Thiết kế đầu dò ADN cho kỹ thuật lai dot blot



























- 2013






























- 2013
Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học



Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013
LỜI CẢM ƠN
Để có thể hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất
tới PGS. TS. Võ Thị Thương Lan, người đã chỉ bảo tận tình trong suốt quá trình tôi
thực hiện đề tài. Cô không chỉ truyền thụ cho tôi nhiều kiến thức về chuyên môn mà
còn giúp tôi bồi đắp lòng say mê, sự nghiêm túc, tính cẩn thận trong nghiên cứu
khoa học. Đó là nền tảng cho quá trình thực hiện luận văn, là hành trang giúp tôi
tự tin vững bước trên con đường khoa học sau này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn ThS. Tạ Bích Thuận. Cô đã luôn động viên, dành
cho tôi nhiều lời khuyên quý báu trong những lúc tôi gặp khó khăn.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo Khoa Sinh học, Trường Đại
học Khoa học Tự nhiên đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và
nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn NCS. Ngô Thị Hà, NCS. Vương Diệu Linh, ThS.
Lê Hồng Thu, CN. Trần Tuấn Anh và các bạn sinh viên Phòng thí nghiệm Sinh Y
thuộc Khoa Sinh học, Phòng Sinh học Phân tử thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa
học sự sống và Phòng Genomic thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ
Enzym - Protein đã giúp đỡ và cổ vũ tôi trong suốt thời gian qua.
Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn tới bố mẹ và anh trai, người thân và bạn bè
đã ủng hộ, giúp đỡ tôi rất nhiều về cả vật chất lẫn tinh thần để tôi có thể hoàn
thành luận văn này.
Hà Nội, tháng 12 năm 2013
Học viên

Nguyễn Thị Thu Hường
Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học



Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013

 
ADN Axit deoxyribonucleic
ARN Axit ribonucleic
bp 
cs. 
codon Cd
Da Dalton
dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate
dTTP Deoxythymidine triphosphate
dUTP Deoxyuridine triphosphate
H
2
O 
kb Kilobase = 1000 bp
M Mol/lit
PCR 
SDS Sodium Dodecyl Sulfate
SSC Saline Sodium Citrate
TBE - Borate - EDTA

Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học



Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013
DANH MC CÁC BNG
Bng

Trang
Bng 1
m ca mt s loi màng dùng trong k thut lai axit nucleic
19
Bng 2
Thành phn các dung dm và lai
c
27
Bng 3
Trình t các mi dùng trong nghiên cc sn
phng
28
Bng 4
Trình t u dò oligo dùng trong k thuc
28
Bng 5
Thành phu kin phn ng khun C và T
31
Bng 6
8% 
38

Bng 7
Thành phu kin phn ng khui u dò M
39
Bng 8
Thành phu kin tn u dò M
vi biotin và DIG
40
Bng 9
Thành phu kin phn i sàng lng
tht bin ti Cd 17, Cd 26 và Cd 41-42 trên gen β-globin
48
Bng 10
Kt qu sàng lt bin ti Cd 17, Cd 26 và Cd 41-42 trên 30
mu bnh phm bng phn i
50
Bng 11
Thành phu kin phn ng PCR vi cp mi CD F/R
khun gen β-globin c 700 bp
50
Bng 12
Thành phu kin phn nh du trình t 
thuc
53
Bng 13
Tn s t bin gây b-thalassemia  mt s quc gia trên
th gii
61


Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học

Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013
DANH MC CÁC HÌNH
Hình

Trang
Hình 1
Mô hình chui xon kép, liên kt hydro và phosphodieste trong
phân t ADN
03
Hình 2
S bin tính và hi tính ca phân t ADN si kép
04
Hình 3
Các phân t si kép hình thành trong phn ng lai axit nucleic
05
Hình 4
u dò bch chuyt
07
Hình 5
u dò bi ngu nhiên
08
Hình 6
Nguyên lý chung ca h thu không phóng x gián tip
12
Hình 7
Cu trúc phân t digoxigenin-11-dUTP và biotin-16-dUTP
13

Hình 8
ng cn C, T và M
25
Hình 9
V u dò oligo và cp mi CD F/R trên gen β-globin
30
Hình 10
Kt qu u dò M vi biotin và DIG
41
Hình 11
Kt qu so sánh hiu qu u biotin và DIG và ki
nhy ca k thum
42
Hình 12
Kt qu n di kim tra sn phm khun T
43
Hình 13
Kt qu m phân bin T  65
0
C
44
Hình 14
Kt qu m vi các loi ADN khác nhau chn C và
n T
45
Hình 15
Kt qu u dò M vn chèn C và T
46
Hình 16
Kt qu m vi plasmid pBluescript và cp mi M13 F/R

