ATP, đảm bảo cung cấp năng lợng cho quá trình hoạt động của tế bào trong
điều kiện không có oxy. Phản ứng do enzim photpho glyxeratkitonaza xúc tác tạo
axit 3 photphoglyxeric.
A.1.3.Đ.P.G
ATP
ADP
A.3.P.G
ch
2
o
o
p
coo
o
p
o
p
ch
2
o
o
p
cooh

ch
oh
ch
oh
* Giai đoạn 4: Sự tạo thành axit piruvic
Dới sự tác dụng của enzim photphat glyxeranmutaza mà axit 3
photphoglyxeric bị chuyển thành axit 2 photphoglyxeric.
Phạm Thị Hải Lớp: K27A Sinh KTNN
10
Khoá luận tốt nghiệp
cho
A.3.P.G
cooh
cho
ch
2
oh
cooh
o
p
o
p
A.2.P.G
o
p
o
p
ch
oh
Do tác dụng của enzim enolaza mà axit 2 photphoglyxeric chuyển thành

axit enol piruvic
cooh
cooh
A.2.P.G
ch
o
p
o
p
o
ch
2
oh
ch
2
C
o
p
o
p
o
A.2.P.E.P
h
2
o
_
Dớc sự tác dụng của enzim piruvat kinaza mà axit 2 photpho enol piruvic
chuyển thành axit piruvic.

c

h

2

C

o

c

o

o

h

c

o

o

h

c

h

3

C

o

ATP
ADP
c

h

2

C

o

p

o

p

o

c

o

o

h

A.2.P.E.P

A.E.P

A.P

H

* Giai đoạn 5: Sự chuyển axit piruvic thành rợu.
Đầu tiên axit piruvic bị khử nhóm cacboxyl thành CO
2
và axetalđehyt nhờ
enzim xúc tác là pyruvat đecacbonxylaza. Sau đó axetalđehyt bị khử thành etanol
nhờ enzim alcođehiđrogenaz.
cooh
C
o
ch
3
co
2
_
CHO
ch
3
nadh
2

NAD
ch
3
ch
2
oh
Phơng trình tổng quát quá trình lên men:
C
6
H
12
O
6
+ 2ADP+ 2H
3
PO
4
2C
2
H
5
OH + 2CO
2
+ 2ATP + 6H
2
O
Nh vậy sự lên men chuyển đờng thành rợu là một dãy các quá trình oxy hoá
khử có enzim trong tế bào nấm men tham gia.
Phạm Thị Hải Lớp: K27A Sinh KTNN
11

Khoá luận tốt nghiệp
2.4. Hệ vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men rợu vang, bệnh vang
2.4.1. Nấm men
2.4.2. Nấm mốc
Nấm mốc phát triển ở quả, chất bã của sản xuất rợu vang, thùng chứa thiết bị
hoặc do bụi, không khí đa đến nh nấm mốc thuộc chi Rhizopus, Aspergillus.
2.4.3. Vi khuẩn
Trong nớc hoa quả và nớc rợu vang có thể phát triển những dạng vi khuẩn có
tính ổn định lớn với rợu và axit hữu cơ. Chúng có thể gây ra những biến đổi sâu sắc
trong rợu vang về vị chua, mùi và có loài còn gây bệnh làm đục cho vang, đó thờng
là các vi khuẩn Acetorbacter xylium, Acetorbacter aceti. Pasteur đã khám phá cơ
chế làm hoá lỏng vang của các vi sinh vật khi rợu vang tiếp xúc với không khí nhiễm
vi khuẩn Bacillus. Do vậy, để bảo quản rợu vang ngời ta có thể thanh trùng pasteur
nhng nó làm giảm chất lợng rợu vang, phơng pháp vi lọc hoặc dùng một số chất bảo
quản phổ biến nh SO
2
( 75 120 mg/l ).
2.4.4. Bệnh vang
Bệnh vang đã đợc Pasteur nghiên cứu và khám phá. Bệnh vang là hiện tợng r-
ợu bị chua đi và phẩm chất giảm rất nhanh. [1,18].
Nguyên nhân: Do rợu vang tiếp xúc với không khí và do đó dới tác dụng của
vi khuẩn axit axetic phát triển đã biến cồn thành axit. Ngoài ra bệnh vang còn có thể
do vi sinh vật lên men kỵ khí.
2.5. Các yếu tố ảnh hởng tới quá trình sinh trởng của nấm men
2.5.1. Nguồn cacbon
Cacbon có trong tế bào chất thành tế bào, trong tất cả các phản ứng enzim
axit nucleic và sản phẩm trao đổi chất. Vì vậy các hợp chất cacbon có vị trí quan
trọng hàng đầu cho sự sinh trởng nấm men. Nguồn thức ăn chủ yếu của nấm men là
hyđrat cacbon, nó đáp ứng 3 nhu cầu của nấm men là:
- Sản sinh năng lợng

