Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có khả năng phân giải tinh bột và thử nghiệm xử lý nước thải nuôi trồng thủy sản tại Quảng Nam - Đà Nẵng.

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG



NGUYỄN THỊ HỒNG TRINH

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN
CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY TINH BỘT VÀ THỬ NGHIỆM
XỬ LÝ NƯỚC THẢI HỒ NUÔI TRỒNG THỦY SẢN TẠI
QUẢNG NAM - ĐÀ NẴNG


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP



Đà nẵng, 2015
ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG


NGUYỄN THỊ HỒNG TRINH

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN
CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY TINH BỘT VÀ THỬ NGHIỆM
XỬ LÝ NƯỚC THẢI HỒ NUÔI TRỒNG THỦY SẢN TẠI
QUẢNG NAM - ĐÀ NẴNG

Ngành: Quản lý tài nguyên và môi trường

Người hướng dẫn: TS. Võ Châu Tuấn



Đà nẵng, 2015
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chưa từng được
ai công bố trong bất kì công trình nào khác.
Tác giả


Nguyễn Thị Hồng Trinh

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân
thành đến TS. Võ Châu Tuấn – người đã trực tiếp hướng dẫn em trong suốt
thời gian thực hiện đề tài. Đồng thời, xin chân thành cảm ơn sự quan tâm, tạo
điều kiện và giúp đỡ của Ban chủ nhiệm khoa Sinh – Môi trường, các thầy cô
giáo và bạn bè.
Đà Nẵng, Ngày 05 tháng 05 năm 2015
Sinh viên thực hiện


Nguyễn Thị Hồng Trinh

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1
1. Đặt vấn đề 1
2. Mục tiêu của đề tài 2
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Sơ lược về VSV có khả năng sinh amylase và đặc điểm của enzyme 3
1.1.1. Các loại VSV sinh enzyme amylase 3
1.1.2. Đặt tính và cơ chế tác dụng của amylase 4
1.1.3. Sinh tổng hợp amylase ở VSV 5
1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp amylase
của VSV 5
1.2.1. Ảnh hưởng của pH môi trường 5
1.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ 6
1.2.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 6
1.3. Các nghiên cứu ứng dụng VSV trong xử lý nước thải NTTS 7
1.3.1. Nước thải NTTS và các vấn đề môi trường 7
1.3.2. Các ghiên cứu VSV để xử lý nước thải NTTS 8
1.3.3. Các ứng dụng VSV trong xử lý nước thải NTTS 10
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12
2.1. Đối tượng nghiên cứu 12
2.2. Địa điểm, phạm vi và thời gian nghiên cứu 12
2.2.1. Địa điểm nghiên cứu 12
2.2.2. Phạm vi nghiên cứu 12
2.3. Phương pháp nghiên cứu 12
2.3.1. Phương pháp lấy mẫu 12
2.3.2. Phương pháp phân lập và xác định VK có khả năng phân hủy tinh bột
mạnh 12
2.3.3. Phương pháp nhộm Gram 14
2.3.4. Phương pháp xác định các điều kiện ảnh hưởng đến sinh trưởng của
VK 14

2.3.5. Phương pháp xác định ảnh hưởng của các điều kiện đến khả năng sinh
enzyme amylase của VK 15
2.3.6. Phương pháp bố trí thí nghiệm xử lý nước thải NTTS bằng vi khuẩn ở
bể aerotank 16
2.3.7. Phương pháp xác định các thông số ô nhiễm của nước thải 16
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 18
3.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng VK có khả năng phân giải tinh bột 18
3.2. Khảo sát các đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào VK 19
3.2.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc 19
3.2.2. Đặc điểm hình thái tế bào 20
3.3. Ảnh hưởng của một số yếu tố nuôi cấy đến sinh trưởng và sinh enzyme
amylase của các chủng VK 21
3.3.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 21
3.3.2. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy 23
3.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ 25
3.4. Thử nghiệm xử lý nước thải NTTS bằng vi khuẩn tuyển chọn trên bể lọc
sinh học hiếu khí 26
3.4.1. Sự thay đổi pH của nước thải NTTS trong 9 ngày xử lý bằng VK tuyển
chọn 27
3.4.3. Sự thay đổi hàm lượng BOD trong nước thải xử lý 28
3.4.4. Sự thay đổi hàm lượng NH
4
+
trong nước thải xử lý 29
3.4.5. Sự thay đổi hàm lượng photphat trong nước thải xử lý 30
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31
1. Kết luận 31
2. Kiến nghị 31
TÀI LIỆU THAM KHẢO 32

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
NTTS : nuôi trồng thủy sản
VK : vi khuẩn
VSV : vi sinh vật
EM : efective microorganis
CHC : chất hữu cơ
BOD : nhu cầu oxy sinh học
DANH MỤC BẢNG
TT
Tên bảng
Trang
1
Bảng 3.1. Khả năng phân giải tinh bột của các chủng vi
khuẩn phân lập
18

DANH MỤC BIỂU ĐỒ
TT
Tên biểu đồ
Trang
1
Biểu đồ 3.1. Quá trình sinh trưởng của VK T1, T3 và T5
trong 72 h nuôi cấy
21
2
Biểu đồ 3.2. Khả năng phân giải tinh bột của enzyme
amylase 3 chủng VK T1, T3, T5 trong 72 h nuôi cấy
22
3

Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của 3
chủng VK T1, T3, T5
23
4
Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh enzyme
amylase của 3 chủng T1, T3, T5
24
5
Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng của 3
chủng T1, T3, T5
25
6
Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phân
giải tinh bột của 3 chủng T1, T3, T5
26
7
Biểu đồ 3.7. Sự thay đổi pH trong nước thải NTTS qua 9
ngày xử lý
27
8
Biểu đồ 3.8. Hàm lượng TSS trong nước thải NTTS qua 9
ngày xử lý
28
9
Biểu đồ 3.9. Sự thay đổi hàm lượng BOD trong nước thải
NTTS qua 9 ngày xử lý
29
10
Biểu đồ 3.10. Sự thay đổi hàm lượng NH
4

+
trong nước thải
NTTS qua 9 ngày xử lý
29
11
Biểu đồ 3.1. Sự thay đổi hàm lượng PO
4
3-
trong nước thải
NTTS qua 9 ngày xử lý
30

DANH MỤC HÌNH
TT
Tên hình
Trang
1
Hình 3.1. Khả năng phân giải tinh bột của các chủng vi
khuẩn phân lập
19
2
Hình 3.2. Hình thái khuẩn lạc 3 chủng VK T1, T3, T5 nuôi
cấy trên môi trường LB
20
3
Hình 3.3. Hình thái tế bào của 3 chủng VK T1, T3,T5
20
4
Hình 3.4. Vòng phân giải tinh bột của các chủng VK trong
thời gian tối ưu

22
5
Hình 3.5. Vòng phân giải tinh bột của các chủng VK trên
môi trường pH tối ưu
24
6
Hình 3.6. Vòng phân giải tinh bột của 3 chủng VK ở nhiệt
độ tối ưu
26




1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Việt Nam được xem là nước có tài nguyên biển khá đa dạng và phong
phú. Ngành đánh bắt, nuôi trồng và chế biến thuỷ hải sản chiếm tỷ trọng khá
lớn trong kim ngạch xuất khẩu của Việt Nam [1]. Trong những năm gần đây,
nhận thấy tầm quan trọng của nghề nuôi trồng thủy sản (NTTS), Chính phủ và
Bộ Thuỷ sản đã dành sự ủng hộ mạnh mẽ cho phát triển bền vững của NTTS.
Chính vì thế ngành khai thác và nuôi trồng thủy hải sản ở nước ta đã có những
buớc tiến vượt bậc, đóng góp quan trọng vào tổng kim ngạch xuất khẩu, giải
quyết công ăn việc làm cho hàng triệu lao động của nuớc ta [17].
Với tiềm năng và lợi thế trong NTTS, các tỉnh, thành phố duyên hải miền
Trung đã tập trung phát triển NTTS. Năm 2013, diện tích nuôi trồng toàn vùng đạt
xấp xỉ 34 nghìn ha. Sản lượng đạt hơn 180 nghìn tấn. Hình thức sản xuất trước
đây chủ yếu theo hộ gia đình với quy mô nhỏ, song trong những năm gần đây,
ngành NTTS của vùng duyên hải miền Trung đã và đang thu hút được nhiều
nhiều nhà đầu tư sản xuất nuôi trồng, kinh doanh thức ăn nuôi thủy sản và các

dịch vụ thú y Tuy nhiên, việc phát triển mạnh diện tích nuôi trồng đã gây ảnh
hưởng xấu - làm suy thoái môi trường trên diện rộng, trong đó có tỉnh Quảng Nam
và Đà Nẵng. Tình trạng ô nhiễm môi trường đang xảy ra nghiêm trọng trong
NTTS do hàm lượng lớn các chất hữu cơ (CHC) cao phân tử chậm phân hủy
như tinh bột, pectin, protein, lipid, cellulose và một số chất khác [7] sinh ra từ
lượng thức ăn dư thừa, phân và các rác thải khác đọng lại dưới đáy ao nuôi.
Ngoài ra, còn các hóa chất, kháng sinh được sử dụng trong quá trình nuôi
trồng cũng dư đọng lại mà không được xử lý. Việc hình thành lớp bùn đáy do
tích tụ lâu ngày của các CHC, cặn bã là nơi sinh sống của các vi sinh vật
(VSV) gây thối, các VSV sinh các khí độc như NH
3
, NO
2
, H
2
S, CH
4
Các
VSV gây bệnh như: Vibrio, Aeromonas, E. coli, Pseudomonas, Proteus,
Staphylococcus nhiều loại nấm và nguyên sinh động vật làm phát sinh
2
nhiều loại dịch bệnh nguy hại, ảnh hưởng lâu dài đến đời sống và kinh tế
người dân. Bên cạnh đó, việc xả chất thải chưa qua xử lí ra môi trường đã và
đang hủy hoại môi trường sinh thái, làm cạn kiệt nguồn nước dùng cho sinh hoạt
và nuôi trồng.
Tại Quảng Nam và Đà Nẵng hiện nay vẫn chưa có công trình nghiên cứu
nào về việc xử lý nước thải hồ nuôi trồng thủy sản cũng như đưa ra các biện
pháp để giảm thiểu ô nhiễm. Như vậy, việc tìm ra giải pháp xử lý ô nhiễm
môi truờng, xử lý nuớc thải NTTS đang là một vấn đề mang tính thời sự, rất
cấp bách. Xuất phát từ những cơ sở trên đây, chúng tôi tiến hành thực hiện đề

