Sàng lọc, tinh sạch và bước đầu nghiên cứu chất kháng viêm từ thực vật sử dụng thụ thể Toll-like 4 (TLR4

Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, khích lệ, động
viên của các Thầy, Cô, đồng nghiệp, bạn bè và những người thân trong gia đình. Qua đây, tôi xin
được gửi lời cảm ơn sâu sắc của mình đến những cá nhân và tập thế đã hết lòng giúp đỡ để tôi có
thể hoàn thành luận văn này.
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị Mai Phương, người thầy đã
trực tiếp hướng dẫn cho tôi, luôn chỉ bảo tận tình đế tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ nghiên cứu của phòng Hóa sinh Thực vật, Viện Công
nghệ Sinh học, đã giúp tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS. Đặng Ngọc Quang, TS. Trịnh Tất Cường, các anh
chị nghiên cứu sinh, các bạn cao học và các em sinh viên trực thuộc phòng thí nghiệm bộ môn Hóa
hữu cơ, thuộc khoa Hóa học, trường ĐHSP Hà Nội và phòng thí nghiệm Trọng Điếm Công nghệ
Enzyme và Protein, trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên đã nhiệt tình dạy bảo, giúp đỡ và tạo điều kiện
thuận lợi nhất để tôi hoàn thành bản luận văn này.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình thân yêu, bạn bè và đồng nghiệp - những người đã luôn
luôn ở bên tôi, luôn động viên, khích lệ và là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong suốt quá trình học tập
và nghiên cứu.
Hà Nội, ngày 20 thảng 06 nẵm 2013 Học viên
Dương Thị Nụ
LỜI CẢM ƠN
Luận văn của tôi đã được thực hiện theo đề tài: "Xây dựng và hoàn thiện mô
hình sàng lọc hoạt tính kháng viêm mới thông qua các thụ thể glucocorticoid và họ
thụ thể toll-like trên tế bào macrophage của động vật thí nghiệm" thuộc Viện Hàn
lâm Khoa Học & Công Nghệ Việt Nam, mã số VAST03/11-13 do TS. Nguyễn Thị
Mai Phương làm chủ nhiệm.
Tôi xin cam đoan rằng các số liệu và kết quả nghiên cún trong luận văn tốt
nghiệp của tôi là trung thực và không trùng lặp với các đề tài khác. Tôi cũng xin cam
đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các
thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày 20 tháng 06 năm 2013 Hộc viên
Dương Thị Nụ
Trang phụ bìa Lời cảm ơn Lời

cam đoan Mục lục
Danh mục các thuật ngữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
LỜI CAM ĐOAN
3.1.2. Gây cảm ứng viêm trên dòng tế bào macrophage chuột sử
Bảng 2.1. Danh sách các dịch chiết thực vật được lựa chọn cho nghiên
ASP Aspirin
BMDM Bone marrow derived macrophage
cox
Cyclo - oxygenase
DMSO Dimethyl sulfoxide
ELISA Enzyme - Linked Immuno Sorbent Assay
GC Glucocorticoid
GR Glucocorticoid receptor
HPLC High performed liquid chromatography
IL Interleukin
kDa Kilo dalton
LPS Lipopolysaccharide
MAPK Mitogen activated protein kinase
NF-&B Nuclear factor kappa, light chain enhancer of activated B cell
NMR Nuclear magnetic resonance
NSAID Non - steroidal anti - inflammatory drug
OD Optical density
PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis
SDS Sodium dodecyl sulphate
TLC Thin layer chromatography (Sac kí bản mỏng)
TLR Toll - like receptor
TNFa Tumor Necrosis Factor alpha

