SỰ HÌNH THÀNH VÀ TĂNG TRƯỞNG CỦA RỄ BẤT ĐỊNH TỪ NUÔI CẤY IN VITRO CỦA CÂY ĐƯƠNG QUY NHẬT BẢN

TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 165-173
SỰ HÌNH THÀNH VÀ TĂNG TRƯỞNG CỦA RỄ BẤT ĐỊNH
TỪ NUÔI CẤY IN VITRO CỦA CÂY ĐƯƠNG QUY NHẬT BẢN
(ANGELICA ACUTILOBA KITAGAWA)
Nguyễn Thị Quỳnh*, Hoàng Ngọc Nhung, Nguyễn Lê Anh Thư
Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, *
TÓM TẮT: Cây Đương quy nhật bản (ĐQNB) là cây thuốc quí, đầu vị trong nhiều bài thuốc cổ truyền,
với dược tính chủ yếu đến từ bộ rễ. Trong nghiên cứu này, sự hình thành và tăng trưởng rễ của cây ĐQNB
in vitro đã được thực hiện trong điều kiện tối với nhiệt độ phòng nuôi 24 ± 2
o
C, độ ẩm tương đối 65 ± 5%.
Phiến lá ở ba vị trí khác nhau của chồi in vitro được nuôi cấy trên môi trường khoáng MS kết hợp với
vitamin Morel hay khoáng và vitamin Gamborg’s B5. Tỷ lệ mẫu tạo rễ đạt 100% cũng như khối lượng
tươi của rễ (132,7 mg/mẫu) lớn nhất khi phiến lá ở vị trí thứ hai tính từ chồi ngọn được nuôi cấy trên môi
trường Gamborg’s B5. Khi phiến lá được nuôi cấy trên môi trường Gamborg’s B5 có bổ sung các
cytokinin bao gồm BA, Kin hoặc TDZ ở các nồng độ 0,1; 0,5 hay 1 mg/l, tỷ lệ mẫu tạo rễ, số rễ/mẫu, khối
lượng tươi của rễ cũng như tỷ lệ khối lượng tươi rễ/khối lượng tươi mẫu lớn nhất ở nồng độ 0,1 mg/l BA.
Trong môi trường lỏng gồm khoáng MS, vitamin Morel, và bổ sung IBA ở các nồng độ 0,2; 0,5 hay 1
mg/l, rễ bất định của cây ĐQNB in vitro khi được nuôi trên máy lắc ở tốc độ 100 vòng/phút đã gia tăng
sinh khối theo sự gia tăng nồng độ IBA và theo thời gian nuôi cấy. Ở ngày thứ 28, rễ bất định của cây
ĐQNB trong môi trường bổ sung 1 mg/l IBA có khối lượng tươi (2423,7 mg/bình) lớn nhất và tăng gần 5
lần so với khối lượng rễ ở ngày nuôi cấy ban đầu (500 mg/bình).
Từ khóa: Angelica acutiloba, auxin, cytokinin, rễ bất định.
MỞ ĐẦU
Cây Đương quy nhật bản (Angelica
acutiloba (Sieb. & Zucc.) Kitagawa) là cây
thuốc quí, đầu vị và không thể thiếu trong y học
cổ truyền đối với việc điều trị bệnh phụ nữ và
bồi bổ khí huyết, đồng thời còn là thuốc trị bệnh
như thuốc chữa thiếu máu, đau đầu, kháng
viêm, tăng cường miễn dịch. Dược tính của cây

Đương quy đến từ bộ phận rễ nơi có chứa rất
nhiều hợp chất thứ cấp, bao gồm 47 hợp chất
khác nhau, trong đó ligustilide (22,8%) và
butylidenephthalide (19,5%) là hai hợp chất
chính. Cây Đương quy nhật bản từ lúc trồng đến
lúc thu hoạch rễ phải mất từ 2-3 năm, dẫn đến
chi phí công lao động và chăm sóc trên đồng
ruộng gia tăng khiến giá thành sản phẩm tăng
theo rất cao [3].
Cây Đương quy nhật bản (ĐQNB) đã được
du nhập vào trồng ở Việt Nam với diện tích mở
rộng từ Tây Bắc đến khu vực sông Hồng gần Hà
Nội [14]. Cây ĐQNB ưa khí hậu ẩm mát, vì vậy
việc gieo hạt và sinh trưởng của cây cần trùng
với thời gian có nhiệt độ thấp trong năm. Thời
gian gieo hạt ở Việt Nam tốt nhất là đầu tháng
10. Việc gieo hạt vào thời điểm muộn hơn
(tháng 11 đến tháng 2) sẽ dẫn đến tỷ lệ nẩy
mầm giảm đáng kể do nhiệt độ giảm mạnh ở
thời điểm này. Ngoài ra, hạt Đương quy dễ mất
khả năng nảy mầm khiến việc sử dụng hạt để
nhân giống gặp nhiều khó khăn. Nhu cầu rễ cây
ĐQNB rất lớn trên thế giới, khoảng 450 tấn
năm 2005 trong khi cung chỉ đạt được xấp xỉ
197 tấn, vì vậy cần tìm phương pháp nhân
nhanh hữu hiệu cây Đương quy mà vẫn đảm
bảo sự đồng nhất về mặt di truyền.
Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật từ
khi ra đời đã đem đến khả năng làm tăng hệ số
nhân giống của thực vật chỉ trong một thời gian