tài “Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy
tinh bột và thử nghiệm xử lý nước thải hồ nuôi trồng thủy sản tại Quảng
Nam – Đà Nẵng”.
2. Mục tiêu của đề tài
Tuyển chọn được các chủng vi khuẩn (VK) có khả năng sinh enzyme
amylase mạnh, đồng thời xác định được khả năng xử lý nước thải hồ NTTS
của các chủng VK tuyển chọn.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
Đề tài cung cấp dữ liệu khoa học về các chủng VK có khả năng phân giải
tinh bột trong môi trường nước tại địa phương; đồng thời cung cấp cơ sở khoa
học trong xử lý nước thải bằng VSV.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của đề tài là sơ sở để phát triển phương pháp xử lý nước thải
NTTS bằng VSV có hiệu quả cao và thân thiện với môi trường.




3
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Sơ lược về VSV có khả năng sinh amylase và đặc điểm của enzyme
1.1.1. Các loại VSV sinh enzyme amylase [2]
Trong thiên nhiên enzyme có ở hầu hết mọi thực vật, động vật và VSV.
Song chỉ có một số hạt thực vật và một số loài VSV mới là những đối tựợng
có thể dùng làm nguồn thu các chế phẩm enzyme amylase, do chúng có khả
năng tích lũy một lượng lớn các enzyme này trong những điều kiện xác định.
Những chủng VSV tạo nhiều amylase thường đựơc phân lập từ các

nguồn tự nhiên. VSV tạo amylase được dùng nhiều hơn cả là nấm sợi, giải
nấm men và VK, còn xạ khuẩn thì ít hơn. Để thu nhận amylase người ta
thường dùng các giống nấm sợi Aspergillus và Rhizopus
Nấm men và giả nấm men thuộc các giống Candida, Saccharomyces,
Endomycopsis, Endomyces cũng tạo amylas. Đặc biệt người ta đã tuyển chọn
được chủng Endomycopsis specise 20-9 có khả năng tổng hợp mạnh mẽ
glucoamylase, -amylase, glucoziltrans-ferase và invertase.
Nhiều VK cũng có khả năng tạo lượng lớn enzyme amylase như:
Phytomonas destructans, B.cassavanum, Clostridium acetobutylicum,
Pseudomonas saccharophila… Các VK ưa nhiệt có khả năng sinh trưởng
nhanh và phát triển tốt ở nhiệt độ cao nên khi nuôi chúng ít bị nhiễm VSV
khác. Đáng chú ý là B.diastaticus, B.tearothermo-philus, B.coagulans, B.
circulans, đặt biệt là B.circulans được phân lập từ đất sinh trưởng tốt ở 65-
70C và tạo amylase mạnh nhất ở 50C.
Trong nhóm xạ khuẩn thì rất hiếm gặp loài tạo amylase mạnh mẽ, tuy
nhiên, cũng có một số, chẳng hạn như xạ khuẩn ưa nhiệt. Micromonospora
vulgaris 42 có khả năng tạo một lượng nhỏ - amylase hoạt động ở 65
o
C
cùng với proteinase và các enzyme khác.
4
1.1.2. Đặc tính và cơ chế tác dụng của amylase [2]
Hiện nay người ta đã biết rõ có 6 loại enzyme amylase trong đó -
amylase, -amylase, gluco-amylase (-amylase) thủy phân liên kết -1,4-
glucoside của tinh bột và các polysaccharide, 3 amylase còn lại (dextrin-6-
glucanhidrolase, amilopectin-6-glucanhidrolase, oligoside-6-glucanhidrolase
hay dextrinase) thủy phân các liên kết -1,6-glucoside trong polysaccharide
và các dextrin cuối.
a.


-amylase
-amylase phân cắt các liên kết -1,4-glucoside nằm ở phía bên trong
phân tử cơ chất (tinh bột, glycogen và polysaccharide) một cách ngẫu nhiên.
Như vậy chúng có khả năng chuyển 80 – 82% tinh bột thành maltose. -
amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà còn thủy phân cả hạt tinh bột còn
nguyên, song tốc độ rất chậm.
Khi thủy phân tinh bột -amylase thường xảy ra 2 giai đoạn:
- Giai đoạn đầu: chỉ một số liên kết trong phân tử bị đứt và độ nhớt của
hồ tinh bột giảm nhanh.
- Giai đoạn hai: thủy phân các dextrin phân tử lớn vừa tạo thành.
- -amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công những hạt tinh bột bị
vỡ, còn -amylase VK lại có khả năng phân hủy các hạt tinh bột còn nguyên
lẫn hồ tinh bột (Popadicts và cs, 1971). Amylase của Bacillus subtilis phân
giải tinh bột còn nguyên 2 – 2,5 lần nhanh hơn so với -amylase của nấm
mốc (Lixiuk và Popadicts, 1969) (trích Lê Minh Cẩm Ngọc, 2005)
pH tối thích cho hoạt động của -amylase từ nấm mốc là 4,5 – 4,8; của
VK là 5,8 – 6,0 (hoạt động tốt pH: 5,8 – 7,0). Nhiệt độ tối thích cho hoạt động
xúc tác của -amylase là 50C. Amylase của VK có thể chịu được nhiệt độ
92C, trong khi đó amylase của nấm mốc bị bất hoạt ở 70C. Tính bền nhiệt
5
của -amylase VK là một ưu điểm lớn, được sử dụng để xử lý nguyên liệu ở
các công đoạn phải dùng nhiệt cao.
b.

