Tiểu luận môn Sinh Học Phân Tử ỨNG DỤNG CỦA SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH

ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

TIỂU LUẬN
Đề tài: “ỨNG DỤNG CỦA SINH HỌC PHÂN TỬ
TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH”

Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc
Học viên thực hiện : Nguyễn Thị Thanh Vinh
Lớp : LL&PPDH bộ môn Sinh học K22
Huế, 1/1/2014
GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo – PGS.TS
Nguyễn Bá Lộc đã tận tình giảng dạy và giúp đỡ tôi trong
suốt quá trình học tập, nghiên cứu.
Tuy đã có nhiều cố gắng, nhưng chắc chắn tiểu luận
của tôi còn có rất nhiều thiếu sót. Rất mong nhận được sự
góp ý của thầy giáo và các bạn trong lớp.
Xin chân thành cám ơn!
MỤC LỤC
- 2 -
GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh
1
Phần I: ĐẶT VẤN ĐỀ 4
Phần II: NỘI DUNG 5
II.1. Sinh học phân tử 5
II.1.1. Khái niệm 5
II.2. Ứng dụng trong chẩn đoán bệnh 14
Phần III: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36
III.1. Kết luận 36

III.2. Đề nghị 36
Phần IV: TÀI LIỆU THAM KHẢO 37
- 3 -
GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh
Phần I: ĐẶT VẤN ĐỀ
Sang thế kỉ XXI, khoa học – công nghệ có những bước phát triển nhảy vọt.
Nhiều công trình nghiên cứu, nhiều thành tựu mới ra đời đã đáp ứng và đảm bảo
nhu cầu cuộc sống cho con người ngày một tốt hơn. Y học trong thế kỷ XXI cũng
có những bước tiến dài, đạt được những kết quả khả quan: Nhiều căn bệnh hiểm
nghèo đã được chặn đứng, nhiều căn bệnh khác đang có triển vọng sẽ tìm ra cách
điều trị, … Tất cả những điều đó đạt được là nhờ sự ứng dụng của ngành Sinh học
phân tử vào trong y học
Sinh học phân tử là môn khoa học nghiên cứu giới sinh vật hay các hiện tượng
sinh học ở mức độ phân tử. Cũng như nhiều ngành khoa học khác, Sinh học phân
tử trong thời gian qua cũng phát triển mạnh mẽ và những thành tựu của nó đã được
ứng dụng có hiệu quả trong các lĩnh vực khác nhau của y học, mang lại cơ hội cho
nhiều bệnh nhân, mở ra triển vọng về một nền y học phát triển trong tương lai.
Nhận thấy được tầm quan trọng và lợi ích to lớn mà Sinh học phân tử mang lại
cho y học liên quan trực tiếp đến sức khỏe và đời sống của chúng ta và nó là vấn đề
mang tính thời sự nên em chọn đề tài “Ứng dụng của Sinh học phân tử chẩn
đoán bệnh” với mong muốn mở mang kiến thức về môn học Sinh học phân tử và
cập nhật những thành tựu mới của nó trong y học.
- 4 -
GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh
Phần II: NỘI DUNG
II.1. Sinh học phân tử
II.1.1. Khái niệm
Sinh học phân tử (molecular biology) là môn khoa học nghiên cứu giới sinh vật
hay các hiện tượng sinh vật ở mức độ phân tử.
Mục đích của sinh học phân tử là tìm hiểu mối tương tác giữa các hệ thống

khác nhau trong tế bào bao gồm cả mối liên hệ và tương tác giữa các phân tử DNA,
RNA, quá trình tổng hợp protein cũng như tìm hiểu cơ chế điều hòa những mối
tương tác này. Kiến thức về các mối tương tác trong từng đối tượng tế bào, mô, cơ
quan, hệ cơ quan, cơ thể v.v. giúp ta tìm hiểu sâu hơn về học thuyết trung tâm
(central Dogma) trong di truyền học từ đó có những can thiệp thích hợp để đưa đến
những ứng dụng trong y dược học, nông nghiệp, công nghiệp, bảo vệ môi sinh.v.v.
Sinh học phân tử cũng không chỉ giúp con người nghiên cứu hình thái của sinh
vật ở mức độ tinh vi hơn mà còn nghiên cứu quá trình hình thành, phát triển (về số
lượng và kích thước) của một tế bào, một cơ quan, một cá thể hay một loài cũng
như nghiên cứu về chức năng của các quá trình đó.
II.1.2. Các phương pháp nghiên cứu Sinh học phân tử
II.1.2.1. Phương pháp PCR (Polymerase chain Reaction)
II.1.2.1.1. Nguyên tắc:
Tất cả các ADN – polymerase khi tiến hành tổng hợp một đoạn ADN mới đều
cần có mạch khuôn ADN và 1 đoạn mồi. Mồi là đoạn ADN ngắn có khả năng bắt
cặp bổ sung với 1 đầu của mạch khuôn. ADN – polymerase làm nhiệm vụ nối dài
mồi để hình thành mạch mới.
Phương pháp PCR dựa vào đặc tính hoạt động đó của ADN – polymerase. Khi
cung cấp 2 mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với 2 đầu của ADN ta sẽ tổng hợp
được đoạn ADN nằm giữa 2 mồi đó.
* PCR thực hiện qua ba bước:
- 5 -
GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh
- Bước 1:
Biến tính phân tử ADN là khuôn: Để gây biến tính ADN, chuyển ADN mạch
kép thành ADN mạch đơn, cần sử dụng nhiệt độ cao hơn nhiệt độ Tm phân tử,
thường khoảng 92 – 95
0
C trong thời gian khoảng 1 phút.
- Bước 2:

Mồi bắt cặp với khuôn: Quá trình này xảy ra ở nhiệt độ tháp hơn Tm (40 –
70
0
C) trong khoảng 1 phút.
- Bước 3:
Nhờ ADN – poymerase, quá trình tổng hợp 2 chuỗi ADN xảy ra. Qua strinhf
này được thực hiện ở nhiệt độ cao, khoảng 72
0
C, nhờ sử dụng ADN – polymerase
chịu nhiệt: Tap-polymerase.
Ba giai đoạn trên xảy ra theo chu kì và được lặp lại nhiều lần làm cho sau mỗi
lần, số lượng mẫu tăng lên gấp đôi, là quá trình khuếch đại mẫu theo cấp số nhân,
cứ sau khoảng 30 chu kỳ sẽ tạo ra được 10
6
bản sao của mẫu ban đầu.
II.1.2.1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến PCR:
- ADN mẫu :
Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra với ADN thật tinh sạch.
- Enzim:
Enzim được sử dụng là enzim polymerase chịu nhiệt được tách ra từ vi khuẩn
suối nước nóng.
- Mồi - primer:
Tức là những đoạn DNA đơn có kích thước chỉ vài chục base, có thể bắt cặp
theo nguyên tắc bổ sung vào đoạn khởi đầu và đoạn kết thúc của chuỗi DNA đích
khi chuỗi đích này được biến tính thành sợi đan.
+ Đoạn mồi có hai vai trò chính :
(1) Quyết định nên tính đặc hiệu của thử nghiệm.
- 6 -
GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh
(2) Khởi động men polymerase vì men polymerase chỉ có thể bắt đầu tổng hợp

sợi bổ sung cho chuỗi DNA đích một khi nó nhận dạng được đầu 3', đang ở tình
trạng sợi đôi.
- Nhiệt độ (Tm):
+ Công thức được sử dụng trong điều kiện primer có khoảng 20 oligo nucleotit
Td = 4(G+C)+2(A+T).
A, T, G, C là số lượng các nucleotit trong oligo nucleotit.
- Dung dịch đệm:
Thường chứa muối đệm Tris HCL 10 mM, KCL 50Mm và MgCl2 2 1.5mM.
Ngoài ra dung dịch đệm PCR còn có thể chứa 0.001% BSA hay Gelatine và trong
một số phản ứng PCR còn có thể thêm tween hay formamide nữa. Ảnh hưởng lên
thử nghiệm PCR nhiều nhất là nồng độ MgCl2, vì vậy để có được một thử nghiệm
PCR có độ nhạy cao, phả ứng rõ nét, người ta phải tối ưu hóa phản ứng bằng cách
thăm dò một nồng độ MgCl2 thích hợp nhất.
- Số lượng chu kỳ:
Trong thực tế người ta thưởng sử dụng 30 chu kỳ là tối ưu và không bao giờ
vượt quá 40 chu kỳ. Sở dĩ như vậy vì phản ứng PCR diễn ra qua 2 giai đoạn:
+ Giai đoạn đầu: có số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân tỉ lệ với lượng mẫu
ban đầu.
+ Giai đoạn sau: Số lượng bản sao giảm dần vì sự phân hủy làm cạn kiệt các
thành phần tham gia phản ứng, sự xuất hiện các sản phẩm phụ và các bản sao vừa
tạo ra không kết hợp với mồi mà kết hợp với nhau.
Số chu kỳ cho 1 phản ứng tùy thuộc số lượng bản mẫu ban đầu. Ví dụ nếu số
lượng bản mẫu là 10
5
thì cần 25 – 30 chu kỳ; nếu số lượng bản mẫu là 10
2
– 10
3
thì
số chu kỳ phải là 35 – 40 chu kỳ.

II.1.2.1.3. Qui trình tiến hành PCR:
- 7 -
GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh
Phương pháp PCR
Quá trình thực hiện phương pháp PCR xảy ra theo chu kì thực hiện với các
bước cơ bản sau :
- Bước 1:
Biến tính phân tử ADN khuôn tiến hành ở 94
0
C. Trước hết tiến hành xử lý mẫu
ở 94
0
C trong 5 phút đầu để khởi đầu quá trình. Sau đó cứ đầu mỗi chu kỳ lại xử lý
94
0
C trong 30 phút để biến tính ADN.
- Bước 2 :
- 8 -
GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh
Kết hợp mồi vào khuôn cho các mồi vào với mẫu ADN đã biến tính rồi xử lý ở
nhiệt độ 60
0
C trong 30 phút, ở nhiệt độ này các primer srx liên kết với ADN khuôn.
- Bước 3 :
Tổng hợp 2 chuỗi ADN. Cho nguyên liệu dNTP vào và xử llys ở nhiệt độ 72
0
C
trong 1 phút, ở nhiệt độ này quá trình tổng hợp 2 chuỗi bổ sung cho 2 chuỗi ADN
khuôn xảy ra.
Sau khi kết thúc giai đoạn 3, tiếp tục quay lại chu kì với việc xử lý ở nhiệt độ

94
0
C trong 30 giây.
Mọi thao tác đều được tiến hành trong phòng vô trùng. Mẫu thu được sẽ được
cất giữ ở 4
0
C.
II.1.2.2. Phương pháp tách chiết axit nucleic
II.1.2.2.1. Phương pháp tách chiết axit nucleic
* Phương pháp tách chiết ADN:
- Các bước
+ Phá bỏ màng tế bào và màng nhân
+ Loại bỏ các tạp chất
+ Kết tủa axit nucleic
- Quy trình tách chiết
- 9 -
GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh
Mẫu
Cố định mẫu bằng N
2
lỏng
Mẫu mất hoạt tính enzim
Nghiền với hỗn hợp phenol-Tris SDS
Hỗn hợp
Lọc

Dịch Bã (bỏ đi)
4
0
C-24

h
, lọc
Dịch Bã (bỏ đi)
Alcol 96
0
+Acetat Na1M
-20
0
C-24
h
Hỗn hợp
Ly tâm 3000g/10
'
Tủa (Axit Nucleic tổng số) Dịch (bỏ đi)
NaCl0,3M+Cetavlon
4
0
C-30
'
Hỗn hợp
Ly tâm 3000g/10
'
Tủa (ARN) Dịch (ADN)
* Phương pháp tách chiết ARN:
- Các bước:
+ Phá bỏ màng tế bào
+ Tách protein ra khỏi hỗn hợp bằng xử lý phenol-chlorofform và ly tâm
- 10 -
GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh
+ Kết tủa ARN bằng etanol rồi thu nhận qua ly tâm

