Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học phân tử của virus lở mồm long móng type o phân lập được tại hà nội năm 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM







NGUYỄN THỊ THẢO






NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ
CỦA VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG TYPE O PHÂN LẬP
ĐƯỢC TẠI HÀ NỘI NĂM 2013






LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI – 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM





NGUYỄN THỊ THẢO


NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ
CỦA VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG TYPE O PHÂN LẬP
ĐƯỢC TẠI HÀ NỘI NĂM 2013

CHUYÊN NGÀNH: THÚ Y
MÃ SỐ: 60.64.01.01






NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. LÊ VĂN PHAN

HÀ NỘI – 2014
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng:
- Các kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa ai
công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác.
- Các thông tin trích dẫn trong luận văn được chỉ dẫn rõ nguồn gốc.
Hà Nội, tháng 10 năm 2014
Tác giả luận văn



Nguyễn Thị Thảo

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page ii

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được đề tài nghiên cứu này, tôi nhận được sự giúp đỡ, chỉ bảo,
hướng dẫn tận tình của các tập thể và cá nhân. Cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn
và cảm ơn chân thành tới:
Ban giám đốc Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam, Ban đào tạo sau Đại học,
Khoa Thú y, các thầy cô giáo bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm đã giúp đỡ, tạo điều
kiện để tôi học tập, tiếp thu nâng cao kiến thức của chương trình học.
Đặc biệt tôi xin tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến Thầy TS. Lê Văn
Phan - Giảng viên khoa Thú y, Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam, đã tận tình chỉ dạy,
hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và viết khóa luận tốt nghiệp.
Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được gửi lời cảm ơn tới gia đình,
người thân cùng bạn bè đã động viên giúp đỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong suốt
quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện đề tài.
Một lần nữa tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn, cảm ơn chân thành nhất tới những
tập thể và cá nhân đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành chương trình học tập./.
Hà Nội, tháng 10 năm 2014
Tác giả luận văn



Nguyễn Thị Thảo

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page iii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC BẢNG v
DANH MỤC HÌNH vi
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
1. Tính cấp thiết của đề tài. 1
2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 2
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Tình hình bệnh LMLM trên thế giới và tại Việt Nam 3
1.1.1. Sơ lược về bệnh lở mồm long móng 3
1.1.2. Lịch sử và địa dư bệnh 3
1.1.3. Tình hình nghiên cứu bệnh LMLM trên thế giới 4
1.1.4. Tình hình nghiên cứu bệnh lở mồm long móng tại Việt Nam 6
1.2. Đặc điểm sinh học phân tử của virus lở mồm long móng 8
1.2.1. Căn bệnh 8
1.2.2. Sự phân bố các chủng virus gây bệnh 11
1.2.3. Dịch tễ học 12
1.2.4. Triệu chứng 14
1.2.5. Bệnh tích 18
1.2.6. Các phương pháp chẩn đoán 19
1.2.7. Phòng bệnh 23
1.2.8. Điều trị 24

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU 26
2.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 26
2.2. Đối tượng nghiên cứu 26
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page iv

2.3. Nội dung nghiên cứu 26
2.4. Nguyên vật liệu 26
2.4.1. Hóa chất 26
2.4.2. Trang thiết bị máy móc 28
2.5 . Phương pháp nghiên cứu 28
2.5.1. Chẩn đoán virus gây bệnh Lở mồm long móng từ mẫu bệnh phẩm 28
2.5.2. Phân lập virus gây bệnh Lở mồm long móng từ mẫu bệnh phẩm 31
2.5.3. Giải trình tự gen VP1 và xây dựng cây phả hệ (phylogenetic tree) 33
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 34
3.1. Kết quả chẩn đoán và định type virus gây bệnh Lở mồm long móng
bằng phương pháp RT-PCR một bước (One-step RT-PCR) 34
3.2. Kết quả phân lập virus Lở mồm long móng type O 36
3.2.1. Kết quả nuôi cấy và duy trì tế bào BHK-21 36
3.2.3 Kết quả chuẩn độ virus LMLM 40
3.3. Kết quả giải trình tự gene mã hoá protein VP1 41
3.4. Kết quả xây dựng cây phả hệ (phylogenetic tree) 50
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 53
Kết luận 53
Kiến nghị 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO 54


Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page v

DANH MỤC BẢNG
STT TÊN BẢNG TRANG
Bảng 1.1: Tổng hợp tình hình dịch bệnh LMLM giai đoạn 1999 -2010
7
Bảng 1.2: Sự phân bố các type virus LMLM trên thế giới 11
Bảng 2.1: Các cặp mồi được sử dụng trong nghiên cứu 30
Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng RT-PCR 30
Bảng 2.3. Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR 30
Bảng 3.1: Thông tin về 6 mẫu bệnh phẩm được sử dụng trong nghiên cứu 34
Bảng 3.2. Kết quả xác định hiệu giá virus (TCID
50
) của các chủng virus LMLM
phân lập được 41
Bảng 3.3. Thông tin một số chủng virus LMLM tham chiếu khác thuộc type O,
Topotype ME-SA ở Việt Nam sử dụng trong nghiên cứu 43
Bảng 3.4. Tỷ lệ tương đồng (%) về gen VP1 của 6 chủng virus LMLMO/VN/HN1/2013,
O/VN/HN2/2013, O/VN/HN3/2013, O/VN/HN4/2013, O/VN/HN5/2013,
và O/VN/HN6/2013 với nhau và với các chủng virus LMLM tham chiếu
khác của Việt Nam 45
Bảng 3.5. Tỷ lệ tương đồng (%) về trình tự amino acid của gen VP1 của 6 chủng
virus LMLMO/VN/HN1/2013, O/VN/HN2/2013, O/VN/HN3/2013,
O/VN/HN4/2013, O/VN/HN5/2013, và O/VN/HN6/2013 với nhau và
với các chủng virus LMLM tham chiếu khác của Việt Nam 46
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page vi

