Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn malolactic và ứng dụng trong công nghệ sản xuất rượu vang

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1 Giới thiệu chung về rƣợu vang 3
1.1.1 Vài nét về rượu vang 3
1.1.2 Công nghệ sản xuất rượu vang 4
1.2 Vi khuẩn lactic 7
1.2.1 Phân loại và kiểu hình của các vi khuẩn lactic trong rượu vang 10
1.2.2 Vi khuẩn Oenococcus oeni 11
1.3 Quá trình lên men malolactic 12
1.3.1 Bản chất của quá trình lên men malolactic 12
1.3.2 Vai trò của quá trình lên men malolactic 14
1.3.3 Ảnh hưởng của quá trình lên men malolactic đến thành phần và chất
lượng rượu vang 15
1.4 Các kỹ thuật nhằm cải thiện quá trình lên men malolactic 18
1.4.1 Sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic 18
1.4.2 Sử dụng chế phẩm enzim malolactic để chuyển hoá axít malic 19
1.4.3 Sử dụng chủng nấm men tái tổ hợp gen malolactat decacboxylaza trong
sản xuất vang 20
1.5 Các phƣơng pháp lên men malolactic và khả năng ứng dụng để nâng cao
chất lƣợng rƣợu vang 21
CHƢƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25
2.1 Nguyên liệu, chủng vi sinh và hóa chất 25
2.1.1 Nguyên liệu 25
2.1.2 Vi sinh vật 25
2.1.3 Môi trường phân lập vi sinh vật 25
2.1.4 Hóa chất 26
2.1.5 Dụng cụ máy móc, thiết bị 26
2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 26
2.2.1 Phương pháp công nghệ 26
2.2.2 Phương pháp vi sinh vật 27

2.2.3 Phương pháp phân tích lý hóa 28
CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31
3.1 Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn malolactic cho sản xuất rƣợu
vang 31
3.1.1 Phân lập các chủng vi khuẩn malolactic tại Ninh Thuận 31
3.1.2 Xác định khả năng lên men malolactic của các chủng vi khuẩn phân lập 33
3.1.3 Xác định khả năng chịu SO
2
của 02 chủng vi khuẩn malolactic phân lập được 36
3.2 Nghiên cứu quá trình lên men malolactic của Chủng NT9 và Chủng
NT12 trên môi trƣờng rƣợu vang non 37
3.3 Nghiên cứu khả năng tạo chất thơm của các chủng vi khuẩn malolactic 42
3.4 Nghiên cứu xác định các điều kiện tối ƣu quá trình lên men malolactic
O.oeni NT12 44
3.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất dinh dưỡng bổ sung đến quá trình lên
men malolactic. 44
3.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men malolactic 47
3.4.3 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung vi khuẩn lactic đến chất lượng rượu vang . 49
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO 56
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Phân tích rượu vang đỏ trước và sau lên men malolactic 15
Bảng 3.1. Đặc tính sinh lý của các chủng vi khuẩn lactic phân lập được 31
Bảng 3.2 Đặc tính trao đổi chất của các chủng vi khuân lactic phân lập được 34
Bảng 3.3 Khả năng lên men malolactic của 8 chủng vi khuẩn phân lập được 35
Bảng 3.4 Hàm lượng axít malic và axít lactic trước và sau lên men Malolactic trên
môi trường nước nho axít (AG) được sulphit hóa với hàm lượng K
2
S
2

O
5.
bổ sung
etanol tới nồng độ 14%v/v 37
Bảng 3.5 Hàm lượng axít malic trước và sau quá trình lên men malolactic của 2
chủng vi khuẩn malolactic trên môi trường rượu vang non 38
Bảng 3.6 Hàm lượng axít lactic trước và sau quá trình lên men malolactic của 2
chủng vi khuẩn malolactic trên môi trường rượu vang non 39
Bảng 3.7 Hàm lượng axít axetic trước và sau lên men malolactic của 2 chủng vi
khuẩn malolactic 40
Bảng 3.8 Hàm lượng diaxetyl trước và sau lên men malolactic của 2 chủng vi khuẩn
malolactic 41
Bảng 3.9 Một số chất bay hơi tạo thành sau quá trình lên men malolactic của 02 chủng 43
Bảng 3.10 Thành phần dịch vang non sau khi lên men rượu 45
Bảng 3.11 Hàm lượng axít malic (g/l) được phân giải trong quá trình tàng trữ có bổ
sung dinh dưỡng khác nhau theo thời gian 46
Bảng 3.12 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự chuyển hóa axít malolaic thành axít
lactic trong quá trình lên men malolactic 48
Bảng 3.13 Thành phần của rượu vang sau khi kết thúc quá trình lên men malolactic 49
Bảng 3.14 Thời gian lên men và hàm lượng axít malic, axít lactic sau quá trình lên
men malolactic ở các thời điểm bổ sung vi khuẩn lactic khác nhau 51
Bảng 3.15 Rượu etanol được tạo thành và hàm lượng đường sót sau quá trình lên
men malolactic 52
Bảng 3.16 Sự tạo thành 1 số chất bay hơi được tạo thành sau quá trình lên men
malolactic 53
DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình dạng chuỗi của chủng O.oeni. 10
Hình 1.2. Quá trình trao đổi chất của các vi khuẩn lactic lên men dị hình 13
Hình 1.3. Cơ chế của quá trình lên men malolactic 133

Hình 1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men malolactic 17
Hình 2.1 Sơ đồ phân lập vi khuẩn malolactic từ nguồn nguyên liệu quả và lá nho . 27
Hình 3.1 So sánh hàm lượng axít malic trước và sau quá trình lên men malolactic
của 2 chủng vi khuẩn malolactic trên môi trường rượu vang non 38
Hình 3.2. So sánh hàm lượng axít lactic trước và sau quá trình lên men malolactic
của 2 chủng vi khuẩn malolactic trên môi trường rượu vang non 39
Hình 3.3 So sánh hàm lượng axít axetic trước và sau lên men malolactic của 2
chủng vi khuẩn malolactic 41
Hình 3.4 So sánh hàm lượng diaxetyl trước và sau lên men malolactic của 2 chủng
vi khuẩn malolactic 42
Hình 3.5 So sánh hàm lượng axit axetic tạo thành sau quá trình lên men malolactic
của 2 chủng 43
Hình 3.6 Hàm lượng axít malic được phân giải trong quá trình tàng trữ có bổ sung
dinh dưỡng khác nhau theo thời gian. 46
Hình 3.7 So sánh sự tạo thành rượu etanol sau quá trình lên men malolactic 52
Hình 3.8 So sánh sự tạo thành 1 số chất bay hơi sau quá trình lên men malolactic . 53



DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AG
Acid Grape - Nước nho axít
CoA
Coenzyme A
CFU
Colony forming unit - Đơn vị hình thành khuẩn lạc
HDL
High density lipoprotein - Lipoprotein có tỷ trọng cao
LAB

