Nghiên cứu cấu trúc di truyền một số dòng Citrus Tristeza Virus gây bệnh trên cây ăn quả chi Citrus ở Việt Nam

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lâm Đại Nhân đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ
tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS.TS. Lê Trần Bình, PGS.TS. Chu
Hoàng Hà đã tạo điều kiện giúp đỡ và đóng góp những ý kiến quý báu để tôi hoàn thành bản luận
văn.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy, cô trong Ban Giám Hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2,
Ban Chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN trường ĐHSP Hà Nội 2, Phòng Tổ chức cán bộ, Phòng
Sau đại học trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện trong thời gian tôi học tập chương trình
thạc sĩ.
Trong thời gian thực tập tôi cũng nhận được sự giúp đỡ tận tình của Th.s. Đặng Thị
Hương, Tập thể cán bộ Phòng Công nghê tế bào thưc vât? Viên Công nghê sinh hoc. Nhân dịp
này tôi
xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó.
Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè những người đã luôn động viên, góp ý cho tôi
trong thời gian qua.
Hà Nội, tháng 10 năm 2010
La Việt Hồng
LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
DANH MỤC TỪ VIÉT TẮT
MỤC
2
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số
liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công
bố.
3

Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng của cam, quýt, chanh và bưởi
Bảng 1.2. Hàm lượng vitamin trong quả cam, chanh, quýt, bưởi (mg/100g)
Bảng 2.1. Thành phần môi trường LB đặc, long
Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng tổng hợp cDNA
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen
Bảng 2.4. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR khuếch đại gen
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng PCR đọc trình tự nucleotide
Bảng 2.7. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR đọc trình tự nucleotide
Bảng 3.1. Trình tự các cặp mồi đặc hiệu cho CTV
Hlnh 1.1. Triệu chứng do virus Citrus Tristeza gây ra Hình
1.2. Rầy mềm, trung gian truyền bệnh Tristeza
Hình 1.3. (A) Tổ chức genome của CTV kiểu dại (CTV9R), (B) Ảnh hiển
vi điện tử âm bản nucleocapsid
Hình 3.1. Ket quả điện di RNA tách từ 4 mẫu lá trên gel agarose 1%
Hình 3.2. Ket quả điện di sản phấm RT-PCR trên gel agarose 0,8%; M:
marker lkb Hình 3.3. Ket quả điện di kiểm tra sản phẩm tinh sạch PCR; M:
Marker 1 kb Hình 3.4. Sơ đồ cấu tạo vector pBT
Hình 3.5. Khuẩn lạc màu xanh trắng sau khi nuôi qua đêm ở 37°c trên môi
trường LB đặc
Hình 3.6. Ket quả điện di sản phẩm colony-PCR với cặp mồi pUC18 trên
gel agarose 1% các mẫu CT, HG, HN và VL, M: Marker 1 kb
Hình 3.7. Ket quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt plasmide pBT tái tố hợp
bằng enzyme giới hạn đôi với mấu HG, HN, CT và VL; M: Marker 1 kb
DANH MỤC
4
Hình 3.8. Ket quả so sánh trình tự nucleotide đoạn A giữa các mẫu CT,
HG, HN và VL
Hình 3.9. Cây phát sinh chủng loại xây dựng trên cơ sở so sánh trình tự
đoạn gen A của CT, HG, HN và VL với các trình tự tương ứng công bố trên

GenBank
Hình 3.10. Ket quả so sánh trình tự nucleotide đoạn F giữa các mẫu CT,
HG, HN và VL
Hình 3.11. Cây phát sinh chủng loại xây dựng trên cơ sở
so sánh trình tự đoạn gen F của CT, HG, HN và VL với các
trình tự tương ứng công bố trên GenBank
DANH MỤC
5
Hình 3.12. Kết quả so sánh trình tự nucleotide đoạn p giữa các mẫu CT, HG,
HN và VL
Hình 3.13. Cây phát sỉnh chủng loạỉ xây dựng trên cơ sở so
sánh trình tự đoạn gen p của CT, HG, HN và VL với các
trình tự tương ứng công bố trên GenBank
|jg microgram
|Li
1 microlitre
jam micrometer
bp base pair
BYV Beet yellows virus
cDNA Complementary DNA
cs Cộng sự
CP/NCP Protein VỎ (Coat protein/Nucleocapsid Protein)
CCM Cây có múi
CTV Citrus tristezci virus
CT Cần Thơ (mẫu thu tại tỉnh cần Thơ)
DDBJ Ngân hàng dữ liệu gen Nhật Bản thuộc Trung tâm thông tin sinh
học
có địa chỉ truy cập: www.ddbi.nig.ac.ip
DEPC Diethyl pyro Carbonate
DNA Deoxyribonucleic acid

EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetic Acid
ELISA Kỹ thuật hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme (Enzyme-linked
immunosorbent assay)
EMBL Phòng Sinh học phân tử Châu Au thuộc Viện Thông tin Sinh học
Châu Âu có địa chỉ truy cập: www.ebi.ac.uk
HSP70 Heat shock protein 70- protein sốc nhiệt
HG Hà Giang (mẫu thu tại tỉnh Hà Giang)
HN Hà Nội (Mau thu tại Hà Nội)
IPTG Isopropylthio-ị3-D-galactoside
Kb Kilobase
LB Luria và Bertani
M Marker (thang đo kích thước DNA)
NCBI Trung tâm Thôngtin côngnghệ sinh học quốc giacủa Hoa Kỳ có địa
chỉ truy cập: www.NCBI.nlm.nih.gov
ng Nanogram
nm Nanometer
ORF Open reading frames - khung đọc mở
PNAS Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States
of America (Kỷ yếu Viện Khoa học Quốc gia Hoa Kỳ)
PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)
PCS Polycloning site - vùng nhân dòng đa điểm cắt
PMF Polymethoxylated flavones
RNA Ribonucleic acid
RNase Ribonuclease
RT- PCR Reverse transcription polymerase chain reaction (phảnứng PCR phiên
mă ngược)
TAE Tris - Acetate - EDTA
Taq Thermus aquatỉcus
v/p vòng/phút