ngắn, đồng thời việc nuôi cấy các cơ quan hay
mô, tế bào thực vật đã giúp các nhà nghiên cứu
thu nhận được các hợp chất thứ cấp có giá trị
trong y dược với hiệu suất cao khi không thể
sản xuất từ tế bào vi sinh vật hoặc tổng hợp
bằng con đường hoá học. Công trình nghiên cứu
về nuôi cấy mô tế bào cây ĐQNB tại Việt Nam
chưa nhiều. Hoàng Ngọc Nhung và nnk. (2012)
[13] đã chứng minh sự tạo chồi trực tiếp của cây
ĐQNB bằng phương pháp nuôi cấy lớp mỏng
cắt ngang của chồi đỉnh cây in vitro trên môi
trường khoáng MS, vitamin Gamborg’s B5, bổ
165
Nguyen Thi Quynh, Hoang Ngoc Nhung, Nguyen Le Anh Thu
sung 0,1 mg/l α-naphthaleneacetic acid (NAA),
1 mg/1 thidiazuron (TDZ), 30 g/l đường
sucrose, 10% (v/v) nước dừa và 40 mg/l
adenine.
Trong bài này, ảnh hưởng của thành phần
khoáng và vitamin khác nhau trong môi
trường nuôi cấy, cũng như vai trò của
cytokinin lên sự tạo rễ bất định từ mẫu
cấy phiến lá của cây ĐQNB in vitro đã
được khảo sát, đồng thời nghiên cứu
bước đầu về sự tăng trưởng của rễ bất
định khi được tách rời khỏi mẫu và nuôi
cấy trong môi trường lỏng được trình
bày.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu

Chồi in vitro cây ĐQNB có nguồn gốc từ
cây nảy mầm từ hạt (do Đại học Chiba, Nhật
Bản cung cấp) khi được nuôi cấy trên môi
trường khoáng MS [12] kết hợp với vitamin
Morel [11] có bổ sung 30 g/l đường sucrose
(công ty Đường Biên Hòa), 8 g/l agar (công ty
Cổ phần Đồ hộp Hạ Long). pH của môi trường
trước khi khử trùng là 5,8. Môi trường được
khử trùng ở nhiệt độ 121
o
C, 1 atm trong 20
phút.
Phương pháp
Sự phát sinh rễ ở các vị trí phiến lá khác nhau
của cây ĐQNB in vitro dưới ảnh hưởng
của thành phần khoáng và vitamin khác
nhau trong môi trường nuôi cấy
Mẫu cấy là phiến lá của chồi in vitro được
nuôi cấy trước đó trên môi trường MS. Mỗi
phiến lá được cắt thành 3 phần, mỗi phần được
rạch 3 đường tạo thành 3 vết thương. Môi
trường nuôi cấy được bổ sung 30 g/l

đường
sucrose, 8 g/l agar, 6 mg/l NAA và 1 mg/l
kinetin (Kin) với pH được điều chỉnh đến 5,8 và
hấp vô trùng ở 121
o
C, 1 atm trong thời gian 20
phút. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu

nhiên theo kiểu 2 yếu tố: (A) thành phần môi
trường, có 2 mức độ: khoáng MS và vitamin
Morel hoặc khoáng và vitamin Gamborg’s B5
[4]; và (B) là vị trí phiến lá mọc ở chồi in vitro,
có 3 mức độ: lá mở 2, 3 hoặc 4 tính từ chồi
ngọn xuống. Thí nghiệm có 6 nghiệm thức, mỗi
nghiệm thức có 5 bình (V = 130 ml), mỗi bình
chứa 18 ml môi trường với 1 mẫu phiến lá được
đặt hoàn toàn trong tối. Phòng nuôi cây có nhiệt
độ 24 ± 2
o
C, độ ẩm tương đối 65 ± 5%. Các thí
nghiệm đều được lặp lại 3 lần, thời gian thí
nghiệm 42 ngày. Tỷ lệ (%) mẫu tạo rễ, số
rễ/mẫu, khối lượng tươi (KLT) và khô (KLK)
của rễ, được xác định ở ngày thứ 42.
Vai trò của cytokinin lên sự tạo rễ bất định trên
mẫu cấy phiến lá của cây ĐQNB in vitro
Mẫu cấy là phiến lá thứ 2 của chồi in vitro
được nuôi cấy trước đó trên môi trường MS.
Mỗi phiến lá được cắt thành 3 phần, mỗi phần
rạch 3 đường tạo thành 3 vết thương. Thí
nghiệm kế thừa kết quả của thí nghiệm trước,
môi trường nuôi cấy với thành phần khoáng và
vitamin Gamborg’s B5 có bổ sung 30 g/l đường
sucrose, 8 g/l agar và 6 mg/l NAA. Thí nghiệm
gồm 9 nghiệm thức với 3 loại cytokinin, bao
gồm N6-benzyladenine (BA), Kin hoặc TDZ,
được bổ sung vào môi trường trước khi khử
trùng ở 3 mức nồng độ 0,1; 0,5 hay 1 mg/l. Mỗi