Lactic acid bacteria - Vi khuẩn lactic
MRS
De Man, Rogosa and Sharp - Môi trường MRS
NAD
+
Nicotinamit Adenin Dinucleotide
NADH
Nicotinamit Adenin Dinucleotide Hydrogen
EO
Chế phẩm Essential oenos
OD
Optical density - Mật độ quang
MLF
Melolactic fermentaeion - Lên men malolactic



1
MỞ ĐẦU
Rượu vang là đồ uống có cồn được sản xuất từ quá trình lên men dịch quả
nói chung mà phổ biến nhất là từ quả nho. Do nho là loại quả có thành phần hoá học
thích hợp cho nấm men phát triển và có hương thơm đáp ứng được những yêu cầu
cho sản xuất rượu vang chất lượng cao. Trải qua lịch sử hình thành và phát triển lâu
đời, rượu vang nho với nồng độ rượu vừa phải từ 10-14%v là đồ uống có lợi cho
sức khỏe của con người với giá trị dinh dưỡng cao, hương vị thơm ngon rất được ưa
chuộng ở khắp nơi trên thế giới. Từ nhiều năm nay, rượu vang nho đã trở thành thức
uống phổ biến ở nước ta. Thị trường rượu vang trong nước rất phát triển, tuy nhiên
vẫn chưa đáp ứng được yêu cầu cả về chất và lượng. Theo số liệu của Tổng cục
thống kê, kể từ năm 2010 đến nay, rượu vang nhập khẩu đã tăng khoảng 25%/ năm.
Trong đó, Ninh Thuận được biết đến là vùng trồng nho chính có sản lượng lớn nhất

cả nước, hiện trồng chủ yếu là giống nho Red Cardinal thường dùng để ăn tươi hơn
là để lên men rượu vì cho màu sắc nhạt, không hấp dẫn. Do vậy, chất lượng rượu
vang Việt Nam hiện nay chưa thật cao khi so sánh với rượu vang nhập khẩu do
hương và vị sản phẩm chưa đạt tiêu chuẩn, màu sắc dễ bị nâu hoá, sản phẩm bị lắng
cặn…Với tiềm năng về thị trường lớn như ở nước ta, việc cải tiến công nghệ để sản
xuất rượu vang nho là vấn đề đang rất được quan tâm.
Nhiều nước trên thế giới đã giải quyết được vấn đề này bằng những nghiên
cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất rượu vang nho đi sâu làm rõ các cơ chế như: sự
chuyển hóa các thành phần trong nho thành các chất thơm trong rượu vang, tác
động của điều kiện môi trường đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn
malolactic trong quá trình lên men malolactic[26, 27]…Quá trình lên men rượu
vang là quá trình lên men thực hiện chủ yếu nhờ nấm men và một phần bởi vi khuẩn
lactic có mặt trên quả nho hoặc trên thiết bị làm rượu. Nấm men sử dụng hệ enzym
của mình để chuyển hóa glucoza và một số đường khác thành rượu và các sản phẩm
phụ khác (rượu bậc cao, este, các axít hữu cơ ), trong khi đó vi khuẩn lactic chuyển
hóa axít malic thành axít lactic và CO
2
bằng quá trình lên men malolactic. Lên men
malolactic đóng vai trò quan trọng trong sản xuất rượu vang đỏ và 1 số loại vang

2
trắng, đây là một quá trình không thể thiếu trong việc làm biến đổi các thành phần
hóa học, mang lại cho rượu vang những hương vị đặc trưng. Với điều kiện, công
nghệ sản xuất rượu vang của Việt Nam hiện nay, việc phân lập và tuyển chọn một
số chủng vi khuẩn lactic để tối ưu hóa quá trình lên men malolactic là rất cần thiết.
Điều này đã giúp các nhà sản xuất rượu vang kiểm soát quá trình sản xuất rượu
vang được tốt hơn, giảm rủi ro tạo ra các sản phẩm hỏng hoặc có chất lượng không
ổn định, đồng thời làm đa dạng các chủng loại rượu vang phục vụ cho nhu cầu
người tiêu dùng. Từ đó mở ra hướng nghiên cứu mới cho công nghệ sản xuất rượu
vang nho chất lượng cao của Việt Nam giải quyết những vấn đề thực tiễn của ngành

sản xuất rượu vang trong nước.Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tuyển
chọn vi khuẩn malolactic và ứng dụng trong công nghệ sản xuất rượu vang”.

3
CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Giới thiệu chung về rƣợu vang
1.1.1 Vài nét về rượu vang
Rượu vang là thức uống có cồn được sản xuất bằng phương pháp lên men
không chưng cất từ dịch nho. Nhờ tác nhân lên men (lên men một giai đoạn) hoặc
nhờ nấm men và vi khuẩn lactic (lên men hai gian đoạn) đã tạo cho rượu vang có
hương vị đặc trưng, cũng như giá trị dinh dưỡng cao hơn hẳn các loại rượu khác.
Thuật ngữ “Rượu vang”- tiếng la tinh là “vinum”, được bắt nguồn từ chữ “vinea”,
có nghĩa là cây nho. Trước tiên việc sản xuất rượu vang được tiến hành bằng cách
ép lấy dịch quả nho, sau đó lên men hoàn toàn tự nhiên trong các hang đá. Người La
Mã có công truyền bá nghề trồng nho làm rượu sang Pháp Marseilles từ thế kỉ II,
sau đó là vùng Champagne và Monselle Valley vào khoảng thế kỉ IV. Pháp bắt đầu
xuất khẩu rượu vang sang Anh và Đức vào thế kỉ XII. Vào năm 1857, lần đầu tiên
trong lịch sử, Louis Pasteur công bố những nghiên cứu về quá trình lên men, xác
định rõ vai trò quan trọng của nấm men trong quá trình lên men rượu và sự biến đổi
hoá sinh trong quá trình lên men của nấm men [8]. Đến nay đã có hàng trăm loại
rượu vang khác nhau đáp ứng được nhu cầu đa dạng của người tiêu dùng. Phân loại
rượu vang được dựa trên màu sắc: vang màu và vang trắng, trong các loại vang màu
thì rượu vang đỏ có giá trị cao nhất. Ngày nay nguyên liệu chế biến rượu vang được
mở rộng ra các loại nguyên liệu quả khác nhau, phong phú về màu sắc và chất lượng.
Trải qua nhiều thế kỷ, rượu vang đã khẳng định vai trò của nó với sức khỏe
con người. Louis Pasteur đã nhiều lần khẳng định: “Rượu vang là loại đồ uống rất
vệ sinh và rất có lợi cho sức khoẻ”. Khoa học hiện nay đã phát hiện trong rượu
vang đỏ có chứa chất trans-resveratrol là một chất chống oxi hóa, gặp trong vỏ của
quả nho đỏ (vỏ mỗi quả chứa khoảng 2µg trans-resveratrol). Các polyphenol trong
Chất này có tác dụng trung hòa các tác nhân oxi hóa, chẳng hạn các gốc tự do được

tạo thành trong quá trình trao đổi chất bình thường của tế bào. Các gốc tự do này sẽ
gây hư hại mô nếu không nhanh chóng được loại bỏ. Chính tác dụng nói trên của