VL Vĩnh Long (mẫu thu tại tỉnh Vĩnh Long)
X-gal 5-brom-4-chloro-3-indolyl-ị3-D-galactosidase
MỞ ĐÀU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Cây có múi (CCM) là tên gọi chung của nhóm cây cam, quýt, bưởi, chanh
cùng họ Rutaceae

[45]. CCM giữ một vị trí quan trọng trong các loại
cây ăn quả vì đây là loại cây có giá trị dinh dưỡng cao, có hương vị thơm
ngon, được nhiều người ưa dùng. Sản phẩm của CCM được sử dụng với nhiều
mục đích khác nhau như để ăn tươi, vắt lấy nước uống, lấy mùi vị, chế biến
thức ăn, làm mứt, chế biến nước giải khát, làm hương liệu
Trên thế giới, sản xuất CCM là một ngành lớn với diện tích 3,5 triệu ha
và sản lượng 80 triệu tấn/năm, mức tiêu thụ bình quân trên đầu người là 15 kg
quả/năm. Ở Việt Nam, CCM được trồng nhiều ở Đồng bằng sông Cửu Long
với diện tích cam quýt là 94.200 ha, bưởi 45.200 ha, diện tích mỗi năm tăng
bình quân gần 7%, CCM được trồng nhiều ở các tỉnh: cần Thơ, Ben Tre, Đồng
Tháp, Vĩnh Long, Tiền Giang [48].
Tuy nhiên một trong những trở ngại đối với mở rộng diện tích, nâng cao
chất lượng CCM là bệnh vàng lá Greening, bệnh Tristeza làm cho sản lượng
cũng như chất lượng quả giảm, trong đó bệnh Tristeza còn gọi bệnh tàn lụi có
tác nhân là vỉrus Citrus Tristeza

gây thiệt hại kinh tế rất lớn trên cây ăn quả có
múi [10], [40], [25].
Hiện nay, ở nước ta bệnh Tristeza được coi là một trong hai bệnh gây
ảnh hưởng tới năng suất và phẩm chất cây ăn quả có múi cùng với bệnh
Greening. Tuy vậy, vẫn chưa có nhiều nghiên cứu trong việc xác định sự đa
dạng về hệ gen của virus này.
Với những lý do trên chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu cấu trúc

di truyền một số dòng Citrus trỉsteza virus gây bệnh trên cây ăn quả chi
Citrus ở Việt Nam”
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Xác định sự đa dạng di truyền của các dòng virus gây bệnh Tristeza ở Việt
Nam trong mối liên hệ với các dòng virus gây bệnh trong khu vực, thế giới để
có biện pháp quản lý bệnh trên cây ăn quả có múi.
- Góp thêm tư liệu khoa học cho việc xác định trình tự nucleotide toàn bộ hệ
genome của virus Citrus Tristeia

ở Việt Nam, từ đó đánh giá tính đa dạng di
truyền của các chủng virus được chính xác. Bên cạnh đó còn có ý nghĩa quan
trọng trong việc nghiên cứu tạo cây chuyển gen kháng virus.
3. Nhiệm vụ nghiên cửu
- Xác định trình tự 3 đoạn gen của 4 dòng virus gây bệnh trên CCM ở các tỉnh
Hà Giang, Hà Nội, cần Thơ và Vĩnh Long.
- Cây phân loại về sự đa dạng di truyền các đoạn gen của các dòng virus trên.
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng: 4 mẫu lá nhiễm các dòng virus Citrus Tristeza thu tại các tỉnh Hà
Giang, Hà Nội, cần Thơ và Vĩnh Long.
Phạm vi: xác định trình tự nucleotide 3 đoạn gen của mỗi
dòng virus, xây dựng cây phân loại về sự đa dạng di truyền
của 4 dòng virus nghiên cứu.
CHƯƠNG 1. TỐNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Nguồn gốc, phân bố và giá trị của cây có múi
CCM thuộc họ Rutaceae

và có khoảng 150 chi và 1500 loài được trồng ở
vùng nhiệt đới và bán nhiệt đới [43], [45]. CCM phát sinh từ vùng Đông Nam
Châu Á, trong đó sự phát triển của một số loài cam quýt được kéo dài từ biên
giới Đông Bắc của Ấn Độ qua Myanma và một số vùng phía nam của Đảo Hải