-amylase


-amylase không thủy phân hạt tinh bột nguyên mà thủy phân mạnh mẽ
hồ tinh bột.


-amylase xúc tác sự thủy phân các liên kết -1,4glucan trong tế
bào.

- amylase chỉ phổ biến trong giới thực vật. Vi khuẩn không có

-
amylase.
c. Glucoamylase
Glucoamylase thủy phân liên kết -1,4 glucan và -1,6 glucan trong
polysaccharide. Glucoamylase có khả năng xúc tác thủy phân phân hủy hoàn
toàn tinh bột, glucogen, amylopeptin, panose, isomantose và mantose tới
glucose. Đa số glucoamylase đều thuộc loại enzyme acid, thể hiện hoạt lực tối
đa ở vùng pH 3,5 – 5. Glucoamylase bền với acid nhưng lại kém bền với tác
dụng của rượi etylic, aceton.
1.1.3. Sinh tổng hợp amylase ở VSV
Khi nuôi VSV tạo amylase có hai quá trình liên kết mật thiết nhau: quá
trình tổng hợp sinh khối VSV và quá trình tích tụ enzyme trong tế bào hay
ngoài môi trường.
Amylase của Bacillus subtilis được tạo thành ở VK trong giai đoạn đã
hoặc đang kết thúc quá trình sinh trưởng. Cả trong môi trường nuôi cấy lẫn
trong bản thân tế bào VK “trẻ” đều không tìm thấy amylase. Amylase ngoại
bào được tổng hợp ở tế bào đang chuyển sang thời kỳ tự phân.
1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp
amylase của VSV [9] [10] [2]
1.2.1. Ảnh hưởng của pH môi trường
Khi nuôi cấy VSV bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt thì pH môi
trường ít bị thay đổi trong quá trình nuôi do môi trường có dung dịch đệm, độ
ẩm thấp. Tuy nhiên, pH ban đầu cũng ảnh hưởng không nhỏ đến sự phát triển
6
và hình thành enzyme của VSV. VSV ưa acid có pH sinh trưởng tốt nhất là

pH 0 - 5,5; đối với VSV ưa trung tính là pH 5,5 - 8,0; đối với VSV ưa kiềm
thì pH 8,5 - 11,5. VSV ưa kiềm cực đoan có mức sinh trưởng tối ưu ở pH 10
hay cao hơn nữa. Nói chung, các nhóm VSV khác nhau đều có phạm vi sinh
trưởng riêng của mình. Đa số VK phát triển và sinh enzyme cao ở môi trường
trung tính, trong khi đó nấm sợi phát triển và tạo amylase ở môi trường axit
yếu. pH môi trường không chỉ ảnh hưởng đến lượng enzyme tổng hợp mà
còn ảnh hưởng đến chủng loại enzyme được tổng hợp. Khi nuôi cấy A.oryzae
trên môi trường có pH 6,5 thì ưu thế tổng hợp thuộc về -amylase, trong khi
đó ưu thế thuộc về glucoamylase khi pH môi trường là 4,5.
1.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng với sinh trưởng của
VSV và sự tạo thành các enzyme amylase. Không tuân thủ đầy đủ chế độ
nhiệt sẽ dẫn tới giảm hoạt lực các amylase. Nhiệt độ nuôi tối thích đối với
nấm sợi thuộc giống Aspergillus là 30 - 32C, môi trường thích hợp nhất và
tạo nhiều amylase ở Bacillus là 37C, một số VK khác thì có nhiệt độ tối
thích cao hơn. B.circulans phát triển mạnh ở nhiệt đô 65 - 70C song lại tạo
nhiều amylase ở nhiệt độ 50C, vì vậy người ta thường cấy giống ở 70C sau
đó tiến hành cho tích lũy ở nhiệt độ 50C nuôi chủng này bằng môi trường
nước lỏng gồm nước nấu khoai tây, pepton. Các VSV ưa nhiệt thì sinh tổng
hợp nên các amylase bền nhiệt. Enzyme với độ bền nhiệt cao có ưu thế lớn
trong nhiều lĩnh vực sản xuất.
1.2.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Thời gian nuôi cấy ảnh hưởng rất lớn đến sự tạo thành enzyme. Đối với
đa số nấm mốc khi nuôi ở môi trường xốp sự tạo thành amylase cực đại
thường kết thúc khi nấm mốc bắt đầu sinh bào tử, thời gian kết thúc sự tạo
thành amylase thường từ 30 - 42 giờ. Còn đối với VK sự tạo thành amylase
tốt nhất từ khoàng 40 - 50 giờ. Còn nuôi cấy chìm sinh trưởng của chủng
7
giống đạt cực đại tới pha ổn định trước, khoảng từ 5 đến 8 giờ sau thì hoạt độ
enzyme đạt cực đại.