DANH MỤC HÌNH
STT TÊN HÌNH TRANG

Hình 1.1. Bản đồ hiện trạng bệnh LMLM của các nước thành viên chính thức OIE
(theo OIE, 2/2014) 5
Hình 1.2: Hình thái và cấu tạo virus Lở mồm long móng 9
Hình 1.3: Sơ đồ cấu trúc hệ gen của virus LMLM 10
Hình 1.4: Sự phân bố bệnh LMLM trên thế giới tháng 9/2013 12
Hình 1.5: Niêm mạc lưỡi bò bong tróc 15
Hình 1.6: Một số triệu chứng xuất hiện ở trâu, bò 16
Hình 1.7: Một số triệu chứng xuất hiện ở lợn 17
Hình 1.8: một số hình ảnh lở mồm long móng trên dê 18
Hình 1.9: Hình ảnh bệnh tích trâu mắc LMLM 19
Hình 3.1: Kết quả chạy RT-PCR với cặp mồi định tính 1F/1R (Reid và cs., 2000). Sản
phẩm PCR thu được có kích thước theo dự kiến là 328bp; Giếng 1-6: Các
mẫu bệnh phẩm tương ứng với O/VN/HN1/2013, O/VN/HN2/2013,
O/VN/HN3/2013, O/VN/HN4/2013, O/VN/HN5/2013, O/VN/HN6/2013;
M: DNA Marker 100bp (INtRON Biotechnology). 35
Hình 3.2:Kết quả định type virus LMLM bằng phương pháp RT-PCR. Giếng 1 - 6: Các
mẫu bệnh phẩm tương ứng với O/VN/HN1/2013, O/VN/HN2/2013,
O/VN/HN3/2013, O/VN/HN4/2013, O/VN/HN5/2013, O/VN/HN6/2013;
M: DNA Marker 100bp (INtRON Biotechnology) 36
Hình 3.3. Kết quả nuôi cấy tế bào BHK-21 dùng để phân lập virus LMLM 37
Hình 3.4: Gây nhiễm virus Lở mồm long móng lên tế bào BHK-21, đời thứ 1 (sau
24 giờ gây nhiễm virus) 38
Hình 3.5: Gây nhiễm virus Lở mồm long móng lên tế bào BHK-21, đời thứ 2 (sau
24 giờ gây nhiễm virus) 39
Hình 3.6: Gây nhiễm virus Lở mồm long móng lên tế bào BHK-21, đời thứ 3 (sau
24 giờ) 40
Hình 3.7. Hiệu giá virus (TCID
50
) của các chủng virus LMLM phân lập được 41
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page vii

Hình 3.8: Kết quả chạy RT-PCR với cặp mồi VN-VP1F/VN-VP1R (Le và cs.,
2012). Sản phẩm PCR thu được có kích thước theo dự kiến là 821 bp;
Giếng 1 - 6: Các chủng virus LMLM type O tương ứng với
O/VN/HN1/2013, O/VN/HN2/2013, O/VN/HN3/2013,O/VN/HN4/2013,
O/VN/HN5/2013, O/VN/HN6/2013; M: 1 Kb Marker ADN (INtRON
Biotechnology). 42
Hình 3.9. So sánh trình tự gen VP1 của 6 chủng virus LMLM O/VN/HN1/2013,
O/VN/HN2/2013, O/VN/HN3/2013, O/VN/HN4/2013, O/VN/HN5/2013,
và O/VN/HN6/2013 với nhau và với các chủng virus LMLM type O,
topotype ME-SA tham chiếu khác của Việt Nam 47
Hình 3.9 (Tiếp). So sánh trình tự gen VP1 của 6 chủng virus LMLM
O/VN/HN1/2013, O/VN/HN2/2013, O/VN/HN3/2013, O/VN/HN4/2013,
O/VN/HN5/2013, và O/VN/HN6/2013 với nhau và với các chủng virus
LMLM type O, topotype ME-SA tham chiếu khác của Việt Nam 48
Hình 3.10. So sánh trình tự amino acid suy diễn (deduced amino acid) của gen
VP1 của 6 chủng virus LMLM O/VN/HN1/2013, O/VN/HN2/2013,
O/VN/HN3/2013, O/VN/HN4/2013, O/VN/HN5/2013, và
O/VN/HN6/2013 với nhau và với các chủng virus LMLM type O,
topotype ME-SA tham chiếu khác của Việt Nam 49
Hình 3.11. Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ của 6 chủng virus LMLM type O
(O/VN/HN1/2013, O/VN/HN2/2013, O/VN/HN3/2013,
O/VN/HN4/2013, O/VN/HN5/2013, và O/VN/HN6/2013) phân lập tại
Hà Nội với các chủng virus LMLM tham chiếu khác. 51