47
Hình 17
 minh ha v trí các mi s dng trong phn i
49
Hình 18
Kt qu n di sn phi
49
Hình 19
Kt qu tinh sch sn phm PCR mu T9 vi cp mi CD F/R
51
Hình 20
Kt qu so sánh trình t n gen khui bng
cp mi CD F/R vi ngân hàng d liu NCBI
52
Hình 21
Kt qu u n gen β-globin vi biotin
54
Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học



Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013
Hình 22
Chuu dò chm lên màng trong k thum
c
55
Hình 23
Kt qu c phát hit bin trên gen β-globin ca
tng cu dò
55

Hình 24
Kt qu c phát hing tht bin trên gen
β-globin
57

Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học



Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013
MC LC
M U 1
NG QUAN TÀI LIU 2
1.1. CU TRÚC PHÂN T ADN 2
1.2. NGUYÊN TC CA K THUT LAI AXIT NUCLEIC 3
1.3. U DÒ 5
1.3.1. m cu dò trong k thut lai axit nucleic 5
u dò 6
1.3.3. Các chu dò 9
1.4. MT S K THUT LAI AXIT NUCLEIC 13
1.4.1. Lai ti ch 13
1.4.2. Lai pha lng 15
1.4.3. Lai pha rn 15
1.5. CÁC YU T N K THUT LAI PHA RN 18
1.6. NG DNG CA CÁC K THUT LAI AXIT NUCLEIC 20
U 25
2.1. NGUYÊN LIU, HÓA CHT VÀ THIT B 25

ng nghiên cu 25
2.1.2. Hóa cht 26
2.1.3. Các mi 27
u dò oligo 28
Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học



Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013
2.1.5. Màng lai 29
2.1.6. Thit b 29
2.2. U 29
2.2.1. Thit k u dò 29
 30
m 31
2.2.3.1. Bin tính và c nh ADN trên màng nylon (Roche) 31
2.2.3.2. Tin lai và lai 32
2.2.3.3. Phát hiu dò 33
c 34
2.2.4.1. Hot hóa màng nylon (Pall) 34
2.2.4.2. C u dò trên màng nylon (Pall) 34
2.2.4.3. Tin lai và lai 34
2.2.4.4. Phát hiu biotin 35
2.2.5. Tách ADN t mu bnh phm 35
2.2.6. Tách plasmid 36
2.2.7. Tinh sch sn phm PCR bng kit High pure PCR cleanup micro 37
n di 37
T QU VÀ THO LUN 39
A - KT QU 39
M 39

3.1.1. Kt qu khuu dò M 39
Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học



Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013
3.1.2. So sánh hiu qu u vi biotin và DIG 41
3.1.3. Chun b trình t  i chng 42
3.1.4. Kt qu m phân bit trình t  i chng 43
C 47
3.2.1. Sàng lc mt s t bin trên gen β-globin 47
3.2.2. Chun b u trình t c 52
3.2.3. Kt qu c phát hit bin trên gen β-globin 54
B - THO LUN 57
T LUN VÀ KIN NGH 62
KT LUN 63
KIN NGH 63
TÀI LIU THAM KHO 63
PH LC 72

Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học



Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013
1

Ngày nay, c
chóng. tri
   

giúp chúng ta cùng  am  
.    
 có nghiên
 - . 
 
.     
 
PCR , lai ADN (Southern blot, dot blot, line blot) và gi 
chú ý  - phát
 . kinh 
 thao tác 
chóng, chi phí 
.  
   Human Papillomavirus) liên
 này 
  . 
c 
 
.  

 và -
Protein, 

Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học



Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013
2


1.1. ADN
 R., Gosling R., 1952) và thông tin
 E., 1950), Watson J. và Crick F. 
ADN (1953).  này 
               
ADN.  công trình ADN  
Miescher F.  [1]. Cùn G. 
 
Lan.  Avery O., MacLeod C. và McCartey M. 
ADN  [1]
 ADN  nucleic  
bào . ADN 


.
ADN  
(monomer) deoxyribonucleotide. 


ADN 
 [41]. ADN
 (A, G, T, C)pentose và
nhóm phosphate. 
               
   hai
g [41].
Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học

Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013
3

Hình 1: (A) Mô , (B) liên 
ADN [77].
ADN 

(Hình 1) [1].

