Các phản ứng sinh hóa củ vi sinh vật

CÁC PHẢN ỨNG SINH HÓA
1.1. Nguyên tắc: Xác định khả năng lên men củavi sinhvật đốivới
nguồn carbohydrate cụ thể (Glucose, Lactose, Xylose…) kếthợp
vớimôitrường kiểmtrakhả năng sinh acid hoặc sinh acid và sinh
hơi.
1.2. Sảnphẩmcuốicùngcủa quá trình lên men carbohydrates:
• các loại acid như: lactic acid, acetic acid,…,
•mộtvàiloạirượunhư: ethyl alcohol…,
•Xêton
•vàhailoạihơi là: carbon dioxide, hydrogen.
1. KIỂM TRA KHẢ NĂNG LÊN MEN CARBOHYDRATE
1.3. Môi trường: Carbohydrate fermentation broth
Chứa3 thànhphầncănbản:
¾ (0.5 - 1.0)% carbohydrate kiểm tra (ví dụ: lactose hoặc
glucose…),
¾ Chấtchỉ thị pH (Xem phần1.4).
¾ Môi trường dinh dưỡng để hầuhếtcácvi sinhvậtcóthể
tăng trưởng dù vi sinh vật đócókhả năng lên men đường
hay không.
1. KIỂM TRA KHẢ NĂNG LÊN MEN CARBOHYDRATE
1.4. Chấtchỉ thị pH:
Phenolsulfonphthalein
(C
19
H
14
O
5
S)
8.4 – đỏ hồng
nhạt

6.8 - vàng7.9Phenol red
2- Methylamiophenazine
(C
15
H
17
N
4
Cl)
8.0 - vàng6.8 - đỏ7.5Neutral red
4’ –
Dimethylaminoazobenzene-
2-carboxylic acid
(C
15
H
15
N
3
O
2
)
6.0 - vàng4.4 - đỏ5.0Methyl red
Dibromophenolsulfonphthalein
(C
27
H
28
O
5

SBr
2
)
7.6 – Xanh đậm6.0 - vàng
7.0 – xanh lá
cây
Bromthymol
blue
Dibromo-o-
cresolsulfonphthalein
(C
21
H
16
O
5
SBr
2
)
6.8 - tím5.2 - vàng6.3 –tím
Bromcresol
purple
Acid fuchsin8.0 – vàng nhạt5.0 - hồng
7.2 – không
màu
Andrade’s
Thành phầnhóahọcpH kiềmpH acid
pH môi
trường
Chấtchỉ thị

pH
1. KIỂM TRA KHẢ NĂNG LÊN MEN CARBOHYDRATE
2. MÔI TRƯỜNG KLIGLER’S IRON AGAR (KIA)/ MÔI
TRƯỜNG TRIPLE SUGAR IRON AGAR TESTS (TSI)
2.1. Nguyên tắc: Xác định khả năng sử dụng nguồn carbohydrate
cụ thể kếthợpvớimôitrường tăng trưởng cănbản, có hoặc
khôngcósinhhơi và hydrogen sulfide (H
2
S).
2.2. Môi trường
Glucose hay Galactose
Chu trình Krebs
Hiếu khí
CO
2
+ H
2
O + năng lượng
2.3. Sinh hóa
•
•
S
S
ử
ử
d
d
ụ
ụ
ng

ng
lactose
lactose
•
•
S
S
ử
ử
d
d
ụ
ụ
ng
ng
glucose (
glucose (
đi
đi
ề
ề
u
u
ki
ki
ệ
ệ
n
n
hi

hi
ế
ế
u
u
kh
kh
í
í
-
-
m
m
ặ
ặ
t
t
nghiên
nghiên
)
)
KIA
•1% Lactose
• 0.1% Glucose
TSI
•1% Lactose 1% Sucrose
• 0.1% Glucose
Chấtchỉ thị pH: Phenol red
Lactose
β - Galactosidase