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page viii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Kí hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt
Aa Amino acid
BHK Baby Hamster Kidney
Bp Base pair Cặp base
Cs Cộng sự
DNA Deoxyribonucleic acid
α-MEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
ELISA Enzyme Linked Imunosorbent Assay
FMD Foot and Mouth Disease Bệnh lở mồm long móng
LMLM Lở mồm long móng
Nt Nucleotide
OIEORF
Office International des
EpizootiesOpen Reading Frame
Khung đọc mở
ORFPCR
Open Reading Frame
Polymerase Chain
Reaction
Khung đọc mở
PCRRNA
Polymerase Chain
ReactionRibonucleic acid

RNART-
PCR
Ribonucleic acidReverse Trancription
Polymerase Chain Reaction

RT-
PCRUTR
Reverse Trancription Polymerase
Chain ReactionUntranslated region
Vùng không mã hóa
UTR Untranslated region Vùng không mã hóa
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 1

ĐẶT VẤN ĐỀ

1. Tính cấp thiết của đề tài.
Việt Nam là một nước với hơn 70% dân số bằng nghề nông nghiệp, ngành
chăn nuôi luôn đóng vai trò quan trọng trong nền kinh tế của đất nước. Trong những
năm gần đây, với chính sách mở cửa của nền kinh tế, ngành chăn nuôi của nước ta
đã và đang dần hòa nhập cùng với sự phát triển của nghành chăn nuôi công nghiệp
thế giới. Nhà Nước, Bộ nông nghiệp đã cho nhập các giống gia súc, gia cầm có
năng suất và chất lượng cao từ các nước có nền chăn nuôi phát triển nhằm mục đích
nâng cao sản lượng, chất lượng sản phẩm.
Theo Tổng Cục Thống Kê tính đến 7/2013 giá trị sản xuất ngành chăn nuôi
(theo giá so sánh 2010) tăng 4,1% so với cùng kỳ năm 2012, tuy nhiên tổng số đàn
trâu của cả nước lại giảm 2,5%, đàn bò giảm 3%, đàn lợn giảm 1,5%, gia cầm giảm
2% so với cùng kỳ năm 2012 mà nguyên nhân chính là do sự đe dọa của dịch bệnh
ngày càng tăng, đặc biệt là bệnh lở mồm long móng (LMLM ).

Bệnh lở mồm long móng (LMLM) được Tổ chức Thú y Thế giới OIE (World
Organisation for Animal Health) coi là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất trong tất
cả những bệnh truyền nhiễm ở gia súc. Sự nguy hiểm của bệnh là do khả năng lây
lan rất nhanh và mạnh. Đến nay theo các tài liệu nghiên cứu, virus gây bệnh LMLM
được chia thành 7 type là O, A, C, SAT1, SAT2, SAT3, và Asia1. Dưới các type là
những biến chủng virus gọi là phân type và hiện nay đã phát hiện hơn 70 phân type
virus. Trong thời gian gần đây, tình hình diễn biến của dịch bệnh LMLM xảy ra ở
các nước trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng ngày càng trở nên phức
tạp và khó kiểm soát.
Trước tình hình nan giải trên, Đảng và Nhà Nước đã đưa ra nhiều biện pháp
như nhập ngoại vaccine từ các nước phát triển Mỹ, Pháp, Đức, Bồ Đào Nha Tuy
vậy, cũng chỉ hạn chế được một phần bởi virus LMLM có khả năng biến chủng rất
cao và mỗi biến chủng đều có “dấu ấn” kháng nguyên riêng của nó.
Thách thức đặt ra cho chúng ta chính là nghiêm cứu loại vaccine phù hợp
với chủng virus lở mồm long móng tại Việt Nam. Để làm được điều đó vấn đề
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 2

đầu tiên là chẩn đoán, định type, phân lập và giải trình tự gen của virus lở mồm
long móng. Xuất phát từ thực tiễn trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu
một số đặc điểm sinh học phân tử của virus lở mồm long móng Type O phân
lập được tại Hà Nội năm 2013”.
2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
- Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR trong chẩn đoán và định type nhanh các chủng
virus LMLM gây bệnh.
- Phân lập virus LMLM trên môi trường tế bào BHK-21.
- Giải mã, phân tích gen VP1 (gen mã hóa cho kháng nguyên capsid của virus
LMLM) của các chủng virus LMLM phân lập được tại Hà Nội năm 2013.
- Xây dựng cây phả hệ (phylogenetic tree) để đánh giá về nguồn gốc tiến hóa, sự
biến đổi di truyền của các chủng virus LMLM phân lập được.

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
- Phương pháp sinh học phân tử RT- PCR là một phương pháp có độ nhạy và độ
đặc hiệu cao, vì vậy việc ứng dụng thành công phương pháp RT-PCR trong
chẩn đoán sẽ giúp cho việc nhận diện được chủng virus gây bệnh được nhanh,
chính xác, giúp đưa ra được biện pháp phòng trị hợp lý, hạn chế thiệt hại trong
chăn nuôi.
- Những thông tin cập nhật về những chủng, biến chủng của virus LMLM đang
lưu hành và gây bệnh trên đàn gia súc sẽ giúp cho việc định hướng, lựa chọn
được chủng virus LMLM thích hợp dùng làm chủng virus sản xuất vaccine
phòng bệnh.




Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tình hình bệnh LMLM trên thế giới và tại Việt Nam
1.1.1. Sơ lược về bệnh lở mồm long móng
Bệnh lở mồm long móng (tiếng Anh: Foot-and-mouth disease, viết
tắt FMD; tiếng Latin: Aphtae epizooticae), là một loại bệnh bệnh truyền nhiễm rất
nguy hiểm, lây lan nhanh, gây ra bởi 1 trong 7 type virus: Type A, O, C, Asia1,
SAT1, SAT2, SAT3, với hơn 70 phân type, ở Việt Nam đã phát hiện bệnh gây ra
bởi 3 type A, O và Asia1. Bệnh LMLM lây lan qua đường tiếp xúc giữa động vật
khoẻ với động vật, sản phẩm động vật, thức ăn, nước uống, không khí, chất thải,
dụng cụ, phương tiện vận chuyển, có mang mầm bệnh. Bệnh lây lan từ vùng này
sang vùng khác, tỉnh này sang tỉnh khác, nước này sang nước khác theo đường vận
chuyển động vật, sản phẩm động vật ở dạng tươi sống (kể cả thịt ướp đông, da,

xương, sừng, móng, sữa, lông, ). Động vật mắc bệnh LMLM là các loài động vật
có móng guốc chẵn như: trâu, bò, lợn, dê, cừu, hưu, nai, . Mặc dù xuất hiện như
một loại bệnh nhẹ, có tỷ lệ tử vong thấp ngoại trừ những con vật non, từ 2-5% đối
với gia súc trưởng thành và 20-50% ở đàn gia súc như bê, nghé, lợn con. Ở gia súc
sinh sản, bệnh LMLM làm sảy thai khoảng 25% động vật có chửa, sản lượng sữa
giảm 50% do viêm vú và lượng sữa thu được phải trải qua nhiều khâu khử trùng
phức tạp mới sử dụng được. Điều này cho thấy sự thiệt hại về kinh tế do bệnh
LMLM gây ra là rất trầm trọng (Knowles, 2001).
Theo Tổ chức Thú y thế giới (OIE), đây là bệnh dịch xếp đầu tiên ở bảng A
(gồm các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất cho chăn nuôi và hạn chế thương mại
đối với động vật, sản phẩm động vật).
1.1.2. Lịch sử và địa dư bệnh
Bệnh lở mồm long móng được Fracastorious phát hiện và mô tả lần đầu tiên tại
Italia năm 1514. Sau đó bệnh lây lan sang nhiều nước Châu Âu, nhưng đến thế kỷ
20 (1920) bệnh LMLM mới được nghiên cứu một cách tương đối chi tiết
(Andersen., 1980).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 4

Năm 1992, Tổ chức Thú y thế giới (OIE) đã thành lập nhóm phối hợp khống chế
bệnh LMLM của khu vực Đông Nam Á; đến năm 1994 nâng lên thành tiểu ban
phòng chống bệnh LMLM khu vực thuộc OIE bao gồm 7 nước: Myanma, Thái Lan,
Lào, Campuchia, Việt Nam, Malaysia và Phillipin.
1.1.3. Tình hình nghiên cứu bệnh LMLM trên thế giới
Virus gây bệnh Lở mồm long móng (LMLM) được hai nhà khoa học Đức là
Loefler và Frosch phân lập lần đầu tiên vào năm 1897. Virus LMLM được xác định
có 7 type chính là O, A, C, Asia 1, SAT1, SAT2, SAT3 (Carrillo và cs., 2005).
Dựa vào phân tích cây phát sinh chủng loại của trình tự gen VP1, type O được chia
thành 10 genotype, ký hiệu Europe-South America (Euro-SA), Middle East-South
Asia (ME-SA), Southeast Asia (SEA), Cathay (CHY), West Africa (WA), East

Africa 1 (EA-1), East Africa 2 (EA-2), East Africa 3 (EA-3), Indonesia-1 (ISA-1),
và Indonesia-2 (ISA-2) (Knowles và cs., 2005). Type Asia 1 được chia thành 6
genotypes (I–VI) (Valarcher và cs., 2009). Ngoài 7 type virus cơ bản trên thì người
ta đã thừa nhận có hơn 70 phân type của virus LMLM (Sobrino và cs., 2001). Bệnh
LMLM đã xuất hiện ở nhiều nước thuộc Châu Á, Châu Phi, Châu Mỹ La Tinh và
Châu Âu. Điển hình là trong những năm 1981-1985, dịch xuất hiện ở 80 nước, gây
nên tổn thất lớn cho nền kinh tế của những nước này (OIE, 2011). Đến năm 2000,
bệnh đã xuất hiện ở Nhật Bản, Hàn Quốc. Tại châu Âu năm 2001 dịch đầu tiên xảy
ra ở Anh, sau đó lan ra Pháp, Hà Lan, Ai-len qua con đường vận chuyển gia súc
(OIE, 2011).
Ở khu vực Đông Nam Á, những năm gần đây virus LMLM serotype O, A, và
Asia 1 được cho là nguyên nhân chính gây ra các trận đại dịch ở Campuchia, Lào,
Malaysia, Myanma, Philippine, Thái Lan và Việt Nam. Những nghiên cứu về virus
LMLM cho thấy các chủng virus LMLM phân lập được tại những nước này có tính
tương đồng cao về trình tự nucleotide (Gleeson, 2002; Khounsy và cs., 2009;
Knowles và cs., 2005; Le và cs., 2010a; Le và cs., 2010b; Valarcher và cs., 2009).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 5