4
trans-resveratrol đã góp phần làm giảm nguy cơ tử vong do bệnh nhồi máu cơ tim ở
người [30].
1.1.2 Công nghệ sản xuất rượu vang [7, 8, 12]
Lên men là một quá trình trao đổi chất dưới tác dụng của các enzyme tương
ứng. Tùy theo sản phẩm tích tụ sau quá trình lên men mà người ta chia các kiểu lên
men khác nhau. Có hai hình thức lên men chính là lên men yếm khí và lên men hiếu
khí. Lên men rượu là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm men, chúng
sẽ chuyển hóa đường thành ethanol và CO
2
. Thực chất đây là quá trình oxi hoá -
khử có mặt các enzyme của nấm men. Năng lượng sinh ra phục vụ cho hoạt động
sống của nấm men hoặc bị tiêu hao dưới dạng nhiệt [7]. Sự thay đổi nhiệt độ trong
quá trình lên men có thể dẫn tới sốc nhiệt làm ảnh hưởng tới hoạt tính của nấm men.
Do vậy giữ nhiệt độ ổn định trong quá trình lên men là một yếu tố quan trọng giúp
quá trình lên men được hoàn thành. Nấm men nhạy cảm nhất với nhiệt độ trong giai
đoạn đầu phát triển và nhân lên và nó trở nên chống chịu tốt hơn trong giai đoạn
sau. Do vậy đối với lên men rượu vang thì giai đoạn đầu của quá trình lên men nên
duy trì ở nhiệt độ 18-22
o
C và sau đấy cho phép tăng dần lên [7, 12]. Nhiệt độ lên
men ban đầu quá cao có thể là nguyên nhân gây ra hiện tượng ì ở cuối quá trình lên
men.
Quá trình lên men rượu chia làm hai thời kỳ chính:
- Thời kỳ phát triển sinh khối: giai đoạn này với sự có mặt của oxy, tế bào nấm
men phát triển sinh khối.
- Thời kỳ lên men chuyển đường thành rượu và CO

2
: giai đoạn này nấm men
hấp thụ các chất dinh dưỡng và sử dụng các enzyme sẵn có của mình thực hiện xúc
tác sinh học trong quá trình trao đổi chất để duy trì sự sống, tạo thành rượu và CO
2
.
Sản phẩm thu hồi của quá trình lên men rất phức tạp. Ngoài ethanol còn
nhiều chất khác như este, rượu bậc cao, các axit hữu cơ, glycerol, dầu fusel Tỷ lệ
các sản phẩm phụ này phụ thuộc vào điều kiện của môi trường lên men.

5
Trong quá trình này, nấm men chuyển hóa đường thành rượu và giải phóng
CO
2
dưới tác dụng xúc tác của enzyme do nấm men tạo ra theo con đường Enol-
pyruvat [7].

Nho đỏ
Nghiền/chà tách cuống
Sulfite hóa
Ngâm
Tách dịch nho rỉ
Tách cặn
Hiệu chỉnh thành phần
dich nho
Lên men
Lên malolactic
Ủ rượu
Ổn định rượu
Làm trong
Rót sản phẩm
Rượu Vang

Hho

Cặn

Cặn

Cuống
SO
2

Nấm men
Hoạt hóa nấm men
Vi khuẩn lactic

6


Sơ đồ: 1.1 Quy trình công nghệ sản xuất rƣợu vang đỏ trên thế giới.

Trong quả nho và nhiều loại quả khác, hầu như chỉ có đường khử glucoza,
fructoza. Vì vậy nếu sử dụng dịch lên men hoàn toàn từ dịch ép quả thì quá trình lên
men rất thuận lợi. Sản phẩm thu hồi của quá trình lên men rất phức tạp. Ngoài
etanol, còn có nhiều các hợp chất khác như este, rượu bậc cao, các axít hữu cơ,
glyxerol
Este: Các este được cho là có ý nghĩa lớn nhất đối với sự hình thành hương

vị rượu vang [40]. Mùi quả đặc trưng của vang chủ yếu nhờ vào một hỗn hợp của
hexyl axetat, etyl caprilat. Este có mặt nhiều nhất trong rượu vang là etyl axetat. Nó
được hình thành trong quá trình lên men và trong quá trình lưu giữ ở thùng gỗ sồi.
Ngưỡng cảm nhận của etyl axetat là 160 mg/l [41]. Trên ngưỡng này, nó ảnh hưởng
xấu đến hương vị của rượu nhưng ở nồng độ thấp hơn thì nó lại đóng góp tích cực
vào giá trị cảm quan của vang.
Rượu bậc cao: Rượu bậc cao được hình thành trong quá trình lên men rượu
và đạt tới nồng độ từ 150-550 mg/l [41]. Rượu bậc cao và các este của nó đóng vai
trò quan trọng đến việc tạo hương cho rượu. Các rượu bậc cao chủ yếu là các
isobutyl và các amyl alcohol. Ở nồng độ thấp hơn 300 mg/l, nó tạo hương rất tốt
cho rượu nhưng ở nồng độ cao hơn, hương của nó không chấp nhận được.
Các axít hữu cơ: Các axít hữu cơ có tác dụng làm bền và nâng cao giá trị
cảm quan của rượu, đặc biệt là rượu vang trắng [31]. Đặc tính bảo quản của nó cũng
làm tăng độ bền hóa lý và vi sinh vật của rượu vang. Các axít hữu cơ chủ yếu được
hình thành trong quá trình lên men là axít lactic, axít sucxinic, axít axetic, ngoài ra
còn có một lượng nhỏ axít butyric, axít formic và propionic, nhưng nhiều hơn cả
là axít lactic và axít axetic. Các axít hữu cơ có tác dụng làm giảm pH môi trường
trong quá trình lên men. Chúng ít ảnh hưởng đến thành phần hương của rượu trừ
axít axetic tạo ra mùi dấm chua. Không thể sản xuất ra rượu mà không có ít axít
axetic nào. Hàm lượng trung bình của nó trong rượu vang bàn là nhỏ hơn 0,4g/l

7
trong khi ngưỡng phát hiện của nó là 3g/l. Nhiệt độ lên men malolactic cao thúc đẩy
sự tạo thành axít bay hơi nhiều hơn [27].
Ngoài ra, các thành phần như aldehyt, glyxerol được tạo ra bởi nấm men
trong quá trình lên men đều có tác dụng tạo nên hương thơm đặc trưng của rượu
vang. Quá trình lên men rượu đã giải phóng 40 kcal năng lượng tự do trên một phân
tử đường. Quá trình lên men thường chứa khoảng 180g đường/lít, do đó sự giải
phóng nhiệt về lí thuyết sẽ làm cho nhiệt độ lên men tăng từ 20
o