Nam. Những loài này bao gồm: chanh tây, chanh ta, thanh yên, bưởi, cam ngọt,
cam chua [6].
Hiện nay CCM được trồng khắp nơi trên thế giới trong vùng khí hậu
nhiệt đới và Á nhiệt đới. Những vùng trồng phân bố từ vĩ độ 35° Nam đến Bắc,
những vùng thương mại chính là Á nhiệt đới tại vĩ độ cao hơn 20° Nam hay
Bắc của xích đạo. Ở Việt Nam, CCM được trồng từ Bắc tới Nam. Riêng Đồng
bằng sông Cửu Long, CCM hiện diện tập trung ở các tỉnh Tiền Giang, Vĩnh
Long, Đồng Tháp và cần Thơ với các chủng loại đặc sản như bưởi năm roi,
bưởi da xanh, quýt tiều, quýt đường, cam mật, cam dây, cam sành [6].
Cây ăn quả có múi là một loại cây ăn quả lâu năm, nhanh cho thu hoạch,
một số loài có thế cho thu hoạch quả vào năm thứ 2 sau khi trồng. Ớ nước ta, 1
ha cam quýt ở thời kỳ 8 tuổi năng suất trung bình có thể đạt 16 tấn. So về giá
trị kinh tế 1 ha trồng cam cho thu nhập gấp 4 - 10 lần 1 ha trồng lúa [1].
Trên thế giới sản xuất CCM là một ngành lớn với diện tích 3,5 triệu ha
và sản lượng 80 triệu tấn/năm, mức tiêu thụ bình quân trên đầu người là 15 kg
quả/năm. Ớ Việt Nam, CCM được trồng nhiều ở Đồng bằng sông Cửu Long với
diện tích cam quýt là 94.200 ha, bưởi 45.200 ha, diện tích mỗi năm tăng bình
quân gần 7% [48].
Theo tác giả Trần Thượng Tuấn và cộng sự (1994) [6], quả cam quýt
được sử dụng rộng rãi vì chứa nhiều dinh dưỡng cần thiết cho cơ thể, nhất là
vitamin

c (Bảng 1.1; 1.2).

Vị chua nhẹ và hơi đắng giúp dễ tiêu hoá, tuần
hoàn của máu, vỏ giàu pectin được sử dụng làm mứt, kẹo, thuốc nam hay
trích lấy tinh dầu, trái được chế biến thành nhiều sản phấm như: nước giải
khát, sirô, rượu bổ
Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng của cam, quýt, chanh và bưởi
Loạ

i
quả
Nư
ớc
(%)
Tro
(%
)
Protei
n
(%)
Hydr
at
cacbo
n
(%)
Ch
ất
XO’
(%
)
Năng
lượng
(%)
Muối
khoáng
(mg/lOOg)
C
a
p F

e
Ca
m
87,5 0,5 0,5 8,4 1,4 43 3
4
2
3
0,
4
Cha
nh
87,5 0,5 0,3 3,6 1,3 18 4
0
2
2
0,
6
Quý
t
88,5 0,6 0,4 8,6 0,8 35 3
5
1
7
0,
4
Bưỏ
i
83,5 0,4 0,5 15,3 0,7 30 3
0
1

9
0,
7
Bảng 1.2. Hàm lượng vitamin trong quả cam, chanh, quýt, bưởi (mg/lOOg)
Loại
quả
Vitamin
A
Vitamin
BI
Vitamỉn
B2
Vitamin pp Vitamin c
Cam 0,30 0,08 0,03 0,20 48
Chanh 0,30 0,04 0,01 0,01 50
Quýt 0,60 0,08 0,03 0,02 55
Bưởi 0,02 0,05 0,01 0,10 42
Tinh dầu được cất từ vỏ quả, lá và hoa được dùng trong công nghiệp
thực phẩm và công nghiệp mỹ phấm. Trên thị trường quốc tế tinh dầu có giá
trị rất cao (1 kg tinh dầu có giá trị trên dưới 300 USD) [1].
Ngoài ra, những loại quả thuộc nhóm Citrus còn được dùng làm thuốc
chữa bệnh. Các thầy thuốc Ấn Độ, Trung Quốc đã dùng vỏ quả cam để phòng
bệnh dịch hạch, chữa bệnh phổi và bệnh chảy máu dưới da. ở Mỹ vào những
năm 30 của thế kỷ 20 các thầy thuốc đã dùng vỏ cam quýt kết hợp với insulin
để trị bệnh tiếu đường. Ờ Nga bắt đầu thế kỷ 11, các loại quả CCM được sử
dụng để phòng ngừa và chữa trị bệnh y học trong nhân gian. Ở nước ta, nhân
dân đã dùng cây lá và hoa quả các loại cây ăn quả có múi đế phòng và chữa
bệnh từ xa xưa, như vỏ quýt có tên dược liệu là “trần bì”, được sử dụng nhiều
trong một số bài thuốc y học cố truyền [1]. Nghiên cứu mới đây của các nhà
khoa học Hoa Kỳ cho thấy hợp chất được chiết xuất từ vỏ cam quít có tên khoa

học là polymethoxylated

flavones

(PMF) - là những yếu tố chống oxy hóa tích
cực thuộc nhóm flavonoid, có khả năng hạn chế gan xuất tiết loại cholesterol
độc hại LDL - gây ra các bệnh tim mạch [50]. Một thử nghiệm của các nhà
khoa học Israel (Học viện Công nghệ Technion) trên chuột cũng cho thấy tác
dụng rất tốt của dịch chiết từ vỏ quả cam, chanh, quýt có tác dụng chữa hen
suyễn do dịch chiết này có chứa limonene [50].
1.2. Những bênh thường găp ở cây có múi
1.2.1. Bệnh vàng lá thối rễ
Bệnh vàng lá thối rễ là một trong những bệnh quan trọng trên CCM, nhất
là trên cam sành và quýt tiều. Bệnh thường gây hại nặng trong mùa mưa lũ,
gân lá có màu vàng trắng, phiến lá ngả màu vàng xanh và sau đó rụng đi nhất
là sau các cơn gió lớn. Lúc đầu chỉ có một vài cành bị bệnh và biểu hiện sự
rụng lá, sau đó toàn lá cây bị rụng. Khi đào rễ lên ở phía lá vàng và rụng thấy
rễ bị thối, vỏ rễ tuột khỏi phần gỗ, gỗ bị sọc nâu lan dần lên phần rễ chính.
Bệnh cũng xuất hiện trên cây bưởi, tuy nhiên mức độ bệnh ở bưởi ít hơn so với
cam sành và quýt tiều. Bệnh chủ yếu do nấm Fusarium

solani

tấn công làm hư
bộ rễ, tuy nhiên bên cạnh đó còn nhiều tác nhân khác như Phytophthora,
Pythỉum, Slerotỉum, Thỉelavỉopsỉs