MỞ ĐÀU
1. Lý do chon đề tài
Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng và ẩm nên khả năng mắc
các bệnh nhiễm trùng nặng và choáng khuẩn do viêm rất cao. Cho đến nay, viêm nặng
và choáng do viêm vẫn là một trong các nguyên nhân chính của những ca tử vong ở
các bệnh nhân cần chăm sóc đặc biệt. Các trường họp này vẫn tiếp tục gia tăng rộng
khắp cả trên thế giới và Việt Nam. Trong nhiều trường hợp, quá trình bị viêm kéo dài
mà không được điều trị kịp thời còn dẫn đến những bệnh mãn tính nguy hiếm như tim
mạch, tiếu đường, thấp khớp
Việt Nam cũng là nước có nguồn tài nguyên sinh vật rất phong phú, đặc biệt về
thực vật. Theo thống kê của Viện Dược liệu thì tính đến năm 2000, nước ta có gần
4000 loài thực vật, 22 loài tảo và trên 33 loài động vật được dùng làm thuốc ở các
mức độ khác nhau, đó là chưa kế đến nhiều loài tảo biển và động vật biển cũng có thể
được dùng làm thuốc [6]. Các số liệu trên đây cho thấy tiềm năng to lớn của nguồn
dược liệu Việt Nam có thể sử dụng trong các nghiên cứu sàng lọc đê tìm ra nhũng
chât có hoạt tính dược học quý hiêm, trong đó có các chất kháng viêm mới có hiệu
quả cao mà không gây ra các phản ứng phụ. Tuy vậy, có thể nói các nghiên cún khoa
học một cách có hệ thống và chi tiết về điều tra, khai thác, đánh giá tác dụng và sử
dụng các chất hoạt tính sinh học từ nguồn tài nguyên sinh vật trong nước để phát triển
thành các sản phẩm thuốc mới, phục vụ cho bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cộng đồng
vẫn còn rất hạn chế.
Trong lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng các chất kháng viêm ở Việt Nam, hiện
nay chưa có nhiều các nghiên cún sâu cũng như chưa có các hệ thống và mô hình
nghiên cứu hiện đại về quá trình viêm và tác dụng của chất kháng viêm. Đây chính là
cơ sở để phát triển các sản phẩm thuốc có thể thương mại được trên thị trường Việt
Nam và quốc tế. Các nghiên cún về viêm mới chỉ dừng ở mức tạo được mô hình gây
viêm thực nghiệm in vivo cổ điển. Ngoài ra, đánh giá tác dụng kháng viêm cũng chủ
yếu được thực hiện với các cao chiết thô của thực vật. Đó cũng là nguyên nhân tại sao
có rất ít nhũng chất kháng viêm mới được phát hiện và úng dụng ở Việt Nam. Như

vậy, chúng ta còn thiếu các nghiên cứu hiện đại với các mô hình gây viêm hay nghiên
6
cứu cơ chế kháng viêm thông qua đánh giá ảnh hưởng của chất nghiên cún lên các thụ
thể như TLR, GC, mức độ giải phóng các chất trung gian được tiết ra trong quá trình
tiền viêm và viêm, các tín hiệu gây viêm đặc hiệu. Đặc biệt, cho đến nay chúng ta
chưa có mô hình sàng lọc in vitro cho phép sàng lọc nhanh và hiệu quả các chất
kháng viêm mới từ các nguồn nguyên liệu khác nhau.
Đe góp phần giải quyết những tồn tại nêu trên, chúng tôi đã tiến hành thực
hiện đề tài “Sàng lọc, tinh sạch và bưó’c đầu nghiên cứu chất kháng viêm từ thực
vật sử dụng thụ thể Toll-like 4 (TLR4)” với mục tiêu trước mắt là xây dựng được
một mô hình sàng lọc in vỉtro các chất kháng viêm mới và bước đâu nghiên cứu tác
dụng kháng viêm củã chât tinh sạch từ dịch chiêt tiêm năng. Mục tiêu lâu dài của
nghiên cứu này là phát hiện và định hướng ứng dụng các chất kháng viêm từ nguồn
dược liệu Việt Nam để phát triển sản phẩm thuốc kháng viêm mới, có chất lượng tốt
dùng điều trị bệnh cho con người.
2. Mục đích nghiên cửu
Sàng lọc, tinh sạch và bước đầu nghiên cứu chất kháng viêm từ thực vật sử
dụng thụ thể Toll-like 4 (TLR4) trên màng tế bào macrophage chuột.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Chuẩn bị các dịch chiết thực vật trong dung môi hữu cơ.
- Xây dựng mô hình sàng lọc in vitro chất kháng viêm sử dụng thụ thể
TLR4.
- Sàng lọc các dịch chiết thực vật có khả năng kháng viêm sử dụng mô hình sàng lọc ỉn
vỉtro đã xây dựng được.
- Tinh sạch chất kháng viêm tù’ dịch chiết thực vật tiềm năng.
- Bước đầu nghiên cún cơ chế kháng viêm của chất tinh sạch được thông qua việc: i)
xác định hoạt tính biểu hiện của các cytokine tiền viêm và kháng viêm gồm: IFNy,
IL6, TNFa và IL10; ii) mức độ biểu hiện của protein P-p38 liên quan đến con đường
tín hiệu MAPK.
4. Đóng góp mói của đề tài