nghiệm thức có 3 bình (V = 130 ml), mỗi bình
chứa 18 ml môi trường với 1 mẫu phiến lá. Thí
nghiệm được lặp lại 3 lần. Điều kiện nuôi cấy
giống như thí nghiệm trên. Các chỉ tiêu theo dõi
bao gồm tỷ lệ (%) mẫu tạo rễ, số rễ/mẫu, KLT
rễ, tỷ lệ (%) KLT rễ/KLT mẫu, được xác định ở
ngày thứ 42.
Nghiên cứu sự tăng trưởng của rễ bất định cây
ĐQNB khi nuôi cấy trong môi trường lỏng có
lắc
Cùng lúc với nghiên cứu tạo rễ bất định từ
phiến lá, thí nghiệm khảo sát sự tăng trưởng của
rễ bất định tách rời từ chồi cây ĐQNB khi nuôi
cấy trên môi trường lỏng cũng được tiến hành
nhằm hướng đến việc sản xuất sinh khối rễ
trong hệ thống bioreactor sau này. Mẫu cấy là rễ
bất định tách ra từ cây ĐQNB in vitro hình
thành trong quá trình phát triển chồi thành cây
hoàn chỉnh. Mỗi mẫu có trọng lượng tươi ban
đầu là 500 mg được đặt vào trong bình tam giác
(V = 370 ml) chứa 50 ml môi trường lỏng gồm
khoáng MS, vitamin Morel, 30 g/l đường
sucrose và được bổ sung indole-3-butyric acid
(IBA) với các nồng độ 0,2; 0,5 hay 1 mg/l. pH
của môi trường được điều chỉnh là 5,8 trước khi
hấp khử trùng ở 121
o
C, 1 atm trong 20 phút.
Các bình môi trường lỏng chứa mẫu cấy được
166

TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 165-173
đặt trên máy lắc INNOVA (công ty New
Brunswick Scientific, Hoa Kỳ), model 2100,
với vận tốc 100 vòng/phút trong điều kiện hoàn
toàn tối. Phòng nuôi cấy có nhiệt độ 24±2
o
C, độ
ẩm tương đối 65±5%. Thí nghiệm gồm 3
nghiệm thức tương ứng với 3 nồng độ IBA, mỗi
nghiệm thức 3 bình, được lặp lại 3 lần. Thời
gian thí nghiệm là 28 ngày. Khối lượng tươi của
rễ được đo ở các ngày nuôi cấy thứ 7, 14, 21, 28
và 35.
Số liệu các thí nghiệm được phân tích
ANOVA, một hoặc hai yếu tố, bằng phần mềm
thống kê MSTATC, phiên bản 2.1, của Đại học
bang Michigan, Hoa Kỳ và vẽ biểu đồ bằng
phần mềm Microsoft Office Excel 2007.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Sự phát sinh rễ ở các vị trí phiến lá khác
nhau của cây ĐQNB in vitro dưới
ảnh hưởng của thành phần khoáng
và vitamin khác nhau trong môi
trường nuôi cấy
Sự cảm ứng tạo rễ bất định và dinh dưỡng
khoáng có mối quan hệ mật thiết với nhau.
Trong thí nghiệm này, thành phần khoáng và
vitamin có ảnh hưởng rõ rệt lên khối lượng tươi
của rễ bất định ở các vị trí mẫu khác nhau vào
ngày kết thúc thí nghiệm (bảng 1, hình 1). Tất

cả các mẫu phiến lá cấy trên môi trường khoáng
và vitamin Gamborg’s B5 đều cho KLT cao hơn
các mẫu cấy trên môi trường có thành phần
khoáng MS kết hợp với vitamin Morel. Mẫu
cấy ở công thức B2 cho rễ có KLT cao nhất
132,7 mg/mẫu, trong khi mẫu cấy có KLT của
rễ thấp nhất là ở công thức M2 (3,0 mg/mẫu).
Hai loại môi trường MS và Gamborg’s B5 đều
tương đồng về chủng loại và hàm lượng các
thành phần khoáng vi lượng. Vì vậy, sự phát
sinh rễ bất định của cây ĐQNB trong nuôi cấy
này có thể do sự khác biệt về thành phần và
hàm lượng của khoáng đa lượng hay vitamin.
Schwambach et al. (2005) [17] chứng minh Ca,
Zn và N trong môi trường nuôi cấy đã có ảnh
hưởng đáng kể đến số lượng rễ hình thành trên
đối tượng Eucalyptus globulus Labill. Trong
thành phần khoáng đa lượng của môi trường
Gamborg’s B5, NH
4
+
hiện diện chỉ bằng 8% so
với môi trường MS ((NH
4
)
2
SO
4
/NH
4