 
                


0
 [1]
 ADN  

1.2. NGUYÊN  
ADN    
 tính  [68]. 
phosphodieste
ADN.      
  ADN) (Hình
Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học



Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013
4
2) [4].  g

, 
quá trình [7].  
 quan tâm   
 .  
              - temperature
melting) [71]ADN 
trí s ADN 
, ADN 
. 
 
  40% GC), ADN 
Tm  87
0
 [58]. 
 25
0
C.

Hình 2: ADN 41].


,   
 ,    axit nucleic quan tâm
[13, 43]. TADN 
ARN  cao  
Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học



Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013

5
 
 
 
Hình 3). 
 và  
tính các   


Hình 3:  [58].
1.3. 
1.3.1. Đặc điểm của đầu dò trong kỹ thuật lai axit nucleic
 axit nucleic 
(ADN 

 ARN) [5, 8]. Các ADN          
ADNc (complementary DNA), ADN  
58, 65]. ADN
   [53, 65]. 
Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học



Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013
6
 
Chain Reaction) 







 

 





  





[31, 75].
ADN  
dò oligo) [7, 32].  này 
i  nên chúng
 [11, 37]. 
  
51, 58]. 











    
. 
 





18  100 bp.
 40 - 













  










, 
"" .
 4 nucleotide.
 









 70% 













 
1.3.2. Các phương pháp đánh dấu đầu dò
ADN ADN 
ARN [7]. Trong , các nucleotide   các 
    
các nucleotide ADN nucleotide
 ùng UTP
 [34].  ADN:
Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học



Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013
7
(a)  ADN in vitro [58]: ADN
ADN 
ADN in vitro
ADN ADN in vitro theo 
nick-translation)
 PCR.
  [7]: DNa ADN 

ADN 
--3'), m
a 
có K
ADN  (Hình 4).

Hình 4: 58].
Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học



Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013
8
 


            


 5).

Hình 5:  [58].
      58   
   

t
PCR 
40
 
 ADN 

31

Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học

Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013
9
(b)       [58]: Trong      ,
           ATP
5' 
 
 
          enzyme terminal transferase [33].
Enzyme này    thêm  deoxyribonucleotide   -OH 
ADN ADN  
ADN g , oligonucleotide  
 thêm .
  
làm              
ADN .
1.3.3. Các chất đánh dấu đầu dò
33]:
 xit nucleic  
 
  
 
 ;
 
 
 













[33]:
(a) 





: 







Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học



Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013
10


m Geiger-

32
P,
33
P,
35
S,
3
H,
14
C,
125
I [19

0,5 µg ADN [55]. H





 

32



 55, 58


22,
66
quan tâm [23, 26].
(b) 





: 
 , 

 , 

 , 



  và phát


 [29, 55, 71].  



  [58]. Các

horseradish peroxidase, các  
khi  
 

33]. 
[26]. 

   
  khi  .
Ánh sáng phát ra            
Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học



Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013
11
quang [58].  
    
fluoresceinrhodamine, Texas red, CY5) [33].
- 


2
O
2
[33].  t
               


 [70, 78]

33].

T 


 
 [58]. S
; (ii) nhóm báo cáo  ; (iii) 
hóm báo cáo)
6.
Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học



Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013
12

Hình 6: 58].
 (vitamin H)
[36, 55, 64   
streptavidin alkaline phosphatase  là streptavidin - 
    Streptomyces avidinii)       

K
d
= 10
-15
) [16, 64
biotin-11-dUTP -16-dUTP (Hình 7) [19].
 biotin, digoxigenin (DIG) 

























 ADN và ARN [39]. K-digoxigenin 


  





 . 

 (5-bromo-4-
chloro-3-indolyl phosphate) và NBT (nitro-blue tetrazolium) [75
 tan là NBT diformazan có màu xanh tím, quan

Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học



Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013
13

Hình 7: (A) digoxigenin-11-dUTP và (B) biotin-16-dUTP [58].


              
glycan [55


 [60, 61, 64].
1.4. 
1.4.1. Lai tại chỗ
in situ hybridization - ISH) 






 
Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học

Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013
14
10, 50
lai 

  
 [21]

ARN và ADN in
situ hybridization -         in situ
hybridization - CISH) [76

20, 79
  

63


20



                 
(Immunohistochemistry -           
   
[79



44


Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học



Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013
15
1.4.2. Lai pha lỏng



0


 guanidine thiocyanatet này có

ethanol hay dioxane [65ADN 


              
               
             


ADN 

65].

1.4.3. Lai pha rắn
ADN ARN
60
pnitrocellu[55]. 
northern blot, dot blot và reverse dot blot.

ADN ADN
ADN  phân
tách trên gel agarose. Sau 