Xây dựng được một mô hình nghiên cứu và sàng lọc các chất
kháng viêm in vỉtro thông qua thụ thể TLR4 và bước đầu đánh
giá được cơ chế tác dụng của chất sàng lọc được.
7
NỘI DƯNG CHƯƠNG 1. TỐNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Khái niệm về viêm
Viêm (inflammation) là kết quả có tính qui luật của các tác nhân gây viêm xuất
hiện trong cơ thế, là quá trình phức hợp giữa điều hòa và phản ứng. Quá trình này xảy
ra ở bộ máy liên kết và vi mạch, gây ra những rối loạn chủ yếu về hóa tổ chức và tính
thấm thành mạch, dẫn đến các hiện tượng thoát huyết tương, xuyên bạch cầu, tăng
sinh tế bào tại 0 viêm và hiện tượng thực bào, gây ra 4 triệu chứng điển hình là sưng
(tumor), nóng (calor), đỏ (rubor) và đau (dolor).
Những thay đổi về hình thái và sinh hóa gặp trong quá trình viêm diễn biến
theo quy luật. Mặc dù mức độ và thời gian của các giai đoạn viêm có thể thay đổi,
nhưng quá trình viêm thường diễn biến qua 3 giai đoạn: giai đoạn tổn thương tổ chức,
giai đoạn rối loạn vận mạch và thoát dịch rỉ viêm, giai đoạn tăng sinh tổ chức để hàn
gắn tổn thương.
Nguyên nhân gây viêm rất nhiều và phức tạp, có thế chia làm 2 loại:
- Nguyên nhân ngoại sinh', do nhiễm vi sinh vật (vi khuẩn, virus, một số loại nấm, các
vi sinh vật đơn bào, kí sinh trùng và côn trùng), các yếu tố hóa học (hóa chat acid,
baze, thuốc ), các yếu tố cơ học (chấn thương, áp lực, ma sát, dị vật ), các yếu tố
vật lý (nhiệt, tia phóng xạ, bức xạ ).
- Nguyên nhân nội sinh: do các sản phẩm chuyển hóa (ure máu tăng gây viêm màng
phổi, màng tim hay acid uric trong máu tăng gây viêm khớp trong bệnh goutte), do
hoại tủ’ kín gây viêm vô trùng (hoại tô chỏm xương đùi), do phản ứng tự miễn (bệnh
thấp khớp, viêm cầu thận), hay do viêm xung quanh tổ chức ung thư
Trong thực tế, hai loại nguyên nhân này thường kết họp với nhau. Cường độ,
tính chất của viêm cũng thay đổi tùy theo đặc điểm của nhân tố bệnh lí, điều kiện
phát sinh và tính phản ứng của cơ thế do đó biếu hiện lâm sàng của các trường hợp
viêm có thể thay đổi khác nhau.

Khi phản úng viêm xảy ra, nhiều loại tế bào sẽ được hoạt hóa và tập trung đến
0 viêm như các loại tế bào di chuyển (migrating cells) gồm: bạch cầu đơn nhân, đa
nhân, các tế bào limpho, tiểu cầu, tế bào nội mạc Các tế bào này giải phóng ra hàng
loạt các chất trung gian, phần lớn là các chất prostaglandins (PG), leukotrienes (LT),
8
histamine, bradykinin, nhân tố hoạt hóa tiểu cầu (PAF) và interleukin-1. Các chất này
lại tiếp tục hoạt hóa các tế bào khác làm giải phóng ra hàng loạt các enzyme "dọn
dẹp" chủ yếu phân giải protein như các proteaza, interleukin, cytokine, superoxide,
hydroperoxide gây ra ton thương mô, qua đó khép kín quá trình viêm mạn tính.
Quá trình tiết ra của các chất trung gian như trên làm tăng dòng chảy của máu tới
những vùng xâm nhập và dẫn tới hiện tượng đỏ, nóng. Một vài chất tiết ra làm hẹp
dòng chảy của máu dẫn tới bị sưng. Khi quá trình viêm kéo dài sẽ dẫn tới hiệu quả
tích lũy và trạng thái mât cân băng dỡ quá trình viêm chiêm ưu thê hơn quá trình
kháng viêm và quá trình đông tụ chiếm ưu thế hơn quá trình phân giải tơ huyết
(fibrin). Quá trình nghẽn mạch, thiếu máu cục bộ, các mô bị tốn thương sẽ là hậu quả
tiếp sau dẫn tới viêm nặng và choáng do viêm, mất chức năng của đa cơ quan và tử
vong [35].
1.2. Các chất kháng viêm
Các chất kháng viêm không đảo ngược được quá trình viêm mà chỉ làm giới
hạn hoặc chậm quá trình này bằng cách ức chế việc sản xuất các chất trung gian gây
viêm như các cytokines Các chất kháng viêm được phân loại thành 3 nhóm chính
gồm:
1.2.1. Các chất kháng viêm không có bản chất steroid (NSAID)
Chất kháng viêm không có bản chat steroid (non-steroidal antiinflammatory
drug - NSAID) là loại chat có tác dụng hạ sốt, giảm đau, kháng viêm không có cấu
trúc steroid. Những chất tiêu biểu của nhóm này gồm có aspirin, ibuprofen,
diclofenac, và naproxen đã được điều chế thành thuốc và sử dụng rộng rãi trong điều
trị từ lâu. Đặc điểm kháng viêm của NSAID là tác dụng lên hầu hết các loại viêm
không kể nguyên nhân, chỉ ở liều lượng cao mới có tác dụng kháng viêm và những
chất này có tác dụng lên thời kì đầu của quá trình viêm.