NO
3
), nên
tính đối kháng giữa sự đồng hoá đạm và hấp thu
các cation đa lượng không cao, vì thế sự cảm
ứng tạo rễ bất định của mẫu cấy phiến lá cây
ĐQNB trên môi trường khoáng Gamborg’s B5
đạt hiệu quả lớn hơn (bảng 1). Nghiên cứu của
Nguyễn Thị Liễu và nnk. (2010) [8] cũng cho
thấy thành phần khoáng đa lượng và vi lượng
trong môi trường Gamborg’s B5 là phù hợp cho
sự tạo rễ bất định từ mô sẹo có nguồn gốc từ rễ
của cây Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha
et Gurshv.) khi môi trường có bổ sung 7 mg/l
NAA.
Bảng 1. Ảnh hưởng của thành phần khoáng, vitamin và vị trí phiến lá của cây ĐQNB lên tỷ lệ mẫu
tạo rễ, số rễ/mẫu, khối lượng tươi (KLT) và khối lượng khô (KLK) của rễ ở ngày thứ 42
Công thức
z
Tỷ lệ mẫu tạo rễ
Số rễ/mẫu
KLT rễ
KLK rễ
M2
73,6
4,3
3,0 e
x
0,9
M3

44,4
4,5
5,4 de
0,8
M4
55,6
14,3
16,5 d
4,1
B2
100,0
39,5
132,7 a
17,6
B3
90,0
36,4
71,4 c
11,9
B4
88,9
42,5
103,4 b
14,1
ANOVA
y
Khoáng - Vit (A)
**
**
**

**
Vị trí lá (B)
*
*
**
NS
A x B
NS
NS
**
NS
z
M hoặc B bên trái đại diện cho khoáng MS kết hợp với vitamin Morel hoặc khoáng và vitamin Gamborg’s
B5, các số bên phải đại diện cho vị trí lá thứ 2, 3 hoặc 4;
y
NS, *, **: không khác biệt hoặc khác biệt có ý
167
Nguyen Thi Quynh, Hoang Ngoc Nhung, Nguyen Le Anh Thu
nghĩa ở p ≤ 0,05 hoặc 0,01;
x
Các trị số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo
trắc nghiệm phân hạng Duncan’s Multiple Range Test.
Trong thành phần vitamin, thyamine đóng
vai trò quan trọng trong sự chuyển hoá
carbohydrate và trực tiếp tham gia vào quá trình
sinh tổng hợp một số loại acid amin, cho nên
thyamine cần được cung cấp liên tục trong quá
trình nuôi cấy [15]. Thyamine hiện diện trong
vitamin Gamborg’s B5 với hàm lượng cao gấp
10 lần so với trong vitamin Morel. Vì vậy, có

thể thyamine cũng đã ảnh hưởng đến việc làm
gia tăng số lượng rễ bất định của cây ĐQNB.
Chée (1995) [1] cũng đã chứng minh thyamine
cần thiết cho quá trình cảm ứng tạo rễ bất định ở
loài Taxus sp

Hình 1. Ảnh hưởng của thành phần khoáng và vitamin trong môi trường nuôi cấy
lên sự hình thành rễ ở các vị trí khác nhau của mẫu cấy phiến lá của cây ĐQNB
M hoặc B bên trái đại diện cho khoáng MS và vitamin Morel hoặc khoáng và vitamin Gamborg’s B5, các số
bên phải đại diện cho vị trí lá thứ 2, 3 hoặc 4.
Môi trường nuôi cấy là yếu tố tác động
chính gây cảm ứng ở mô nuôi cấy, tuy nhiên,
tuổi sinh lý của mô cấy cũng cần quan tâm do
ảnh hưởng của nó liên quan đến sự phát sinh
hình thái ở thực vật nuôi cấy như sự tạo mô sẹo,
tạo chồi hay rễ bất định. Ở ngày thứ 42, tỷ lệ
mẫu cấy hình thành mô sẹo ở vết thương và tạo
rễ giảm dần ở các vị trí phiến lá càng xa chồi
ngọn dù cấy trên loại môi trường nào, cùng với
số mẫu phiến lá hóa nâu đen và chết tăng dần. Ở
mẫu phiến lá thứ 4 tuy cho lượng rễ nhiều,
nhưng tỷ lệ mẫu không tạo rễ cao. Mẫu nuôi cấy
trên môi trường khoáng và vitamin Gamborg’s
B5 có tỷ lệ tạo rễ ở phiến lá thứ 2 lên đến 100%
mặc dù không khác biệt về phương diện thống
kê so với các nghiệm thức còn lại (bảng 1). Mẫu
cấy càng già, khả năng phản biệt hoá bị suy
giảm khiến khiến khả năng tái biệt hoá thành rễ
bất định theo con đường trực tiếp hoặc gián tiếp
thông qua mô sẹo cũng bị ảnh hưởng.