C lên 45
o
C [32].
Như vậy, ban đầu là quá trình lên men rượu được nấm men Saccharomyces
cerevissiae đảm nhận. Tiếp theo là hoạt động của các vi khuẩn Leuconostoc oenos,
Lactobacillus, Pediococcus chuyển hoá đường sót trong rượu vang non và quan
trọng hơn cả là quá trình lên men axít malic thành axít 1 actic và axít xitric thành
axít axetic, axetoin, diaxetyl, butađiol 2-3, góp phần đáng kể vào sự hình thành
hương vị đặc trưng của rượu vang, “Đây chính là quá trình lên men Malolactic”.
Trong công nghệ sản xuất rượu vang, quá trình lên men malolactic được tiến hành
sau khi lên men chính, dịch lên men được gọi là “vang non” được tiến hành lắng
gặn cặn và được chuyển sang bồn hay nồi lên men tiếp theo [4].
1.2 Vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic là một bộ phận của hệ vi sinh vật tự nhiên trên quả nho,
trong dịch đường và rượu vang. Vi khuẩn lactic là những tế bào Gram dương, dị
dưỡng hoá năng hữu cơ, hoạt tính catalaza âm tính và axít lactic được xem là sản
phẩm cuối cùng của quá trình trao đổi chất của chúng [4]. Chính pH axít, hàm
lượng êtanol và các thành phần khác của rượu vang tạo ra áp lực chọn lọc đối với
các vi khuẩn lactic. Chỉ có một số loài rất nhỏ có khả năng tự phát triển trong các
loại dịch đường và rượu vang. Các loài thường gặp trong sản xuất rượu vang chủ
yếu thuộc các giống sau: Pediococcus, Leuconostoc, Oenococcus và Lactobacillus.
Sự xuất hiện của các loại vi khuẩn lactic này trên bề mặt quả nho là rất nhỏ, khoảng
100 tế bào/g quả [43]. Mật độ quần thể vi khuẩn lactic phụ thuộc rất nhiều vào điều
kiện khí hậu trong những ngày cuối cùng của quá trình chín, độ chín và trạng thái
vệ sinh của quả nho. Các quần thể vi sinh vật có mặt nhiều hơn trên vỏ quả nho chín

8
hoặc có tình trạng vệ sinh kém. Khi quá trình chín của quả nho kết thúc bởi một giai
đoạn nóng và ít mưa kéo dài, thì các vi khuẩn lactic sẽ xuất hiện nhiều hơn trên bề
mặt quả nho. Tuy nhiên, các loài vi sinh vật ban đầu này xuất hiện rất ít trong rượu

vang mà phần lớn là các loại vi khuẩn nhiễm tạp từ các dụng cụ làm rượu trong các
giai đoạn khác nhau diễn ra trong quá trình bơm dịch nước nho vào thùng lên men.
Mặc dù người ta có thể bắt gặp trong các loại rượu vang một số vi khuẩn tự nhiên từ
quả nho, nhưng chủ yếu vẫn là các vi khuẩn có nguồn gốc từ các thiết bị trong hầm
rượu. Tương tự như vậy đối với trường hợp của nấm men. Nấm men tự nhiên trên
bề mặt quả tự phát triển sau các thao tác công nghệ khác nhau diễn ra tiếp sau quá
trình thu hái và quá trình chuyển bơm dịch nước nho vào thùng lên men, cho tới tận
khi dịch đường nước nho được cấy giống. Tuy nhiên, cũng có thể là có sự phát triển
của các loại nấm men có nguồn gốc từ các vật liệu tiếp xúc với dịch nước nho. Do
vậy, sau giai đoạn thu hoạch nho, các nấm men nhanh chóng phát triển và chiếm
lĩnh hầm rượu. Trên thực tế, người ta vẫn chưa làm sáng tỏ được là con đường nào
trong hai con đường gieo giống tự nhiên này là có vai trò quan trọng hơn.
Trong suốt quá trình sản xuất rượu vang, các vi khuẩn lactic phát triển,
không chỉ về số lượng mà còn có cả sự thay đổi của các loài. Vi khuẩn phân lập
được trên vỏ quả nho trước khi thu hoạch thuộc chủ yếu là các loài Lactobacillus
plantarum, L. hilgardii và L. Casei. Loài Oenococcus oeni trước đây được gọi là
Leuconostoc oenos xuất hiện muộn hơn nhưng lại là quan trọng nhất, rất hiếm khi
chúng có mặt trên lá nho, quả nho và chỉ có số lượng rất ít. Trong thực tế, loài này
rất ít xuất hiện ở giai đoạn đầu của quá trình lên men. Các loại trực khuẩn và cầu
khuẩn xuất hiện trên quả nho thường xuyên hơn so với O.oeni. Trong số tất cả các
loài này nói trên, loài cuối cùng O.oeni được coi là có khả năng chống chịu cao nhất
đối với các điều kiện môi trường bất lợi của rượu vang như pH thấp, hàm lượng cồn
và SO
2
cao và do vậy chịu trách nhiệm chính cho quá trình lên men malolactic
trong đa số các trường hợp[4].
Số lượng tế bào vi khuẩn lactic đạt 10
3
- 10
4

tế bào/ml sau quá trình ép nho
[43]. Dịch nước nho ngay sau khi được đưa đến thùng lên men có chứa một hệ vi

9
sinh vật rất đa dạng, phần lớn bao gồm các loài Lactobacillus plantamm, L. casei, L.
hilgardii, L. brevis, Pediococcus dcimnosLis, p. pentosaceus, Leuconostoc
mensenteroides và Oenococcus oeni. Tuy nhiên, trong tình trạng vệ sinh kém hoặc
trong các điều kiện vận chuyển hoặc mức độ sạch của các thiết bị trons, hầm rượu
không cao, số lượng tế bào vi khuẩn lactic có thể lên tới 10
6
tế bào/ml. Bên cạnh đó,
trong giai đoạn đầu của quá trình lên men rượu, các tế bào nấm men cũng có số
lượng tương tự. Điều này rất có thể dẫn đến sự nguy cơ cạnh tranh pháp triển giữa
vi khuẩn và nấm men. Hơn nữa pH của dịch nước nho chín kỹ thường rất cao tạo
điểu kiện thuận lợi cho các vi khuẩn. Đây là tác nhân quyết định chính tới số lượng
của quần thể các vi khuẩn và đối với sự phát triển của chúng trong giai đoạn đầu
của quá trình lên men. Trong quá trình sản xuất rượu vang, có lên men malolactic,
quần thể vi khuẩn tự nhiên pháp triển trải qua rất nhiều pha khác nhau. Trong những
ngày đầu tiên của quá trình lên men rượu, các loại vi khuẩn và nấm men tự phát
triển. Nhưng các nấm men thích nghi với dịch đường của nho nhiều hơn, tự sinh sản
rất nhanh đạt tới các quần thể rất lớn. Lafon- Lafourcade, 1983 đã bắt gặp, sự phát
triển của các vi khuẩn lactic đồng thời với sự phát triển của các nấm men trong giai
đoạn đầu của quá trình lên men nhưng nó chỉ dừng lại ở giới hạn từ 10
4
đến 10
5
tế
bào vi khuẩn lactic/mL [43]. Sự phát triển này phụ thuộc vào các điều kiện hoá lý
của môi trường và sự phát triển này còn cao hơn khi pH cao và hàm lượng SO
2