Cơ chế kháng viêm của các nhóm NSAID khác nhau thì khác nhau nhưng có
tác dụng kháng viêm chung là ức chế sinh tổng hợp prostaglandin (PG) do ức chế
men cyclo-oxygenase (COX) làm giảm tổng họp PG, làm bền vững màng lysosome
do đó hạn chế giải phóng các enzyme của lysosome trong quá trình thực bào, nên có
tác dụng kháng viêm. Ngoài ra NSAID còn ức chế các chất trung gian hóa học của
9
quá trình viêm như các kinin huyết tương, ức chế cơ chất của enzyme, ức chế sự di
chuyển của bạch cầu, ức chế phản ứng kháiĩg nguyên - kháng thê. Riêng salicylate,
một chât kháng viêm thuộc nhóm này ngoài những tác dụng trên còn làm tăng giải
phóng steroid nên làm tăng tác dụng kháng viêm.
Ngoài tác dụng kháng viêm, hạ sốt, giảm đau, chống ngưng kết tiểu cầu
NSAID còn có tác dụng phụ như làm rối loạn dạ dày - ruột. Do NSAID ức chế tổng
hợp PG nên tạo điều kiện cho HC1 và pepsin của dịch vị gây tổn thương cho niêm
mạc dạ dày khi hàng rào bảo vệ bị suy yếu. Ngoài ra, các NSAID còn tác động trực
tiếp hủy hoại các tế bào biểu mô tiêu hóa do phần lớn chúng đều là những acid. Các
NSAID còn ức chế sự phân chia của tế bào biểu mô đường tiêu hóa làm thay đổi lưu
lượng máu tới các cơ quan tiêu hóa, làm giảm thiểu các lóp chất cung cấp năng lượng
trong các tế bào niêm mạc và hoạt hóa men 5-lipoxygenase làm tăng các leukotrien -
là chất gây hủy hoại tế bào biểu mô của hệ tiêu hóa - gây thủng 0 loét. Vì vậy khi
nghiên cứu tác dụng kháng viêm của NSAID cần phải chú ý tới tác dụng phụ của
chúng.
1.2.2. Các chất kháng viêm có bản chất steroid
Steroid là các họp chất chất béo hữu cơ hòa tan có nguồn gốc tụ’ nhiên hoặc
tổng hợp, có công thức từ 17 nguyên tử cacbon sắp xếp thành 4 vòng và bao gồm cả
các sterol và axit mật, thượng thận, và kích thích tố giới tính.
Các chất kháng viêm có bản chat steroid tiêu biếu là nhóm chất corticoid (hay
còn gọi là glucocorticoid). Các chất thuộc nhóm glucocorticoid thường gặp như
dexamethasone, prednisone, prednisolone, hydrocortisone, triamcinolone hoặc xuất
hiện sau này như beclomethasone, betamethasone, flunisolide. Glucocorticoid chống
lại các biểu hiện của quá trình viêm, dị úng dù do bất kỳ nguyên nhân gì (cơ học, hóa

học, nhiễm khuẩn, tia xạ, miễn dịch). Sở dĩ nó có được tác dụng đó là do
glucocorticoid làm giảm tác dụng hoặc ức chế các chất trung gian gây viêm như các
cytokin (interleukin, TMF, GM-CSF), ecosanoid (prostaglandin, leukotrien) giảm
phóng thích histamin từ tê bàõ mast; làm giảm sự tập trung của bạch câu tại ô viêm
như neutrophil, đại thực bào và giảm cả hoạt tính của các bạch cầu này.
Glucocorticoid còn làm giảm chức năng của nguyên bào sợi, do đó làm giảm sản xuất
1
collagen và glycosaminglycan dẫn đến làm giảm sự hình thành mô liên kết. Điều này
góp phần ức chế quá trình viêm mạn tính nhưng cũng làm chậm lành vết thương.
Ngoài ra glucocorticoid làm giảm số lượng bạch cầu lympho, ức chế chức năng thực
bào, ức chế sản xuất kháng thế và các thành phần bố thế, ức chế giải phóng và tác
dụng của các enzyme tiểu thể, ức chế hóa hướng động và sự di chuyến của bạch cầu
do đó nó có tác dụng ức chế miễn dịch. Nhưng điều đó làm mất đi đáp ứng viêm có
tính chất bảo vệ, làm giảm khả năng đề kháng nên dễ nhiễm khuẩn, nhiễm nấm.
1.2.3. Các chất khác
Thuộc về nhóm này có vàng và colchicin. Colchicin làm giảm sự di chuyển của
bạch cầu, ức chế úng động học, chuyển hóa và chức năng của bạch cầu đa nhân nên
làm giảm các phản ứng viêm. Colchicin ức chế sự hình thành tinh thể urate trong
khóp của bệnh nhân goutte thông qua việc làm giảm tiết các chất chemotaxis của bạch
cầu đa nhân và giải phóng enzyme lysosome. Colchicin có tác dụng ức chế đặc hiệu
sự giải phóng một glycoprotein có trọng lượng phân tử 8400 Da. Đây là một chất
chemotaxis của bạch cầu đa nhân đối với các bạch cầu trung tính và monocyte có khả
năng thực bào các thể urate [42].
1.3. Khái niệm về thụ thể
1.3.1. Thụ thể và phân loại
Thụ thể là những protein biệt hóa để tiếp nhận các phân tử hóa học nội sinh
(ligand) hay ngoại sinh (thuốc, độc chất). Có hai loại thụ thể gồm:
- Thụ thể hướng ion (ionotropic receptor): hoạt hóa một kênh ion không chọn lọc.
- Thụ thê hướng chuyên hóa (íĩĩẽtãbotrõpic receptor): khởi động một chuỗi phản ứng
hóa học để tạo ra một hay nhiều hiệu quả sinh học.