- Quy trình tách chiết.
Mẫu
Cố định mẫu bằng N
2
lỏng
Mẫu mất hoạt tính enzim
Nghiền với hỗn hợp chất tẩy
Hỗn hợp
Lọc

Dịch Bã (bỏ đi)
Phenol-chloroform
Hỗn hợp
Ly tâm 3000g/10
'
Dịch Tủa (bỏ đi)
Alcol 96
0
+ Acetat Na1M
-20
0
C-24h
Hỗn hợp
Ly tâm 3000g/10
'
Tủa (ARN) Dịch (bỏ đi)
II.1.2.2.2. Phương pháp phân tích thành phần axit nucleic
* Thuỷ phân axit nucleic:
- Thuỷ phân bằng kiềm
- Thuỷ phân bằng Ribonuclease

- Thuỷ phân bằng nuclease T
1
- Thuỷ phân bằng photphodiesterase nọc độc rắn
- Enzim cắt hạn chế (RE)
- 11 -
GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh
* Phương pháp tách các nucleotit:
- Điện di:
+ Nguyên tắc của phương pháp là do: Dưới tác động của điện trường, các phân
tử ADN (thường tích điện âm) khác nhau về kích thước, điện tích, mức độ cuộn
xoắn và dạng phân tử (mạch thẳng hay mạch vòng) sẽ di chuyển qua hệ mạng của
gel từ cực âm (cathode) sang cực dương (anode) với tốc độ di chuyển khác nhau.
Vì vậy, chúng dần dần tách nhau ra trên trường điện di, qua đó người ta có thể thu
thập và phân tích được từng phân đoạn ADN hoặc gen riêng rẽ.
+ Có hai loại vật liệu làm gel được sử dụng phổ biến trong điện di, đó là
agarose và polyacrylamid. (1) gel polyacrylamid có khả năng phân tách cao, nhưng
khoảng kích thước ADN có thể phân tích hẹp.(2) gel agarose có khả năng phân tách
thấp hơn đối với các phân đoạn ADN kích thước nhỏ, nhưng rất hiệu quả khi phân
tách các phân đoạn ADN kích thước lớn tới hàng chục hoặc hàng trăm kb (1 kb =
1000 bp).
- Phương pháp ly tâm:
Siêu ly tâm trên một gradient liên tục CsCI. Trong quá trình ly tâm dung dịch
CsCI đậm đặc trong ống ly tâm sẽ tự động hình thành một gradient tỷ trọng tăng
dần từ miệng đến đáy ống. Dưới tác động của lực ly tâm các nucleotit di chuyển
trong ống đến vị trí có tỷ trọng bằng tỷ trọng của chính chúng sexduwngf lại. Bằng
cách đó các nucleotit có tỷ trọng khác nhau sẽ được tách riêng ra thành các lớp
khác nhau trong ống nghiệm.
- Phương pháp sắc ký:
+ Sắc ký ái lực trên oligo - T - cellulase để tinh sạch ARN
m

+ Sắc ký gel
+ Sắc ký trao đổi ion trên cột để thu hồi các lượng rất nhỏ ADN
+ Sắc ký lỏng cao áp
II.1.2.3. Các phương pháp biến đổi vật liệu di truyền
II.1.2.3.1. Biến đổi vật liệu di truyền
- 12 -
GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh
* Loại bỏ một trình tự ADN:
Có thể thực hiện bằng nhiều cách, sau đây là những cách sử dụng phổ biến:
- Thuỷ giải bằng RE thích hợp
- Các sản phẩm của phản ứng phân cắt do RE được tách ra bằng điện di trên gel
agarose
- Các phần ADN không muốn loại bỏ sẽ được ly trích từ gel, nối lại bằng
ligase
*Gắn thêm một trình tự ADN.
*Tạo đột biến điểm có định hướng:
- Tạo dòng trong phage M13 cho trình tự cần tạo đột bến.
- Tổng hợp nhân tạo một oligo nucleotit có mang đọt biến ở vị trí mong muốn.
- Lai hai thành phần trên trong điều kiện không ngiêm ngặt để có thể lai các
trình tựu không bổ sung hoàn toàn.
- Oligo nucleotit bắt cặp với trình tự A được sử dụng làm mồi cho sự tổng hợp
mạch bổ sung với trình tự A nhờ ADN - polymerase.
- Tách rời hai mạch rồi chuyển vào vi khuẩn các dòng vi khuẩn mang vector tái
tổ hợp đột biến sẽ được chọn lọc qua phương pháp lai.
II.1.2.3.2. Chuyển gen vào tế bào nhận.
* Phương pháp biến nạp:
Biến nạp là quá trình chuyển ADN trực tiếp tách ra từ tế bào thể cho sang tế
bào thể nhận.
- Kỹ thuật calcium phosphate dựa vào sự hình thành một phức hợp ADN-
calcium dễ được tế bào thu nhận qua cơ chế thực bào.