Vai trò của cytokinin lên sự tạo rễ bất định
trên mẫu cấy phiến lá của cây ĐQNB in vitro
Mỗi loại mẫu cấy đều chứa một lượng auxin
168
TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 165-173
và cytokinin nội sinh nhất định. Auxin sẽ
cảm ứng mẫu cấy tạo mô sẹo và hình thành sơ
khởi rễ khi phối hợp với cytokinin theo một tỷ
lệ thích hợp. Khi môi trường nuôi cấy có bổ
sung auxin và cytokinin ngoại sinh, tùy vào tỷ
lệ auxin tổng: cytokinin tổng mà mẫu cấy sẽ có
những đáp ứng khác nhau, nếu tỷ lệ auxin:
cytokinin lớn thì kích thích sự ra rễ. Trong thí
nghiệm này, phiến lá cây ĐQNB được nuôi cấy
trong môi trường có 6 mg l
-1
NAA và khi bổ
sung thêm Kin hoặc BA đều có sự hình thành rễ
bất định (bảng 2). Tuy nhiên, tỷ lệ mẫu tạo rễ ở
các công thức có sự hiện diện của BA cao hơn
so với các nghiệm thức có Kin, đồng thời tỷ lệ
mẫu tạo rễ và số rễ/mẫu giảm dần khi nồng độ
BA tăng từ 0,1 lên 1 mg/l. Gaspar et al. (1996)
[5] cho rằng việc bổ sung cytokinin có thể gây
ức chế một số hoạt tính của auxin. Vì vậy, KLT
của rễ cùng với tỷ lệ KLT rễ/KLT mẫu giảm
dần khi nồng độ BA bổ sung vào môi trường
tăng dần. Tuy nhiên, tùy theo loại cytokinin mà
sự phối hợp với auxin trong môi trường đem
đến sự khác biệt về tỷ lệ mẫu tạo rễ, số lượng rễ

hay khối lượng rễ, tương tự như thí nghiệm ở
cây đậu (Phaseolus vulgaris), kinetin ức chế sự
hình thành rễ trên trụ hạ diệp [6], trong khi lại
kích thích hình thành rễ bất định ở trụ hạ diệp
và cuống lá của Pinus radiata [18], hay của cây
hoa hồng [21]. Tương tự trong thí nghiệm này,
tỷ lệ mẫu tạo rễ và số rễ, đồng thời KLT rễ cùng
với tỷ lệ KLT rễ/KLT mẫu tăng cùng với sự
tăng nồng độ Kin trong môi trường nuôi cấy
(bảng 2, hình 2).
Bảng 2. Ảnh hưởng của cytokinin lên tỷ lệ mẫu tạo rễ, số rễ, khối lượng tưới (KLT) và tỷ lệ khối
lượng tươi rễ/khối lượng tươi mẫu (KLT rễ/KLT mẫu) của rễ bất định trên mẫu cấy
phiến lá của cây ĐQNB ở ngày thứ 42
Nghiệm thức
z
Tỷ lệ mẫu
Số rễ/mẫu
KLT rễ
KLT rễ/KLT
B0,1
74,1 a
x
26,4 a
137,30 a
x
34,63 a
B0,5
74,1 a
22,3 a
91,59 a

15,60 b
B1
29,6 bc
1,7 b
3,62 b
1,92 c
K0,1
7,4 c
0,7 b
0,76 b
0,25 c
K0,5
25,9 bc
5,1 b
14,29 b
5,43 bc
K1
44,4 ab
20,8 a
92,71 a
28,32 a
T0,1
0,0 c
0,0 b
0,00 b
0,00 c
T0,5
0,0 c
0,0 b
0,00 b

0,00 c
T1
0,0 c
0,0 b
0,00 b
0,00 c
ANOVA
y



Loại cyt. (A)
**
**
*
**
Nồng độ cyt. (B)
NS
NS
NS
NS
A x B
**
**
**
**
z
B, K, hoặc T bên trái đại diện cho BA, Kin hoặc TDZ; các số bên phải đại diện cho nồng độ (0,1; 0,5 hoặc 1
mg l
-1

);
y
NS, **: không khác biệt hoặc khác biệt có ý nghĩa ở p ≤ 0,01;
x
Các trị số có chữ cái
giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng Duncan’s
Multiple Range Test.
169
Nguyen Thi Quynh, Hoang Ngoc Nhung, Nguyen Le Anh Thu
Hình 2. Ảnh hưởng của BA, Kin hay TDZ ở các nồng độ khác nhau
lên sự hình thành rễ của mẫu cấy phiến lá cây ĐQNB
Chữ B, K hoặc T bên trái đại diện BA, Kin hoặc TDZ; các số bên phải
đại diện cho nồng độ (0,1; 0,5 hoặc 1 mg l
-1
).
Sự hiện diện của TDZ trong môi trường
nuôi cấy đã không cảm ứng mẫu cấy tạo rễ bất
định như BA hay Kin mà chỉ cảm ứng tạo mô
sẹo có màu vàng trắng nơi có vết thương. Điều
này chứng tỏ TDZ kết hợp với auxin nội sinh
trong mô cấy đã cảm ứng sự tăng sinh tế bào,
nhưng hoạt tính tạo sơ khởi rễ bất định có thể đã
bị TDZ ức chế nên không hình thành sơ khởi rễ
bất định. Theo Mok et al. (1982) [10], cấu trúc
phân tử của TDZ có 2 nhóm chức năng là nhóm
phenyl và nhóm thidiazon. Do đó, tùy theo sự
hoạt động của hai nhóm này mà kết quả cảm
ứng của mô nuôi cấy sẽ khác nhau.
Nghiên cứu sự tăng trưởng của rễ bất định
cây ĐQNB khi nuôi cấy trong môi trường