1.3.2. Các thụ thể trong đáp ứng viêm
L3.2.1. Thụ thể Dectin-1
1
Dectin-1 là một protein màng type 2 có trọng lượng 28 kDa. Thụ thể này có
một màng type 2 kết hợp với 1 vùng lectin-type c và 1 vùng tế bào chất, trong đó có 1
thụ thế miễn dịch sinh học tyrosine có công thức C
6
H
9
(N03). Thụ thể Dectin-1 được
biểu hiện trên các dòng tế bào monocyte, macrophage, tế bào trung tính và tế bào tua.
Dectin-1 được chứng minh có vai trò quan trọng trong nhận dạng nấm, đặc biệt là các
thành phần giàu P-glucan [40]. Khi thụ thể Dectin-1 liên kết với phối tử đặc hiệu sẽ
truyền tín hiệu vàonhân tế bào và dẫn tới sản sinh ra cytokine, chemokine, quá trình
oxy hóa (ROS) và quá trình nitơ hóa (RNS) kích thích tăng cường khả năng thực bào
của cơ thể [4040]. Nhiều nghiên cứu đã công bố vai trò của Dectin-1 trong quá trình
sản xuất cytokine tiền viêm đế ức chế sự phát triến của Mycobacterium tuberculosis
[25].
Dựa vào những tín hiệu của thụ thế Dectin-1, một số hợp chất tách chiết từ
thực vật đã được chứng minh có khả năng điều hòa được đáp ứng viêm và điều trị
hiệu quả chuột bị nhiễm trùng nặng và choáng nhiễm trùng. Chẳng hạn, các chất tách
chiết từ nhân sâm Hàn Quốc như Rbl, Rb2, Rc, hợp chất K (C-K) đã được công bố có
khả năng điều hòa các tín hiệu viêm như cytokine, quá trình phospho hóa yếu tố tự
phân bào (MAPK - mitogen activated protein kinase), phản ứng tạo gốc tự do (ROS)
thông qua tín hiệu của thụ thể Dectin-1 [15].
1
Hình 1.1. Cơ chế hoạt động của thụ thể Dectin-1 [50]
/ A \ e A s r * \ / A \
Macrophages Respiratory burst ? TNF Phagocytosis and
TNF production

Dendritic cells IL-10 productionIL-2 production TNFandlL-12 TNF
production
and phagocytosis production
1
I.3.2.2. Thụ thể họ toll -like (TLR)
1
Đáp ứng ban đầu hay đáp ứng viêm bẩm sinh với quá trình viêm gây ra bởi các
mầm bệnh là đáp ứng không đặc hiệu của quá trình bảo vệ vật chủ. Năm 1996, Toll
đã phát hiện ra protein của ruồi dấm Drosophila và nhận thấy rang protein này không
chỉ cần thiết cho sự phát triển phôi đối với ruồi mà còn đáp ứng hiệu quả chống lại
nấm [27]. Từ khám phá này, các nghiên cứu đã phát hiện và hiểu rõ được chức năng
của các protein có tên gọi toll trong quá trình đáp ứng miễn dịch bẩm sinh. Ở chuột
có 12 loại thụ thể toll gọi là toll like receptors (TLR) được phân loại thành TLR1 -
TLR12, ở người thì chỉ có 11 loại TLR. TLR là protein màng loại I được biểu hiện
trong các tế bào miễn dịch tham gia đáp ứng ở giai đoạn đầu tiên của vật chủ với
mầm bệnh bao gồm các đại thực bào (macrophage), tế bào tua, tế bào da và bạch cầu
trung tính. Lớp thụ thế này được gọi là các thụ thế nhận dạng mầm bệnh (PRR).
Chúng có khả năng nhận dạng rất phong phú từ protozoa tới vi khuẩn, nấm và virut.
Đây là các thụ thế nhận biết quan trọng nhất của các sản phấm của vi sinh vật. Các
vùng ngoại bào của TLR có chứa các motif giàu leucin (LRR) lặp đi lặp lại tậo dạng
đê ngựâ có thê nhận biêt các LPS củâ vi khuân gram (-), peptidoglican của vi khuẩn
gram (+), các lipoprotein, lipopeotide, roi (flagella) của vi khuẩn. TLR phát hiện
các mầm bệnh bằng liên kết với các phân tử mẫu ở vi sinh vật (PAMPs). Lớp thụ thế
này sau khi nhận dạng ra mầm bệnh sẽ truyền tín hiệu vào bên trong tế bào. Khi đã
nhận biết được, các LRR của TLR khơi mào hàng loạt các chuỗi chuyển hóa, ví dụ
LPS hoạt hóa TLR4, oligoderoxynucleotide vi khuẩn hoạt hóa TLR9 và kích thích
sản xuất các cytokine, chemokine tiền viêm và kháng viêm, interferon, quá trình
phosphoryl hóa các yếu tố tự phân bào protein kinase (mitogen - activated protein
kinases- MAPKs), hay phản úng oxy hóa [29]. Bên cạnh đó, TLR còn tham gia vào
quá trình kích thích ban đầu các lóp tín hiệu trong tế bào để pháttriển miễn dịch đáp