Hình 1.1. Bản đồ hiện trạng bệnh LMLM của các nước thành viên chính thức
OIE (theo OIE, 2/2014)
Trên thế giới, vắc-xin phòng bệnh LMLM đã được nghiên cứu sản xuất từ đầu
những năm 1900 và được coi là yếu tố quyết định trong công tác phòng chống dịch
bệnh. Ngày nay vắc-xin phòng bệnh LMLM được sản xuất tại nhiều nước trên thế
giới như Hà Lan, Pháp, Nga, Trung Quốc.Từ đầu thế kỷ 21 các phương pháp sản
xuất vắc-xin vô hoạt phòng bệnh LMLM đã được cải tiến nhiều. Thành phần virus
kháng nguyên của vắc-xin có thể là một hoặc nhiều serotype được trộn với các chất
bổ trợ (Doel, 2003). Nhiều nước trên thế giới đã thanh toán được bệnh dịch LMLM

như Australia, New Zealand, các nước thuộc quần đảo Thái Bình Dương, các nước
thuộc EU, các nước thuộc vùng Bắc Trung Mỹ. Ở khu vực Đông Nam Á bao gồm
Thái Lan, Indonesia, Philippines. Các nước trên đều phải thực hiện một chương
trình quốc gia về tiêm phòng nhiều năm, kiểm dịch và các biện pháp khác theo quy
định của Tổ chức Thú y thế giới (Valarcher và cs., 2009).

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 6

1.1.4. Tình hình nghiên cứu bệnh lở mồm long móng tại Việt Nam
Bệnh LMLM được phát hiện lần đầu ở Nha Trang năm 1898 (Đào, 2000), sau
đó lan rộng ra cả nước.
Năm 1999, dịch xảy ra ở Cao Bằng, sau đó lây lan xuống Bắc Ninh và Hà Nội.
Đến đầu năm 2000, dịch đã lây lan khắp 58/61 tỉnh, thành phố với 297.808 trâu bò
và 36.530 lợn bị bệnh, gây thiệt hại lớn về kinh tế xã hội. Năm 2004, dịch xảy ra ở
cả 3 vùng miền, tăng hơn nhiều so với năm 2003 cả về diện dịch và số thiệt hại. Số
tỉnh có dịch LMLM là 24 tỉnh , trong đó có 9 tỉnh do virus LMLM type A, 12 tỉnh
do virus LMLM type O và 3 tỉnh do cả hai virus LMLM type O và A. Năm 2005, số
tỉnh có dịch LMLM là 37 tỉnh, trong đó có 3 tỉnh do virus LMLM type A, 13 tỉnh
do virus LMLM type O, 3 tỉnh do cả hai virus LMLM type O và A, 2 tỉnh do virus
LMLM type Asia 1. Năm 2006, hầu hết các tỉnh thành thông báo có dịch LMLM
nguyên nhân chính là do type O (Hoang, 2009). Theo số liệu ghi nhận được gần đây
nhất từ Cục Thú y thì từ tháng 9/2010 đến tháng 6/2011, dịch lở mồm long móng đã
xảy ra ở 2.063 xã, phường thuộc 279 huyện của 39 tỉnh là Quảng Ninh, Hà Nam,
Nam Định, Hà Giang, Cao Bằng, Bắc Cạn, Tuyên Quang, Lào Cai, Yên Bái, Thái
Nguyên, Lạng Sơn, Bắc Ninh, Bắc Giang, Phú Thọ, Điện Biên, Lai Châu, Sơn La,
Hòa Bình, Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Nam, Quảng Ngãi,
Phú Yên, Khánh Hòa, Kon Tum, Gia Lai, Đắc Lắc, Lâm Đồng, Bình Phước, Tây
Ninh, Bình Dương, Đồng Nai, Bà Rịa -Vũng Tàu, Long An, Tiền Giang, Vĩnh
Long, Sóc Trăng.Tổng số gia súc mắc bệnh 150.986 con trâu bò lợn, dê trong đó có

72.163 con trâu, 26.311 con bò và 48.626 con lợn, 1.097 con dê. Tổng số gia súc bị
chết và tiêu hủy là 45.107 con trong đó 5.120 con trâu, 938 con bò, 37.760 con lợn
và 329 con dê phải tiêu hủy.






Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 7

Bảng 1.1: Tổng hợp tình hình dịch bệnh LMLM giai đoạn 1999 -2010
Năm
Trâu bò Lợn
Số
tỉnh

Số
huyện

Số ổ
dịch
Số
mắc
Số
chết,
xử lý
Số
tỉnh

Số
huyện

Số ổ
dịch
Số
mắc
Số
chết,
xử lý
1999
55 347 1.912

112.579

1.309 52 217 958 25.820

3.270
2000
48 126 1.708

351.284

15.136

51 266 1.148

42.999

14.986

2001
16 29 47 3.976 112 17 47 95 6.428 1.534
2002
26 71 183 10.287 194 28 75 208 6.933 2.229
2003
28 88 266 20.303 116 28 67 123 3.533 712
2004
32 134 490 25.658 189 22 35 87 1.555 725
2005
26 160 408 28.241 582 25 - - 3.976 1.024
2006
52 - - 23.749 2.263 31 - - 9.714 6.590
2007
27 91 225 7.442 1.047 24 71 172 10.851

10.763

2008
14 43 122 2.408 218 5 9 12 67 39
2009
27 87 231 7.861 432 16 23 35 499 429
2010
28 - - 16.330 419 16 - - 1.675 848
(Nguồn: Bộ Nông Nghiệp và Phát triển nông thôn, 2011)
Từ năm 2001 đến nay, Viện Thú y đã thực hiện đề tài nhánh mang số
KC04.06.04 với tiêu đề “Chẩn đoán định type virus gây bệnh LMLM bằng kỹ thuật
sinh học phân tử RT-PCR” bằng bệnh phẩm của gia súc (trâu, bò và lợn) nghi mắc
bệnh LMLM tại nhiều tỉnh thành trong phạm vi cả nước.