- Tạo thành những tiền chất
- Thực hiện quá trình oxy hoá khử để biến những tiền chất này thành sản
phẩm trung gian, để xây dựng tế bào hoặc tích tụ trong môi trờng.
2.5.2. Nguồn nitơ và muối khoáng
- Nguồn nitơ: Trong quá trình sống của nấm men cũng nh tất cả những cơ thể
sống khác đều cần nitơ để xây dựng tế bào. Do đó môi trờng nuôi cấy cần cung cấp
đầy đủ các hợp chất nitơ mà nấm men có thể đồng hoá.
- Các nguyên tố của photpho, lu huỳnh đóng vai trò quan trọng trong quá
trình trao đổi chất của tế bào nấm men, tham gia chủ yếu vào thành phần của nhân,
hạt nhiễm sắc thể, enzim.
Các ion: Ca
2+
, Mg
2+
điều chỉnh sự phát triển của tế bào nấm men.
Phạm Thị Hải Lớp: K27A Sinh KTNN
12
Khoá luận tốt nghiệp
Các ion: Fe
3+
, Mg
2+
nằm trong thành phần của enzim hoạt động sinh học cũng
ảnh hởng tới sinh trởng và phát triển của nấm men [16].
2.5.3. Nguồn Oxi
Đối với nấm men dùng để lên men, oxi cần trong giai đoạn đầu giúp nấm
men sinh trởng, tăng sinh khối. Quá trình lên men rợu diễn ra ở điều kiện yếm khí
để tăng hiệu quả tạo cồn. Sự khuấy đảo làm tăng tốc độ lên men, rút ngắn thời gian
lên men có lợi về mặt kinh tế nhng không có lợi về công nghệ do tạo sản phẩm bậc
hai quá lớn.

2.6. Các yếu tố ảnh hởng tới quá trình lên men
2.6.1. pH môi trờng
Trong quá trình nuôi cấy, pH môi trờng bị biến đổi khiến cho sự sinh sản của
nấm men cũng bị biến đổi, ở giai đoạn cuối pH tăng lên một ít do môi trờng lúc này
bắt đầu khan hiếm chất dinh dỡng và hoạt lực enzim trong tế bào lớn. Vì vậy nấm
men tự phân huỷ và giải phóng NH
3
. Khi pH dới 2 3 thì quá trình lên men bị yếu
đi. Nếu pH trên 6,5 7,5 khả năng lên men vang phát triển tốt: 4,0 5,0.
2.6.2. ảnh hởng của nhiệt độ
Quá trình lên men thờng sinh ra nhiệt và lợng nhiệt này có ảnh hởng lớn đến
chất lợng rợu.
Nhiệt độ ảnh hởng lớn đến quá trình phát triển của nấm men do các phản ứng
sinh hoá diễn ra trong tế bào đều chịu sự chi phối của nhiệt độ. Nhiệt độ giới hạn
của men rợu vang là không quá 30
0
c. ở 35
0
c đợc coi là nhiệt độ nguy hiểm, tuy
nhiên đây không đợc coi là quy luật chung tuyệt đối về nhiệt độ. Nhiệt độ 35
0
c
nấm men mất tác dụng , quá trình lên men bị dừng lại nhng không bị chết nấm men.
Trong quá trình lên men rợu vang, việc khống chế nhiệt độ dới 30
0
c là điều rất
quan trọng. Nếu vợt quá đến nhiệt độ tới hạn (35
0
c ), quá trình lên men rợu bị
ngừng lại ảnh hởng đến việc chuyển hoá đờng thành cồn và CO

2
. Đồng thời lợng đ-
ờng sót lại cha đợc lên men là môi trờng cho các vi khuẩn sinh khí hoạt động, đặc
biệt vi khuẩn chuyển hoá đờng thành axit lắc tíc hoặc axit axetic, đó là hiện tợng
hoá chua axit, làm giảm chất lợng rợu vang.
Ngợc lại ở nhiệt độ thấp (<20
0
c), quá trình lên men xảy ra chậm chạp, các
cấu tử có lợi cho rợu vang đợc hình thành quá ít. Quá trình lên men bắt đầu tốt ở
nhiệt độ 20
0
c, ở 25
0
c quá trình lên men xảy ra rõ rệt sau 12 h, còn 17 - 18
0
c xảy
ra sau 24 h. Quá trình lên men không diễn ra ở nhiệt độ thấp 10
0
c. Nh vậy nhiệt độ
thích hợp cho nấm men phát triển là 20 - 28
0
c.
2.6.3. ảnh hởng của nồng độ cồn
Nghiên cứu cho biết nồng độ cồn thích hợp cho rợu vang phát triển tốt: 9
14
0
. Hàm lợng cồn cao gây khó khăn cho quá trình lên men, làm chậm, thậm chí
làm dừng lại quá trình lên men. ảnh hởng của cùng một hàm lợng cồn ở 30
0
c và