Glucose + Galactose
Đáy
Nghiên
2. MÔI TRƯỜNG KLIGLER’S IRON AGAR (KIA)/ MÔI
TRƯỜNG TRIPLE SUGAR IRON AGAR TESTS (TSI)
•
•
S
S
ử
ử
d
d
ụ
ụ
ng
ng
glucose (
glucose (
đi
đi
ề
ề
u
u
ki
ki
ệ
ệ
n

n
k
k
ỵ
ỵ
kh
kh
í
í
–
–
đ
đ
á
á
y
y
)
)
Con
Con
đư
đư
ờ
ờ
ng
ng
Embden
Embden
-

-
Meyerhof
Meyerhof
Glucose hoặc Galactose
Con đường Embden-Meyerhof
Kỵ khí
Các acid hữucơ
Các aldehyde
Các loạirượu
CO
2
+ H
2
Năng lượng
2. MÔI TRƯỜNG KLIGLER’S IRON AGAR (KIA)/ MÔI
TRƯỜNG TRIPLE SUGAR IRON AGAR TESTS (TSI)
•
•
Không
Không
lên
lên
men lactose
men lactose
v
v
à
à
glucose
glucose

Peptone
Hiếukhí
Kỵ khí
Ammonia (NH
3
) Æ Kiềm
Vi khuẩn(môitrường acid) + Sodium thiosulfate
H
2
S gas
H
2
S + ion sắt Sắtsulfide (không tan tạotủamàuđen)
•
•
Sinh
Sinh
hydrogen sulfide (H
hydrogen sulfide (H
2
2
S)
S)
2. MÔI TRƯỜNG KLIGLER’S IRON AGAR (KIA)/ MÔI
TRƯỜNG TRIPLE SUGAR IRON AGAR TESTS (TSI)
Đáy ống nghiệm
• Màu vàng: glucose dương tính (lên men glucose)
•Màuđỏ/không đổi màu: glucose âm tính (không lên men glucose)
•Màuđen: sinh H
2

S
•Vỡ thạch: sinh hơitừ glucose
Mặtnghiên:
• Màu vàng: lactose và/hoặcsucrose dương tính (lactose và/hoặcsucrose
đượcsử dụng)
•Màuđỏ/không đổi màu: lactose và sucrose âm tính (lactose và sucrose
không đượcsử dụng)
2.4. Đọckếtquả
2. MÔI TRƯỜNG KLIGLER’S IRON AGAR (KIA)/ MÔI
TRƯỜNG TRIPLE SUGAR IRON AGAR TESTS (TSI)
3. DECARBOXYLASE TEST (LTSINE-ORNITHINE-
ARGININE) VÀ DEHYDROLASE TEST (ARGININE)
3.1. Decarboxylase test (lysine-ornithine-arginine).
3.1.1. Nguyên tắc:
Sử dụng để phát hiệnvi khuẩn sinh các ezyme decarboxylase, các
enzyme này tương tác với các amino acid có gốc carboxyl (-
COOH) ở cuối, tạo thành amine hay diamine và carbon dioxide
(CO
2
).
L-Lysine
Lysine decarboxylase
-CO
2
Cadaverine (diamine) + CO
2
L- Ornithine
Ornithine decarboxylase
-CO
2

Putrescine (diamine) + CO
2
R-CH-NH
2
-COOH
(amino acid)
R-CH
2
-NH
2
(amine)
+ CO
2
Kiềm
hoặc
2
HN-R-NH
2
(diamine)
Chỉ thị pH
Bromcresol purple
Cadaverine và Putrescine ổn định khi đượctạoradưới điềukiệnkỵ khí vì
thế vi khuẩnphải được nuôi cấytrongđiềukiệnkỵ khí bằng cách phủ mộtlớp
paraffin hay dầu khoáng lên trên bề mặtmôitrường.
3. DECARBOXYLASE TEST (LTSINE-ORNITHINE-
ARGININE) VÀ DEHYDROLASE TEST (ARGININE)
3.1. Decarboxylase test (lysine-ornithine-arginine).
3.1.2. Cơ sở sinh hóa:
L-Arginine
A

r
g
i
n
i
n
e
d
e
c
a
r
b
o
x
y
l
a
s
e
Agmatine
Agmatine
ureoehydrolase
Putrescine + Urea
Urease
2NH
3
+ CO
2
A

r
g
i
n
i
n
e
d
e
h
y
d
r
o
l
a
s
e
L-Citrulline +
NH
3
Citrulline
ureidase
2NH
3
CO
2
L-Ornithine
CO
2