thấp
[29]. Sự phát triển của các vi khuẩn laclic trong giai đoạn đầu của quá trình lên men
nrợu mang tính chuyển tiếp. Trong giai đoạn hoạt động mạnh nhất của quá trình lên
men rượu và tới tận khi hàm lượng đường đã bị cạn kiệt, số lượng các vi khuẩn
giảm xuống nhanh chóng, chỉ còn 10
2
- 10
3
tế bào/ml và thậm chí còn thấp hơn do
sự cạnh tranh với các loại nấm men và các điều kiện môi trường. Trong quá trình
lên men rượu, sự cạnh tranh của nhiều loài vi khuẩn khác nhau diễn ra liên tục và
tới cuối quá trình lên men rượu thì chỉ có những loài chịu được với môi trường
êtanol tốt hơn tồn tại được, đặc biệt là các vi khuẩn O.oeni [35]. Cuối quá trình lên
men rượu, sẽ còn khoảng 10
2
- 10
3
tế bào/mL vi khuẩn O.oeni. Chính loài này sẽ tự
sinh sản ngay sau đó và tạo ra hệ vi sinh vật chịu trách nhiệm lên men malolactic.

10
Cũng có thể có các đại diện của các loài khác còn sống sót với số lượng rất nhỏ sau
quá trình lên men, chúng có thể phát triển nếu như rượu vang không được bảo vệ
tốt và đây chính là nguyên nhân làm hỏng rượu vang. Liên quan tới quá trình
chuyển hoá axít malic, loài O.oeμni này được khởi động ngay sau khi số lượng quán
thể đủ lớn để khởi động (thường là 10
6
tế bào/mL). Sự phát triển này có thể kéo dài
trong nhiều ngày hoặc nhiều tuần tuỳ theo các trường hợp. Lên men malolactic có
thể hoàn thành ở cuối pha tĩnh hoặc đầu pha suy vong. Nhưng nếu có các điều kiện

là thích hợp, lên men malolactic có thể kết thúc ở cuối pha phát triển. Cuối cùng,
khi kết thúc lên men malolactic, cần phải Sulfit hoá rượu vang để loại bỏ hoàn toàn
các vi khuẩn còn sống [14].
1.2.1 Phân loại và kiểu hình của các vi khuẩn lactic trong rượu vang
Các vi khuẩn lactic thuộc nhóm các vi sinh vật Gram dương và do vậy được
nhuộm mầu bằng phép thử Gram có liên quan tới cấu tạo của thành tế bào. Các vi
khuẩn Leuconostoc và Oenococcus (hình 1-2) có dạng hình cầu. Đó là các tế bào
nhỏ (kích thước từ 0,5 - 1 μm) tròn hoặc hơi dài tạo ra các cặp hoặc chuỗi.



Hình 1.1 Tế bào dạng chuỗi của chủng O.oeni.
Tuỳ vào sự đa dạng của các sản phẩm trao đổi chất của các loại đường, các
vi khuẩn lactic được phân biệt thành 2 nhóm:
- Nhóm sinh axít lactic (> 85%) từ glucoza được gọi là lên men đồng hình như
các loài thuộc giống Pediococcus và loài Lactobacillus mali. Các vi khuẩn này phân

11
huỷ glucoza thành pyruvat theo con đường đường phân truyền thống. Pyruvat tiếp
theo bị khử thành axít D và/hoặc L - lactic phụ thuộc vào từng loài bởi các enzim
lactate dehydrogenaza L và/hoặc D. Quá trình này cho phép ôxy hoá khử các phân
tử NADH2+ thu được từ quá trình đường phân thành NAD+.
- Nhóm mà bên cạnh axít lactic, còn sản xuất axít axêtic, ethanol và CO
2
, được
gọi là lên men dị hình. Người ta phân biệt:
+ Các loài dị hình nghiêm ngặt như các loài thuộc giống Leuconostoc và một vài
loài thuộc giống Lactobacillus (L. brevis, L. hilgardii ). Chúng không có enzim
aldolaza của hai con đường (đường và pentoza -photphat) phân và do vậy không thể
lên men các loại đường theo con đường lên men dị hình của các pentoza-photphat.

+ Các loài lên men dị hình tuỳ tiện như O.oeni, Lactobacillus casei và
Lactobacillus plantarum có các enzym của cả hai con đường (đường phân và
pentoza-photphat) và chúng thích nghi với một trong hai con đường này phụ thuộc
vào điều kiện môi trường [14].
1.2.2 Vi khuẩn Oenococcus oeni
Mặc dù có rất nhiều loài vi khuẩn malolactic sử dụng trong sản xuất rượu
vang nhưng O. oeni vẫn là loài vi khuẩn được lựa chọn bởi đa số các nhà sản xuất
rượu vang. O. oeni có tên gọi trước đây là Leuconostoc oenos, là một loài hiếu khí
tùy tiện và có thể sinh trưởng trên môi trường có pH thấp (pH 4,2-4,8) được bổ sung
nước cà chua hoặc nước nho [26]. Ở các vùng sản xuất rượu nho, nó có mặt trong
dịch hèm cũng như trong rượu vang non. Nguồn cacbon (có nguồn gốc từ các loại
đường), nitơ (từ các axit amin tự do hoặc các chuỗi peptit ngắn), các vitamin (axit
nicotinic, thiamin và uracil) là toàn bộ nhu cầu cho sự sinh trưởng tối ưu của vi
khuẩn này. O.oeni có khả năng chuyển hoá axít L-malic thành axít L-lactic, lên
men fructoza, glucoza và trehaloza. Quá trình lên men glucoza tạo ra axít D-lactic,
C0
2
, axít axetic và etanol. Một số loài thuỷ phân arginin và một số khác lên men
axít xitric khi có mặt các loại đường có thế lên men, nhưng các tính chất này bị mất
đi sau một vài lần cấy liên tiếp [46].
Tế bào O. oeni có hình cầu và tồn tại ở dạng chuỗi khi sinh trưởng trên môi

12
trường rắn. Sự sinh trưởng tương đối chậm và có thể mất từ 5-7 ngày để hình thành
các khuẩn lạc có thể quan sát được tại nhiệt độ từ 20-30°C. Mặc dù trước đây chúng
được xếp vào cùng nhóm với các loài Lenconostoc, nhưng phân tích ADN đã chỉ ra
chúng là một nhóm tách biệt hoàn toàn với loài Leuconostoc [46].
O. oeni được coi là ứng viên tốt nhất để tiến hành lên men malolactic nhờ
sự thích nghi của chúng với các điều kiện khắc nghiệt của môi trường, đặc biệt là
điều kiện axít và hàm lượng cồn cao trong rượu. Rượu vang cấy các chủng O. oeni