Trong một số trường hợp do tuyến trùng
gây hại và tạo vết thương cho nấm bệnh tấn công. Các loài

tuyến trùng như:
Pratylenchus, Radopholus, Tylenchulus.
1.2.2. Bệnh héo và chết cây do nấm Clitocybe tabessens
Bệnh héo và chết cây do nấm Cỉitocybe tabessens

thường xảy ra trong
vườn trồng bưởi năm roi và quýt tiều. Triệu chứng biếu hiện qua hiện tượng lá
đọt héo như thiếu nước, khi bệnh nặng thường héo toàn cây, lá khô. Bệnh nặng
trong mùa nắng, bưởi năm roi là bị hại nặng nhất.
1.2.3. Bệnh vàng lá Greening
Là một bệnh gây thiệt hại nặng đến nền sản xuất CCM thế giới nhất là
Châu Phi và Châu Á. Ờ Trung Quốc người ta gọi là “Huanglongbing”, Nam
Phi gọi là Greening. Tuy chưa có một báo cáo chính thức thiệt hại của bệnh,
nhưng ở Philippines người ta đánh giá mức độ nhiễm lên đến 7 triệu CCM [8].
Thái lan có khoảng 95% cây bị nhiễm bệnh ở các tỉnh phía Bắc và Đông [12],
nhiều nước khác cũng cho thấy thiệt hại của Greening. Ớ Việt Nam, bệnh này
cũng gây thiệt hại nặng từ Bắc chí Nam. Có hai dòng chủ yếu gây bệnh này:
dòng Châu Phi phát triển mạnh trong điều kiện nhiệt độ 20 - 25°c, dòng Châu
Á phát triển cả trong điều kiện lạnh và nóng (lên đến 35°C) [38]. Vi khuẩn
Liberibacters gây bệnh Greening có thể nhiễm trên tất cả CCM, cam mật, quýt
và các dòng lai của quýt là nhiễm nặng nhất. Bưởi chùm, chanh Rangpus,
chanh núm và bưởi nhiễm ít hơn. Chanh giấy, cam ba lá và các dòng lai có xu
hướng chống chịu tốt hơn. Tuy nhiên, không có giống nào kháng lại bệnh này
cả.
Triệu chứng trên lá: sơ khởi với phiến lá biến màu vàng, nhưng kích
thước lá bình thường, đôi khi hình thành những đốm vàng. Những lá mới sau
đó nhỏ hơn kích thước bình thường và mọc thẳng đứng, lá bị vàng như triệu
chứng thiếu kẽm và sắt. Ket quả phân tích lá cho thấy hàm lượmg kali cao,
nhưng hàm lượng canxi, magie và kẽm thấp [17], [24].
Triệu chứng trên quả: quả trên cây nhiễm bệnh trở nên nhỏ lại, biến

dạng và có vị đắng hơn, có thế do hàm lượng axit cao và hàm lượng đường
giảm thấp. Quả thường rụng sớm, những quả còn lại thường vẫn giữ được màu
xanh [28], có thế vì lý do này nên người ta gọi theo triệu chứng bệnh là
Greening. Quả phát triển lệch tâm, hạt trên quả bị hỏng và phát triển không
bình thường.
Theo báo cáo của Garnier và cộng sự (1984) [18], bệnh Greening do vi
khuẩn Gram âm hiện diện trong mô libe gây ra, vi khuẩn này chưa nuôi cấy
được trong phòng thí nghiệm. Đặc tính của dòng vi khuẩn được xác định thông
qua việc định chuỗi gen 16S ribosome DNA và protein trong ribosome. Ket
quả cho thấy vi khuẩn này thuộc chi Alphaproteobacteria (vi khuẩn Gram âm)
và có tên khoa học “Candidatus

Liberibacter”. Loài gây hại ở Châu Phi là
Candidatus

Liberibacter africanus. Loài gây hại ở Châu Á (gồm cả Việt Nam)
là

Candidatus

Liberibacter asiaticus.
Theo các tác giả van Lelyveld LJ và van Vuuren SP (1988) [39], khi cây
bị bệnh greening thì hoạt độ của enzyme peroxidase bị giảm, hoạt động của
enzyme này tương quan nghịch với độ nhạy cảm với bệnh greening của loài,
do đó có thể sử dụng chỉ tiêu hoạt độ enzyme peroxidase trong lá như một “chỉ
thị” đánh giá khả năng chống chịu bệnh và độ nhạy cảm với greening.
1.2.4. Bệnh Tristeza
1.2.4.1. Triệu chứng và phân bổ của bệnh
Tristeza là một bệnh nguy hại trên CCM với tác nhân gây bệnh là virus
thuộc họ cỉosterovirus.

Triệu chứng bệnh xuất hiện trên CCM tuỳ theo giống,
dòng

virus

nhiễm (Hình 1.1), được phân loại như sau [44]:
• Mức nhẹ: không gây ảnh hưởng nhiều đến năng suất cây, chỉ gây gân
trong hoặc lõm thân nhẹ trên chanh giấy (

Citrus aurantifolia).
• Vàng lùn cây con: gây vàng và lùn trên cây cam chua (sour orange,
Citrus

aurantỉum),

chanh giấy (

Citrus

ỉỉmơn),

và bưởi chùm (

Citrus
paradỉsi).
• Chết nhanh trên cam chua: ghép cam mật (Citrus sinensis

) trên gốc ghép
cam chua sẽ cho cây bị lùn, vàng, lõm thân và chết nhanh.