ứng nên được xem như là các thành viên kích thích viêm. Trong số này, TLR4 tham
gia hoạt động trong hệ thống miễn dịch cảm ứng bằng lipopolyscharide vi khuẩn
(LPS) thông qua nhận dạng đặc hiệu những phân tủ’ ngoại độc to (lipid A). Đây là
một yếu tố cơ bản trong đáp ứng miễn dịch với vi khuấn gram âm. Quá trình hoạt
động đầy đủ của TLR truyền tín hiệu đòi hỏi sự họp tác hoạt động của một vài
adapter tín hiệu, bao gồm MyD88 (myeloid differentiation primary response protein
1
88) và những adaptor của MyD88, chẳng hạn như các tín hiệu của TLR2 phụ thuộc
hoàn toàn vào MyD88 (myeloid differentiation primary response protein 88), hay
TLR4 phụ thuộc vào giai đoạn protein có chứa MyD88/TIR (TIRAP) hoặc đoạn thụ
thể toll/IL-1 có chứa một adapter kích thích sinh interferon (TRAM) để tạo ra những
đáp ứng phân biệt [30].
TLR2, TLR9
Hình 1.2. Cơ chế hoạt động của một số TLR [49]
1
TI
M
IL
0
VMyD8
8
p
01
VMy
Đ88
p
TO
LLI
P r
I IRAK

■v
TOLLI
Pị
I
IRA
K
/ \
CTRAF
6# / \
TA
K1
I
MKK6 TAK1
M
K
K
6
ị
[N
\
ị
[Sr.Kẽ
ị
1JN
Tín hiệu TLR không thích họp hoặc không kiếm soát được sẽ làm ảnh hưởng
xấu tới sinh lý mầm bệnh của nhiều bệnh bao gồm: bệnh nhiễm trùng, các bệnh viêm
loét đại tràng, hội chứng mẫn cảm miễn dịch hay bệnh hủi. Nhiễm trùng có thể được
định nghĩa như những điều kiện lâm sàng gây ra bởi đáp ứng miễn dịch của bệnh
nhân với quá trình nhiễm trùng, được đặc trưng bởi viêm hệ thống và có quá trình
đông tụ [14]. Các nỗ lực nhằm điều trị kháng viêm (kháng LPS, kháng cytokine) và

kháng đông tụ trong nhiều năm qua đều không mang lại hiệu quả bởi lẽ các liệu pháp
này bị giới hạn bởi tính kháng nhiễm và việc chăm sóc hỗ trợ không được xử lí dưới
góc độ mầm bệnh về mặt sinh lí học. Các nghiên cún chuẩn đoán cho thấy nhiễm
trùng gram âm chiếm khoảng 60% trong tổng số các trường hợp và LPS là chất
truyền đi ban đầu kích thích đáp ứng tăng cường viêm thông qua hệ thống miễn dịch.
Ngoài ra, Bhattacheriee và Akira cũng chúng minh được TLR là thụ thể nhận dạng
đặc hiệu LPS với bằng chứng là các vi khuẩn đột biến LPS không bộc lộ hoặc các
động vật thiếu TLR4 không phát triến choáng nhiễm khuấn trong quá trình đáp ứng
với LPS [10]. với phát hiện này, các nhà nghiên cứu hy vọng răng việc điêu trị bệnh
nhiêm trùng vi khuân có thê được cải thiện nhờ cách can thiệp vào con đường tín
hiệu TLR, cụ thể là TLR4 (Hình 1.3). Chất ức chế phân tủ’ liên kết vói TLR4 là MD-
2 được xem như một đại diện chống viêm đã có mặt trong danh sách các thuốc tiềm
năng. Bên cạnh đó, việc phát hiện thấy LPS là phối tô đặc hiệu trong mô hình chuột
gây nhiễm trùng bởi LPS cũng giúp định ra hướng nghiên cứu mới về điều trị
choáng do viêm nặng sử dụng mô hình chuột gây sốc bằng LPS. Đây là hướng
nghiên cứu rất có triển vọng trong việc tìm ra được các chất có khả năng kìm hãm
quá trình sinh ra các yếu tố gây viêm [10]. Chính vì thế, trong số các TLR được phát
hiện thì TLR4 được quan tâm nghiên cún nhiều nhất.
NF-KB
c
Hình 1.3. Cơ chế hoạt động kháng LPS của
TLR4 [46]
ịiiKKỳ
NIC
Dl
JOOOOOOOOOO
OOOOOO
XXDOOOOOOO
OOOOOO
IK