đã tuyển chọn cho phép dễ dàng kiểm soát toàn bộ quá trình lên men malolactic.
Ngoài ra, việc lựa chọn một chủng o. oeni có thể cho phép các nhà sản xuất rượu
đảm bảo về các tính chất được tạo ra trong sản phẩm cuối cùng. Do vậy, rượu vang
tạo ra đặc trưng. Mặc dù, thường chỉ một chủng vi khuẩn được lựa chọn, nhưng
trong một số trường hợp thỉ một hỗn hợp các chủng có thể được sử dụng để cấy
giống. Điều này không chỉ tạo ra các đặc tính được yêu thích hơn của rượu vang,
mà còn tạo ra khả năng sống sót cao nhất của vi khuẩn nếu có một thực khuẩn thể
trong rượu [26].
1.3 Quá trình lên men malolactic
1.3.1 Bản chất của quá trình lên men malolactic
Trong lên men rượu vang người ta gọi quá trình phân giải axit malic và
xitric dưới tác dụng của enzym malolacticase của O. oeni là quá trình lên men
lactic, một quá trình quan trọng bậc nhất trong giai đoạn lên men phụ của rượu vang
và sâm panh [3, 42]. Vi khuẩn lactic tự nhiên luôn có mặt trên vỏ quả nho sau khi
chín với số lượng từ 10
3
đến 10
4
CFU/ml và đi vào vang non theo dịch nước quả.
Tuy nhiên, số lượng của chúng lúc này cũng bị giảm đáng kể do bị ức chế và tiêu
diệt bởi S0
2
(khoảng 50 mg/ml) ở giai đoạn sunfit hoá và nồng độ cồn cao (khoảng
14-15° cồn) sinh ra sau quá trình lên men rượu. Do vậy, trong rượu vang non, các
loại trực khuẩn và cầu khuẩn lactic bị tiêu diệt gần như hoàn toàn và chỉ còn sót lại
số lượng ít ỏi các tế bào vi khuẩn O. oeni từ 10
2
-10
3
CFU/ml. Tuy nhiêu, đây chính

là tác nhân chính của một quá trình quan trọng nhất trong giai đoạn lên men phụ kéo
dài đó là quá trình lên men malolactic.

13


Hình 1.2. Quá trình trao đổi chất của các vi khuẩn lactic lên men dị hình [32]
Đặc trưng cơ bản nhất của quá trình này là sự chuyển hoá hoàn toàn các
diaxít như malic và xitric có trong dịch quả và một phần sinh ra sau quá trình lên
men chính (khoảng 10 g/1) thành các monoaxít như lactic và axetic bởi các vi
khuẩn O. oeni [32]. Axit malic và xitric chủ yếu vào dịch lên men từ quả và chỉ một
lượng ít được tạo ra từ quá trình lên men rượu. Khi axit malic và xitric bị phân giải
sẽ làm vang chua dịu hơn và vị hài hoà hơn, một khi rượu vang không còn hai loại
axit thì ít có nguy cơ biến đổi độ chua và làm chất lượng vang ổn định hơn. Sản
phẩm của quá trình lên men malolactic từ axit malic là axit lactic và CO
2
, còn từ
axit xitric là diaxetyl, axetoin, 2,3 - butadiol đây là những tiền chất tạo nên hình
thơm đặc trưng cho vang, ngoài ra còn tạo thành axít axêtic.
Cơ chế của quá trình lên men malolactic được trình bày tóm tắt theo sơ đồ
dưới đây:





Hình 1.3. Cơ chế của quá trình lên men malolactic

14

Lên men malolactic là một chuỗi các phản ứng hoá học phức tạp được xúc
tác bởi một hệ enzim có trong vi khuẩn L.oenos. Ban đầu là enzim malat
dehydrogenaza chuyển hoá axít malic thành axít oxaloaxetic, tiếp theo là phản ứng
decacboxy được xúc tác bởi enzim oxaloaxetat decacboxylaza để tạo thành axít
pyruvic. Sản phẩm trung gian này cuối cùng bị chuyển hoá thành axít D hoặc L-
lactic bởi enzim D hoặc L-lactic dehydrogenaza [12].
1.3.2 Vai trò của quá trình lên men malolactic
Những nghiên cứu gần đây cho thấy, rượu vang được trải qua lên men
malolactic cho chất lượng cao hơn hẳn khi không trải qua giai đoạn này. Sự biến đổi
chất lượng của vang sau quá trình lên malolactic đã được chỉ ra là vì ba lí do chủ
yếu sau [3,4,42].
- Để giảm độ chua của vang do axit malic (diaxit) được chuyển thành axit
lactic (monoaxit), điều này làm giảm độ axit và tăng đọ pH nhờ đó mà vang thay vì
vị chua gắt của axit malic sẽ trở nên dịu hơn và vị hài hòa hơn.
- Làm tăng tính ổn định sinh học của rượu vang bởi vì sự phát triển của vi
khuẩn sẽ làm nghèo nguồn dinh dưỡng và loại khỏi môi trường hai axit hữu cơ quan
trọng là axit malic và axít xitric. Đảm bảo giảm tối thiểu quá trình lên men chậm
của vi khuẩn lactic khi bảo quản vang trong chai và sự phát triển một cách tự phát
của các vi sinh vật không mong muốn gây nên các bệnh cho vang.
- Làm tăng tổ hợp thơm của vang vì các hợp chất diaxetyl, axetoin và 2,3-
butanediol tạo ra từ quá trình chuyển hóa axit xitric bởi vi khuẩn là các hợp phần
tạo nên hương thơm cho vang. Những thành phần khác ảnh hưởng đến hương vị
cũng tăng như axit bay hơi, dietyl suxinat, một số este bay hơi, etyl axetat, n-
propanol, 2-butanol, n-hexanol, etyl lactate và 2,3 butanediol. Một số thành phần
khác cũng tăng nhẹ như 3-methy-n-butal axetat, n-hexyl axetat, 2-phenyletyl-axetat
và 2-etyl-n-hexanoat [42,44].



15

1.3.3 Ảnh hưởng của quá trình lên men malolactic đến thành phần và chất
lượng rượu vang
1.3.3.1 Sự giảm độ chua
Mỗi phân tử axit L-malic chuyển hóa tạo ra axit L-lactic do sự mất đi nhóm
cacboxyl và làm giảm tương ứng độ axit của rượu vang. Độ giảm axít sau quá trình
lên men malolactic rất khác nhau phụ thuộc vào nồng độ axít malic. Độ giảm này từ
2-3 g/l (H
2
SO
4
). Lên men 1 g axít malic trong 1 lít rượu vang non sẽ làm giảm axít
tổng số xấp xỉ 0,4 g/1. Trong quá trình lên men malolactic, hàm lượng axít bay hơi
thường xuyên tăng lên, có thể một phần là do sự phá hủy của axít xitric. Vi khuẩn
cũng sản xuất axít axetic từ sự phân giải đường pentoza. Sự phân hủy axít malic
dường như là không đủ cung cấp năng lượng cho hoạt động tế bào [28].