lỏng có lắc
Việc bổ sung các auxin như IBA vào môi
trường nuôi cấy ở nhiều loài thực vật dẫn đến sự
cảm ứng tạo rễ bất định [9]. Trong thí nghiệm
này, sự gia tăng sinh khối rễ theo thời gian nuôi
cấy chịu ảnh hưởng rõ rệt bởi sự hiện diện và sự
gia tăng nồng độ của IBA (hình 3 và 4). Khối
lượng tươi của rễ gia tăng khi nồng độ IBA
trong môi trường nuôi cấy tăng. Ở các ngày
nuôi cấy thứ 14, 21, 28 khối lượng tươi của rễ
đều gia tăng nhanh, gấp đôi hay gấp ba khi nồng
độ IBA bổ sung ở mức 0,5 hay 1 mg/l so với rễ
nuôi trong môi trường có bổ sung IBA 0,2 mg/l
(hình 3). Ở ngày nuôi cấy thứ 28, sự gia tăng
sinh khối rễ ở nghiệm thức bổ sung IBA 1 mg/l
là lớn nhất (1923,7 mg/bình) với khối lượng
tươi trung bình của nghiệm thức này là 2423,7
mg/bình. Sự gia tăng khối lượng tươi rễ bất định
ở bất kỳ nồng độ IBA nào của cây ĐQNB theo
thời gian nuôi cấy đã thể hiện động học tăng
trưởng rễ điển hình (hình 3). Từ ngày nuôi cấy
đầu tiên đến ngày nuôi cấy thứ 7, khối lượng rễ
gia tăng tương đối chậm (lag phase - pha tiềm
tàng). Từ ngày nuôi cấy thứ 7 đến ngày nuôi
cấy thứ 21, khối lượng rễ gia tăng nhanh ở tất cả
các nghiệm thức (log/exponential phase - pha
tăng trưởng). Sự tăng trưởng của rễ trở nên
chậm, tương đối ổn định từ ngày nuôi cấy 21
đến ngày 28 (stationary phase - pha ổn định), và
có khuynh hướng đi vào trạng thái suy thoái,

không tăng trưởng thêm từ ngày 28 vào ngày
thứ 35 (diminishing growth phase - pha suy
thoái) (hình 3). Từ kết quả này, việc nuôi cấy rễ
bất định cây ĐQNB trên môi trường lỏng có bổ
sung IBA nên dừng ở ngày thứ 28 để thu sinh
170
TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 165-173
khối, hoặc môi trường mới cần được bổ sung
cho chu kỳ nuôi cấy rễ tiếp theo.
Hình 3. Sự biến thiên sinh khối rễ cây ĐQNB
theo thời gian nuôi cấy
Chữ I đại diện cho IBA, các số bên phải của chữ
I đại diện các nồng độ 0,2; 0,5 hay 1 mg/l.
Sự không tăng sinh khối tươi rễ ở tất cả các
công thức khi kéo dài thời gian nuôi cấy từ ngày
28 đến ngày thứ 35 có lẽ do sự giảm pH của
môi trường nuôi cấy thông qua việc hấp thu
dinh dưỡng khoáng của các tế bào rễ. Sau 35
ngày nuôi cấy, pH của môi trường bổ sung IBA
0,2; 0,5 hay 1 mg/l lần lượt là 4; 3,9 hay 3,8. pH
của môi trường giảm càng mạnh, chứng tỏ tế
bào hấp thu lượng dinh dưỡng khoáng từ môi
trường càng lớn. Rễ cây luôn có sự hấp thu tích
cực và chọn lọc các chất dinh dưỡng thông qua
quá trình trao đổi chất của tế bào. Để hấp thu
các chất dinh dưỡng dưới dạng cation, rễ cây
phải tiết ra các ion H
+
để trao đổi với môi
trường xung quanh. Ion H

+
tích lũy dần trong
vùng rễ, làm cho pH của môi trường giảm dần.
Mặt khác sự hấp thu tích cực cũng dẫn đến tiêu
hao nhiều năng lượng của tế bào, vì vậy rễ hô
hấp mạnh và thải ra nhiều khí CO
2
vào môi
trường hệ rễ. Lượng khí CO
2
này kết hợp với
nước tạo ra một lượng acid carbonic, tích lũy
ngày càng nhiều dẫn đến việc làm giảm pH của
môi trường [20]. Tuy nhiên, Dilorio et al.
(1992) [2] đã chứng minh sự gia tăng khí CO
2
trong bình nuôi cấy do sự hô hấp của rễ cùng
với sự thiếu hụt O
2
đã kích thích rễ tơ tăng
trưởng mạnh hơn.
Hình 4. Rễ cây ĐQNB trên các môi trường nuôi cấy khác nhau
Chữ I đại diện cho IBA, các số bên phải chữ I đại diện các nồng độ 0,2; 0,5 hay 1 mg/l.
Trong thí nghiệm này, rễ tăng trưởng còn
nhờ vào nguồn carbon hữu cơ có mặt trong môi
trường nuôi cấy, chủ yếu là của đường sucrose.
Rễ cây ĐQNB thông qua hô hấp sẽ tiêu thụ
carbon đồng hóa để có năng lượng cần thiết cho
sự duy trì và gia tăng sinh khối, vì vậy tiến trình
này cần thiết phải có sự hiện diện của oxy. Theo