- Kỹ thuật biến nạp: Sử dụng dòng điện có điện áp cao tạo nên các lỗ thủng trên
màng tế bào làm cho ADN từ môi trường dễ dàng xâm nhập vào tế bào qua các lỗ
thủng đó.
- Kỹ thuật tiêm: Dùng bơm tiêm để tiêm dung dịch chứa ADN vào tế bào
- 13 -
GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh
- Kỹ thuật bắn: Dùng máy bắn gen để bắn những viên đạn cực nhỏ có tẩm
ADN cần mang và trong tế bào
* Phương pháp tải nạp:
Tải nạp là quá trình chuyển ADN vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận thông qua
Phage.
- Dùng thể truyền là Plasmid của vi khuẩn: Người ta thay một đoạn trong
plasmid bằng đoạn ADN cần chuyển. Cho plasmid vào tế bào đích bằng cách tái
nạp thông qua tế bào virus. Plasmid sẽ xâm nhập vào bộ gen của tế bào đích và đưa
đoạn ADN cần chuyển vào theo
- Dùng thể truyền là virus: Loại một bộ gen của virus rồi gắn thay vào một
đoạn ADN cần nghiên cứu sau đó cho virus xâm nhiễm vào tế bào đích. Đoạn
ADN cần gắn theo bộ gen của virus vào tế bào đích và tái tổ hợp với bộ gen của tế
bào đích.
II.2. Ứng dụng trong chẩn đoán bệnh
II.2.1. Xác định ADN bình thường – dấu ấn di truyền
- ADN bộ gen người của chúng ta có đến 30% chứa các trình tự base lặp lại và
hầu như không mang những mã có ý nghĩa chức năng. Cũng như các trình tự base
có ý nghĩa chức năng (gọi là gen), các trình tự base lặp lại này được di truyền từ
cha mẹ sang con cái theo định luật phân ly độc lập của Mendel. Tuy nhiên khác với
gen, rất khó tìm thấy sự khác biệt về trình tự base của gen giữa các cá nhân, có
nhiều trình tự base lặp lại có thể giúp phân biệt được cá nhân này với cá nhân khác,
không những thế, có thể giúp tìm xem họ có quan hệ huyết thống với nhau hay
không? Các trình tự base lặp lại này được gọi là các dấu ấn ADN. Có hai loại dấu
ấn ADN hiện đang được dùng trong xét nghiệm dấu ấn ADN là: Tiểu vệ tinh và vi

vệ tinh. Tuy nhiên tiểu vệ tinh là loại dấu ấn đang được sử dụng nhiều.
+ Tiểu vệ tinh: Ðó là các trình tự base lõi lặp lại, gọi là các tiểu vệ tinh VNTRs
(Variable Number of Tandem Repeats = Số lượng thay đổi các trình tự base lặp
lại), có các kích thước thay đổi từ 1.000 base (1 KB) đến 30.000 base (30 KB).
- 14 -
GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh
+ Các bước thực hiện:
(1) Trước hết mẫu máu được lấy từ những người cần thử nghiệm để tách được
bạch cầu, sau đó ly trích toàn bộ bộ gen nguyên vẹn của bạch cầu trong các mẫu
thử nghiệm;
(2) Cắt đoạn các bộ gen đã ly trích này bằng men cắt hạn chế, là một loại men
cắt nhận diện được 4 trình tự base đặc hiệu, nhờ đó cắt đoạn được bộ gen thành
những mảnh ADN dài ngắn khác nhau, trong đó có những mảnh chứa các trình tự
base lặp lại;
(3) Ðiện di mẫu thử nghiệm để phân tách các đoạn ADN này trên thạch
agarose, sau đó chuyển các đoạn ADN trên thạch này qua một màng nylon bằng kỹ
thuật thấm Southern (Southern blotting);
(4) Phát hiện vị trí các trình tự base lặp lại trên màng nylon bằng cách lai với
một trong những dò ADN đánh dấu đồng vị phóng xạ và đặc hiệu cho các trình tự
base lặp lại này.
* Mẫu để xét nghiệm: Tất cả các tế bào có nhân tức là có ADN: một giọt máu,
tinh dịch, sợi tóc
* Ứng dụng:
Dấu ấn di truyền hiện nay đang được sử dụng ngày càng rộng rãi, nó được gọi
là những tấm thẻ ADN. Lần đầu tiên tại Việt Nam, các nhà khoa học Trung tâm
phân tích ADN và công nghệ di truyền (Hà Nội) đã thiết kế ra thẻ ADN cá
nhân. Hiện nay, đã có khoảng 1.500 tấm thẻ ADN ra đời (trung bình 1 tháng có
khoảng 100 người yêu cầu giám định ADN) tại Trung tâm phân tích ADN và Công
nghệ di truyền - một trong những đơn vị hàng đầu trong việc phân tích, giám định
ADN của Việt Nam. Ở Việt Nam, thẻ ADN dùng để xác định đặc trưng cá thể

người, bao gồm nhận dạng và xác định huyết thống đã đạt chuẩn mực quốc tế. Cụ
thể là đã áp dụng những công nghệ tiên tiến nhất, xác định riêng biệt từng cá thể và
xác định được tất cả các mối quan hệ huyết thống, kể cả những quan hệ phức tạp,
thậm chí cách nhiều đời với độ chính xác rất cao, vì dùng tới 2 bộ gen, mỗi bộ 16
- 15 -
GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh
gen (mức cao nhất mà thế giới đang làm), ngoài ra còn sử dụng hơn 50 gen độc lập
trong những trường hợp cần thiết. Việc Lập thẻ ADN cá nhân có thể vừa nhận
huyết thống, vừa chữa bệnh.
- Điều tra hình sự:
Xác định tội phạm, hiếp dâm thông qua các dấu vết để lại trên hiện trường .
- Xác định huyết thống:
Hiện nhu cầu giám định ADN với mục đích này ở Việt Nam có thể nói là
không thấp và chắc chắn có xu hướng ngày càng tăng cao do các nguyên nhân:
Chiến tranh kéo dài dẫn đến những thất lạc, thậm chí ra khỏi biên giới Việt Nam,
nhu cầu tìm người thân là rất lớn; Quá trình phát triển kinh tế - xã hội phát sinh các
quan hệ huyết thống rắc rối…
II.2.2. Xác định ADN bệnh lí
Sinh học phân tử được sử dụng rộng rãi trong việc xác định bệnh lý. Trong đó
phương pháp PCR được ứng dụng nhiều. Và phương pháp này được sử dụng trong
chẩn đoán bệnh ung thư (tìm HPV trong ung thư cổ tử cung, phát hiện gen APC
trong ung thư đại tràng, gen BRCA 1 - BRCA 2 trong ung thư vú, gen TPMT trong
bệnh bạch cầu trẻ em, gen IgH và TCRy trong u lympho không Hodgkin, gen Rb-
105 trong u nguyên bào lưới, gen NF-1,2 trong u xơ thần kinh…), nghiên cứu về hệ
kháng nguyên bạch cầu người (HLA, human lymphocyte antigen)…
a. Nguyên tắc
Bằng kỹ thuật PCR, từ một lượng khuôn ADN rất nhỏ như: một giọt máu, một
sợi tóc hay một tế bào… người ta có thể khuếch đại chính xác, trật tự một lượng
lớn lên đến hàng triệu bản nhằm phục vụ cho các quá trình khảo sát trong phản
ứng. Trong công nghệ sinh học, PCR được sử dụng trong việc lập bản đồ gen, phát