Bảng 1.1. Phân tích rƣợu vang đỏ trƣớc và sau lên men malolactic
Axít
Trƣớc lên men
(g/1 H
2
SO
4
)
Sau lên men
(g/1 H
2
SO
4
)

Axít tổng số
4,9
3,8
Axít bay hơi
0,21
0,28
Axít malic
3,2
0,5
Axít lactic
0,12
1,8

Lên men malolactic được thừa nhận là có ảnh hưởng tới sự ổn định vi sinh
vật và sự phức tạp của hương vị, cần thiết để điều chỉnh độ axít và pH của rượu
vang. Sự tăng lên của pH đi kèm với lên men malolactic có thể cũng ảnh hưởng đến
màu sắc của rượu vang.

1.3.3.2 Những thay đổi về hương
Các nhà nghiên cứu đã chỉ ra rằng các chủng vi khuẩn malolactic khác nhau
có thể tăng hoặc giảm cường độ của các đặc tính hương và vị của rượu vang và
những thay đổi này phụ thuộc vào chủng vi khuẩn. Ngoài ra, hương rượu vang chịu
tác động của lên men malolactic có thể là mùi bơ, mùi hạt dẻ, mùi nấm men, mùi gỗ

16
sồi, mùi mồ hôi và mùi đất. Lên men malolactic cũng tác động đến hương hoa và
quả cũng như cảm giác mềm mại của rượu vang [28,32]. Cơ chế ảnh hưởng của vi
khuẩn malolactic đến hương rượu vang có thể là:
- Loại bỏ những hợp chất tạo hương có trong rượu vang non bởi sự trao đổi
chất và hấp thụ với thành tế bào.

- Tạo ra các họp chất tạo hương mới từ vi khuẩn nhờ quá trình trao đổi chất
của đường, axít amin và các cơ chất khác.
- Sự trao đổi chất và biến đổi các sản phẩm thứ cấp từ nấm men và nho tới các
sản phẩm cuối cùng tạo ra tác động lớn hơn hoặc nhỏ hơn đối với giá trị cảm quan
của rượu.
Các chủng vi khuẩn lên men malolactic có khả năng tạo ra diaxetyl có mùi
bơ, mùi hạt dẻ. Mặc dù hàm lượng thấp từ 1-4 mg/1 tạo ra hương bơ đặc trưng cho
rượu vang nhưng hàm lượng vượt quá 5-7 mg/1 có thể ảnh hưởng bất lợi tới chất
lượng rượu vang và gây hỏng rượu [17,39].
Sự tạo thành diaxetyl chịu ảnh hưởng bởi các vi sinh vật, môi trường và các
yếu tố sản xuất. Ngoài yếu tố chủng vi sinh vật, các yếu tố sản xuất cũng có một tác
động đáng kể đến hàm lượng diaxetyl, bao gồm loại rượu, tương tác giữa cặn nấm
men và vi khuấn, thời gian hoàn thành lên men malolactic, sự tiếp xúc giữa rượu
vang và không khí, sự bổ sung S0
2
, hàm lượng axit xitric và đường, nhiệt độ và pH.
Một số tiêu chí cho rằng để đạt được hàm lượng diaxetyl cao trong rượu vang bao
gồm sử dụng một chủng vi sinh vật có khả năng tạo ra hàm lượng diaxetyl cao, tỷ lệ
cấy giống vi khuẩn thấp, pH và nhiệt độ thấp hơn [11,37].
Hương quả của rượu vang không nhất thiết bị giảm bởi quá trình lên men
malolactic, thậm chí trong một số trường hợp nó có thế còn tăng lên do nó có thể
tạo ra các este như etyl lactat và isoamyl axetat. Điều thú vị là sự tăng lên của
hương quả nhờ quá trình lên men malolactic liên quan tới sự giảm đi của mùi rau.
Sự giảm đi của mùi rau trong rượu vang Chardonnay sau quá trình lên men
malolactic là loại bỏ mùi tỏi chín và mùi giống ure của 1-octanol và l-octene-3-ol [32] .


17
1.3.3.3 Ảnh hưởng đến màu sắc của rượu vang đỏ
Lên men maloactic rượu vang đỏ có thể làm giảm cường độ màu của rượu

vang đỏ. Ví dụ như sự tăng lên của pH trong quá trình lên men malolactic có thể tác
động đến sự cân bằng phụ thuộc pH của các chất màu anthocyanin, dẫn tới mất đi
màu đỏ. Sự giảm màu sắc của rượu vang đỏ tăng lên liên tục bởi sự kết tủa của các
phân tử anthocyanin được giải phóng với các polysaccharit. Lên men malolactic
cũng làm tăng sự kết tủa anthocyanin và tannin. Phản ứng này làm ổn định màu của rượu.
Tính chất cảm quan của rượu cũng được tăng lên nhiều. Hương của rượu
trở nên quyến rũ hơn. Rượu trở nên mềm mại hơn do sự khử gần như hoàn toàn axit
malic thành axít lactic. Kết thúc quá trình lên men malolactic, hương và vị của rượu
đầy đủ hơn nhưng lại thanh hơn [7].
1.3.3.4 Các chất ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn malolactic và quá trình lên
menmalolactic
Thành phần rượu vang, phương pháp sản xuất và mối tương tác giữa vi
khuẩn malolactic và các vi sinh vật khác có thế ảnh hưởng tới sự sống sót và sinh
trưởng củavi khuấn malolactic trong rượu vang và vì vậy ảnh hưởng tới quá trình
lên menmalolactic. Tuy nhiên, các điều kiện môi trường như pH, nhiệt độ, độ cồn,
tình trạng dinh dưỡng, và S0
2
cũng chiếm một vai trò đáng kể (hình 1.4).

Hình 1.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men malolactic [7]
Giá trị pH nhỏ nhất mà tại đó vi khuẩn sinh trưởng được trong rượu vang
pH

18
xấp xỉ 2,9-3,0. Sự sinh trưởng của vi khuẩn nhanh hơn và quá trình lên men
malolactic hoàn thành sớm hơn khi pH tăng trên 3,0. Mặc dù pH 6,3 là tối ưu cho
hoạt động của các enzym malolactic, nhưng sự phân giải axit malic lại diễn ra
nhanh nhất tại các giá trị pH thấp hơn.
Khả năng chịu cồn là một đặc tính quan trọng của nhiều vi khuẩn
malolactic. Hầu hết các chủng không có khả năng phát triển trong rượu vang có