20
0
c là hoàn toàn khác nhau. ở 30
0
c cồn gây ảnh hởng xấu hơn ở 20
0
c. Điều này
Phạm Thị Hải Lớp: K27A Sinh KTNN
13
Khoá luận tốt nghiệp
có ý nghĩa quan trọng trong việc cải tạo chất lợng rợu vang. Nhiều thí nghiệm chỉ ra
rằng, chính hàm lợng cồn cao (nồng độ cồn 14% ) đã cản trở sự lên men chứ không
phải sự thiếu vắng các chất sinh trởng hoặc sự tạo thành các chất kháng khuẩn.
Để phục vụ cho công nghiệp sản xuất rợu vang, cải thiện chất lợng vang,
nhiều nhà nghiên cứu đã tạo ra những nòi nấm men thích ứng với nồng độ cao. Việc
sử dụng các nòi nấm men này là bổ ích song các nòi này rất nhạy cảm với nhiệt độ
cao.
2.6.4. ảnh hởng của nồng độ đờng và áp suất thẩm thấu
Ngoài yếu tố pH, nhiệt độ, độ cồn thì nồng độ đờng cũng là một yếu tố quan
trọng, ảnh hởng đến quá trình lên men. Nồng độ đờng cao, ức chế quá trình lên men.
Nồng độ đờng thích hợp khoảng 200 280 g/l. Nếu cao hơn nữa tốc độ lên men
giảm đi.
Đờng và các chất hoà tan khác trong môi trờng tạo áp suất, áp suất thẩm thấu
chênh lệch giữa tế bào nấm men và môi trờng nuôi cấy. Sự chênh lệch này làm cho
các chất dinh dỡng dễ hòa tan và thấm vào môi trờng tế bào qua màng và sản phẩm
của tế bào hoà tan vào môi trờng. áp suất thẩm thấu quá cao gây hiện tợng khô sinh
lý teo chất nguyên sinh. Nồng độ quá cao tế bào nấm men không sinh trởng đợc.
Nồng độ đờng quá thấp tế bào sẽ ngừng phát triển.
Phạm Thị Hải Lớp: K27A Sinh KTNN
14

Khoá luận tốt nghiệp
Phần 3
Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu
3.1. Đối tợng nghiên cứu
Quả vải thiều (Litchi chinensis sonn ) đợc thu nhận từ hai trung tâm trồng và thu
hoạch nhiều nhất ở Việt Nam là huyện Lục Ngạn (Bắc Giang ) và Thanh Hà (Hng
Yên ).
Các chủng nấm men nghiên cứu đợc phân lập từ dịch cùi quả vải thiều có vị trí
phân loại theo Yelinov N.(1996 ) sau đây:
Lớp : Ascomycetes
Bộ : Saccharomyateae
Họ phụ : Saccharomyateaetdieae
Giống : Saccharomyces
Loài : Cervisiae
3.2. Hoá chất
- Đờng: glucoza, sacaorza.
- Một số chất vô cơ: KH
2
SO
4
( Kalihiđrophotphat ).
MgSO
4
. 7H
2
O ( Magie sun phat ).
- Một số chất hữu cơ: Thạch agar, peptôn, phenolphtalein.
- Nớc cất, nớc máy.
- Cồn.
3.3. Dụng cụ thiết bị

- Nồi hấp áp lực.
- Cồn kế.
- Kính hiển vi quang học.
- Buồng đếm Goriaev.
- Cân kỹ thuật và cân phân tích.
- Tủ sấy.
- Buồng vô trùng.
- ống nghiệm.
- Máy đo pH và giấy đo pH.
- Hộp pêtri.
- Bình cầu, bình tam giác.
- Bàn trong thuỷ tinh, phễu thuỷ tinh, côc thuỷ tinh.
- Que cấy, đèn cồn.
3.4. Môi trờng
Dựa vào tính chất của nấm men Saccharomyces cerevisiae chúng tôi chọn
môi trờng vô cơ theo tỷ lệ sau:
3.4.1. Môi trờng Hansen (MT
1
) g/l: Môi trờng phân lập và sơ tuyển chủng nấm
men
Phạm Thị Hải Lớp: K27A Sinh KTNN
15
Khoá luận tốt nghiệp
- Đờng glucoza : 50 g.
- Pepton : 5,0 g.
- MgSO
4
. 7 H
2
O : 0,5 g.