Các nghiên cứu dịch tễ học kết hợp với chẩn đoán lâm sàng cũng cho thấy, có 3
type LMLM đang lưu hành ở Việt Nam gồm type O, A và Asia 1 và là nguyên nhân gây
ra các đợt dịch trong những năm gần đây, trong đó type O được cho là type virus phổ
biến nhất (Gleeson, 2002; Knowles và cs., 2005; Valarcher và cs., 2009). Virus type O,
A được thông báo là đã gây ra đại dịch LMLM năm 2008 và 2 tháng đầu năm 2009,
trong khi đó type Asia 1 là nguyên nhân chính của đợt dịch 2007 (Hoang, 2009).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 8

Trong những nghiên cứu gần đây, khi giải mã và phân tích gen VP1 của các
chủng virus LMLM type O và Asia1 phân lập được tại Việt Nam vào những năm
2005, 2006 và 2007 thấy type O phân lập được thuộc phân type Southeast Asia
(SEA) và chi Mya-98 trong tổng số 10 phân type được ghi nhận trên thế giới. Trong
khi đó, chủng virus LMLM type Asia1 được xác định thuộc nhóm IV và V và có độ
tương đồng rất cao với chủng virus gây đại dịch LMLM ở Trung Quốc và Mông Cổ
năm 2005 (Le và cs., 2010b). Tương tự năm 2011 và 2012, Le và cs cũng đã phát
triển thành công phương pháp One-step multiplex RT-PCR để nhanh chóng chẩn
đoán và định type virus gây bệnh LMLM type O, A, Asia 1 đang lưu hành và gây
bệnh trên đàn gia súc nuôi tại Việt Nam.
1.2. Đặc điểm sinh học phân tử của virus lở mồm long móng
1.2.1. Căn bệnh
1.2.1.1 Các đặc tính sinh học chung của virus LMLM
Virus lở mồm long móng có kích thước vô cùng nhỏ bé phải quan sát dưới
kính hiển vi điện tử. Đây là loại vi sinh vật ký sinh nội bào tuyệt đối, nó chỉ có thể
sống và nhân lên trong môi trường tế bào sống. Virus không có cấu tạo tế bào,
người ta chia nó theo một giới riêng độc lập, nó chỉ gồm vỏ capsid (protein) bên
trong là nhân (acid nucleic) được tạo thành từ DNA hoặc RNA.
1.2.1.2. Hình thái, cấu tạo của virus LMLM
Virus LMLM thuộc loại virus nhỏ nhất trong các virus qua lọc, thuộc họ
Picornaviridae, chi Aphthovirus. Hạt virus gồm phần trung tâm là acid nuleic 31%,

được bao bọc bởi một capside (là protein) gồm 60 capsomere, không vỏ bọc. Dưới
kính hiển vi điện tử, virus thường có dạng hình cầu hay hình dâu, đường kính 20-28
nm, gồm 20 mặt đối xứng, 30 cạnh 10 đỉnh.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 9


Hình 1.2: Hình thái và cấu tạo virus Lở mồm long móng
(Nguồn: />31/DateType/month/Default.aspx)
Ở virus có vỏ bọc, acid nucleic chiếm một phần nhỏ 1-2% và ở virus trần là
25-50% so với cơ chất. Trong quá trình nhiễm vào vật chủ, hệ gen của virus thoát
khỏi vỏ protein và vào trong tế bào.
Nhân của virus LMLM là một sợi RNA đơn dương chứa khoảng 8200
nucleotide mã hóa cho 4 loại protein cấu trúc VP1, VP2, VP3, VP4 (Racaniello,
2001, Mason và cs., 2003) và các protein không cấu trúc của virus. Các đoạn gen S
và L thể hiện vị trí và việc dự đoán cấu trúc bậc 2 của UTRs. Đầu 5’ UTR bao gồm
đoạn S-fragment, poly C, đoạn pseudoknot, cấu trúc cre và IRES (Internal
Ribosome Entry Site) và đầu 3’ UTR với một đoạn poly A.
Đầu 5
’
của sợi RNA được gắn với một khối protein nhỏ (VPg) có khối lượng
khoảng 3 kDa (Grubman, 1980; Sangar và cs., 1977), đầu 3
’
là 1 chuỗi poly (A)
(Saravanan và cs., 2011). Vùng không đọc mở UTR (untranslated region) ở đầu
5
’
có khoảng 1300 nu bao gồm đoạn S chiếm khoảng 360 nu, chức năng của đoạn
này chưa được làm rõ (người ta cho rằng nó có thể liên quan tới việc duy trì sự ổn
định RNA của virus khi xâm nhập vào tế bào vật chủ (Barton và cs., 2001)). Tiếp

theo là đoạn poly (C) có khoảng 80-200 nu (Harris và Brown, 1977) cũng có trường
hợp có tới 400 nu đó là do đoạn poly (C) sẽ dài ra trong quá trình nuôi cấy tế bào
(Escarmis và cs., 1992). Tiếp đến là đoạn L chiếm khoảng 700 nu với bộ ba mã mở
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 10