hiện gen, dòng hoá gen, giải mã trình tự ADN…
b. Chẩn đoán viêm gan siêu vi B
* Virus viêm gan B có phần lõi của nó là ADN tức là acid nhân chứa đựng
thông tin di truyền của virus. Virus viêm gan B một khi nhân bản hoàn chỉnh thì sẽ
- 16 -
GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh
tạo được một virus hoàn chỉnh tức là bên trong phần vỏ của nó (đó là kháng nguyên
vỏ hay kháng nguyên bề mặt HBsAg) có chứa được phần lõi HBV-DNA.
* Xét nghiệm chẩn đoán HBV- DNA tức là xét nghiệm tìm xem trong máu của
bệnh nhân có mang virus hoàn chỉnh hay không. Đây là một xét nghiệm sinh học
phân tử. Nó được thực hiển bởi phương pháp PCR.
- Máu của bệnh nhân khi lấy sẽ được tách huyết tương hay huyết thanh và sau
đó phòng thí nghiệm sẽ tách chiết ADN của virus trong các mẫu huyết tương và
huyết thanh này để đưa vào một ống nghiệm rồi nhân bản các ADN này trong ống
nghiệm thành hàng tỷ bản sao để phát hiện. Nhờ nhân bản từ 1 bản gốc lên hàng tỷ
bản sao rồi mới phát hiện nên xét nghiệm này có độ nhạy cảm cực cao, đủ sức để
phát hiện ADN của virus có trong mẫu thử dù số lượng rất thấp.
c. Chẩn đoán viêm gan virus C
Ngày nay, việc ứng dụng sinh học phân tử trong chẩn đoán điều trị bệnh viêm
gan do virus nói chung và bệnh viêm gan do virus C ngày càng trở nên quan trọng,
chúng trở thành các chỉ định xét nghiêm bắt buộc trong điều trị viêm gan virus C
nhất là viêm gan C kháng thuốc, chúng đặc biệt hữu ích trong việc thiết lập điều trị,
thay đổi điều trị, đánh giá về virus học cũng như sự kháng thuốc của virus viêm
gan C.
* Các kĩ thuật khuếch đại mục tiêu:
- Nguyên tắc cơ bản của các kỹ thuật khuếch đại mục tiêu là tổng hợp một số
lượng lớn bản sao của các bộ gen virus (được gọi là các sản phẩm khuếch đại PCR,
LCR, amplicon)
- Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) phát hiện HCV RNA:
Phương pháp này dùng nhiều nhiệt độ khác nhau và chung một enzym

polymerase chịu nhiệt. Các sản phẩm khuếch đại là các ADN mạch đôi. PCR được
áp dụng cho các virus ADN trực tiếp, tuy nhiên với virus ARN (như HCV) một
bước sao chép ngược là cần thiết, để tổng hợp ADN bổ trợ dùng làm khuôn trong
phản ứng PCR. Khi mỗi chu kỳ PCR hoàn tất, số lượng bản sao được nhân đôi, sau
- 17 -
GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh
n chu kỳ 2n bản sao của mỗi phân tử ban đầu được tổng hợp về mặt lý thuyết. Việc
phát hiện các sản phẩm khuếch đại dựa vào phương pháp lai đặc hiệu. Việc định
lượng được dựa vào khuếch đại cạnh tranh của khuôn virus với một lượng chuẩn
tổng hợp thêm vào mỗi ống phản ứng.
* Các kỹ thuật khuếch đại tín hiệu:
Trong các kỹ thuật khuếch đại tín hiệu, bộ gien virus lúc đầu được lai vào một
giá bằng các bộ dò oligonucleotid bắt giữ đặc hiệu, sau đó tín hiệu phát ra bởi các
lai được khuếch đại và đo lường. Có hai kỹ thuật hay sử dụng:
- Phương pháp bắt giữ lai (hybrid capture)
- Kỹ thuật ADN nhánh (Branched DNA technology)
* Phân tích trình tự bộ gen HCV:
Phân tích trình tự bộ gen virus nhằm vào việc xác định các trình tự ký tên (điều
này được dùng để phân loại các chủng virus theo lợi ích lâm sàng, gọi là kiểu gen
của virus) hoặc các thay thế acid amin ở các vị trí đặc biệt (điều này được dùng để
xác định các acid amin đã biết liên quan đến sự kháng thuốc). Phân tích trình tự bộ
gen dựa vào việc xác định trình tự trực tiếp, cung cấp toàn bộ trình tự của đoạn
được phân tích, hoặc các kỹ thuật thay thế nhận dạng các trình tự đặc hiệu ở các vị
trí cho sẵn. Có hai kỹ thuật thường áp dụng:
- Xác định trình tự trực tiếp của các sản phẩm khuếch đại HCV PCR: được
thực hiện sau phản ứng xác định trình tự trong một thiết bị xác định trình tự DNA
tự động. Thiết bị có thể dùng để xác định trình tự nucleotid chính xác và trịnh tự
acid amin suy ra của đoạn được phân tích. Điều này được áp dụng vào việc phát
hiện các loại hình đột biến.
- Lai ngược của các sản phẩm khuếch đại HCV PCR: Việc xác định trình tự