1.3. Các nghiên cứu ứng dụng VSV trong xử lý nước thải NTTS
1.3.1. Nước thải NTTS và các vấn đề môi trường
Ở Việt Nam hoạt động NTTS thực sự khởi sắc từ năm 1990 và đến năm
2000 – 2002 thì bùng phát cả về diện tích lẫn đối tượng nuôi. Việc mở rộng
diện tích NTTS được tiến hành chủ yếu trên các vùng đất ngập nước ven biển
miền Trung và một phần diện tích canh tác nông nghiệp kém hiệu quả đã
được chuyển sang NTTS [4].
Sự suy giảm chất lượng môi trường nước tăng tỷ lệ thuận với diện tích
và sản lượng NTTS. Tại một số khu vực nuôi tôm tập trung (trong đó có cả
nuôi trên cát), do việc xả thải các CHC phú dưỡng, chất độc VSV (cả mầm
bệnh) và các chất sinh hoạt bừa bãi làm cho môi trường suy thoái, bùng nổ
dịch bệnh (bệnh tôm năm 1993 – 1994) và gây thiệt hại đáng kể về kinh tế
cũng như về điều kiện môi trường sinh thái [4].
Hiện nay, có rất nhiều loại sản phẩm thuốc, hóa chất và chế phẩm sinh
học được dùng rộng rãi trong NTTS trên thế giới. Hóa chất được dùng trong
NTTS trên thế giới thường ở các dạng sau: thuốc diệt nấm (antifoulants),
thuốc khử trùng (disinfectants), thuốc diệt tảo (algicides), thuốc trừ cỏ
(herbicides), thuốc trừ sâu (pesticides), thuốc diệt ký sinh trùng (parasiticides)
và thuốc diệt khuẩn (antibacterials) và chất kháng sinh được sử dụng đáng kể
trong NTTS hoặc để chữa các bệnh lây nhiễm hoặc phòng bệnh [5].
Những hóa chất trên có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ sức khỏe
động vật thủy sản nếu như sử dụng đúng, nhưng khi lạm dụng dẫn đến những
hậu quả khôn lường, gây rủi ro cho người lao động, làm giảm giá trị thương
phẩm và còn tạo các chủng VK kháng thuốc làm giảm hiệu quả trong điều trị
bệnh.
8
Phần lớn lớp bùn trong các đầm, ao NTTS chủ yếu là các CHC như
protein, lipit, axit béo với công thức chung CH
3
(CH

2
)
n
COOH, photpholipids,
sterol – vitamin D3, các hoocmon, carbohydrate, chất khoáng và vitamin, vỏ
tôm lột xác,… Lớp bùn này luôn ở trong tình trạng ngập nước, yếm khí, các
VSV yếm khí phát triển mạnh, phân hủy các hợp chất trên tạo thành các sản
phẩm là H
2
S, NH
3
, CH
4
,… rất có hại cho thủy sinh vật, ví dụ nồng độ 1,3
ppm của H
2
S có thể gây sốc, tê liệt và thậm chí gây chết tôm. Khí NH
3
cũng
được sinh ra từ quá trình phân hủy yếm khí thức ăn tồn dư gây độc trực tiếp
cho tôm, làm ảnh hưởng đến độ pH của nước và kìm hãm sự phát triển của
thực vật phù du (Kongkeo, 1990) [14].
Tóm lại, các chất ô nhiễm chủ yếu trong nước thải NTTS bao gồm:
Cacbon hữu cơ (gồm thức ăn, phân bón, chế phẩm sinh học…), nitơ được
phân hủy từ các protein, photpho phân hủy từ các protein. Nồng độ các chất ô
nhiễm trên được biểu thị bởi một số chỉ tiêu chung như chỉ tiêu nhu cầu oxy
hóa sinh – BOD (Biochemical Oxygen Demand), nitơ tổng (TN) và photpho
tổng (TP).
1.3.2. Các nghiên cứu VSV phân giải tinh bột trong nước thải NTTS
1.3.2.1. Nghiên cứu ngoài nước