- KH
2
PO
4
: 1,0 g.
- (NH
4
)
2
SO
4
: 1,0 g.
- Thạch agar : 20 g.
- Nớc cất : 1000 ml.
3.4.2. Môi trờng nhân giống (MT
2
): g/l.
- Đờng glucoza : 50 g.
- Pepton : 5,0 g.
- MgSO
4
. 7 H
2
O : 0,5 g.
- KH
2
PO
4
: 1,0 g.
- (NH

4
)
2
SO
4
: 1,0 g.
- Nớc cất : 1000 ml.
3.4.3. Môi trờng lên men (MT
3
) : g/l.
- Dịch siro hoa quả :200
- MgSO
4
. 7 H
2
O : 1,0 g.
- KH
2
PO
4
: 1,0 g.
- (NH
4
)
2
SO
4
: 1,0 g.
- Nớc cất : 1000 ml.
3.5. Phơng pháp nghiên cứu:

Trong đề tài này tôi sử dụng phơng pháp nghiên cứu sau:
1. Tuyển chọn khuẩn lạc nấm men.
2. Xác định hoạt lực lên men bằng:
+ Cân bình trọng lợng.
+Xác định số lợng tế bào trên buồng đếm Goriaev và hoạt hoá giống.
3. Xác định hàm lợng đờng bằng khúc xạ kế.
4. Xác định độ pH bằng giấy đo pH và máy đo pH.
5. Quan sát tế bào nấm men trên kính hiển vi quang học có độ phóng đại
1000 lần.
6. Các phơng pháp phân tích:
+ Xác định hàm lợng axit trong dịch lên men bằng chuẩn độ NaOH 0,1 N.
+ Xác định độ cồn bằng ancol kế rồi quy về độ cồn chuẩn 15
0
c, bằng ph-
ơng pháp hoá học.
7. Xử lý số liệu bằng thống kê toán học.
3.5.1. Phân lập và tuyển chọn khuẩn lạc nấm men trên môi trờng thạch đĩa:
Để tuyển chọn một tập hợp tế bào nấm men của cùng một nòi có kích thớc
hình thái và khả năng lên men nh nhau, chúng tôi chọn phơng pháp phân lập trên
hộp pêtri. Môi trờng để tuyển chọn khuẩn lạc nấm men là Hansen.
Phạm Thị Hải Lớp: K27A Sinh KTNN
16
Khoá luận tốt nghiệp
Các tiến hành: Môi trờng phân lập đợc khử trùng và phân vào các hộp pêtri
vô trùng để nguội theo phơng pháp Pasteur.
Dịch hoa quả đã đợc pha loãng 10
-1
- 10
-10
bằng nớc cất. Nhờ một hai giọt

huyền phù với độ pha loãng 10
-9
lên bề mặt thạch dàn đều bằng bàn trang. Gói kín
và nuôi trong tủ ẩm ở điều kiện 24 28
0
c trong 4 ngày trên bề mặt xuất hiện các
khuẩn lạc, với các đặc điểm trắng, bóng đặc trng cho nấm men (mép răng ca và nhẵn
bóng ).
3.5.2. Phơng pháp hoạt hoá giống
Trớc khi cấy nấm men vào dịch lên men để có những tế bào to khoẻ thì tôi
tiến hành hoạt hoá giống bằng cách nuôi trên môi trờng thạch nghiêng 24 28
0
c
trong vòng 24 h trên máy lắc. Sau đó đem cấy vào dịch nhân giống đợc pha ở nồng
độ đờng 10% trong vòng 24 h đợc giống cấp hai.
3.5.3. Phơng pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men
Để biết đợc hoạt lực lên men so sánh giữa các chủng, chúng tôi đã tiến hành
dùng các phơng pháp sau:
* Phơng pháp cân bình trọng lợng:
Dịch lên men trong các bình có cùng thể tích 250 ml môi trờng, có cùng một
lợng tế bào nấm men của các giống khác nhau. Sau 24 h lên men đem cân trọng l-
ợng chênh lệch giữa 2 lần cân là 0,1 thì dừng lại.
* Phơng pháp xác định tế bào bằng buồng đếm Goriaev:
Cấy giống vào môi trờng nhân giống ở 28
0
c, lắc đều canh trờng dùng pipet
chia độ pha loãng canh trờng. Tuỳ theo mức độ giai đoạn phát triển mà độ pha loãng
theo tỷ lệ khác nhau. Dùng pipet lấy dịch pha loãng nhỏ vào một khe hở giữa hai
tấm kính, chú ý tránh tạo bọt khí sau đó đặt lá kính lên trên để yên 3 5 phút rồi
tiến hành soi trên kính hiển vi ở vật kính 10 và 40 đếm số tế bào trong 5 ô lớn chéo