trực tiếp tốn nhiều công sức và chỉ thực hiện ở viện nghiên cứu đặc biệt, do đó cho
đến nay có nhiều kỹ thuật mới được phát triển để áp dụng cho lâm sàng, trong đó
được ứng dụng nhiều nhất là phương pháp dựa vào lai ngược các sản phẩm khuếch
đại PCR. Tóm lại, với sự ra đời và cải tiến không ngừng của kỹ thuật sinh học phân
- 18 -
GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh
tử, các xét nghiệm này được sử dụng rộng rãi để chẩn đoán, giúp tiên lượng cũng
như quyết định phương hướng điều trị viêm gan mạn do virus C, do đó khi có xét
nghiệm anti HCV dương tính, thì các xét nghiệm sinh học phân tử sau cần làm đó
là định tính HCV RNA nhằm xác định tình trạng nhiễm virus viêm gan C; định
lượng HCV RNA nhằm tiên lượng tình trạng nhiễm HCV, số lượng HCV RNA
càng cao bệnh càng tiến triển và càng khó đáp ứng với điều trị và cuối cùng là xác
định kiểu gen HCV RNA giúp tiên lượng cho quá trình điều trị, nếu kiểu gen 2 và 3
thì thời gian dự kiến điều trị sẽ thấp hơn kiểu gen 1.
d. Bước đầu chẩn đoán HPV (human papiloma virus) bằng phương pháp
sinh học phân tử
Ứng dụng từ nhiều nghiên cứu đã được công bố trên thế giới kỹ thuật PCR đã
được triển khai thực hiện và áp dụng tại Bệnh viện Phong Da liễu TW Quy hòa để
phát hiện và định type HPV. PCR đặc hiệu theo nhóm phát hiện nhiều type HPV
cùng một nhóm. Một thống kê tại khoa xét nghiệm Bệnh viện Phong Da liễu Trung
ương Quy hoà:
- Có 17/21 mẫu (80%) bệnh phẩm dịch cổ tử cung của bệnh nhân được chẩn
đoán “tổn thương tế bào gai mức độ thấp LSIL/HPV” được gửi từ Trung tâm chăm
sóc sức khoẻ sinh sản tỉnh Bình định cho kết quả dương tính với PCR-HPV.
- 34/35 (97%) mẫu bệnh phẩm là u sùi sinh dục của bệnh nhân được chẩn đoán
sùi mào gà cho kết quả dương tính với PCR-HPV và 100% thuộc type HPV-6/11.
- Lấy ngẫu nhiên 30 mẫu bệnh phẩm là phết cổ tử cung của bệnh nhân STD
được chỉ định làm PCR - Chamydia trachomatis, có 8/30 (26%) mẫu cho kết quả
dương tính với PCR-HPV.
Kết quả này phù hợp với nhiều thống kê khác, cho thấy tình hình dịch tể của

HPV không chỉ đối với ung thư cổ tử cung mà còn là vấn đề cần thiết phải quan
tâm trong các bệnh lây truyền qua đường tình dục.
e. Trong bệnh lí vi sinh học và kí sinh trùng:
- 19 -
GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh
Trong vi sinh vật, phản ứng khuyếch đại DNA được ứng dụng rất sớm và ngày
càng rộng rãi để chẩn đoán cǎn nguyên của các bệnh nhiễm trùng, ký sinh trùng và
virus, để tìm hiểu sâu hơn về cơ chế gây bệnh của chúng và để phân loại chúng một
cách chi tiết và chính xác hơn.
* Xác định cǎn nguyên của bệnh nhiễm trùng:
Cǎn cứ vào các đặc điểm thường gặp nhất của vi sinh vật được quan tâm, người
ta tìm đến các gen quyết định các tính trạng đó, thiết kế một mồi phù hợp nhằm để
khuyếch đại một vùng ổn định nào đó trên bộ gen. Sản phẩm của quá trình khuyếch
đại sau này, vì vậy, đã được xác định (cả về độ dài và trình tự các nucleotide) ngay
từ giai đoạn này. Khi đưa gen mồi nói trên vào một hỗn hợp ADN đã được tách
chiết từ vi sinh vật, nếu ADN này có chứa các đoạn gen có trình tự các nucleotide
bổ sung với trình tự của gen mồi thì chúng sẽ cặp đôi với nhau theo nguyên tắc và
sau đó gen mồi được kéo dài về phía đầu 3' của nó nhờ enzyme ADN polymerase.
Đoạn ADN đó nhờ vậy sẽ được nhân lên một cách đặc hiệu rất nhiều lần. Sau quá
trình nhân lên, người ta sẽ tìm đoạn DNA này, thông thường nhất, bằng điện di trên
gel agarose và nhuộm bằng Ethidium bromide. Như vậy, sau khi điện di, nếu có
bǎng ADN chạy giống như bǎng chuẩn thì điều đó có nghĩa là có vi sinh vật cần
tìm trong bệnh phẩm; ngược lại, nếu không thấy bǎng (band) nào xuất hiện hoặc có
những bǎng không giống với bǎng chuẩn thì có nghĩa là không có tác nhân gây
bệnh cần tìm trong bệnh phẩm.
Dựa trên nguyên tắc này, hiện nay, hầu như tất cả vi sinh vật gây bệnh đều có
thể tìm được nhờ phản ứng PCR. Sau đây là một số ứng dụng điển hình:
(1) Dùng PCR cho vi sinh vật chưa nuôi cấy nhân tạo được hoặc nuôi cấy rất
khó:
- Tác nhân vi khuẩn gây bệnh giang mai (Treponema pallidum), hiện nay vẫn