Các chủng VK và nấm mốc là những VSV được nghiên cứu nhiều nhất
để xử lý nước thải trong nhiều thập kỷ qua. Theo nhiều nghiên cứu cho thấy
thành phần và cấu trúc các chủng VK trong ao nuôi tôm thâm canh và rừng
ngập mặn rất khác nhau nguyên nhân là do nguồn thức ăn đầu vào cung cấp
cho các ao nuôi, do đó các chủng VK này có khả năng xử lý nguồn chất thải
hữu cơ trong ao nuôi với hiệu xuất cao hơn các chủng phân lập từ các nơi
khác [21].
Một nghiên cứu về quản lý sức khỏe ao nuôi tôm sú nhờ chế phẩm sinh
học của M.K. ABU HENA và cs đã chỉ ra rằng sau khi sử dụng các chủng VK
có lợi xử lý nước thải nuôi tôm các thông số ô nhiễm hữu cơ giảm xuống
9
đáng kể, các thông số như oxy hòa tan, pH, nhiệt độ, độ mặn, tổng chất rắn lơ
lửng, NO
3
-
và PO
4
3-
đều nằm trong khoảng thích hợp cho tôm phát triển [18].
Nghiên cứu về sự ảnh hưởng của các yếu tố lý hóa lên VK trong ao nuôi cá
của Jun và cs (năm 2000) chỉ ra rằng sự sinh trưởng và sinh enzyme của VK
chịu ảnh hưởng nhiều bởi các yếu tố lý hóa trong ao nuôi và nghiên cứu cũng
chỉ ra rằng từ bề mặt lớp bùn đáy xuống 1,5 cm là nơi diễn ra quá trình phân
hủy CHC mạnh nhất [22].
1.3.2.2. Nghiên cứu trong nước
Trong nước đã có nhiều công trình khoa học nghiên cứu sử dụng VSV
phân giải tinh bột. Nghiên cứu tuyển chọn các VK có tiềm năng phân hủy tinh
bột và protein để ứng dụng trong xử lý nước thải chế biến lương thực và thủy
sản, Nguyễn Hoàng Mỹ và cs (năm 2011) đã tuyển chọn được 12 chủng VK
khác nhau bao gồm 6 chủng có khả năng phân giải tinh bột mạnh nhất và 6

chủng có khả năng phân giải protein tốt nhất. Kết quả đề tài cho thấy hiệu quả
xử lý chất hữu cơ khi phối trộn các chủng với nhau tăng lên so với khi chỉ sử
dụng một chủng riêng rẻ, hiệu suất đạt gần 90% đối với nước thải nông sản và
80% đối với nước thải chế biến thủy sản [8]. Nghiên cứu khảo sát bước đầu
VSV phân giải tinh bột ở một số ao nuôi tôm thuộc đầm Sam – Chuồn, Phú
Vang, Thừa Thiên Huế đã phân lập với 206 chủng VK và 96 chủng xạ khuẩn
có khả năng phân giải tinh bột, bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch
kết quả thu được chủng vi khuẩn V94 và chủng xạ khuẩn X65 phân giải tinh
bột mạnh nhất và hai chủng này được chọn nghiên cứu sự ảnh hưởng các điều
kiện thời gian, pH, nhiệt độ lên khả năng sinh trưởng và sinh enzyme amylase
[13]. Để có cơ sở tạo chế phẩm vi sinh làm sạch ao nuôi tôm, từ bùn ao nuôi
tôm ở đầm Sam – Chuồn, huyện Phú Vang, tỉnh Thừa Thiên Huế, Phạm Thị
Ngọc Lan, Huỳnh Ngọc Thành (năm 2012) đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu
nấm mốc có khả năng phân giải tinh bột phân lập từ ao nuôi tôm Ở đầm Sam
– Chuồn, Thừa Thiên Huế”, kết quả đã tuyển chọn được 2 chủng MA20 và
10
M102 có hoạt tính amylase mạnh, chủng MA20 thể hiện hoạt tính amylase
mạnh nhất trong môi trường với nguồn nitrogen là NaNO
3
, pH 6,5 và tích lũy
sinh khối lớn nhất với nguồn nitrogen là gelatin, chủng M102 thể hiện hoạt
tính amylase mạnh nhất trong môi trường với nguồn nitrogen là KNO
3
, pH
5,5 và tích lũy sinh khối lớn nhất với nguồn nitrogen là NaNO
3
[12].
1.3.3. Các ứng dụng VSV trong xử lý nước thải NTTS
Hiện nay, có rất nhiều phương pháp sinh học đã và đang được ứng dụng
rộng rãi trong xử lý ô nhiễm môi trường NTTS, đặc biệt là các chất thải hữu

cơ. Tiêu biểu là việc sử dụng hệ VSV để phân hủy các chất ô nhiễm hữu cơ từ
chất thải. Có thể nêu lên một số phương pháp sau:
 Probiotic trong xử lý môi trường
Trong NTTS, probiotic còn là chế phẩm xử lý môi trường. Thay cho mục
đích chủ yếu là tiêu diệt các bào tử VK, chế phẩm sinh học được sản xuất với
mục đích chủ yếu là kích thích sự gia tăng của các VSV có lợi trong ao nuôi.
Một thành phần khác cũng được tìm thấy trong chế phẩm probiotic đó là
tập hợp các enzyme có nguồn gốc VSV như: amylase, proteose, lipase,
cellulose, chitinase, một số vitamin thiết yếu hoặc axit amin và chất
khoáng,… nhằm kích thích hoạt tính ban đầu của VSV của chế phẩm và xúc
tác cho sự hoạt động của enzyme trong môi trường.
 Men vi sinh trong NTTS
Khi đưa men vi sinh vào môi trường nước ao, các VK có lợi sẽ sinh sôi và
phát triển nhanh. Hoạt động của các VK có lợi sẽ có tác dụng cho các ao nuôi
tôm như phân hủy các CHC trong nước, phân hủy xác tảo chết và làm giảm
sự gia tăng của lớp bùn đáy ao, giảm các độc tố trong nước (NH
3
, H
2
S,
NO
2
…), nâng cao khả năng miễn dịch của tôm, ức chế hoạt động và phát
triển của VSV có hại,… [15]
 Chế phẩm EM trong NTTS
11
Việc ứng dụng chế phẩm sinh học vào quá trình quản lý môi trường ao
nuôi tôm là một tiến bộ trong ứng dụng VSV xử lý môi trường và loại chế
phẩm sinh học được sử dụng có hiệu quả nhất là EM. Qua một thời gian sử
dụng cho thấy chế phẩm EM có khả năng phân giải tốt các chất thải hữu cơ