đầu là AUG cho phép Ribosom gắn vào để bắt đầu quá trình phiên mã. Theo
Chatarjee và cs. (1976); Saiz và cs. (2001) đoạn UTR ở đầu 3
’
có nhiệm vụ báo hiệu
sự kết thúc của quá trình chép hoàn chỉnh, có khoảng 190 nu và đuôi poly (A) có
10-100nu. Trong bộ gen của virus LMLM quan trọng nhất là khung đọc mở ORF
gồm 6996 nu mã hóa cho các protein cấu trúc và không cấu trúc của virus (Forss và
cs, 1984). Phần này được chia ra thành 3 đoạn gen là P1, P2, và P3 (lần lượt từ đầu
5
’
tới 3
’
). Trong đó, đoạn P1 bao gồm các đoạn gen 1A, 1B, 1C, 1D mã hóa cho các
protein cấu trúc tương ứng là VP4, VP2, VP3, và VP1 (Rueckert và Wimmer,
1985). Theo Vakharia và cs (1987), đoạn gen P2, P3 bao gồm các vùng gen mã hóa
cho các protein không cấu trúc tương ứng là 2A, 2B, 2C và 3A, 3B, 3C, 3D. Trong
đó, vùng gen 2A có tính ổn định cao ở tất cả các serotype, vùng gen 2C có liên quan
tới quá trình hoàn thiện hạt virus (Saunders và cs., 1985), vùng gen 3B mã hóa cho
protein VPg (Fross và Schaller, 1982).

Hình 1.3: Sơ đồ cấu trúc hệ gen của virus LMLM
(Nguồn />mong-o-trau-bo-va-lon-tai-nghe-an-tu-nam-2002-2007-cac-giai-phap-phong-
chong-46192/
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 11

1.2.1.3. Tính chất nuôi cấy
- Có thể nuôi cấy virus trên tổ chức da của thai lợn, thai bò còn sống.
- Nuôi cấy trên tổ chức lưỡi bò trưởng thành.
- Nuôi cấy trên môi trường tế bào thận bê, thận cừu, hoặc thận chuột BHK-21
(Baby Hamster Kidney dòng 21).
1.2.1.4. Sức đề kháng của virus LMLM
- Virus có sức đề kháng mạnh:
+ Ở 60
0
C tồn tại 5-15 phút, ở 100
0
C virus chết ngay lập tức.Từ 0-4
0
C tồn tại
425 ngày.
+ Trong đất ẩm virus sống hàng năm, gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển và
gây bệnh.
+ Trong thịt ướp lạnh virus tồn tại khá lâu.
+ Trong phân ủ thành đống virus tồn tại 7 ngày.
+ Nước tiểu virus tồn tại 39 ngày.
1.2.2. Sự phân bố các chủng virus gây bệnh
Các type virus gây bệnh có sự phân bố khác nhau trên toàn cầu.Type O, A
được nhận biết ở nhiều vùng khác nhau trên thế giới.
Bảng 1.2: Sự phân bố các type virus LMLM trên thế giới
Vùng Type
Nam Mỹ O, A, C
Châu Âu O,A,C
Châu Phi O, A, C, SAT1, SAT2, SAT3

Châu Á O, A, C, Asia1
Bắc và Trung Mỹ,Caribe và Châu Đại Dương Không có virus

(Nguồn:
Các type SAT1, SAT2, SAT3 được giới hạn ở một số nước thuộc Châu Phi.
Type huyết thanh Asia1 được tìm thấy ở nhiều nước thuộc Châu Á. Riêng type
huyết thanh C chỉ còn tồn tại ở một số nước như Philippines.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 12

Theo tài liệu của Cục Thú y, chủng virus gây bệnh LMLM trên gia súc ở Việt
Nam thuộc type O, gần đây có xuất hiện virus type Asia 1 ở các tỉnh miền núi phía
bắc, type A ở một số tỉnh miền trung như: Nghệ An, Hà Tĩnh…

Hình 1.4: Sự phân bố bệnh LMLM trên thế giới tháng 9/2013
(Nguồn:
1.2.3. Dịch tễ học
1.2.3.1. Động vật cảm nhiễm
Trong tự nhiên: virus gây bệnh chủ yếu cho trâu, bò, dê, cừu, lợn và động vật
hoang dã như trâu, bò, lợn rừng, lạc đà, sơn dương, voi. Loài ăn thịt ít mắc và
thường ở thể nhẹ. Động vật một móng như ngựa, lừa, la không mắc bệnh. Loài chim
cũng không cảm nhiễm. Trong vùng dịch LMLM ngoài trâu, bò có thể thấy nhím,
chuột, hươu, nai, hoẵng mắc bệnh và chết khá nhiều.
Trong phòng thí nghiệm: Chuột lang rất cảm thụ, phương pháp gây nhiễm tốt
nhất là tiêm trong da hoặc khía da hay tiêm nội bì gan bàn chân. Sau 12-24 giờ chỗ
tiêm có nổi mụn nhỏ màu đỏ, có thủy thũng, sau 2-3 ngày có thể nhiễm trùng toàn
thân và có nhiều mụn ở miệng, lưỡi, lợi.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 13