hàm lượng cồn lớn hơn 15% v/v nhưng một số lại quan sát thấy sự sinh trưởng ở độ
cồn 20% v/v.
Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu đối với phòng thí nghiệm vi khuẩn lactic là từ
25-27°C và tỷ lệ phân giải malatcao nhất tại nhiệt độ gần đó. Tốc độ sinh trưởng
của vi khuẩn malolactic và tốc độ lên men malolactic bị ức chế tại nhiệt độ thấp.
SO
2
có tác dụng ức chế vi khuẩn malolactic, SO
2
còn có tác dụng thúc đẩy
quá trình lắng trong dịch nho. Theo Navarre (1994), đó là do sự ức chế hệ vi sinh
vật có trong nguyên liệu của SO
2
nên không xảy ra hiện tượng lên men tự nhiên
trong hỗn hợp nho sau quá trình nghiền xé. Nhờ đó mà sự kết lắng của các cấu tử lơ
lửng trong dịch nho sẽ diễn ra nhanh và hiệu quả.
Sự có mặt của thực khuẩn thể có thể cũng ức chế quá trình lên men
malolactic trong rượu vang. Các chủng thực khuẩn thể chống lại các điều kiện bất
lợi và gây phán hủy tế bào vi khuẩn malolactic. Chúng cũng có khả năng phá vỡ
động học quần thể của quá trình lên men malolactic. Mặc dù sự có mặt của các thực
khuẩn thể có ảnh hưởng nghiêm trọng tới chất lượng của rượu vang, chúng có xu
hướng bị ức chế trong suốt quá trình sinh trưởng của vi khuẩn malolactic và ảnh
hưởng của chúng là rất nhỏ nhờ các điều kiện đảm bảo thuận lợi cho sự sinh trưởng
của các vi khuẩn malolactic [7]
1.4 Các kỹ thuật nhằm cải thiện quá trình lên men malolactic
1.4.1 Sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic
Với mục đích khắc phục một cách hiệu quả các yếu tố bất lợi nói trên người ta
đã sử dụng chủng giống vi khuẩn thuần khiết có khả năng lên men malolactic mạnh
trong quá trình sản suất rượu vang. Để sử dụng các chế phấm này một cách hiệu

19
quả, các nhà sản xuất khuyến cáo không nên cấy trực tiếp chế phẩm vào vang non
mà trước tiên phải nhân giống bằng môi trường có bổ xung dịch nước quả và axít
malic cho vi khuẩn từ từ lấy lại hoạt tính lên men malolactic rồi sau đó mới cấy vào
rượu vang non, nhờ vậy tỷ lệ sống của vi khuẩn L.oenos lúc này đạt trên 80% so với
khi cấy trực tiếp chỉ đạt 20%.
Sử dụng cố định tế bào cho quá trình lên men malolactic
Lên men malolactic liên tục bằng phương pháp cố định tế bào vi khuẩn
L.casei trên gel polyacrylamit lần đầu tiên được thực hiện vào năm 1985 bởi Davis
và cộng sự. Bên cạnh đó còn có nhiều nghiên cứu về lên men malolactic bằng cố
định tế bào vi khuẩn L.oenos trong gel aginat ở 25°c trong 24 giờ. Kết quả cho thấy,
trong phương pháp cố định tế bào hoạt tính lên men malolactic được duy trì lâu hơn
so với lên men thông thường, ngay cả trong điều kiện môi trường có độ axít cao và
hàm lượng SO
2
lớn[12].
Trong một nghiên cứu khác, tế bào vi khuẩn Lactobacillussp. 48 đã được cố
định trên gel k-carrageenan khi có hoặc không có mặt Pentagel (bentonit tinh khiết)
có tác dựng làm tăng kích thước lỗ của gel do vậy tạo điều kiện thuận lợi cho quá
trình chuyển khối của hệ thống cố định tế bào. Trong quá trình này, trực khuẩn
Lactobacilli có hoạt tính lên men axít malic, biến đổi pH môi trường, giảm độ chua,
tạo axít lactic tương đương với quá trình lên men malolactic truyền thống [43].
Nếu như sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic để thực hiện quá trình lên men
malolactic thì thời gian lên men phụ có thể rút ngắn xuống còn vài tháng so với vài
năm khi lên men theo truyền thống. Tuy nhiên, thời gian lên men phụ để cho quá
trình lên men malolactic diễn ra triệt để chỉ mất có vài ngày, thậm chí là vài giờ khi
tiên hành lên men bằng cố định tế bào. Chính vì vậy, lên men malolactic bằng cố
định tế bào là một giải pháp có nhiều triển vọng để nâng cao chất lượng của rượu vang.
1.4.2 Sử dụng chế phẩm enzim malolactic để chuyển hoá axít malic
Cho tới nay, sử dụng chế phẩm enzim malolactic có thể được coi là một giải

pháp lý tưởng nhất để chuyển hoá axít malic. Đã có rất nhiều chế phẩm enzim loại
này được sản suất và thương mại hoá, đặc biệt là 5 loại enzym sau: EC 1.1.1.40-

20
enzym malic phụ thuộc NADP, EC 1.1.1.37 - enzym malic dehydrogenaza phụ
thuộc NAD, EC 1.1.1.27- enzyme phụ thuộc NAD, chuyến hoá axít pyruvic thành
axít lactic, EC 1.6.1.1- enzyme nicotiamit nucleotit transhydrogenaza, chuyển H từ
NADPH sang NDA và enzim malolactic phụ thuộc NAD, chuyển hoá trực tiếp axít
malic thành axít lactic.
Hervé Vaillant và Pascal Formisyn, 1996, đã sử dụng phương pháp cố định
enzim malolactic tinh sạch từ chủng L.oenos 8406 trên màng Polysulfone nhằm
chuyển hoá axít malic thành axít lactic. Kết quả cho thấy nhờ có quá trình tinh sạch
mà hoạt lực của enzim malolactic đã tăng 7,5 lần, tức là từ 1,7 đơn vị/mg lên 12,8
đơn vị/mg protein và khối lượng của enzim này là 131 kDa. Trong điều kiện vang
non có pH là 5.5 thì sau 1 tuần có tới 70% lượng axít malic có trong vang bị chuyển
hoá thành axít lactic và tỷ lệ này là 1:1.
1.4.3 Sử dụng chủng nấm men tái tổ hợp gen malolactat decacboxylaza trong
sản xuất vang
Để thực hiện quá trình lên men malolactic người ta còn đề cập tới một
phương pháp hoàn toàn mới đang được nhiều nhà khoa học quan tâm. Đó chính là
sử dụng nấm men chuyển gien. Người ta chuyển gien quyết định khả năng lên men
malolactic của vi khuẩn Leuconostoc oenos vào tế bào nấm men Saccharomyces để
thực hiện đồng thời quá trình lên men rượu và quá trình lên men malolactic nhằm
rút ngắn qui trình sản xuất rượu vang mà vẫn thực hiệu đầy đủ các quá trình lên
men. Để có thể nâng cao năng suất và chất lượng rượu vang, thỏa mãn nhu cầu tiêu
thụ vang ngày càng nhiêu của thị trường.
Có thế nói xu hướng sử dụng chủng nấm men tái tổ hợp vừa có khả năng
lên men rượu vừa có khả năng lên men malolactic đang thu hút được rất nhiều sự
quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học hiện nay. Đã có rất nhiều thành công
trong việc đưa vào các chủng nấm men rượu vang S.cerevissiae mang đoạn gen mã

hoá cho enzim malolactat decacboxylaza. Bằng cách sử dụng các mồi (primer) được
sinh ra từ các vùng bao thủ của các đoạn protein của enzim malic, Cécile Labarre và
cộng sự, 1996 đã nhận được một đoạn ADN có kích thước 324-bp của L.oenos Lo