trong quá trình nuôi, phân hủy các CHC hòa tan và không hòa tan, đồng thời
duy trì được chất lượng nước trong ao nuôi, ức chế khả năng phát triển của
các VSV gây hại như Vibrio, Aeromonas,…[11]
 Các công trình xử lý nước thải NTTS
Đối với NTTS ở quy mô công nghiệp, doanh nghiệp thường áp dụng các
công nghệ vào xử lý nước thải để đạt hiệu xuất cao hơn. Cụ thể các công
nghệ thường được áp dụng trong NTTS: Công trình có bể lọc sinh học; Công
trình có bể aerotank; Công trình có bể RBC; Công trình có bể UASB
Xử lý hiếu khí bể aerotank là tạo điều kiện hiếu khí cho quần thể VSV
có trong nước thải phát triển tạo thành bùn hoạt tính. VSV trong bể aerotank
dễ được bổ sung nhờ bùn hoạt tính ở ngăn lắng và được cung cấp chất dinh
dưỡng tạo điều kiện cho VSV phát triển. CHC nhiễm bẩn trong nước thải bị
oxy hóa bởi quần thể VSV ở trong bùn hoạt tính. Các VSV này sẽ phân hủy
các CHC thành sản phẩm cuối cùng là CO
2
và H
2
O làm giảm nồng độ trong
nước thải.




12
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu
- Các chủng VK sinh enzyme amylase có trong nước thải hồ NTTS tại
Quảng Nam – Đà Nẵng.

- Nước thải hồ NTTS
2.2. Địa điểm, phạm vi và thời gian nghiên cứu
2.2.1. Địa điểm nghiên cứu
Quá trình thu thập mẫu nước để phân lập và xác định các chủng VK
được thực hiện tại các hồ NTTS ở khu vực Quảng Nam – Đà Nẵng.
Quá trình phân lập, xác định hoạt tính, nghiên cứu đặc điểm sinh học,
sử dụng VK để xử lý nước thải NTTS và phân tích các chỉ số được tiến hành
ở các phòng thí nghiệm khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm Đà
Nẵng: Phòng thí nghiệm Sinh lý – Hóa sinh – Vi sinh, Công nghệ sinh học và
phân tích môi trường.
2.2.2. Phạm vi nghiên cứu
Các thí nghiệm trong nghiên cứu được tiến hành ở quy mô phòng thí
nghiệm được thực hiện từ 8/2014 – 4/2015.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp lấy mẫu
Mẫu nước thải và bùn được lấy từ các ao nuôi tôm tại Quảng Nam – Đà
Nẵng. Tiến hành lấy 6 mẫu bùn trong 2 đợt lấy mẫu tại 2 địa điểm nuôi tôm
thuộc Hội An – Quảng Nam và Nam Ô – TP Đà Nẵng.
2.3.2. Phương pháp phân lập và xác định VK có khả năng phân hủy tinh
bột mạnh
2.3.2.1. Phương pháp phân lập
Phân lập các mẫu dựa trên phương pháp phân lập của Egorow [1], [16].
13
Môi trường nuôi cấy LB Broth:
Cao nấm men: 5 g
Trypton: 10 g
NaCl: 10 g
Agar : 8 - 10 g
Pha trong 1 lít nước cất, hấp khử trùng ở 121C trong 20 phút.
Dùng pipet vô trùng hút dịch pha loãng ở nồng độ từ 10

-2
- 10
-6
khoảng
0.1ml nhỏ vào hộp lồng chứa môi trường phân lập đã vô trùng, dùng que gạt
dàn đều mặt thạch. Sau đó, bao gói cẩn thận và nuôi cấy trong tủ ấm ở nhiệt
độ 37
o
C. Sau 1 – 2 ngày nuôi cấy, chọn những khuẩn lạc riêng lẽ, mọc mạnh,
cấy ria sang ống thạch nghiên chứa môi trường phân lập LB.
2.3.2.2. Phương pháp giữ giống VSV
Theo phương pháp Egorow [3] [16], để bảo quản chủng giống VSV cho
những nghiên cứu tiếp theo chúng tôi tiến hành cấy lại định kì trên môi trường
thạch nghiên có cùng môi trường để ở tủ ấm ở 37
o
C trong 2 – 3 ngày. Sau đó
bảo quản trong tủ lạnh ở 4
o
C, cấy truyền định kì để giữ giống
2.3.2.3. Phương pháp xác định khả năng phân hủy tinh bột của vi khuẩn
Môi trường Czapeck thử hoạt tính amylase có công thức:
NaNO
3
0,8 g
K
2
HPO
4
0,4 g
MgSO

