Kiểm nghiệm lương thực thực phẩm chuyên đề: tiêu chuẩn hiện hành trong kiểm nghiệm coliform và e coli


I. Tổng quan về coliforms và E.coli
1. Coliforms
2. E.coli
II. Các phương pháp định tính, định lượng
1. Định tính
2. Định lượng
a. Phương pháp MPN
b. Phương pháp đếm khuẩn lạc
c. Phân tích nhanh
III. Các tiêu chuẩn hiện hành
1. Đối với nước
2. Đối với thực phẩm
3. Một số tiêu chuẩn quốc tế

1. Coliforms
- Thuộc họ Enterobacteriaceae
- Vi khuẩn hình que
- Gram âm
- Không sinh bào tử
- Hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi
- Sinh acid, sinh hơi do lên men lactose ở 37
0
C trong vòng 24 giờ
- Không sinh bào tử
- Chứa β-galactosidase

- Các giống có nguồn gốc từ phân (như Escherichia) :
+ Phát triển nhanh, khoảng 16 giờ, trong 8 môi trường dinh
dưỡng ở 44

0
C
+ Không mọc ở 4
0
C.
+ Là loại vi khuẩn ưa nhiệt, nhiệt độ thích hợp nhất là 41
0
C.
- Các giống không có nguồn gốc từ phân (như Citrobacter, Klebsiella,
Enterobacte ):
+ Chúng có nguồn gốc thuỷ sinh hay từ đất,
+ Mọc nhanh ở 4
o
C trong 3 – 4 ngày và 10
o
C trong 1 ngày.
+ Không mọc ở 41
o
C,
+ Ở 44
o
C ức chế hoàn toàn sự phát triển của tất cả các Coliform
không có nguồn gốc từ phân.
 
E.coli


 !
"#
$% &'() *




Vị trí của coliform trong họ Enterobacteriaceae (Vi khuẩn đường ruột)

Coliforms chịu nhiệt:
-
Là những coliforms có khả năng lên
men lactose sinh hơi trong khoảng
24h khi được ủ ở 44
o
C trong môi
trường EC.

Coliforms phân (E.coli giả định):
- Là coliforms chịu nhiệt có khả
năng sinh indole khi được ủ khoảng
24h ở 44.5
o
C trong môi trường
Trypton.
Fecal Coliform
2. E.coli
- Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) thuộc:

Lớp: Schgzomycetes

Bộ: Eubacteriales

Họ: Enterobacteriaceae


Giống: Escherichia

Loài: Escherichia coli
-
Là một phân nhóm của nhóm coliforms phân
- Cho kết quả thử nghiệm IMViC là ++
E.coli
Các dòng E.coli có khả năng gây bệnh:
- EAEC (Enteroaggregative E. coli), E. coli kết tập ở ruột.
- EHEC (Enterohemorrhagic E. coli), E. coli gây xuất huyết ở ruột.
- EPEC (Enteropathogenic E. coli), E. coli gây bệnh đường ruột.
- ETEC (Enterotoxigenic E. coli), E. coli sinh độc tố ruột.
- EIEC (Enteroinvasive E. coli), E. coli xâm lấn niêm mạc ruột.
+, ,+,/01/2-3
1. Định tính
Nguyên tắc:
- E. coli lên men sinh hơi đường glucose, manitol, lactose,
galactose nhưng không sinh hơi đường maltose, arabinose. E. coli
không lên men dextrin, glycogen, inositol, salisin, ít khi lên men
inulin, pectin.
- Trong môi trường BGBL, khuẩn lạc dẹt, có ánh kim
- E. coli không sinh H
2
S, không tan chảy gellatin, không phân
hủy đạm, hoàn nguyên Nitrate thành Nitrite.





E.coli




E.coli
a/ Định lượng Coliforms:
- Cấy 1ml dich đã pha loãng 10
-1
vào 3 ống nghiệm giống nhau, mỗi ống chứa
10ml canh LSB.
- Thực hiện tương tự với mẫu pha loãng 10
-2 và
10
-3
.
- Ủ các ống nghiệm ở 37
o
C trong 48h.

Ghi nhận ống có sinh hơi (+).
-
Cấy dịch mẫu từ các ống LSB dương tính (+) sang các ống chứa canh
BGBL.
-
Ủ 37
o
C ± 1
o
C trong 48h.

2.1. PHƯƠNG PHÁP MNP
2.1. PHƯƠNG PHÁP MNP

 E.coli!"#$%
&'(()*+,-./0123
b/ Định lượng Coliforms chịu nhiệt:
4
Dùng que cấy vòng, chuyển một
vòng dịch từ ống LSB (+) sang môi
trường EC.
4
Ủ trong 44.5 ± 0,2
o
C trong 24h.

Đếm các ống có sinh hơi (+), ở
mỗi độ pha loãng.
c/ Định lượng Coliforms phân:
4
Cấy ria dịch dịch mẫu từ ống (+) trên môi trường EC sang môi trường EMB
ủ 37
o
C trong 24h.

khuẩn lạc tròn, dẹt hình đĩa và có ánh kim tím là khuẩn lạc của Colifoms
phân (E. coli giả định).
- Chọn khuẩn lạc đường kính lớn hơn 1ml cấy vào canh Tryptone, ủ ở 44,5 ± 0,2
o
C,

trong 24h.Nhỏ thuốc thử Kovac’s vào các ống nghiệm: ống có xuất hiện màu đỏ
trong môi trường trong vài phút là ống (+).
- Thực hiện cho tất cả các ống (+) trên môi trường EC.
Ghi nhận các ống (+) trên môi trường tryptone tương ứng với mỗi độ pha loãng.
c/ Định lượng Coliforms phân:
d/ Định lượng E. coli
4
Thực hiện tương tự như trường hợp coliforms phân để tìm các khuẩn lạc E.
coli giả định.
4
Chọn các khuẩn lạc có đường kính lớn hơn 1mm và cấy vào môi trường
MRVP, Simmon Citrate Agar để thực thử nghiệm IMViC.
(-) (+)
4
5678. Coli9:;<9=>#?@ )**
AA+B E. coli.
Cách đọc kết quả:
Từ kết quả thu được ở các trường hợp trên, dùng bảng MPN thích hợp để
tính ra mật độ VSV trong mẫu và biểu diễn dưới dạng trị số MPN/g hay
MPN/ml mẫu ban đầu chưa pha loãng.
-
Thực hiện tương tự các ống (+) trong môi trường EC và tạo được được khuẩn lạc
E. coli gỉa định trên môi trường EMB.
- Ghi nhận số ống nghiệm có E. coli (+) ở mỗi độ pha loãng của mẫu.
C(#$%DE(
2.2. Phương pháp đếm khuẩn lạc
- Chuẩn bị dịch pha loãng mẫu
- Chuẩn bị các chuỗi pha loãng mẫu
- Cấy mẫu vào môi trường, ủ mẫu
- Đếm số khuẩn lạc hình thành

Định lượng Coliforms, Coliform phân bằng pp đếm khuẩn
lạc:
Nguyên tắc:
Mẫu đã được đồng nhất hóa được cấy một lượng nhất định lên môi
trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose. Đếm số khuẩn lạc lên men
lactose & sinh acid sau khi ủ ở 37±1
o
C trong 24-48h.
Máy đếm khuẩn lạc