Putrescine
Nếuchỉ thị pH thay đổisang kiềm nhanh và mạnh thì đólàdo hệ
thống arginine dehydrolase phân hủyarginine.
3. DECARBOXYLASE TEST (LYSINE-ORNITHINE-
ARGININE) VÀ DEHYDROLASE TEST (ARGININE)
3.2. Arginine decarboxylase test và arginine dehydrolase test.
Cơ sở sinh hóa: L-arginine đượcsử dụng bởihaihệ thống xảyra
đồng thờihoặcriênglẽ. Hai con đường đólà:
3. DECARBOXYLASE TEST (LYSINE-ORNITHINE-
ARGININE) VÀ DEHYDROLASE TEST (ARGININE)
3.3. Môi trường:
– Decarboxylase Basal medium
–pH=6.0
– Bromocresol purple
3.4. Đọckếtquả:
–Kiểmtradương tính: màu tím đụctớimàutímnhạt(sinh
cadaverine)
–Kiểm tra âm tính: màu vàng sáng, trong (chỉ glucose đượclên
men)
4.1. Nguyên tắc: phát hiệnkhả năng oxi hóa tryptophan thành các
dạng của indol: Indole, Skatole (methyl indole) và indole-acetate
4.2. Môi trường: Tryptophan hoặc peptone broth
4.3. Thuốcthử: Kovacs’s
Phản ứng:
4. INDOLE TEST
L-Tryptophan + H
2
O
Tryptophanase
Indole + Pyruvic acid + NH

3
P-Dimethylamino-
benzaldehyde (DMABA)
(Thuốcthử Kovacs)
+ Indole
HCl, alcohol
Warmed
condensation
Red color
4.4. Đọckếtquả.
–Dương tính: xuấthiệnvòngmàuđỏ trên bề mặtmôitrường.
– Âmtính: màuvàng(màucủathuốcthử Kovacs’s)
C=O
H
2
N
H
2
N
Urea
+ 2 HOH
Urease
CO
2
+ H
2
O+2NH
3
↔ (NH
4

)
2
CO
3
Phenol red
5.4. Đọckếtquả.
–Dương tính: môi trường có màu hồng
– Âm tính: môi trường không đổi màu (vàng cam)
5. UREASE TEST
5.1. Nguyên tắc: sử dụng để phát hiệnkhả năng phân cắt urea
thành ammonia do hoạt tính của urease từ vi sinh vậtvàkếtquả là
môi trường bị kiềmhóado NH
3
đượctạora.
5.2. Môi trường: Urea broth (hoặc Urea agar)
5.3. Phản ứng:
2 Glucose + H
2
O Æ 2 Lactic acid + acetic acid + ethanol + 2 CO
2
+ 2H
2
(Formic acid Æ H
2
+CO
2
)
6.5. Đọckếtquả:
–Dương tính: môi trường chuyểnmàuđỏ (pH=4.4)
– Âm tính: môi trường không đổimàu(pH=6.0)

6. METHYL RED (MR) TEST
6.1. Nguyên tắc: kiểmtrakhả năng tạo và duy trì acid đượctạoratừ
quá trình lên men glucose củavi sinhvật.
6.2. Môi trường: MR-VP Broth.
6.3. Thuốcthử: chỉ thị pH Methyl
6.4. Phản ứng:
(+)(-)
Glucose + ½ O
2
Æ 2,3-butanediol + H
2
O + 2 CO
2
2,3-butanediol
Oxi hóa
2,3-butanediol dehydrogenase
Acetoin
7. VOGES-PROSKAUER (VP) TEST
7.1. Nguyên tắc: Xác định khả năng sinh acetylmethylcarbinol
(acetoin) trong quá trình lên men glucose củamộtsố vi sinh vật.
7.2. Môi trường: MR-VP Broth.
7.3. Thuốcthử:
- Naphtol, (chấttăng cường màu)
- KOH 40%, (chất oxi hóa)
7.4. Phản ứng:
Acetoin + α - Naphthol
40%KOH
O
2
(oxidized)