nhau.
Cách tính số tế bào trong 1 ml : M = A. 50. B.
Trong đó: M: Số tế bào trong 1 ml dịch huyền phù.
A: Số lợng tế bào trung bình trong 1 ô vuông.
B : Hệ số pha loãng.
3.5.4. Phơng pháp phân tích
+ Xác định hàm lợng đờng bằng khúc xạ kế.
+ Xác định độ pH bằng giấy đo pH và máy đo pH.
+ Xác định hàm lợng axit trong dịch lên men bằng cách:
Dựa vào nguyên tắc trung hoà axit bằng dung dịch NaOH 0,1 N từ số ml
NaOH 0,1 N dùng để chuẩn ta suy ra hàm lợng axit trong dịch lên men.
Phản ứng trung hoà: OH
-
+ H
+
H
2
O
3.5.5. Quan sát hình dạng tế bào trên kính hiển vi
Phạm Thị Hải Lớp: K27A Sinh KTNN
17
Khoá luận tốt nghiệp
Quan sát hình thái tế bào nấm men trên kính hiển vi quang học có độ phóng
đại 1000 lần.
3.5.6. Phơng pháp xử lý các kết quả bằng thống kê toán học
Xử lý các kết quả nghiên cứu và đánh giá theo phơng pháp thống kê toán học
thông qua các thông số sau:
- Giá trị trung bình số học:
X
=

=
n
i
n
Xi
1
- Độ lệch chuẩn:

=
( )
1
2



n
XXi
nếu n < 30


=
( )
n
XXi


2
nếu n

30
- Sai số trung bình số học: m =


n

- Hệ số biến động: Cv % =
X

. 100 (%).
n : Số lần lặp lại.
Xi : Giá trị đo lần thứ i.
Phạm Thị Hải Lớp: K27A Sinh KTNN
18
Khoá luận tốt nghiệp
Phần 4
Kết quả nghiên cứu và thảo luận
4.1. Phân lập, tuyển chọn và định loại chủng nấm men
4.1.1. Tiêu chuẩn chọn chủng
Quá trình sản xuất etanol phụ thuộc vào chủng dùng trong lên men. Nấm
men sử dụng để lên men rợu vang từ dịch vải thiều phải đạt các yêu cầu sau: [10,
12].
- Lên men tốt trong môi trờng có hàm lợng đờng cao.
- Chịu độ cồn và độ axit cao.
- Tốc độ phát triển nhanh, chu kỳ lên men ngắn.
- Hơng thơm có tạo các este đặc biệt.
- Dễ lắng trong.
- ổn định lâu dài trong sản xuất.
4.1.2. Phân lập và tuyển chọn
Môi trờng phân lập là môi trờng Hansen đợc thanh trùng theo phơng pháp

Pasteur sau đó đợc phân vào các đĩa petri đã vô trùng. Dịch vải đợc pha loãng từ 10
-1
10
-10
, dùng pipet lấy 1 ml dịch huyền phù 10
-9
mở hé đĩa petri nhỏ vào đó từ 1
2 giọt, dùng bàn trang vô trùng nhẹ nhàng dàn đều thể tích đó khắp bề mặt môi tr-
ờng. Nuôi trong tủ ấm 28
0
c trong thời gian 48 giờ. Sau 12 lần phân lập chúng tôi đã
chọn đợc 35 mẫu nấm men. Khi có mẫu tiến hành lựa chọn 2 mẫu có đờng kính
khuẩn lạc lớn nhất và khả năng lên men cao nhất đa sang nghiên cứu tiếp. Hai mẫu
nấm men này tạm thời đợc gọi là H
7
và C
13
.
4.1.3. Xác định tên khoa học của hai mẫu nấm men H
7
và C
13
Dựa vào khoá phân loại của Loder năm 1971 (Khoá phân loại mới đợc nhiều
ngời sử dụng ), theo khóa phân loại này cả hai mẫu nấm men nghiên cứu đều có đặc
tính [10]:
- Sinh sản bằng nảy chồi nhiều phía.
- Không đồng hoá nitrat.
- Tế bào hình trứng, ovan, hình cầu.
- Lên men Glucôza mạnh.
- Lên men đợc saccaroza, galactoza, mantoza.