• Lõm thân trên bưởi: cây bị lùn, cả thân và nhánh cây bị lõm nặng khi
bóc vỏ khỏi thân. Giảm năng suất và kích thước quả, cành trở nên giòn
và dễ gãy.
• Gây lõm thân trên chanh tàu: cây vẫn sinh trưởng bình thường, thân
chính và cành bị quặc quẹo, khi bóc vỏ thân, phần gỗ bị lõm vào rất
nhiều.
•

Gây vàng nửa dưới quả gặp ở quýt đường: cây vẫn sinh trưởng và xanh
tốt, tuy nhiên khi quả đạt kích thước bằng quả bóng bàn thì quả bị vàng
phần nửa dưới lên cuống quả, quả rụng hàng loạt, gây thất thoát nặng
cho nhà vườn.
Dịch bệnh gây thiệt hại cây với cây cam chua lần đầu tiên được báo cáo
ở Nam Phi trong những năm đầu của thế kỷ 20, và ở Argentina và Brazil trong
thập niên 30 thế kỷ trước sau khi các nước này nhập khẩu các CCM nhiễm
bệnh và rệp truyền bệnh Tơxoptera citricida.

Hơn 80 triệu cây ghép trên gốc
cam chua (Citrus

aurantium)

đã bị chết hoặc không sinh sản được bởi CTV.
Các thiệt hại gây ra tại Argentina (hơn 10 triệu cây), Brazil (hơn 6 triệu cây) và
Hoa Kỳ (hơn 3 triệu cây) [14]. Chỉ riêng ở Tây Ban Nha có hơn 40 triệu cây,
chủ yếu là cam ngọt (Citrus sinensis)

và quýt (

Citrus reticulata)

được ghép với
cam chua cũng giảm khả năng sinh sản [15]. Ngoài ra, CTV có thể gây ra thân
rỗ ở một số giống CCM bất kể gốc ghép được sử dụng, đó là

nguyên nhân quan
trọng dẫn đến sự suy giảm của năng suất và chất lượng quả. Đã có rất nhiều
nghiên cứu về bệnh citrus tristeza virus ở vườn cây ăn quả có múi ở Châu Ầu
[15], [21], [22]. Khi cây bị bệnh tàn lụi cho ra rất nhiều hoa và quả nhưng chỉ
vài năm cây tàn lụi và chết nhanh chóng [7].
Hiện nay, ở nước ta bệnh Tristeza thấy xuất hiện trên các vườn quýt với
triệu chứng quả bị vàng nửa dưới, còn trên chanh giấy với triệu chứng gân
trong và dòng virus gây lõm thân trên chanh tàu [3], [44].
(A)Bệnh úa vàng trên cây cam ngọt ghép với gốc cam chua bị nhiễm bệnh do
CTV, so với cây bình thường ở giữa.
(B)Tristeza gây ra sự suy giảm nhanh chóng của cây cam ngọt trên gốc ghép cam
chua (cây ở giữa) bao quanh là các cây với các trạng thái bệnh khác nhau suy
giảm chậm.
(C và D) thân của cây cam ngọt nhiễm CTV khi ghép với gốc cam chua, và có
dạng tổ ong ở mặt trong của vỏ cây của các gốc cam chua dưới đoạn chồi của
cây bị nhiễm Tristeza.
(E, F và G) Tristeza là cho quả nhỏ (so với một loại trái cây bình thường trên
bàn tay) các cành và thân của một cây bưởi bị rỗ.
1.2.4.2. Cơ chế lan truyền và trung gian truyền bệnh
Tác nhân truyền bệnh CTV từ cây bị nhiễm bệnh sang cây khoẻ mạnh
là rầy mềm Toxoptera cỉtricida,

Aphis

gossypii,

Aphis

spiraecoỉa, Toxoptera
aurantii

và Myzus

persicae

(Hình 1.2) [46]. Nhiều tác giả cho rằng rầy mềm
Myzus

persỉcae

chỉ truyền virus thuộc dòng nhẹ, nên ta có thể dựa vào đó để
lây truyền dòng nhẹ phục vụ cho phương pháp bảo vệ chéo (Cross-
protection). Ngoài ra virus còn được truyền qua việc chiết ghép.
Sự xâm nhiễm của virus trong thực vật được cho là liên quan đến hai
quá trình: di chuyển từ tế bào này sang tế bào xung quanh (khoảng cách ngắn)
và di chuyển giữa các bộ phận của cây (khoảng cách dài).

Svetlana

Y. F. và
cộng sự (2008) [35] đã kiểm tra hệ thống xâm nhiễm của CTV ở các loài
CCM khác nhau. Bằng cách sử dụng một dòng CCM “sạch bệnh” CTV và
virus gắn protein huỳnh quang màu xanh (green fluorescent protein-labeled
virus), kết quả cho thấy có sự di chuyển từ tế bào tới tế bào và di chuyển
khoảng cách dài, hai con đường này thường không bị giới hạn, và khả năng di

chuyến thay đối tuỳ theo cây chủ. Tập trung phân tích sự xâm nhiễm ở hai
loài cây có múi khác nhau, Citrus

macrophylla

(loài ít nhạy cảm với CTV) và
cam chua (loài nhạy cảm hơn với CTV), đã cho thấy rằng trong các cây chủ
nhạy cảm hơn có các điếm xâm nhiễm bao gồm một nhóm các tế bào, trong
khi ở những loài CCM ít nhạy cảm với CTV thường là duy nhất một tế bào.
Hình 1.2. Rầy mềm, trung gian truyền bệnh Tristeza
1.2.4.3. Virus Citrus Tristeza
1
Virus Citrus Tristeza