Diacetyl
(Thuốcthử O’Meara and Coblentz)
Diacetyl + Guanidine nucleus
Màu đỏ hồng nhạt
7.4. Đọckếtquả:
–Dương tính: Màu đỏ -hồng nhạttrênbề mặtmôitrường (có
acetoin)
– Âmtính: Màuvàngtrênbề mặtmôitrường (như màu củathuốc
thử)
7. VOGES-PROSKAUER (VP) TEST
Succinic acid
(Cơ chất-S)
Fumaric acid
Succinic dehydrogenase
(Enzyme-E)
E + S
PhứcES
E + P
(sảnphẩm)
Bị khóa bởi malonate
8. MALONATE TEST
8.1. Nguyên tắc: Xác định khả năng sử dụng sodium malonate là
nguồn carbon duy nhất cùa vi sinh vậtvàkếtquả là tạomôi
trường kiềm.
8.2. Môi trường: Malonate broth.
8.3. Thuốcthử: Bromthymol blue – chấtchỉ thị pH
8.4. Phản ứng:
Pyruvate
Acetyl CoA
Oxaloacetate

Citrate
Malate
Fumarate
Succinate
cis-Aconitate
Isocitrate
α - ketoglutarate
Chu
Chu
tr
tr
ì
ì
nh
nh
Krebs
Krebs
Malonate ứcchế
phản ứng
Phá vở tạmthờichutrìnhKrebs Æ Không có khả năng tăng trưởng
trừ khi vi sinh vậtcóthể sử dụng malonate là nguồn carbon duy nhất.
8. MALONATE TEST
8. MALONATE TEST
8.5. Đọckếtquả:
–Dươngtính: Màuxanhdương đậm(kiềm)
– Âm tính: Màu xanh lá cây
Citrate Æ oxalacetate + acetate
Oxalacetate Æ Pyruvate + CO
2
pH kiềm Pyruvate Æ acetate + formate

pH acid
2 pyruvate Æ acetate + CO
2
+ lactate
2 pyruvate Æ acetoin + 2CO
2
9. CITRATE TEST
9.1. Nguyên tắc: Xác định khả năng sử dụng citrate như là nguồn
carbon duy nhất trong quá trình biếndưỡng củavi sinhvật.
9.2. Môi trường: Simmons citrate medium.
9.3. Thuốcthử: Bromthymol blue – chấtchỉ thị pH
Phản ứng:
9. CITRATE TEST
9.4. Cơ sở sinh hóa: Môi trường có chứamuối ammonium vô cơ.
Vi sinh vậtcókhả năng sử dụng citrate làm nguồn Carbon duy
nhất thì có khả năng sử dụng muối Amonium làm nguồnNitơ và
sinh NH
3
làm môi trường trở nên kiềm.
9.5. Đọckếtquả:
–Dươngtính: Màuxanhdương đậm(kiềm)
– Âm tính: Màu xanh lá cây
10.1. Nguyên tắc: Xác định khả năng sống và tái sinh củavi sinh
vậttrongmôitrường chứa potassium cyanide.
10.2. Môi trường: KCN broth.
10.3. Cơ sở sinh hóa:
-Hầuhết các vi sinh vậthiếukhíđềucóenzyme cytochrome
oxidase, nhờ enzyme này mà vi sinh vậtsử dụng oxygen là chất
nhận điệntử cuốicùngđể khử oxygen phân tử thành hydrogen
peroxide (H

2
O
2
)
-Vi sinhvậtkỵ khí không có khả năng sống khi có sự hiệndiện
của oxygen trong không khí vì không có hệ thống cytochrome
oxidase.
10. POTASSIUM CYANIDE TEST
10. POTASSIUM CYANIDE TEST
– Ion cyanide (CN
-
) có thểứcchế quá trình hô hấp, quá trình ức
chế xẩyratrênhệ thống cytochrom. Cyanide là chất ứcchế
cytochrome oxidase.
–Một vài vi sinhvậthiếukhíkhôngnhạyvới cyanide, chúng có
khả năng kháng vớichất ứcchế khi chúng có hệ thống hô hấp
flavoprotein hoặc cyanide-insensitive khử diphosphopyridine
nucleotide (DPNH) và triphosphopyridine nucleotide (TPNH)
oxidases.
10.4. Đọckếtquả:
–Dương tính: Tăng trưởng trên môi trường nuôi cấy(gâyđục)
– Âm tính: Không tăng trưởng (trong)