- Điều kiện không thuận lợi hình thành 1

4 bào tử.
- Mỗi nang chứa 2

4 bào tử.
Từ đó tạm thời đặt tên cho 2 mẫu nấm men là Sacharomyces cerevisiae H
7
và
C
13
.
4.2. Xác định hoạt lực lên men
Trong quá trình lên men thì hoạt lực lên men đợc đánh giá bằng hàm lợng
CO
2
sinh ra. Lợng CO
2
sinh ra càng nhiều, thoát ra ngoài môi trờng thì trọng lợng
bình lên men càng giảm. Điều đó chứng tỏ hoạt lực lên men càng mạnh. Chúng tôi
Phạm Thị Hải Lớp: K27A Sinh KTNN
19
Khoá luận tốt nghiệp
tiến hành thí nghiệm trên hai chủng H
7
và C
13
với số lần nhắc lại là 8 lần, thu đợc
kết quả lợng CO
2

thoát ra trong 72 h từ khi lên men ở bảng số 2.
Bảng 2.Hàm lợng khí CO
2
giải phóng sau 72 h lên men của hai chủng nấm men
Sacharomyces cerevisiae H
7
và C
13
.
Tên
chủng
Hàm lợng CO
2
(g/100 ml )
TN1 TN2 TN3 TN4 TN5 TN6 TN7 TN8
H
7
2,32 2,36 2,30 2,58 2,60 2,35 2,47 2,40
C
13
2,60 2,48 2,45 2,32 2,30 2,58 2,28 2,35
Qua kết quả nghiên cứu cho thấy hai chủng H
7
và C
13
đều lên men mạch, lợng
CO
2
thoát ra nhiều, phủ kín bề mặt lên men làm môi trờng lên men ít bị ô nhiễm. Sự
phát triển nhanh của tế bào nấm men làm cho vi khuẩn, nấm men dại khó xâm nhập,

với lợng CO
2
thoát ra đạt trên 4g/100 ml là đạt yêu cầu dùng cho lên men rợu vang
các loại hoa quả. Vì vậy, hai chủng này đợc nghiên cứu tiếp động thái phát triển
[10].
4.2.2. Động thái phát triển của hai chủng nấm men Sacharomyces cerevisiae H
7
và C
13
Trong qúa trình sản xuất rợu vang giai đoạn nhân giống chiếm một thời gian
ngắn khoảng 24 28 h, nhng nó lại đóng vai trò hết sức quan trọng trong quá trình
tăng nhanh số lợng của tế bào nấm men. Việc nghiên cứu các nhân tố ảnh hởng tới
sự sinh trởng và phát triển 2 chủng H
7
và C
13
là một phần trong quá trình sản xuất r-
ợu.
Chúng tôi tiến hành nuôi cấy trên môi trờng số 2 (môi trờng nhân giống ) ở
điều kiện môi trờng 28
0
c, số tế bào ban đầu 3,5 . 10
6
tế bào, cứ sau 12 h kiểm tra 1
lần. Mục đích là xác định động thái phát triển của 2 chủng nấm men H
7
và C
13
. Kết
quả thí nghiệm đợc diễn ra ở bảng 3 và đồ thị 2.

Bảng 3. Động thái phát triển của 2 chủng nấm men S . cerevisiae H7 và C13
Thời
gian(h)
H7 C13
M.10
6

m

(%)
C
v
(%)
M.10
6

m

(%)
C
v
(%)
0
3,5

0,2
0,00 0,00
3,5

0,2

0,00 0,00
4
6,2

2
0,14 0,24
8,0

3
0,15 0,24
8
11,8

2,5
0,12 0,20
12,6

34
0,14 0,22
12
14

2
0,12 0,20
16

0,41
0,13 0,20
16
28,2

0,36
0,08 0,14
28

0,26
0,10 0,16
20
37

0,23
0,06 0,10
39

0,25
0,07 0,11
24
46

0,25
0,03 0,05
48

0,28
0,02 0,03
28
52

0,36
0,02 0,03

56

0,32
0,02 0,03
32
68

0,42
0,03 0,05
78

0,38
0,04 0,06
36
82

0,38
0,07 0,12
90

0,42
0,07 0,11
40
108

0,46
0,14 0,24
112

0,48

0,14 0,22
44
116

0,42
0,16 0,25
126

0,38
0,17 0,27
Phạm Thị Hải Lớp: K27A Sinh KTNN
20
Khoá luận tốt nghiệp
48
124

0,49
0,18 0,31
138

0,51
0,21 0,33
52
120

0,43
0,15 0,22
134

0,37

0,17 0,27

0
20
40
60
80
100
120
140
160
0
8
16
24
3
2
40
4
8
Chủng H7
Chủng C13
Đồ thị 2. Động thái phát triển của 2 chủng H
7
và C
13
.
Nh vậy cả 2 chủng H
7
và C