(CTV) có nguồn gốc ở Châu Á và đã lan truyền
đến tất cả các nước đang phát triến CCM. CTV thuộc chi Clơsterovirus

có
kích thước khoảng 2000 X 12 nm [23], [13], [33] (Hình 1.3 B). Genome là sợi
RNA đơn dương, không phân đoạn, vỏ protein bao gồm hai phân tử protein
CP và CPm có kích thước phân tử tương ứng khoảng 25 kDa (chiếm 95%) và
27 kDa (chiếm 5%) [41]. Protein CP cấu tạo nên phần thân của virus còn
protein CPm cấu tạo nên phần đuôi ngắn của virus. Hình thành hạt virion có
cấu trúc “rắn đuôi chuông” ở đầu 5’ của hạt virion, cấu trúc virion bất thườn
này lân đâu tiên được phát hiện ở BVY (Beet yellows virus) [19]. Những
phân tích hoá sinh và di truyền cho thấy hai protein này giữ những chức năng
khác nhau trong hạt virion virus.
1
Bộ gen của CTV có kích thước khoảng 19,3 kb (Hình 1.3 A) bao gồm
12 khung đọc mở (ORF - open reading frames) và hai vùng không mã hoá

(UTR) đầu 5’ và đầu 3’, mã hoá cho ít nhất 19 protein bao gồm 2 enzyme
protease tương tự papain, các protein liên quan tới sự tái bản (RNA
polymerase, helicase, methyltransferase), protein giống với heat shock
protein Hsp70 homolog (Hsp70h), 2 protein vỏ CP và CPm, protein p23 tương
tác với RNA, protein p20 được tích luỹ trong thể vùi. Một so protein chưa rõ
chứcnăng như p61, pl3, pl8 [32], [33], [34], [47]. Hsp70h đóng vai trò kép
liên quan đến việc hình thành đuôi của virion, và sự chuyển động của virus từ
tế bào này sang tế bào khác [10].
Trình tự bộ genome hoàn chỉnh của một vài dòng CTV đã
được công bố [23], [35], [30], [27], [40], [8], [42],
Các chủng CTV khác nhau trên thế giới có độ tương đồng
gen là không giống nhau, độ bảo thủ CTV giảm dần từ đầu
3’-5’ [10].
1b 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
PỊ8 p20
ÎTSHl HSP70hM n n
I RdRo I
I
061 ICPI

□

□

p6 p13 p23
B
Hình 1.3. (A) Tố chức genome của CTV kiểu dại (CTV9R): PRO: protein
giong papain, MT: methyl transferase, HEL: helicase, RdRp: RNA -
dependent RNA polymerase.
(B) Ảnh hiển vi điện tử âm bản nucleocapsid rộng và nhỏ của CTV (trái), và

nucleocapsid được xừ lí bằng kháng thể đặc hiệu CPm, được gắn vào đó là các
hạt vàng 10 nm (phải).
Đe xác định trình tự genome có vai trò trong việc biếu hiện bệnh,
Albiach và cộng sự (2010) [9] sử dụng phương pháp lai phân tử từ hai chủng
T36 gây vàng cây ghép (seedling yellows syndrome) và T30 không gây triệu
chứng này để xác định trình tự liên quan. Các tổ hợp lai T36/T30 được tạo ra
bằng cách thay thế một số vùng trình tự T30 vào các vùng khác nhau genome
1
A
ORF -la
PRO PRO
I l

I I - M F J
CTV9R
^
m
r
n
\
fp
4- t, *
v
đầu 3’ của chủng T36, sau đó tái bản trong tế bào trần thuốc lá. Các hạt virion
được hình thành được nhiễm vào Citrus

macrophylla,

làm tương tự với chủng
2

T36 để làm đối chứng. Các mẫu này sau đó được ghép lên cam chua. Kết quả
cho thấy, với tổ hợp lai T36/T30 được thay thế bởi trình tự T30 ở vùng không
được dịch mã p23-3’ (vị trí

nucleotide

từ 18.394-19.296) không có triệu
chứng vàng cây ghép hoặc chỉ có rất ít triệu chứng này.
Tác giả Ngô Ngọc Lan và cộng sự [3] đã tách dòng và xác định trình tự
gen mã hoá protein vỏ CP và CPm của hai dòng virus gây bệnh ở cây quýt
trồng tại Cần Thơ và cây cam sành trồng tại Vĩnh Long, đã thu được gen CP
có kích thước 672 nucleotide và gen CPm có kích thước 723 nucleotide. Hai
gen này có mức độ tương đồng cao so với 10 dòng CTV ở các nước khác
nhau, hai dòng CTV của Việt Nam được xếp chung vào một nhóm cùng với
dòng NuagA (Nhật Bản), BI65