B
NF-KB
xxxxxxx
TLR4 được nhận dạng đầu tiên và chứng
minh chức năng thông qua nghiên cún với chuột
C3H/HeJ và C57BL/10ScCr kháng LPS [29]. Các
nghiên cứu ở chuột đột biến đã chứng minh vai trò
của TLR4 trong quá trình bảo vệ chống lại nội độc
tố trong máu [18]. Chuột bị đột bien TLR4 có tính
nhạy cảm với quá trình nhiễm vi khuẩn gram âm hệ
thống so với đối chứng [43] vì quá trình hoạt động
của TLR4 là rất cần thiết để tạo miễn dịch bảo vệ,
chống lại quá trình viêm cũng như truyền các tín
hiệu viêm nhiễm ngoại độc tố hệ thống một cách
hiệu quả. Hàng loạt các nghiên cứu về các mầm
bệnh vi khuan gram âm bao gồm: Neisseria
menỉngitides, E. coli, Haemophilus influenzae,
Klebsiella pneumoniae, Brucella abortus, s.
pneumoniae và Mycobacteria tuberculosis trên mô
hình chuột bị nhiễm khuẩn đã chứng minh vai trò
quan trọng của TLR4 [37]. TLR4 cũng có thể nhận
dạng được một số loại virus trong quá trình viêm,
bao gồm virus syncytial [23], các retrovirus ở
chuột, virus gây u động vật có vú và gây ung thư
máu ở chuột (murine leukemia vims) [34]. Vai trò
của TLR4 trong các bệnh lây nhiễm, nhiễmtrùng,
quá trình lây nhiễm gram hoặc các vi khuẩn khác
như vi khuẩn lao hay sốt rét [17], [21], [39].
I.3.2.3. Thụ thể glucocorticoid (GR)
Các thụ thể nhận dạng mẫu (pattern

receptors - PRRs) bao gồm các thụ the toll - like,
lectin và dectin-1 chi phối khả năng sống sốt của
vật chủ bằng việc nhận dạng những phân tử mầm
bệnh (pathogen - asociated molecular patterns-
PAMPs) ở vi khuẩn, virut và nấm. Sau khi nhận
dạng mầm bệnh, các thụ thể sẽ truyền tín hiệu vào
tế bào và kích thích tế bào tiết ra các chất trung
gian (mediator) như cytokine, chemokine tiền viêm
và kháng viêm, thậm chí tạo miễn dịch đáp úng ban
đầu [11], [20]. Bên cạnh các thụ thể PRRs như đã
trình bày ở trên, Schăcke và cộng sự đã phát hiện ra
loại thụ thể khác là glucocorticoid có khả năng kìm
hãm các yếu tố sinh ra quá trình viêm bằng cách
liên kết vào acid deoxyribo nucleic (ADN) trong
nhân tế bào [36].
Glucocorticoid (GC) tự nhiên là hormon do
tuyến thượng thận sản xuất, gồm hai chất là
hidrocortison và cortison, có vai trò quan trọng
trong điều hòa chuyến hóa các chat. Glucocorticoid
hoạt động theo cơ chế liên kết với thụ thê
glucocorticoid (GR). Thụ thê glucocorticoid (GR)
là một thành viên của siêu họ thụ thể trong nhân tế
bào [36]. Thụ the glucocorticoid có thể được phân
chia thành 3 đoạn chính: thứ nhất là đoạn cuối đầu
N kích hoạt phiên mã, thứ 2 là đoạn kết acid
deoxyribo nucleic (ADN) trung tâm và thứ 3 là
đoạn cuối đầu c liên kết với phối tử (ligand) [22].
Các phối tử đặc hiệu liên kết thụ the glucocorticoid
bằng cách xuyên qua màng plasma của tế bào. Khi
thụ thể glucocorticoid đã hoạt động nhờ liên kết với

phối tử đặc hiệu, nó sẽ thay đổi hình dạng và
chuyển tới định vị trên ADN của nhân tế bào và
điều khiển quá trình biểu hiện của gene đích. Ớ
trạng thái chưa gắn kết với phối tử, thụ the
glucocorticoid bất hoạt nằm ở tế bào chất có chứa
các protein shock nhiệt 90, 70, 50. Sau khi liên kết
với phối tử đặc hiệu, thụ the glucocorticoid được
kích hoạt sẽ thay đổi hình dạng, sẽ tách ra khỏi
những protein shock nhiệt và tương tác trự’c tiếp
với các vị trí trên chuỗi ADN trong nhân tế bào bao
gồm các yếu tố phản ứng glucocorticoid
(glucocorticoid response element-GREs) trong
vùng promoter của những gene đích, hoặc những
yếu tố (factor) phiên mã khác thông qua các tương
tác protein với protein, giữa thụ the glucocorticoid
và nhân tố phiên mã AP-1 (activator protein 1) hoặc
giữa thụ the glucocorticoid với tổ hợp protein kiểm
soát phiên mã của ADN là NF
- kB (nuclear factor kappa) (Hình 1.4).
Hình 1.4. Cơ chế hoạt động của thụ thể
Glucocorticoid trong tế bào [48]
o Cortisol
Glucocorticoid thực hiện vai trò cơ bản
trong quá trình điều hòa trạng thái cân bằng nội
sinh của cơ thể sống. Chúng cần thiết để duy trì rất
nhiều hoạt động sinh học quan trọng, chẳng hạn
trạng thái cân bằng nội sinh của trung tâm thần kinh
và hệ thống tim mạch, quá trình phản ứng miễn
dịch và quá trình viêm nhiễm. Glucocorticoid đóng
vai trò như là các chất ức chếmiễn dịch và kháng