13
đều có khả năng phát triển tốt và theo đúng
động thái phát triển . Từ kết quả trên ta xác định đợc động thái phát triển của 2
chủng nh sau:
- Pha tiền phát: từ 0h 12h, vì giai đoạn này tế bào mới thích nghi với môi
trờng, kích thớc tế bào tăng dần lên.
- Pha logarit (pha cấp số mũ ): từ 12h 48h, tế bào nấm men phát triển
nhanh do lợng vật chất tích luỹ ở pha tiền phát.
- Pha cân bằng: từ 48h 60h, số lợng tế bào không tăng.
- Pha suy vong: Tốc độ sinh trởng của nấm men giảm nhanh do vậy nấm men
chết nhiều.
Một số nghiên cứu trớc đây cho thấy kết quả là pha logarit từ 12h 96h.
Tuy nhiên pha logarit của 2 chủng H
7
và C
13
mà chúng ta đã nghiên cứu chỉ tồn tại từ
12h 48h. Nguyên nhân do môi trờng có độ cồn cao, độ pH thấp mà các tế bào
nấm men sinh ra đã lên men, làm ức chế sự sinh trởng của nấm men.
4.3. Nghiên cứu ảnh hởng của môi trờng dinh dỡng đến sự sinh trởng và phát
triển của 2 chủng nấm men Sacharomyces cerevisiae H
7
và C
13
trong môi trờng
lên men
Nh chúng ta đã biết hàm lợng rợu etylic tạo thành, lợng axit hữu cơ sinh ra sẽ
quyết định đến chất lợng rợu vang. Do đó việc nghiên cứu yếu tố của môi trờng đến
quá trình lên men rợu vang là vấn đề cần thiết. Sự biến đổi các yếu tố môi trờng
trong một phạm vi nhất định sẽ ảnh hởng tới sự sinh trởng và phát triển của tế bào

Phạm Thị Hải Lớp: K27A Sinh KTNN
21
Thời gian(h)
Số l ợng tế bào ( M.10
6
)
Khoá luận tốt nghiệp
nấm men. Môi trờng chúng tôi dùng để lên men là môi trờng số 3 (MT3 ) môi trờng
đợc bổ sung đờng cho đủ 210 g/l, hàm lợng men sót, hàm lợng rợu tạo thành, lợng
CO
2
giải phóng, các chỉ tiêu đợc xác định sau 15 ngày. Kết quả đợc dẫn ra ở bảng 4
và đồ thị số 2, 3.
Phạm Thị Hải Lớp: K27A Sinh KTNN
22
Khoá luận tốt nghiệp
Bảng 4. Nồng độ cồn, hàm lợng đờng sót,hàm lợng CO
2
, độ pH trong dịch lên
men sau 15 ngày của 2 chủng H7 và C13
Thời
gian
(ngày)
Đờng (g/l) CO
2
(g/l) Rợu (% V) pH
H
7
C
13