chưa nuôi cấy trong môi trường nhân tạo được. Người ta có thể dùng nước ối từ mẹ
làm bệnh phẩm cho phản ứng PCR. Nhờ vậy, giang mai bẩm sinh có thể được chẩn
đoán rất sớm. Người ta cũng đã dùng PCR để tìm gen mã hoá cho protein màng
- 20 -
GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh
ngoài hoặc một đoạn 419-bp của gen mã hoá protein lông của các tác nhân gây
bệnh Lyme (Borrelia burgdorferi). Qua đó, bệnh Lyme có thể được chẩn đoán sớm
và chính xác.
- Tác nhân gây bệnh đường sinh dục: vi khuẩn lậu và các viêm niệu đạo do lậu
khó nuôi cấy. Neisseria gonorrhoeae và các tác nhân thường gây viêm niệu đạo sau
lậu (Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum và Mycoplasma genitalium)
đã có thể đồng thời tìm được trong một ống PCR duy nhất với bệnh phẩm là nước
tiểu. Điều này không những mang lại lợi ích thiết thực cho bệnh nhân mà còn góp
phần đắc lực cho nghiên cứu, tìm hiểu, đánh giá tình hình bệnh một cách sát thực
hơn, do trước đây không có điều kiện nuôi cấy tìm cǎn nguyên gây bệnh.
- Vi khuẩn lao: Mycobacterium tuberculosis không phải là quá khó nuôi cấy,
song chúng mọc rất chậm (thời gian nhân đôi từ 14 - 15 giờ, so với E. coli, khoảng
20 phút). Khoảng 2 tháng sau khi nuôi cấy mới nhìn thấy khuẩn lạc lao. Vì vậy, giá
trị lâm sàng của phương pháp nuôi cấy bị hạn chế rất nhiều. Phương pháp nhuộm
soi từ bệnh phẩm thì có độ nhạy rất kém (phải có trên 10
5
vi khuẩn/ ml đờm mới
cho kết quả dương tính). PCR đã góp phần giải quyết việc này, nó có thể cho kết
quả trong vòng 1 - 2 ngày với độ nhạy gấp khoảng 10.000 lần so với các phương
pháp cổ điển. Vì vậy, có thể chứng minh được sự có mặt của vi khuẩn lao trong
dịch não tuỷ, nước tiểu và các loại bệnh phẩm chứa ít vi khuẩn mà trước đây chẩn
đoán rất khó khǎn.
- 21 -
GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh
PCR để xác định các đột biến kháng Rifamicin (dấu hiệu rất có giá trị để xác

định một M. tuberculosis là đa đề kháng) ở gen rpoB. Nhờ vậy, những biện pháp
điều trị phù hợp được áp dụng một cách kịp thời; điều đó mang lại lợi ích không
nhỏ cho bệnh nhân và cộng đồng, vì rằng những chủng vi khuẩn lao đa đề kháng đã
được hạn chế tung ra môi trường bên ngoài.
- Vi khuẩn trong dạ dày Helicobacter pylori: H.P hiện đang là một trong những
vấn đề thời sự của y học thế giới vì vai trò quan trọng của nó trong các bệnh lý
viêm, loét và ung thư dạ dày được quan tâm gần đây. Tuy vậy, nuôi cấy HP rất khó,
PCR đã được dùng để tìm HP trực tiếp từ mảnh sinh thiết dạ dày, hoặc tìm các gen
(VacA, CagA) liên quan tới độc tính của nó. Nhờ PCR, người ta còn biết được sự
- 22 -
GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh
phân bố của các chủng HP khác nhau trên các vùng địa lý khác nhau hoặc các
chủng HP đặc biệt liên quan mật thiết đến những tình trạng bệnh lý nhất định.
- Các vi khuẩn khác như Coxiella burnetti với mảnh 438-bp của gen mã hoá
cho một protein 27kDa của màng ngoài; Salmonella typhi với mảnh 343-bp mã hoá
cho protein lông và 599-bp mã hoá cho kháng nguyên Vi; Pseudomonas
pseudomallei (hay Burkholderia pseudomallei) với mảnh 517-bp của 16S ARNr
cũng đã được khuyếch đại thành công bằng PCR.
- Xác định độc tố của vi sinh vật: tiểu đơn vị A của độc tố ruột không chịu
nhiệt của Escherichia coli, và gần đây, các gen elta và elfB của E.coli sinh độc tố
ruột (Enterofoxigenic Escherichia Coli_ ETEC); vt1 và vt2 của E. coli gây chảy
máu đường ruột (Enterohemorrhagic Escherichia coli_EHEC); eaeA và bfpA của
E. côli gây bệnh đường ruột (Enteropathogenic Escherichia coli_ EPEC); ial của
E.coli xâm nhập đường ruột (Enteroinvasive Escherichia coli_EIEC) và Shigella đã
được khuyếch đại bằng PCR nhằm chẩn đoán phân biệt giữa các loại Escherichia
coli gây tiêu chảy.
- Xác định vi khuẩn ngoài môi trường: các vi khuẩn khó nuôi cấy và / hoặc
thường có mặt ngoài môi trường có thể được tìm trực tiếp bằng PCR, như các
Legionella, Salmonella, Shigella và Vibrio cholerae.
Nói tóm lại, dùng PCR để tìm tác nhân gây bệnh đã được áp dụng rất rộng rãi.