Yu et al. (2000) [22], sự thông khí của hệ thống
nuôi cấy là yếu tố quan trọng trong sự hình
thành rễ bất định. Soffer và Burger (1988) [19]
cũng đã chứng minh rằng oxy hòa tan thiết yếu
cho sự hình thành và tăng trưởng của rễ bất
định. Do bình nuôi cấy rễ bất định của cây
ĐQNB là bình kín, không có sự trao đổi khí với
171
Nguyen Thi Quynh, Hoang Ngoc Nhung, Nguyen Le Anh Thu
bên ngoài, lượng oxy hòa tan trong môi trường
nuôi cấy sẽ giảm dần trong giai đoạn tăng
trưởng nhanh của rễ từ ngày 14 đến ngày 28. Vì
vậy, ở ngày thứ 35, hoạt động phân chia của tế
bào rễ có thể đã giảm dẫn đến sinh khối của rễ ở
tất cả các công thức đều giảm. Rễ bất định ở
ngày đầu tiên nuôi cấy không có sự hiện diện
của các rễ thứ cấp. Sau 35 ngày nuôi cấy, các rễ
thứ cấp được hình thành từ rễ sơ cấp ban đầu ở
tất cả các công thức khảo sát (hình 4). Tuy
nhiên, sự gia tăng nồng độ IBA trong môi
trường nuôi cấy đã làm gia tăng số lượng rễ thứ
cấp. Kim et al. (2003) [7] cũng chứng minh IBA
có ảnh hưởng mạnh mẽ đến sự hình thành rễ thứ
cấp sau 7 ngày nuôi cấy rễ bất định của cây sâm
Panax ginseng; San José et al. (2012) [16] cũng
đã chứng minh sự hiện diện của IBA 0,1 mg/l
trong môi trường nuôi cấy đã làm sự hình thành
rễ thứ cấp của cây Alnus glutinosa gia tăng rõ
rệt so với đối chứng trên môi trường không có
IBA.

KẾT LUẬN
Kết quả nghiên cứu đã cho thấy tính khả thi
của việc tạo rễ bất định từ nuôi cấy phiến lá cây
ĐQNB in vitro trên môi trường thạch cũng như
việc nuôi cấy rễ bất định trong môi trường lỏng
với sự hỗ trợ của máy lắc để làm tăng sinh khối
rễ. Các nghiên cứu sâu hơn về nuôi cấy rễ cần
được tiến hành để có thể hoàn thiện quy trình
nuôi rễ bất định đồng thời cần triển khai các
nghiên cứu về sự tích lũy các hợp chất thứ cấp
trong rễ in vitro của cây ĐQNB.
Lời cảm ơn: Nghiên cứu nhận được sự hỗ trợ về
nguồn hạt giống cây ĐQNB của GS Toyoki
Kozai, Đại học Chiba, Nhật Bản, kỹ thuật của
Trịnh Thị Thanh Vân và Phạm Minh Duy,
phòng Công nghệ Tế bào Thực vật và trang
thiết bị của Phòng Thí nghiệm trọng điểm về
Công nghệ tế bào thực vật phía Nam, Viện Sinh
học nhiệt đới.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Chée P., 1995. Stimulation of adventitious
rooting of Taxus species by thiamine. Plant
Cell Rep., 14: 753-757.
2. Dilorio A. A., Cheetham R. D., Weathers P.
3. J., 1992. Carbon dioxide improves the
growth of hairy roots cultures on solid
medium and in nutrient mists. Appl.
Microbiol. Biotechnol., 37: 463-467.
4. Fukuda K., Murata K., Matsuda H.,
Taniguchi M., Shibano M., Baba K.,

Shiratori M., Tani T., 2009. Quality of
Angelica acutiloba roots cutivated ang
processed in Sichuan provice of China, J.
Trad. Med., 26: 169-178.
5. Gamborg L., Miller A., Ojima K., 1968.
Nutrient requirements of suspension
cultures of soybean root cells. Exp. Cell
Res., 50: 151-158.
6. Gaspar T., Kevers C., Greppin H., Reid M.,
Thrope A., 1996. Plant hormones and plant
growth regulators in plant tissue culture. In
vitro Cell Dev. Biol. Plant, 32: 272-289.
7. Humphries E.C., 1960. Inhibition of root
development on pertioles and hypocotyls of
dwarf bean (Phaseolus vulgaris) by kinetin.
Physiol. Plant, 13: 659-663.
8. Kim J. S., Hahn E. J., Yeung E. C., Paek K.
Y., 2003. Lateral root development and
saponin accumulation as affected by IBA or
NAA in adventitious root cultures of Panax
ginseng C. A. Meyer. In-Vitro Cel.Dev.
Biol. Plant, 39(2): 245-249.
9. Nguyễn Thị Liễu, Nguyễn Trung Thành,
Nguyễn Văn Kết, 2010. Nghiên cứu khả
năng tạo rễ bất định của sâm Ngọc Linh
(Panax vietnamensis Ha et Grushv.) trong
nuôi cấy in vitro. Tạp chí khoa học Đại học
quốc gia Hà Nội, Khoa học tự nhiên và
Công Nghệ, 27: 30-36.
10. Ludwig-Muller J., 2000. Indole-3-butyric