(Hoa Kỳ), SY 568 (Hoa Kỳ), VT (Israel), T318
A (Tây Ban Nha) trên cây phát sinh chủng loại.
CTV được chia thành 5 chủng chính [46]:
• Virus seedling yellows
• Virus grapefruit pitting
• Virus grapefruit stunt bush
• Virus lime die-back
• Virus Ellendale mandarin decline
1.2.4.4. Chuẩn đoán và phòng chổng bệnh
Bệnh Tristeza gây ra từ nhiều dòng virus khác nhau, việc hiểu rõ dòng
virus gây hại giúp cho việc quản lý bệnh dễ dàng hơn, các dòng CTV khác
nhau thì gây bệnh khác nhau và chúng có thế chứa các genome “biến thế” tùy
thuộc loài rệp truyền bệnh và loại gốc ghép. Các dòng này có thế được phân
biệt bằng các xét nghiệm các mẫu RNA mạch kép [29] hoặc bằng cách sử

dụng kháng thể huyết thanh đơn dòng đặc hiệu [16] hoặc các kháng thể đơn
dòng MCA13 [31]. Có thể sử dụng một số phương pháp sau để giám định:
- Phương pháp giám định bệnh đơn giản nhất là ghép mắt bệnh lên cây
chanh giấy, nếu triệu chứng gân trong xuất hiện trên lá non chứng tỏ
2
cây đã nhiễm bệnh.
- Phương pháp hữu hiệu nhất có thể sử dụng là dùng kháng thể để giám
định bệnh thông qua ELISA, Immuno Sorbent Eletron Microcopy
(ISEM), Dot Immuno Blot Assay (DIBA) hoặc que thử nhanh.
- Phương pháp RT-PCR cũng được sử dụng rộng rãi trong việc giám định
bệnh.
- Sự phát triển của Tissue print-ELISA [15], [20], để phát hiện CTV
trong các mặt cắt của nguyên liệu thực vật trên màng nitrocellulose,
cho phép kiếm tra với độ nhạy cảm cao của hàng ngàn mẫu một cách
đơn giản mà không cần phải chiết xuất.
Đẻ phòng chống bệnh Tristeza, nhiều phương pháp có thể được áp dụng
như loại trừ cây bệnh, thay đổi phương pháp canh tác như trồng xen canh với
ổi. Biện pháp phòng trừ sinh học như sử dụng dòng nhẹ để bảo vệ

chéo, sử
dụng gốc ghép kháng bệnh, sử dụng công nghệ sinh học thông qua chuyển
gen, cụ thể như:
Dùng dòng gây bệnh nhẹ đế chủng lên cây và cây sẽ chống chịu tốt khi
có dòng khác độc hơn tấn công (cơ chế bảo vệ chéo - Mild strain cross-
protection)
- Sử dụng giống kháng hoặc gốc ghép kháng: nhiều giống CCM tỏ ra
chống chịu bệnh này nghĩa là virus vẫn tồn tại trên cây nhưng không lộ
triệu chứng. Một số giống khác kháng lại bệnh cũng có nghĩa là virus
không nhân mật số trên cây bị nhiễm. Những cây này thuộc nhóm
Poncỉrus trifoliate, Swingled glutỉnosa và Severinia buxifolia [30].

- Tạo cây chuyển gen kháng đang được ứng dụng ở nhiều nước trên thế
giới, trong đó Hoa Kỳ là nước đi đầu và đã bắt đầu từ 1996. Người ta
sử dụng chính gen từ vỏ protein của virus hay gen cần thiết cho sự sao
chép của virus để chuyển vào cây với hy vọng đem lại tính kháng cho
cây. Tuy nhiên kết quả mới ở trong phạm vi phòng thí nghiệm và mức
độ nhà lưới.
2
Sử dụng thuốc Confldor cho bệnh vàng lá Greening và rầy chổng cánh
cũng có tác dụng tốt đối với rầy mềm, trung gian truyền bệnh Tristeza.
1.3. Một số kỹ thuật sinh học phân tử
1.3.1. Kỹ thuật RT-PCR
Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase, Polymerase chain reaction) là
sự kết hợp của hai phản ứng sao mã ngược (reverse transcription) và PCR đế
nhân lên một đoạn gen quan tâm từ RNA. Kỹ thuật này gồm hai giai đoạn:
• Tong hop sơi cDNA thứ nhất
Nguyên lí của phương pháp này là sử dụng enzyme sao mã ngược
(Reverse Transcriptase) đế tổng hợp nên sợi cDNA thứ nhất từ RNA. Tuỳ
theo mục đích của thí nghiệm mà các loại RNA được sử dụng khác nhau.
Neu muốn nhân một đoạn gen của sinh vật bậc cao mà không có intron
thì người ta thường tổng hợp cDNA từ mRNA với mồi oligo(dT)s. Neu là sinh
vật bậc thấp như vi khuẩn, virus Người ta có thể tổng hợp cDNA từ RNA
tổng số với mồi ngẫu nhiên hoặc mồi đặc hiệu cho đoạn gen cần nhân lên.
Khi mồi gắn bố sung với sợi RNA khuôn, enzyme sao mã ngược sẽ xúc tác
cho quá trình tổng hợp cDNA từ các nucleotide tự do có trong thành phần
phản ứng ở một nhiệt độ thích hợp. Phản ứng tổng hợp cDNA chỉ xảy ra trong
một chu kỳ, theo lý thuyết sau khi kết thúc phản ứng, thu được lượng cDNA
tương ứng với lượng RNA khuôn ban đầu. Đe tăng hiệu quả cho quá trình
tổng hợp, lượng mồi đưa vào lớn hơn rất nhiều lượng RNA khuôn và chất kìm
hãm (ức chế) enzyme RNAse cũng được đưa vào bảo vệ cho RNA khỏi bị cắt
bởi enzyme RNAse.