H
7
C
13
H
7
C
13
H
7
C
13
1 210 210 0 0 0 0 4,5 4,5
2
180,6

1 182

1 17,8

0,5 18

0,5 1,8

0,05 2,0

0,05
4,39 4,40
3
160,5

1 162,3

1 19,2

0,5 19,3

0,5 2,1

0,05 2,2

0,05
4,32 4,38
4
143,1

1 140,4

1 20,5

0,5 21,4

0,5 2,8

0,05 3,1

0,05
4,28 4,27
5
110,4

1 108,5

1 25,3

0,5 26,1

0,5 3,5

0,05 3,7

0,05
4,15 4,13
6
87,9

0,8 86,3

0,8 28,9

0,5 29,4

0,5 4,1

0,05 4,2

0,05
4,11 4,09
7
63,5

0,6 60,2

0,6 32,4

0,5 35,2

0,5 4,9

0,05 4,8

0,05
4,07 4,05
8
58,6

0,6 59,3

0,6 40,1

0,5 40,4

0,5 5,5

0,05 5,6

0,05
4,0 4,0
9
46,2

0,4 45,7

0,4 46,2

0,5 48,6

0,5 6,3

0,05 6,5

0,05
3,92 3,93
10
37,1

0,4 39,2

0,4 53,5

0,5 59,2

0,5 7,7

0,05 7,4

0,05
3,86 3,82
11
31,2

0,3 30,7

0,3 60,2

0,5 63,8

0,5 8,4

0,05 8,6

0,05
3,73 3,76
12
22,8

0,3 23

0,3 78,1

0,5 80,2

0,5 9,3

0,05 9,4

0,05
3,62 3,64
13
15,3

0,2 15,9

0,2 83,6

0,5 87,9

0,5 10,4

0,05 10,6

0,05
3,51 3,56
14
10,2

0,2 11,4

0,2 91,3

0,5 93,8

0,5 11,5

0,05 11,5

0,05
3,33 3,29
15
5,3

0,2 5,2

0,2 103,8

0,5 100,4

0,5 12,8

0,05 12,9

0,05
3,20 3,21
Phạm Thị Hải Lớp: K27A Sinh KTNN
23
Khoá luận tốt nghiệp
Đồ thị 2. Nồng độ cồn, hàm lợng đờng sót,hàm lợng CO
2
, độ pH trong dịch lên men
sau 15 ngày của Sacharomyces cerevisiae H
7
Đồ thị 3. Biểu diễn Nồng độ cồn, hàm lợng đờng sót,hàm lợng CO
2
, độ pH trong
dịch lên men sau 15 ngày của Sacharomyces cerevisiae C
13
Qua bảng 4 và đồ thị 2, 3 cho thấy chủng Sacharomyces cerevisiae H
7
và C
13

phát
triển mạnh bắt đầu từ ngày thứ 2 trở đi vì nó đợc đánh dấu bằng sự giảm đi hàm lợng
đờng trong dung dịch lên men. Sự giảm hàm lợng đờng tăng mạnh ở các ngày tiếp
theo. Đồng thời với sự giảm hàm lợng đờng là sự tăng lên của khí CO
2
thoát ra. Độ
rợu cũng tăng và đạt cực đại vào ngày 15 là 12,8% V (H
7
) và 12,9% V (C
13
). Qúa
Phạm Thị Hải Lớp: K27A Sinh KTNN
24
Khoá luận tốt nghiệp
trình lên men hàm lợng axit tăng lên làm pH của môi trờng giảm mạnh từ 4,5 xuống
3,20 (H
7
), 3,21 (C
13
) tạo nên vị chua của rợu vang.
4.3.1. ảnh hởng của hàm lợng đờng tới quá trình lên men
Quá trình lên men quyết định chất lợng rợu vang. Môi trờng lên men có
nhiều đặc điểm khác so với môi trờng nhân giống: hàm lợng đờng trong môi trờng
lên men cao hơn, thời gian kết thúc qúa trình lên men dài hơn. Quá trình lên men kỵ
khí hoàn toàn còn quá trình nhân giống thông khí. Nếu nh tốc độ sinh trởng và phát
triển của tế bào nấm men là nhân tố chính của quá trình nhân giống thì trong qúa
trình lên men lại dựa vào các tiêu chuẩn khả năng sinh rợu, tạo hơng, khả năng
chuyển hoá đờng, màu sắc sản phẩm.
Trng qúa trình lên men, hàm lợng rợu sinh ra chủ yếu từ quá trình chuyển hoá
đờng của nấm men. Do đó, yếu tố môi trờng phải nghiên cứu đầu tiên là ảnh hởng

của hàm lợng đờng tới quá trình lên men.
Theo tính toán, hàm lợng đờng thích hợp cho nấm men là 200 240 g/l. Vì
vậy, chúng tôi tiến hành thí nghiệm với các hàm lợng 200, 210,220, 230, 240 g/l với
hai chủng Sacharomyces cerevisiae H
7
và C
13
. Các chỉ tiêu khác vẫn giữ nguyên pH
= 4,5, giống 12%. Theo dõi quá trình lên men và phân tích chủ tiêu đánh giá: hàm l-
ợng CO
2
thoát ra (g/1000 ml ), số lợng tế bào sau 72
h
, phân tích nồng độ cồn và hàm
lợng đờng sót trong dịch lên men sau 360
h
kết quả đợc dẫn ra ở bảng 5.1,5.2,6 và
biểu đồ 1,2.
Bảng 5.1. Kết qủa về ảnh hởng của hàm lợng đờng đến quá trình lên men của
chủng nấm men H
7
Chỉ tiêu Đơn vị
Hàm lợng đờng trong dịch lên men chủng H
7
200 210 220 230 240
CO
2
g/l 2,75 2,88 2,72 2,55 2,13
Đờng sót g/l
5,8

0,2 5,3

0,2
6,00,2 6,10,2
6,5

0,2
`Cồn %V
10,1

0,2 12,8

0,2
11,00,2 11,50,2
12,4

0,2
Bảng 5.2. Kết qủa về ảnh hởng của hàm lợng đờng đến quá trình lên men của
chủng nấm men C
13
Chỉ tiêu Đơn vị
Hàm lợng đờng trong dịch lên men chủng C
13
200 210 220 230 240
CO
2
g/l 3,16 3,32 3,0 2,9 2,45
Đờng sót g/l
6,1

0,2 5,2

0,2
5,70,2
6,4

0,2 7,0

0,2
Cồn %V
12,2

0,2 12,9

0,2
11,20,2
11,6

0,2 12,4

0,2
Phạm Thị Hải Lớp: K27A Sinh KTNN
25