4
0,2 g
KCl 0,2 g
FeSO
4
0,004 g
Agar 8 g
Tinh bột 2 g
Bước 1: Kiểm tra và khẳng định khả năng phân hủy tinh bột. Sau khi có
các khuẩn lạc thuần khiết, tiến hành cấy chấm điểm các khuẩn lạc vào môi
trường thử hoạt tính, ủ 37C. Sau 24 giờ, nhỏ dung dịch thuốc thử lugol vào
14
các khuẩn lạc. Các chủng có khả năng phân hủy tinh bột sẽ xuất hiện vòng tan
trong suốt xung quanh khuẩn lạc, phần môi trường còn lại trên đĩa có màu
xanh dương. Chủng nào không có khả năng phân hủy tinh bột thì xung quanh
bắt màu xanh dương và không có vòng tan trong suốt.
Bước 2: Từ những chủng xác định có khả năng phân hủy tinh bột, tiến
hành cấy ria khuẩn lạc vào môi trường thử hoạt tính, ủ 37C. Sau 24 giờ, nhỏ
dung dịch lugol vào các đĩa thạch. So sánh vòng phân giải, chọn các chủng có
khả năng sinh enzyme amylase mạnh để nghiên cứu điều kiện sinh trưởng và
sinh enzyme đồng thời thử nghiệm xử lý nước thải NTTS trong bể hiếu khí
quy mô phòng thí nghiệm.
2.3.3. Phương pháp nhộm Gram
Dùng que cấy lấy nước vô trùng để làm 3 vết bôi trên 3 phiến kính.
Dùng que cấy lấy một chút khuẩn lạc của chúng làm vết bôi. Để khô vết bôi
trong không khí hoặc cố định nhẹ trên lửa đèn cồn. Đặt 3 miếng giấy lọc trên
3 vết bôi. Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm tím kết tinh qua giấy lọc trong
1 phút. Nhuộm lugol trong 1 phút, rửa nước, tẩy bằng cồn trong 30 giây, để
nghiêng tiêu bản, nhỏ từ từ từng giọt cồn cho đến khi tan hết màu. Rửa nước,
nhuộm bổ sung fuchsin hay safranin trong 1 phút, rửa nước và làm khô và soi

tiêu bản với vật kính dầu. Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu
đỏ.
2.3.4. Phương pháp xác định các điều kiện ảnh hưởng đến sinh trưởng của
VK
2.3.4.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Lấy 3 chủng VK đã tuyển chọn sinh enzyme mạnh nhất từ ống giống lần
lượt cho vào mỗi bình tam giác chứa 40 ml môi trường LB Broth, nuôi cấy lắc
ở 30C trong 24 h. Dùng pipet hút 100 l từ dung dịch mẹ cho vào bình tam
giác có chứa 40 ml môi trường LB Broth (pH 7), nuôi cấy lắc trong các thời
gian 24, 36, 48, 60, 72 giờ, tại 30C. Đánh giá sinh trưởng của VK sau thời
15
gian 24, 36, 48, 60, 72 giờ bằng phương pháp so màu bằng máy đo quang phổ
ở bước sóng 610 nm.
2.3.4.2. Ảnh hưởng của pH
Cấy 3 chủng VK từ ống giống lần lược vào 3 bình tam giác chứa 40 ml
môi trường LB, nuôi cấy lắc ở 30C trong 24 h để được dung dịch mẹ ban
đầu. Sau đó, dùng pipet hút lần lượt 100 l cho vào các bình tam giác có chứa
40 ml môi trường LB, ở các pH khác nhau 5-9 và nuôi cấy ở 30C trong tủ
ấm. Đánh giá khả năng sinh trưởng của VK bằng phương pháp so màu trên
máy đo quang phổ ở bước sóng 610 nm.
2.3.4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Cấy 3 chủng VK vào 3 bình tam giác chứa 40 ml môi trường LB, nuôi cấy
lắc ở 30C trong 24 h. Sau đó, dùng pipet hút 100 l cho vào bình tam giác
có chứa 40 ml môi trường LB ở pH thích hợp đã khảo sát ở trên và nuôi cấy
ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau: 30C, 32C, 35C, 37C, 40C. Đánh giá
khả năng sinh trưởng của VK bằng phương pháp so màu trên máy đo quang
phổ ở bước sóng 610 nm.
2.3.5. Phương pháp xác định ảnh hưởng của các điều kiện đến khả năng
sinh enzyme amylase của VK
2.3.5.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy

Tiến hành tương tự như thí nghiệm khảo sát thời gian sinh trưởng mạnh
nhất của các chủng VK. Sau các khoảng thời gian 24, 36, 48, 60, 72 giờ, ly
tâm dịch huyền phù và thu dịch enzyme amylase thô. Dùng ống nghiệm có
đường kính 1,5 cm đã được khử trùng để đục lỗ trên bề mặt thạch đĩa. Cho 70
l dịch enzyme thô vào các giếng trên đĩa petri, đặt đĩa vào trong tủ ấm ở
nhiệt độ 35C. Sau 48 giờ, nhuộm bằng thuốc thử và đo vòng phân giải.
2.3.5.2. Ảnh hưởng của pH
Tiến hành tương tự như thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH lên sinh
trưởng của VK. Sau các khoảng pH khảo sát, thu enzyme và cho khoảng 70