• Khuếch đại gen bằng kỹ thuật PCR
Sử dụng cDNA làm khuôn để khuếch đại gen quan tâm bằng phản ứng
PCR với cặp mồi đặc hiệu (Primer-F, Primer-R).
1.3.2. Kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction - chuỗi phản ứng trùng hợp)
được Kary Mullis (bằng sáng chế của Hoa Kỳ số 4.683.202) phát minh năm
1985 [4]. Đây là kỹ thuật tương đối đơn giản cho phép nhân nhanh in vitro
một số lượng không hạn chế nguyên bản một đoạn DNA nhất định trong một
2
khoảng thời gian ngắn, nhờ sự xúc tác của DNA polymerase. Tất cả các DNA
polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều
cần sự hiện diện của những cặp mồi đặc hiệu. Mồi (primer) là những đoạn
DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA
polymerase sẽ nối dài đế hình thành mạch mới. Quá trình này gồm ba bước:
Biến tính DNA từ dạng sợi kép thành dạng sợi đơn bằng cách nâng
nhiệt độ lên 94-95°C trong khoảng thời gian 30 giây đến 1 phút.
Gắn mồi với đoạn DNA cần nhân thông qua hạ nhiệt độ xuống 40- 60°c,
trong khoảng 30 giây đến 1 phút, phụ thuộc vào độ dài và tỉ lệ G+C của đoạn
mồi.
Phản ứng polymerase tống hợp phân tử DNA kéo dài từ đoạn mồi. Hai
phân tử DNA mới được tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung từ hai phân tử
khuôn ban đầu. Thời gian kéo dài từ 1 phút đến vài phút. Đe tránh hiện tượng
bắt cặp không đặc hiệu, phản ứng tống hợp nên được thực hiện ở nhiệt độ
72°c. Loại polymerase dùng trong PCR là loại chịu nhiệt (

Tag polymerase)
được tách chiết từ vi khuẩn

Thermus aquaticus

, một loại vi khuẩn được phân
lập từ suối nước nóng. Hiện nay enzyme này được sản xuất chủ yếu theo con
đường tái tổ hợp [5].
Như vậy, sau mỗi chu kỳ phản ứng lượng DNA cần nhân bản sẽ tăng
gấp đôi, với N sợi khuôn ban đầu sau n chu kỳ sẽ có Nx2n sợi DNA được
nhân lên. Ví dụ, sau khoảng 20 chu kỳ có tới trên 30 triệu bản được nhân lên
từ một sợi khuôn ban đầu.
1.3.3. Kỹ thuật biến nạp plasmỉd vào Escherichia coli
Biến nạp theo nghĩa rộng là đưa bất kì đoạn DNA vào bất kì tế bào nào.
Trong trường hợp các tế bào E.coỉi

thì có nghĩa là đưa DNA plasmid vào
trong tế bào.
Plasmid là những phân tử DNA vòng, sợi kép, tự tái bản, được duy trì
trong vi khuấn như các thực thế độc lập ngoài nhiễm sắc thế, một so plasmid
mang thông tin về việc di chuyến chính nó từ tế bào này sang tế bào khác (F
2
plasmid), một số khác mã hoá khả năng kháng lại kháng sinh (R-plasmid) và
một số khác mang bộ gen đặc biệt để sử dụng các chất chuyển hoá bất thường
(plasmid phân huỷ). Mỗi plasmid có một trình tự thực hiện chức năng làm
“điểm khởi đầu” sao chép DNA [4].
Lần đầu tiên biến nạp ở vi khuẩn được Frederick Griffith mô tả vào
năm 1928 trong thí nghiệm nối tiếng “Nguyên lí biến nạp”. Tuy nhiên, không
phải tất cả vi khuẩn đều có thể được biến nạp một cách dễ dàng. Đẻ cho biến
nạp E.coli

có hiệu quả, các tế bào cần trở nên khả biến (competent). Đế đạt
được điều này, người ta ngâm các tế bào trong dung dịch CaCỈ
2
lạnh. Việc

biến nạp các tế bào khả biến được thực hiện bằng cách trộn DNA plasmid với
các tế bào, ủ trong đá 20-30 phút, sau đó tạo một sốc nhiệt ngắn (khoảng 1
phút ở nhiệt độ 42°C), làm như vậy DNA sẽ được thu nạp vào tế bào. Phương
pháp này có tần số biến nạp tối đa khoảng 1 tế bào biến nạp trên 1.000 tế bào
(10’3), hiệu quả biến nạp khoảng 107-108 khuẩn lạc biến nạp từ mỗi
microgam DNA plasmid nguyên vẹn [4]. Sau khi biến nạp, vi khuẩn được
nuôi phục hồi trên môi trường LB ở 37°c trong vòng 60-90 phút. Sau đó, các
tế bào được đưa lên môi trường chọn lọc để nhân lên các tế bào có plasmid.
1.3.4. Kỹ thuật tách dòng
Tách dòng gen là một công cụ hữu hiệu được sử dụng trong kỹ thuật di
truyền và là bước khởi nguồn cho các kỹ thuật sau này. Mục đích của việc
tách dòng là nhằm thu được một lượng lớn bản sao của trình tự gen quan tâm.
Đầu tiên, DNA ngoại lai được nối vào một vector nhằm tạo ra một cấu trúc
vector tái tổ hợp. Vector sử dụng là một plasmid thích ứng của vi khuấn
E.coli.

Sau đó vector tái tố hợp được biến nạp vào tế bào chủ và tế bào chủ
được nuôi cấy trong môi trường thích hợp để nhân vi khuẩn lên nhiều lần.
Cuối cùng qua các bước tách chiết DNA, người ta sẽ thu được một lượng lớn
plasmid

tái tổ hợp. Các nhân tố như

vector,

tế bào chủ có thể thay đổi nhưng
tiến trình tách dòng nói chung được thực hiện qua bốn bước: xử lí DNA cần
tạo dòng, tạo vector tái tổ hợp, biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào chủ và
chọn dòng.
2