PCR có lợi thế lớn là nhanh (thời gian cần thiết cho chẩn đoán tính bằng "giờ" so
với các kỹ thuật kinh điển phải tính bằng "ngày"), nhạy (độ nhạy rất cao, chỉ cần từ
10 - 1000 tế bào vi khuẩn, tuỳ theo kỹ thuật, là đủ) và độ đặc hiệu cũng rất cao.
Nhờ vậy, bệnh được chẩn đoán nhanh hơn và chính xác hơn.
Giá trị chẩn đoán bệnh của PCR đặc biệt trong những trường hợp vi sinh vật
không nuôi cấy được hoặc nuôi cấy rất khó khǎn, tốn kém; hoặc kết quả nuôi cấy
rất chậm, hoặc ở những bệnh nhân đã dùng kháng sinh trước khi vào viện, vì rằng
PCR không nhất thiết đòi hỏi phải có vi sinh vật sống. Tuy vậy, cho đến nay, do
những điểm hạn chế của nó (như đòi hỏi phải có trang thiết bị và nguyên vật liệu
- 23 -
GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh
riêng, đắt tiền; cán bộ kỹ thuật phải có trình độ nhất định; kỹ thuật thực hiện còn
phức tạp), PCR chỉ bổ sung chứ không thay thế hẳn được phương pháp chẩn đoán
kinh điển khác.
(2) PCR đa mồi (multiplex-PCR) trong chẩn đoán phân tử xác định và phân
biệt ký sinh trùng
Đối với ký sinh trùng, cho đến nay đã có hàng chục phương pháp và kit
chẩn đoán multiplex-PCR sử dụng phát hiện nhiều loài gây bệnh. Khi ký sinh trùng
cùng tồn tại ở một vị trí, một vùng trong cơ quan của cơ thể (ví dụ: cùng ở trong
máu, cùng ở trong đường ruột/khoang ruột, cùng ở trong phổi/dịch phổi, hoặc
metacercariae cùng ở trong một vật chủ trung gian), thì việc cùng lúc phát hiện và
phân biệt được nhiều loài gây bệnh mang lại tính kinh tế và lợi ích cao hơn nhiều
so với thực hiện đơn lẻ (Edwards, Gibbs, 1994; De Lellis et al., 2008). Multiplex-
PCR đã được xây dựng để ứng dụng chẩn đoán phân biệt các loài sán lá/sán dây,
bao gồm sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis and Opisthorchis viverrini (Le et al.,
2006); sán lá gan lớn F. hepatica từ ốc vật chủ trung gian (Magalhães et al., 2004;
2008); sán lá phổi Paragonimus spp (Sugiyama et al., 2006; Le et al., 2006); sán
dây Taenia saginata, Taenia solium, Taenia saginata asiatica và ấu trùng sán lợn
(González et al., 2000; 2004; Yamasaki et al., 2004; Trachsel et al., 2007); sán chó
Echinococcus multilocularis (Davidson et al., 2009). Multiplex-PCR cũng được sử

dụng phát hiện và phân biệt các loại giun tròn (nematode) trong đó có Trichinella
và nematode đường ruột (Zarlenga et al., 1999; 2001a,b); phân biệt Ancylostoma
duodenale, Necator americanus, Oesophagostomum bifurcum (Verweij et al.,
2007) hoặc các loài Oesophagostomum spp ở lợn (Lin et al., 2008); phát hiện và
phân biệt Brugia malayi và Wuchereria bancrofti với nhau (Mishra et al., 2007) và
với ký sinh trùng sốt rét (Rao et al., 2009);
Multiplex-PCR tỏ ra sử dụng rất hữu hiệu chẩn đoán phân biệt nhiều nhóm ký
sinh trùng đơn bào (protozoa), chủ yếu tập trung vào nhóm ký sinh trùng đơn bào
đường ruột như Cryptosporidium và Giardia (Patel et al., 1999; Gile et al., 2002;
- 24 -
GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh
Guy et al., 2003); Cyclospora và Eimeria (Orlandi et al., 2003; Fernandez et al.,
2003); đặc biệt là ký sinh trùng đơn bào máu, chủ yếu tập trung ký sinh trùng sốt
rét Plasmodium spp, trước hết là phân biệt 4 loài gây bệnh, chủ yếu ở người, đó là
Plasmodium falciparum, P. vivax, P. malariae, P. ovale, theo từng nhóm hoặc cả 4
loại từ máu (Padley et al., 2003; Patsoula et al., 2003; Rougemont et al., 2004;
Veiga et al., 2006; Rao et al., 2009); hoặc từ vector là muỗi Anopheles (Lardeux et
al., 2008). Một loại ký sinh trùng khác thường có trong máu là Leishmania spp
cũng được chẩn đoán phân biệt bằng multiplex-PCR từ máu, dưới da hay từ nguồn
truyền lây vector là loài muỗi cát Lutzomyia (Harris et al., 1999; Jorquera et al.,
2005; Rodríguez-González et al., 2007; de Pita-Pereira et al., 2008) hayký sinh
trùng đường máu lê dạng trùngBabesia caballi và Babesia equi ở động vật
(Alhassan et al., 2005) hoặc các loài đơn bào máu khác cũng được phát hiện bằng
multiplex-PCR trong đó có Toxoplasma gondii (Ajzenberg et al., 2005;
Nowakowska et al., 2006).
Multiplex-PCR còn được ứng dụng chẩn đoán lỵ amíp do khả năng phát hiện
nhanh, chính xác phân biệt các loài gây bệnh với nhiều loài khác có hình thái tương
tự, trước hết là Entamoeba histolytica và Entamoeba dispar từ phân người bệnh
(Evangelopoulos et al., 2000; Haque et al., 2007; Khairnar, Parija, 2007). Về vùng
gen đích chọn lựa sử dụng chẩn đoán, nhiều tác giả khai thác hệ gen nhân tế bào

trong đó hướng tới đối tượng gen 18S rRNA phân biệt cầu trùng Eimeriavới
Cyclospora(Orlandi et al., 2003), giám định và phân biệt các loài Cryptosporidium
(Patel et al., 1999), phát hiện các loài ký sinh trùng sốt rét Plasmodium
(Rougemont et al., 2004); hay đối tượng là gen pfcrt, pfmdr1, pfdhfr ở ký sinh
trùng sốt rét (Veiga et al., 2006) và nhiều vùng gen hay vùng giao gen khác. Nhiều
công trìnhkhai thác đích là hệ gen ty thể (mitochondrial genome), ví dụ chẩn đoán
phân biệt sán dây Taenia spp (Trachsel et al., 2007; Yamasaki et al., 2004; 2006);
sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis và Opisthorchis viverrini (Le et al., 2006); sán
- 25 -