acid in plant growth and development. Plant
Growth Reg., 32: 219-230.
11. Mok M. C., Mok D. W. S., Amstrong D. J.,
1982. Cytokinin activity of N-phenyl-N’-
1,2,3-thidiazon-5-ylurea (TDZ).
Phytochem., 21: 1509-1511.
12. Morel G., Wetmore R., 1951. Tissue culture
of monocotyledons, American Jour. Bot.,
38(2): 138-140.
13. Murashige T., Skoog F., 1962. A revised
172
TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 165-173
14. medium for rapid growth and bioassays
with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant,
15(3): 473-497.
15. Hoàng Ngọc Nhung, Nguyễn Thị Quỳnh,
Nguyễn Vũ Ngọc Anh, Nguyễn Lê Anh
Thư, Kozai T., 2012. Nghiên cứu sự phát
sinh cơ quan từ lớp mỏng tế bào cây đương
quy Nhật Bản - Angelica acutiloba nuôi cấy
in vitro. Tạp chí Sinh học, 34(3SE): 196-
204.
16. Ninh T. P., Nojima H., Tashiro T., 2009.
Effect of pretreatment of seeds by
gibberellin (GA
3
), kinetin and temperatures
on germination and seedling growth of
Angelica acutiloba Kitagawa. J. Sci. Dev., 7
(Eng.Iss.2): 217-224.

17. Polikarpochkina R. T., Gamburg K. Z.,
Khavin E.E., 1979. Cell-suspension culture
of maize (Zea mays L.). Z.P.
flanzenphysiol., 95: 57-67.
18. San José M. C., Romero L., Janeiro L.V.,
2012. Effect of indole-3-butyric acid on root
formation in Alnus glutinosa microcuttings.
Silva Fennica, 46(5): 643-654.
19. Schwambach J., Fadanelli C., Fett-Neto
A.G., 2005. Mineral nutrition and
adventitious rooting in microcutting of
Eucalyptus globules. Tree Physiol., 25: 487-
494.
20. Smith D. R., Thorpe T. A., 1975. Root
initiation in cuttings of Pinus radiata
seedlings. II. Growth regulator interactions.
J. Exp. Bot., 26: 193-202.
21. Soffer H., Burgur D. W., 1988. Effects of
dissolved oxygen concentrations in aero
hydroponics on the formation and growth of
adventitious roots, J. Am. Soc. Hort. Sci.,
113: 218-221.
22. Thorpe T., Stasolla C., Yeung E. C., de
Klerk G. J., Roberts A., George E. F., 2008.
The components of plant tissue culture
media II: Organic additions, osmotic and pH
effects, and support systems. In: Plant
Propagation by Tissue Culture 3rd Edition,
Vol. 1: The Background, George E.F., Hall
M.A., de Klerk G.J. (eds.), Springer,

Dordrecht, The Netherlands, 115-174.
23. Vries D. P., Dubois L. A. M., 1988. The
effect of BAP and IBA on sprouting and
adventitous root formation of ‘Amanda’
rose single - node softwood cuttings, Sci.
Hortic., 34: 115-121.
24. Yu T. A., Yeh S. D., Cheng Y. H., Yang
J. S., 2000. Efficient rooting for
establishment of papaya plantlets by
micropropagation, Plant Cell Tiss. Org.
Cult., 61(1): 29-35.
FORMATION AND GROWTH OF ADVENTITIOUS ROOTS FROM IN VITRO
ANGELICA ACUTILOBA KITAGAWA TISSUE CULTURE
Nguyen Thi Quynh, Hoang Ngoc Nhung, Nguyen Le Anh Thu
Institute of Tropical Biology, VAST
SUMMARY
Japanese touki is considered of high and prior value in many traditional remedies due to medicinal
properties in the root system. In this study, root formation and growth of Japanese touki cultured in vitro were
carried out in the dark condition of a culture room having temperature of 24 ± 2
o
C and RH of 65 ± 5%. Leaf
blades from three different positions of the in vitro touki shoot were cultured either on basal mineral MS
medium supplemented with Morel vitamins or Gamborg’s B5 medium. Percent of root formation was 100%
as well as root fresh weight (132.7 mg explant
-1
) was the greatest when the second leaf blade was cultured on
the Gamborg’s B5 medium. Percent of root formation, root number, root fresh weight and root fresh
173
Nguyen Thi Quynh, Hoang Ngoc Nhung, Nguyen Le Anh Thu
weight/explant fresh weight were the greatest when the leaf blade was cultured on the Gamborg’s B5 medium

supplemented with 0.1 mg/l BA.
In the MS liquid medium including Morel vitamin, shaked at 100 ppm, and supplemented with different
IBA concentrations (0.2, 0.5 or 1 mg/l), adventitious roots of in vitro touki plants grew and increased their
biomass over time with the increase in IBA concentrations. On day 28, touki roots had the greatest fresh
weight (2423.7 mg/vessel) in the medium supplemented with 1 mg/l IBA, almost 5 times higher than that
(500 mg/vessel) at the first day of culture.
Keywords: Angelica acutiloba, adventitious rout, auxin, cytokinin.
Ngày nhận bài: 30-6-2013
174