Chất chứa virus:
Mụn nước là nơi tập trung nhiều virus nhất, đặc biệt là mụn nước sơ phát mới
hình thành.
Trên cơ thể thú ngoài mụn nước, các chất bài tiết như nước bọt, nước tiểu,
phân, sữa, nước mắt, nước mũi cũng chứa nhiều virus. Số lượng virus trong chất
thải này có thể thay đổi tuỳ thuộc vào thời gian mắc bệnh, thường rất cao trong
ngày đầu và giảm dần. Sau 2 tuần hầu như không còn thấy virus trong các chất bài
tiết. Trung bình 1 con heo mắc bệnh sẽ bài thải khoảng 4 tỉ virus mỗi ngày (gấp
3.000 lần trên bò).
Trên thú chết hoặc bị giết mổ, virus tập trung nhiều trong máu, bắp cơ và ở các
nội tạng.
Lượng virus trong bắp cơ cao hơn trong máu và có mặt đến ngày thứ 7 sau khi
mắc bệnh.
1.2.3.2. Đường xâm nhập và cách truyền bệnh
Đường xâm nhập chính là tiêu hoá, virus có thể vào cơ thể qua niêm mạc miệng,
và niêm mạc ống tiêu hoá. Ngoài ra, các vết trầy ở da, đầu vú cũng là nơi virus xâm
nhập vào cơ thể. Đường sinh dục và hô hấp được coi là đường xâm nhập phụ.
Quá trình lây lan bệnh diễn ra theo các cách thức sau:
+ Lây trực tiếp qua nước bọt hoặc các chất bài tiết do nhốt chung hoặc chăn
thả chung gia súc bệnh với gia súc khoẻ mạnh.
+ Lây gián tiếp qua thức ăn, nước uống, các dụng cụ chăn nuôi, chân tay,
giầy dép của người chăn nuôi, người tham gia điều trị bệnh hoặc lây lan do việc bán
chạy các gia súc mắc bệnh, mổ lậu gia súc mắc bệnh, không xử lý đúng mức thịt gia
súc mắc bệnh hoặc vận chuyển gia súc mắc bệnh.
+ Virus có thể theo gió phát tán ra không khí trong cự ly 10km.
1.2.3.3. Cơ chế gây bệnh
Thời kì nung bệnh thường từ 1 – 3 ngày khi gây bệnh thực nghiệm: 2 – 7 ngày
hoặc 11 ngày khi gây bệnh trong tự nhiên (Tô Long Thành., 2005).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 14

Virus LMLM xâm nhập vào động vật chủ theo đường hô hấp hoặc theo vết
xước trên da, đầu tiên chúng nhân lên với số lượng nhỏ tại nơi xâm nhập (Sobrino
và cs., 2001).
Vùng yết hầu của động vật nhai lại được
coi như vùng sinh bệnh ban đầu của virus
LMLM, sau đó virus LMLM xâm nhập vào
tổ chức lympho vùng hầu hay các hạch liên
quan rồi đi vào máu (Donalsson A.I, 2000).
Sau khi vào máu, virus LMLM được
đưa đến các vị trí thứ cấp gồm các cơ quan
tuyến, hạch lympho khác và biểu mô quanh
mồm, chân, nơi phát sinh các mụn nước
(Donalsson A.I, 2000). Mụn nước dày đặc
xuất hiên ở viền móng, vòm khẩu cái, mõm
lưỡi, đầu vú (Brown C., 2001).
Virus LMLM có thể qua đường sinh dục, qua các niêm mạc khác, qua da của
vành móng (Văn Đăng Kỳ., 2002)
1.2.4. Triệu chứng
1.2.4.1.Triệu chứng ở trâu, bò
- Thời gian nung bệnh từ 1-3 ngày (có thể 11 ngày).
- Con vật bỏ ăn, ủ rũ, đi lại khó khăn, sốt 40-41
o
C.
Miệng:
- Hình thành mụn nước ở lưỡi, lợi , hàm, mũi, miệng.
- Do bị sốt nên miệng nóng, lưỡi dày lên, khó cử động. Sau đó xuất hiện những mụn
nước nhỏ li ti trên niêm mạc miệng, môi , lợi, chân răng, phía trong má, lưỡi.
- Giai đoạn sau những mụn nước to dần lên.
- Sau 1-2 ngày mụn vỡ, bờ xơ xác, đáy mụn có màu hồng đỏ.

- Khi có mụn nhiều thì mặt lưỡi rộp lên giống như vẩy ốc chỗ to chỗ nhỏ, chỗ lồi
chỗ lõm, khi thò tay vào bắt lưỡi ra xem, niêm mạc lưỡi bong ra từng mảng, để
lại các vết đỏ rớm máu.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 15

- Khi mụn vỡ, con vật sẽ chảy nước rãi nhiều, dính, chảy thành dòng, thành sợi
(giống như bọt xà phòng). Có khi nước rãi lẫn màu vàng nhạt hoặc nâu nhạt do
có xuất huyết và lẫn các màng thượng bì do màng mụn bong ra.

Hình 1.5: Niêm mạc lưỡi bò bong tróc
(Nguồn:
Vú:
- Lúc đầu bầu vú và núm vú sưng lên, sau đó xuất hiện những mụn nước ở đầu
núm vú.
- Sờ tay vào con vật sẽ có phản ứng đau, bầu vú nóng,
Vành móng, kẽ móng:
- Lúc đầu da ở vành móng nóng, đỏ, đau.
- Xuất hiện các mụn nước nhỏ li ti.
- Mụn nước dập nát, chảy nước. Nếu vệ sinh tốt sẽ lên da non.
- Có trường hợp mụn loét ăn sâu cả vào phía xương làm cho gót con vật hở ra
giống như đi dép.