viêm đặc trưng không thay thế với nhiều bệnh viêm
nhiễm, mẫn cảm miễn dịch, dị ứng và liên quan đến
quá trình phát triến của tế bào lympho, ví dụ bệnh
thấp khớp Mặc dù glucocorticoid tổng họp có
những đại diện rất tiềm năng về kháng viêm nhưng
khi sử dụng chúng lại sinh ra những phản ứng phụ,
không có lợi cho cơ thể. Đe khắc phục vấn đề này,
cấu trúc của đoạn liên kết với phối tử của thụ thể
glucocorticoid được xác định và cấu trúc của phối
tử được cải biến để làm thay đổi hình dạng cuối
cùng của phức họp thụ the glucocorticoid - phối tử.
Điều này đã đem lại thành công như trong trường
họp các phối tử của thụ thế oestrogen. Phối tử này
giúp thụ thể glucocorticoid vẫn giữ được hoạt tính
kháng viêm nhưng lại giảm đi khả năng gây hiệu
ứng phụ. Hướng nghiên cứu này đã mở ra khả năng
phát triển được nhiều hợp chất kháng viêm hiệu quả
từ các glucocorticoid tổng hợp trong tương lai [13].
Cơ chế kháng viêm của glucocorticoid (Hình
1.5) trong quá trình viêm mạn tính đã được Peter và
cộng sự chứng minh là do nó ức chế quá trình hoạt
động của các yếu tố phiên mã giống như NF- kB và
AP -1 (activator protein - 1) [32]. Theo các tác giả
này thì thụ thê glucocorticoid trong tê bào chât Sãu
khi được kích hoạt bởi glucocorticoid sẽ di chuyển
vào nhân. Ở đây, chúng liên kết với các yếu tố phản
úng glucocorticoid (glucocorticoid response
element - GREs) trong các gene đích đáp ứng
steroid, dẫn tới làm tăng quá trình phiên mã. Tuy
nhiên, thụ the glucocorticoid lại làm giảm quá trình

phiên mã của những gene tham gia vào quá trình
gây viêm và những gene không có vị trí GRE trong
các vùng promoter của chúng. Khi hoạt động, thụ
thể glucocorticoid có thể liên kết với NF- kB đã
được kích hoạt và ngăn cản nó không gắn vào các
vị trí kB ở những gen tham gia vào quá trình viêm.
Quá trình tương tác này có thể xảy ra trong tế bào
chất hoặc trong nhân. Cụ thế, glucocorticoid làm
tăng quá trình phiên mã của gene ỈKBa mã hóa cho
chấtức chế IkBa (NF- kappa- B inhibitor alpha) dẫn
tới quá trình thay đối hình dạng của protein liên kết
với NF- kB. Protein IkBa kích thích quá trình tách
rời của NF- kB trong phức hệ NF- kB dẫn tới NF-
kB bị tách ra khỏi phức hệ này sẽ bị thụ the
glucocorticoid bắt cặp và cản trở liên kết với các
đoạn gene gây viêm. Các kết quả thu được là rất có
giá trị trong việc tìm ra những phối tủ’ của thụ thể
glucocorticoid tổng họp và tự nhiên từ thực vật có
tính kháng viêm ưu việt hơn các thuốc
glucocorticoid đã tìm thấy trước đó. Điều này đã
được khắng định trong việc nghiên cứu của
Schãcke và cộng sự [36]. Sử dụng mô hình sàng lọc
in vitro theo cơ chế hoạt hóa hay ức chế thụ thế
glucocorticoid và mô hình gây viêm in vivo trên
chuột NMRI để theo dõi các phản ứng phụ đặc
trưng của thụ the glucocorticoid cũng như động
dược học (pharmacokinetic) của chất tiềm năng,
các tác giả đã phát hiện thấy chat ZK 245186, một
chất ức chế chọn lọc thụ thế glucocorticoid mới
không có bản chat steroid đang trong giai đoạn thử

nghiệm cho xử lí viêm bề mặt, thể hiện hoạt tính
kháng viêm ưu việt hiện nay.
Hình 1.5. Mô hình CO’ chế kháng viêm của thụ thể glucocorticoid [47]